Made available in DSpace on 2014-08-20T14:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_lourdes_caruccio_hirschmann.pdf: 1613567 bytes, checksum: d6416e53664a9171818d2680a476fe93 (MD5) Previous issue date: 2013-09-12 / The canine visceral leishmaniasis (CVL) is a chronic zoonotic systemic disease, which affects numerous mammals, caused by protozoa Leishimania (Leishimania) chagasi which is transmitted by the hematophagy of the female phlebotominae Lutzomyia longipalis. The CVL shows vast geographical distribution and great lethality potential. Rio Grande do Sul was considered a non-endemic state. However, in 2008, autochthonous cases of the disease in Western cities of the state were reported. The aim of this study was to survey the presence of seropositive dogs in kennels in twelve municipalities of Rio Grande do Sul considering the clinical, epidemiological and laboratory aspects therefore being able to early detect a possible spreading of the disease encouraging prevention and controlling campaigns in order to avoid future outbreaks. This study was conducted in an area without diagnosis for the disease, collecting sampling material of 165 dogs from the cities of Alegrete, São Franscico de Assis, Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio grande, Capão do Leão, Rio Grande and Camaquã. Animals were submitted to general clinical evaluation and tegumentary and lymphadenopathy injuries. In the laboratory evaluation, CBC, parasitological and serological examinations were performed. The information of each animal was described in detail in the form of clinical examination and then submitted to EpiInfo version 6.04. Dermatological signs, normocytic normochromic anemia, platelet changes and neutrophilic leukocytosis were presented by the suspected and confirmed animals. Serological analysis was performed using the techniques of indirect immunofluorescence (IIF), enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and Dual Plate Platform (DPP). It was found the rate of 33.94% (56/165) reagents for Leishmania chagasi in the IIF, the DPP showed that 6.67% (11/165) were positive, while 3.03 % (5/165) were positive in both tests (IIF and DPP) and ELISA showed a 6.06% (11/165). In these confirmed by ELISA, five (5/10) were reagents in IIF and only three (3/10) were positive in DPP, resulting in three seropositive canines according to the updated protocol recommended by the Ministry of Health. A comparison of serological techniques demonstrated that DPP and IIF alone showed an accuracy of 65.45% while in the analysis of the same tests, considering ELISA as a gold standard, the accuracy of the DPP was 90.91% and IFF showed 66.60%. However, when considering only the positive results in DPP and IIF, the accuracy increased to 94.55%, with Kappa=0.375, that is, with considerable agreement. Concluding the investigation of non-endemic districts, five seropositive dogs were revealed: in Cachoeira do Sul (2), in São Francisco de Assis (1), in Dom Pedrito (1) and in Rio Grande (1). / A Leishmaniose Visceral Canina (LVC) é uma zoonose de caráter crônico, sistêmica, que acomete diversos mamíferos, causada pelo protozoário Leishmania (Leishmania) chagasi, que é transmitido pela hematofagia da fêmea do flebotomíneo Lutzomyia longipalpis. A LVC apresenta ampla distribuição geográfica, e com alto potencial de letalidade. O Rio Grande do Sul era considerado um estado do Brasil sem casuística da doença, ou seja, não endêmico. Porém, em 2008 foram registrados casos autóctones de LVC em municípios de região oeste do estado. O objetivo deste estudo foi realizar um levantamento da presença de cães soropositivos em canis de doze municípios do Rio Grande do Sul, considerando os aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais, comparando métodos e protocolos de diagnóstico. Com isso, pode-se detectar precocemente uma possível disseminação da doença, incentivando campanhas de controle e prevenção, evitando assim futuros surtos. Este estudo foi realizado em uma área do RS sem diagnóstico para LVC, sendo avaliados o total de 165 cães provenientes dos municípios de Alegrete, São Francisco de Assis, Santiago, Dom Pedrito, Bagé, Caçapava do Sul, Cachoeira do Sul, Piratini, Arroio Grande, Capão do Leão, Rio Grande e Camaquã. Os animais foram submetidos à avaliação clínica geral, sendo observadas principalmente lesões tegumentares e linfoadenopatias. Na avaliação laboratorial, realizou-se hemograma completo, exame parasitológico e sorológico. Os achados clínicos de cada animal e os resultados das técnicas laboratoriais foram submetidos a análise estatística no programa EpiInfo versão 6.04. Sinais dermatológicos, anemia normocítica normocrômica, alterações plaquetárias e leucocitose com neutrofilia foram apresentados pelos animais sororreagentes. A pesquisa sorológica foi realizada através das técnicas de Imunofluorescência Indireta (IFI), ensaio imunoenzimático (ELISA) e Dual Plate Plataform (DPP). Constatou-se taxa de 33,94% (56/165) na IFI, 6,67% (11/165) no DPP, 3,03% (5/165) na IFI e DPP e 6,06% (10/165) no ELISA. Destes confirmados no ELISA, cinco (5/10) foram reagentes na IFI, e apenas três (3/10) foram positivos no DPP, resultando em três cães soropositivos conforme o protocolo atual preconizado pelo Ministério da Saúde. A comparação das técnicas sorológicas demonstrou que DPP e IFI isoladamente apresentaram uma Acurácia de 65,45%. Já na análise dos mesmos testes quando se considerou o teste de ELISA como padrão ouro, a Acurácia do DPP foi de 90,91% e a da IFI 66,06%. Entretanto, quando se considerou somente resultados positivos no DPP e IFI, a Acurácia aumentou para 94,55%, com um valor de Kappa=0,375, ou seja, com concordância considerável. Conclui-se que a pesquisa em áreas sem diagnóstico do RS, revelou presença de cães sororreagentes em quatro municípios do RS: Cachoeira do Sul (2), São Francisco de Assis (1), Dom Pedrito (1) e Rio Grande (1).

Made available in DSpace on 2014-12-17T14:13:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ElianaLTN_TESE.pdf: 2435421 bytes, checksum: e2270899f92315394897270d5f3384f3 (MD5) Previous issue date: 2009-10-05 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico / Visceral leishmaniasis (VL) has undergone changes in terms of clinical and epidemiological presentation worldwide. Urbanization has been described in different regions of Brazil and the world, as well as in the state of Rio Grande do Norte. These changes have impacted in the clinical outcome of Leishmania infection. A new clinical entity called co-infection of HIV/Leishmania has been described as a consequence of overlapping areas of occurrence of VL and HIV / AIDS in different countries including Brazil. The aim of this study was to define the process of periurbanization of the LV and describe a case series of co-infection HIV / Leishmania in Rio Grande do Norte. A new demographic pattern of VL was detected, with an increase in the number VL adult male subjects. Analysis of spatial distribution of VL in the state of Rio Grande do Norte showed that in the past 20 years VL tends to occur in larger cities and therefore the highest risk disease is greater in the eastern and western regions. The first region included Natal, the state capital, where the process of suburbanization began in 1990, and more recently the city of Mossor?, the second largest state, where periurbanization began in the last five years. In 1990, the emergence of co-infection HIV/Leishmania in the state was observed. Case-control study revealed that the new clinical entity affects adult males, who acquired HIV through sexual intercourse, 40% of those with a preivous history of leishmania infection Relapse and death from LV is increased in HIV positive compared with HIV-negative patients matched by sex and age. This pattern is similar to the observed in Europe, except of the route of transmission, where in Europe occured concomitantly, by parenteral route in drug users. Analysis of spatial distribution identified overlapping new areas of occurrence of HIV / AIDS and LV potentially signaling to increased risk of this new clinical entity as described above. Therefore, epidemiological surveillance for co-infection HIV / Leishmania should be adopted in all areas of risk of VL. At the same time, it is necessary to evaluate drug resistance currently used in the treatment of VL, as well as parenteral transmission of L infantum/ chagasi in areas where drug dependence is a risk factor for HIV acquisition / Leishmaniose visceral (LV) vem sofrendo modifica??es do ponto de vista cl?nico e epidemiol?gico mundialmente. Urbaniza??o foi descrita em diferentes regi?es do Brasil e do mundo, como tamb?m no estado do Rio Grande do Norte, influenciando sobremaneira no comportamento cl?nico da doen?a. Uma nova entidade cl?nica denominada co-infec??o HIV/leishmania vem sendo descrita, como conseq??ncia da sobreposi??o de ?reas de ocorr?ncia de LV e HIV/AIDS, em diferentes pa?ses incluindo o Brasil. O objetivo deste estudo foi definir o processo de periurbaniza??o da LV e descrever s?rie de casos da co-infec??o HIV/Leishmania no Rio Grande do Norte. Mudan?a no padr?o demogr?fico da LV no RN foi detectada, sendo observado aumento no n?mero de indiv?duos na idade adulta, do sexo masculino. An?lise da distribui??o espacial demonstrou que nos ?ltimos 20 anos LV tende a instalar-se em munic?pios de maior porte e, portanto, mais urbanizados do RN, sendo as regi?es leste e oeste as de maior risco para a doen?a. A primeira regi?o inclui Natal, capital do estado, onde o processo de periurbaniza??o iniciou-se, em 1990 e, a outra, inclui a cidade de Mossor?, segunda maior do estado, onde a periurbaniza??o iniciou-se nos ?ltimos 5 anos. Tamb?m em 1990 registra-se a emerg?ncia da co-infec??o HIV/ Leishmania no estado. Estudo tipo caso-controle revelou que a nova entidade cl?nica acomete indiv?duos adultos do sexo masculino, que adquirem HIV por via sexual; 40% destes com hist?ria de infec??o pr?via por leishmania. Reca?das e ?bito por LV ? maior em pacientes HIV positivos comparados com pacientes HIV negativos, pareados por sexo e idade. Esse padr?o ? bastante semelhante ao europeu, exceto, pela via de transmiss?o, que ocorre l? de modo concomitante, por via parenteral, em usu?rios de drogas il?citas. Adicionalmente, a an?lise de distribui??o espacial identificou sobreposi??o de ?reas de ocorr?ncia de HIV/AIDS e LV no RN apontando para risco aumentado da nova entidade cl?nica descrita acima. Portanto, vigil?ncia epidemiol?gica para co-infec??o HIV/Leishmania deve ser adotada em todas as ?reas de risco. Ao mesmo tempo, faz-se necess?rio avaliar resist?ncia ?s drogas utilizadas atualmente, no tratamento da LV, bem como, transmiss?o parenteral de L infantum/chagasi, nas ?reas onde a depend?ncia de droga ? fator de risco para aquisi??o de HIV

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmania is the etiological agent of leishmaniasis. are protozoan trypanosomes genus, obligatory intracellular parasite of the phagocytic system cells mononuclear, with a flagellate form (promastigote), found in the intestinal tract of the insect vector and other intracellular aflagellate (amastigote). In leishmaniasis chemotherapy, pentavalent antimonial are used as first choice drugs. Other drugs such as pentamidine and amphotericin B have been used as alternative drugs. However, these drugs require parenteral administration in the long-term and exhibit serious side effects. Thus, the high toxicity, costs and associated resistance treatments available make it increasingly a search for new substances which can be used in therapy, especially those obtained from natural sources. The objective of this study was to evaluate the chemical profile and the leishmanicide effect in vitro red propolis extracts and Dalbergia ecastophyllum in promastigotes forms of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis. Red Propolis samples and Dalbergia ecastophyllum were collected in the low São Francisco River in Sergipe state, Brazil. The chemical characterization of hydroethanolic extract of propolis was made by Reverse Phase High-performance liquid chromatography (HPLC-FR). Leishmanicidal effect of red propolis extracts and D. ecastophyllum were made in promastigotes of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis by using the Alamar Blue staining method. The cytotoxicity of the propolis extract was evaluated in human macrophages J774 line using the MTT method. By chemical analysis could be identified in red propolis extracts the following phenolic compounds: Vanillic Acid, Ferulic Acid, Rutin, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A, whereas the D. ecastophyllum extract were identified: vanillic acid, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A. As the viability assessment, the obtained ICs50 for red propolis were: 21.54 μg/mL for L. chagasi and 9.73μg/mL for L. amazonensis. For the extract of D. ecastophyllum the ICs50 obtained were 70.47 μg/mL for L. chagasi and 53.42 μg/mL for L. amazonensis. The CC50 of propolis extract in macrophages was 72.63 μg/mL. These results show that the red propolis extract of the low São Francisco has the D. ecastophyllum as botanical origin and it presents leishmanicide potential, with low toxicity. / Os agentes etiológicos da leishmaniose são protozoários tripanossomatídeos do gênero Leishmania, parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear, com uma forma flagelada (promastigota), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e outra aflagelada intracelular (amastigota). Na quimioterapia da leishmaniose, são utilizados os antimoniais pentavalentes como fármacos de primeira escolha. Outros medicamentos tais como pentamidina e anfotericina B, têm sido empregados como drogas alternativas. Entretanto, estas drogas necessitam de administração parenteral em longo prazo e exibem efeitos secundários graves. Logo, a elevada toxicidade, os custos e a resistência associada aos tratamentos disponíveis fazem com que seja crescente a busca por novas substâncias que possam ser utilizadas na terapia, especialmente aquelas obtidas de fontes naturais. O Objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil químico e o efeito leishmanicida in vitro de extratos da própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum, em formas promatigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis. As amostras de própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum foram coletadas na região do baixo São Francisco em Sergipe, Brasil. A caracterização química do extrato hidroetanólico da própolis e D. ecastophyllum foi feita por Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). A efeito leishmanicida dos extratos da própolis vermelha e da D. ecastophyllum foi feita em promastigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis utilizando método colorimétrico com Resazurina. A citotoxicidade do extrato de própolis foi avaliada em macrófagos humanos da linhagem J774 utilizando o método do MTT. Pela análise química puderam ser identificados no extrato da própolis vermelha os seguintes compostos fenólicos: Ácido Vanílico, Ácido Ferúlico, Rutina, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A, enquanto que no extrato de D. ecastophyllum foram identificados: ácido vanílico, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A. Quanto a avaliação da viabilidade, as ICs50 obtidas para a própolis vermelha foram: 21,54 μg/mL para promastigotas de L. chagasi e 9,73 μg/mL para L. amazonensis. Para o extrato de D. ecastophyllum as ICs50 obtidas foram 70,47 μg/mL para L. chagasi e 53,42 μg/mL para L. amazonensis. A CC50 do extrato de própolis em macrófagos foi de 72,63 μg/mL. Tais resultados mostram que o extrato da própolis vermelha do Baixo São Francisco tem a D. ecastophyllum como origem botânica e que o mesmo apresenta potencial leishmanicida, com baixa toxicidade.

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-11T12:57:27Z No. of bitstreams: 1 amanda_r_lobo_ioc_bp_0013_2008.pdf: 4777016 bytes, checksum: a9e75760e9cb6f61af23579591306cb1 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-11T12:57:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 amanda_r_lobo_ioc_bp_0013_2008.pdf: 4777016 bytes, checksum: a9e75760e9cb6f61af23579591306cb1 (MD5) Previous issue date: 2008 / Cnpq - PDTIS/FIOCRUZ / Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Laboratório de Farmacologia Bioquímica e Celular. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose visceral é uma doença de alta mortalidade quando não tratada. Aproximadamente 500.000 novos casos ocorrem todo ano, freqüentemente em países pobres e em desenvolvimento. No Brasil, a leishmaniose visceral é causada pela Leishmania chagasi, que é transmitida principalmente pelo inseto vetor Lutzomyia longipalpis. Após 72 h de alimentação sanguínea num hospedeiro infectado, parasitas procíclicos são vistos aderidos ao intestino do inseto via flagelo. Esta adesão é vital para a evolução do ciclo de transmissão do parasita. Em vetores espécie–específicos foi proposto um papel para um lipofosfogligano (LPG) de superfície de Leishmania na adesão, porém, em vetores permissíveis, tem-se sugerido que esta adesão seja independente de LPG. Com o interesse de identificar e caracterizar moléculas que possam ter uma participação na interação parasito-vetor, nós iniciamos o estudo de duas moléculas de L. chagasi denominadas Flag e Sup, pertencentes à família de proteínas pequenas miristiladas (SMP’s), que anteriormente haviam sido implicadas em adesão ao tubo digestivo de flebotomíneos. Amplificamos e seqüenciamos o gene Flag de L. chagasi e observamos por alinhamento múltiplo o alto grau de conservação deste gene entre as espécies de Leishmania. Proteínas Flag e Sup recombinantes foram produzidas e utilizadas para produção de anticorpos policlonais em coelhos. Vimos por Western Blot de extrato protéico de várias espécies de Leishmania, que os anticorpos monoclonal e policlonal anti-Flag/MBP e o anticorpo policlonal anti-Sup, reconhecem as proteínas em todas as espécies, evidenciando a conservação destas. A imunolocalização destas proteínas mostrou que a proteína Flag está preferencialmente localizada na forma promastigota na bolsa flagelar e no flagelo, e, em amastigota, na bolsa flagelar e no flagelo interno curto, enquanto que a proteína Sup mostrou localização em toda a superfície do corpo em ambas as formas. Experimentos de RT-PCR mostraram que há transcrição diferencial de Flag e Sup quando comparamos entre as formas evolutivas amastigotas e promastigotas. Flag tem uma expressão parecida nas duas formas evolutivas enquanto Sup é mais expresso em amastigotas. Ensaios de inibição ex-vivo incubando previamente L. chagasi com anticorpo monoclonal anti-Flag ou policlonal anti-Sup, mostrou redução significativa de parasitas aderidos ao intestino de L. longipalpis Na tentativa de identificar um potencial receptor para o parasita no intestino de L. longipalpis, observamos a marcação de uma proteína de 27 kDa no extrato protéico do vetor utilizando parasita biotinilado em experimentos de “ligand blot”. / Visceral leishmaniasis is an illness of high mortality if not treated. Approximately 500,000 new cases occur per year, frequently in poor countries. In Brazil, visceral leishmaniasis is caused by Leishmania chagasi, transmitted by the insect vector Lutzomyia longipalpis. After 72h of blood feeding in an infected host, procyclic parasites are seen adhered to insect gut by the flagellum. This adhesion is vital for the completion of the parasite cycle of transmission. In species-specific vectors a role for a surface lipophosphoglycan (LPG) of Leishmania in the adhesion has been considered, while in the permissible vectors, this adhesion may be independent of LPG. Aiming to identify and characterize molecules that may be involved in the parasite- vector interaction, we initiated a study of two molecules of L. chagasi, Flag and Sup, which belong to the small myristylated protein family (SMP's), that have previously been implicated in adhesion to the sandfly midgut. We amplifyed and sequenced the Flag gene of L. chagasi and, using multiple alignments, observed a high degree of conservation of this gene among Leishmania species. Recombinant protein Flag and Sup were produced and used for polyclonal antibodies production in rabbits. By Western Blot of total protein extract of some species of Leishmania, we observed that the anti-Flag monoclonal and polyclonal antibodies and the anti-Sup polyclonal antibody, recognized proteins in all the analyzed species, evidencing their conservation. Immunolocalization of these proteins showed that Flag is preferentially located in the flagellar pocket and flagellum in the promastigote form and in the flagellar pocket and internalized short flagellum in the amastigote, while Sup showed localization on the cell surface in both forms. Experiments of RT-PCR showed that there is a differential transcription of Flag and Sup between amastigotes and promastigotes. Flag has similar levels of expression in both evolutive forms while Sup is more expressed in amastigotes. Assays of ex-vivo inhibition with L. chagasi previously incubated with monoclonal antibodies anti-Flag or anti-Sup showed a significant reduction of the number of adhered parasites to the L. longipalpis midgut. In an attempt to identify a potential receptor for the parasite in the intestine of L. longipalpis, we observed the labelling of a protein of 27 kDa in the protein extract of the vector using biotinylated parasites in experiments of "ligand blot".

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral leishmaniasis is a neglected disease caused by Leishmania infantum in Brazil. The Ecto-NTPDase activities, described in various parasites including Leishmania, is involved in adhesion, infection and virulence of these parasites, functioning as a molecular mechanism able to modulate the host immune response and promoting the disease progression. E-NTPDases are enzymes that hydrolyze nucleotides tri and/or di-phosphate into monophosphate products. The extracellular metabolism of these nucleotides has an important role in infection by L. infantum and other intracellular pathogens. These nucleotides are powerful extracellular signals involved in various cellular processes, which are part of the purinergic signalling that modulates the immune response. The objective of this study was to evaluate the role of ecto-NTPDase activities in adherence and infection of L. infantum in human macrophages. The ecto-NTPDase activities of parasites were evaluated in four different media or conditions: (1) purine-depleted, (2) adenosine-enriched, (3) with inhibitor of ecto-NTPDase activities, and (4) with anti-E antibody NTPDase 1. The effects of these treatments on the adhesion and infection of these parasites in human macrophages were investigated. Immunolocalization of the E-NTPDase in the membrane of L. infantum was also evaluated. The ecto-nucleotidase activity is modulated according to the availability of adenosine in the medium. Parasites cultivated in a purine-depleted medium showed increased hydrolytic capacity of nucleotides and higher infectivity. Parasites grown in adenosine-enriched medium had lower ecto-nucleotidase activity and infectivity. Growing parasites with an inhibitor of Ecto-NTPDase activities led to an increase in the adherence of Leishmania to non-phagocytic cells. E-NTPDase enzymes responsible for the hydrolysis of nucleotides are present in the membrane of L. infantum. The higher hydrolysis capacity is associated with increased adhesion capacity and infection of these parasites in human macrophages. / A Leishmaniose visceral é uma doença negligenciada causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A atividade ecto-nucleotidásica descrita em vários parasitos incluindo Leishmania sp está associada à nutrição, adesão, infecção e virulência destes, funcionando como um mecanismo molecular capaz de modular a resposta imune do hospedeiro, favorecendo a progressão da doença. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou di-fosfatados em seus produtos monofosfatados. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos tem um papel importante na infecção por L. infantum e outros patógenos intracelulares. Estes nucleotídeos extracelulares são potentes sinalizadores envolvidos em vários processos celulares, incluindo a sinalização purinérgica que está relacionada à modulação da resposta imune. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da atividade ecto-nucleotidásica em L. infantum na adesão e infecção de macrófagos humanos. Avaliação da atividade ecto-nucleotidásica de parasitos crescidos em meio depletado de purina, meio enriquecido com adenosina, incubados previamente com inibidor da atividade NTPDásica, ou na presença do anticorpo Anti E-NTPDase 1 e investigar os efeitos desses tratamentos na adesão e infecção desses parasitos em macrófagos humanos. A atividade ecto-nucleotidásica dos parasitas foram avaliadas em quatro condições diferentes: (1) na meio depletado de purina, (2) meio enriquecido com adenosina, (3) com o inibidor da atividade ecto-nucleotidásica, e (4) incubada com anticorpo anti-E NTPDase 1. foram investigados os efeitos desses tratamentos sobre a adesão e infecção destes parasitas em macrófagos humanos. Imunodetectamos a presença de E-NTPDases presentes na membrana de L. infantum, e comparamos a atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. infantum. A atividade ecto-nucleotidásica, é modulada de acordo com a disponibilidade de adenosina do meio, parasitos cultivados em meio depletado de purina apresentaram o aumento da capacidade hidrolítica de nucleotídeos, e maior capacidade infectiva, os parasitos cultivados em meio suplementado com adenosina apresentaram uma menor atividade ecto-nucleotidásica e uma redução de 30% na capacidade infectiva. O aumento da atividade ecto-nucleotidásica levou a um aumento na adesão em células não fagocíticas. As enzimas E-NTPDases estão presentes na membrana de L. infantum. Concluímos que atividade ecto-nucleotidásica está associada a maior capacidade de adesão e infecção destes parasitos in vitro.

Visceral leishmaniasis or kala-azar is a zoonotic disease of domestic and wild canids, caused by the protozoan Leishmania chagasi and transmitted between dogs and man by the vector Lutzomyia longipalpis. The purpose of this research was to analize the spatial distribution of human and canine cases of visceral leishmaniasis in Aracaju, Sergipe from 2005 to 2012; characterize a nitric oxide resistant and susceptible isolates of L. chagasi from dogs in Aracaju, performing proteomic analysis of it by bidimensional electrophoresis and checking their interaction between dog and fox macrophages. In the analysis of the spatial distribution of the disease during the study period, there were 2060 canine and 110 human cases. It was found that the neighborhoods, Zona de Expansão and Mosqueiro, peripheral areas with lower population densities, recent occupation, poor urban infrastructure, had a number of significant human and canine cases. In Dezoito do Forte, Santos Dumont and America neighborhoods, were isolated nitric oxide resistant Leishmania in dogs and in humans, which could confirm the dog as a source of infection for humans and maybe could confirmation that disease in dogs precedes the occurrence of the disease in humans. Infection of fox macrophages by strains of L. chagasi, revealed that the macrophages control the infection rapidly regardless of whether the strain is resistant or not to nitric oxide. This result corroborates the fact that wild canids such as foxes, have an important role in the sylvatic cycle of visceral leishmaniasis, serving as a reservoir for the disease and rarely displaying clinical forms of the disease, unlike the domestic dog. Proteomic analysis was performed in promastigotes in logarithmic and stationary phase showing a difference in the expression of many proteins in both the promastigote growth phases. As an interesting fact we observed an over-expression of a cytosolic malate dehydrogenase and that it may probably be related to an intrinsic resistance of this isolate to nitric oxide. Related to resistance to nitric oxide, overexpression of trypanothione peroxidase was constant at all stages of the growth curve. Also observed was the overexpression of a calpain that may be responsible for inducing greater susceptibility to antimonials and lower susceptibility to miltefosine. / A leishmaniose visceral (LV) ou calazar é uma zoonose de canídeos silvestres e domésticos, causada pelo protozoário Leishmania chagasi e transmitida entre os canídeos e destes ao homem pelo vetor Lutzomyia longipalpis. Os objetivos deste estudo são analisar a distribuição temporo-espacial de casos de leishmaniose visceral canina e humana em Aracaju, Sergipe de 2005 a 2012; avaliar e comparar a regulação de macrófagos de cão e de raposas na infecção por isolados de L. chagasi através do índice de infecção de macrófagos, e realizar análise proteômica das fases de crescimento logarítmica e estacionária de promastigotas de isolados de L. chagasi resistentes e susceptíveis ao óxido nítrico, através da técnica de eletroforese bidimensional. Na análise da distribuição espacial da doença aconteceram 2060 casos caninos e 110 casos humanos. Foi verificado que os bairros da Zona de Expansão e Mosqueiro, áreas periféricas, com mais baixas densidades populacionais, ocupação recente, baixa renda e infraestrutura urbana pouco presente, tiveram um número de casos caninos e humanos expressivos. Nos bairros Dezoito do Forte, Santos Dumont e América, foram isoladas Leishmania resistentes ao óxido nítrico de cães e humanos, o que poderia confirmar o cão como fonte de infecção para o homem e, talvez, uma confirmação que a doença em cães pode preceder a ocorrência da doença em humanos. A infecção de macrófagos de raposa por cepas de L. chagasi resistentes e susceptíveis ao óxido nítrico, revelou que esses controlam rapidamente a infecção independentemente se a cepa é resistente ou não ao óxido nítrico. Este resultado corrobora o fato de que os canídeos silvestres, como as raposas, têm um papel importante no ciclo silvestre da leishmaniose visceral, servindo de reservatório para a doença e raramente apresentando a forma clínica da doença, diferente do cão doméstico. Foi realizada a análise proteômica de promastigotas em fase logarítmica e em fase estacionária revelando uma diferença na expressão de várias proteínas em ambas as fases de crescimento do promastigota. Como fato mais interessante observou-se um aumento acentuado na expressão de uma malato desidrogenase citosólica e que provavelmente apresenta relação com a resistência intrínseca deste isolado ao óxido nítrico. Relacionada com a resistência ao óxido nítrico, um aumento na expressão da tripanotiona peroxidase foi constante em todas as fases de curva de crescimento. Também foi observado um aumenta na expressão de uma calpaína que poderia ser responsável por induzir susceptibilidade maior aos antimoniais e menor susceptibilidade à miltefosina.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmaniasis is a complex of parasitic diseases caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted to humans and other vertebrate hosts through the bite of an infected phlebotomine insect. Currently, all drugs used in the treatment of this disease have low efficacy, high toxicity and are associated with parasitic resistance. In this sense, scientific research that indicates a new compounds with leishmanicidal activity are quite promising. The objective of this study was to evaluate in vitro the leishmanicidal activity of the crude ethanol extract of C. blanchetianus on L. amazonensis and L. infantum as well as their toxic and immunomodulator effect on murine macrophages. Promastigotes in the logarithmic growth phase were subjected to treatment with different concentrations of the extract for 24 and 72 hours at 26ºC, and the viability was measured by the method of Alamar Blue . A greater inhibition was observed in L. amazonensis with an IC50 of 73.6 μg/ml in 24 hours of incubation and 42.6 μg/ml at 72 hours. In L. infantum extract showed an IC50 of 208.7 μg/ml in 24 hours and 108.9 μg/ml at 72 hours. Regarding the reduction of viability, L. amazonensis showed a death percentage of 68.8% with 100 μg/ml of the extract after 24 hours of treatment and approximately 100% after 72 hours, whereas for L. infantum this level of inhibition was not seen with 250 μg/ml of the extract. For the analysis of antiamastigota activity, infected macrophages were treated with different concentrations of the extract and incubated for 72h at 37° C, and the rate of infection was determined by staining method with hematologic pigment and counts in optical microscopy. It was found a higher dose-dependent inhibition in L. amazonensis with an IC50 of 3.10 μg/ml. In L. infantum there was a lower activity of the extract which present an IC50 of 8.83 μg/ml. At lower concentration tested (3 μg/ml) there was a reduction in the viability of L. amazonensis around 44%, while in L. infantum, this level of inhibition was only observed with 7 μg/ml of extract. The cytotoxicity was performed on murine macrophages incubated with different concentrations of the extract for 72 hours at 37°C and the viability was measured by Alamar Blue method. The LD50 observed was 83.79 μg/ml and the selectivity index calculated was 27 to L. amazonensis and 9.5 for L. Infantum, revealing a higher toxicity of the extract in the parasites than in macrophages.Treatment with the extract not modulated the macrophage for nitric oxide synthesis, as verified by Griess reaction. However, interfered in the morphology of promastigote forms, being observed parasites with a rounded body and/or double scourge. Therefore, the data presented in this study indicate that the ethanol extract of C. blanchetianus presents leishmanicidal activity on promastigote and amastigote forms of L. amazonensis and L. infantum, being more effective against the species L. amazonensis, especially on the amastigote form, without causing, however, toxicity to the host cell. / A leishmaniose é um complexo de doenças parasitárias causadas por protozoários do gênero Leishmania e transmitidas ao ser humano e outros hospedeiros vertebrados por meio da picada de um inseto flebotomíneo infectado. Atualmente, todos os medicamentos utilizados no tratamento dessa doença apresentam baixa eficácia, alta toxicidade e estão associados à resistência parasitária. Nesse sentido, pesquisas científicas que indiquem novos compostos com atividade leishmanicida são bastante promissoras. O objetivo deste trabalho foi avaliar in vitro a atividade leishmanicida do extrato etanólico bruto de C. blanchetianus sobre L. amazonensis e L. infantum, bem como o seu efeito tóxico e imunomodulador sobre macrófagos murinos. Promastigotas na fase logarítmica de crescimento foram submetidos ao tratamento com diferentes concentrações do extrato por 24 e 72 horas a 26ºC, e a viabilidade foi mensurada por meio do método de Alamar Blue . Uma maior inibição foi vista em L. amazonensis com um IC50 de 73,6 μg/ml em 24 horas de incubação e de 42,6 μg/ml em 72 horas. Em L. infantum o extrato apresentou um IC50 de 208,7 μg/ml em 24 horas e de 108,9 μg/ml em 72 horas. Em relação à redução da viabilidade, L. amazonensis apresentou um percentual de morte de 68,8%, com 100 μg/ml do extrato, em 24 horas de tratamento e aproximadamente 100% em 72 horas, enquanto que em L. infantum este nível de inibição só foi visto com 250 μg/ml do extrato. Para a análise da atividade antiamastigota, macrófagos infectados foram tratados com diferentes concentrações do extrato e incubados por 72h a 37ºC, e o índice de infecção foi determinado por coloração com corante hematológico e contagem em microscopia óptica. Verificou-se uma inibição dose-dependente maior em L. amazonensis com um IC50 de 3,10 μg/ml. Em L. infantum houve uma menor atividade do extrato que apresentou um IC50 de 8,83 μg/ml. Na menor concentração testada (3 μg/ml) houve uma redução na viabilidade de L. amazonensis por volta de 44%, enquanto que em L. infantum, este nível de inibição só foi observado com 7 μg/ml do extrato. A avaliação da citotoxicidade foi realizada em macrófagos murinos, incubados com diferentes concentrações do extrato por 72h a 37ºC e a viabilidade foi mensurada pelo método de Alamar Blue . O LD50 observado foi de 83,79 μg/ml e o Índice de Seletividade calculado foi de 27 para L. amazonensis e 9,5 para L. Infantum, revelando uma maior toxicidade do extrato nos parasitos do que nos macrófagos. O tratamento com o extrato não modulou o macrófago para a síntese de óxido nítrico, como verificado pela Reação de Griess. Contudo, interferiu na morfologia das formas promastigotas, sendo observados parasitos com corpo arredondado e/ou flagelo duplo. Portanto, os dados apresentados nesse estudo indicam que o extrato etanólico de C. blanchetianus apresenta atividade leishmanicida sobre as formas promastigota e amastigota de L. amazonensis e L. infantum, sendo mais efetivo frente à espécie L. amazonensis, principalmente sobre a forma amastigota, sem causar, no entanto, toxicidade à célula hospedeira.