Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Janaina de Cassia Orlandi Sardi / Banca: Gil Benard / Resumo: A interação fungo-hospedeiro resulta em um processo complexo cujo conhecimento permite melhor entendimento da patogênese das micoses sistêmicas. Espécies de Paracoccidioides são agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), doença progressiva, crônica e sistêmica, geograficamente confinada na América Latina. O fungo é termodimórfico e a infecção ocorre após a inalação de conídios ou fragmentos de hifas, que ao entrarem em contato com o hospedeiro podem ser transformadas em formas leveduriformes. Esse evento é importante para o estabelecimento da PCM, associado a fatores ligados ao fungo bem como ao hospedeiro. A virulência fúngica é descrita como um evento altamente complexo onde em diferentes estágios da infecção ocorre a expressão de múltiplos genes, podendo estar fortemente associados ao estabelecimento da doença. A adesão e a sobrevivência no interior do hospedeiro são extremamente importantes para o estabelecimento da patogênese. Alguns genes de Paracoccidioides spp se apresentam diferencialmente expressos durante a transição dimórfica do fungo, apresentando baixos níveis de expressão na forma miceliar quando comparadas com a forma leveduriforme, sugerindo que estes possivelmente seriam fatores na composição de estratégias moleculares que P. brasiliensis utiliza para morfo-adaptação e sobrevivência no hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão de genes relacionados a alguns dos fatores de virulência de P. brasiliensis e P. lutzii na fase miceliar e leveduriforme, visando verificar o nível de expressão no fungo bem como na interação com células fagocíticas e epiteliais. Para tanto foram realizados ensaios de infecção com P.brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (P01), nas fases miceliar e leveduriforme em células epiteliais pulmonares (MRC-5) e macrófagos alveolares (AMJ2-C11) utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Os genes eleitos para este estudo foram os ... / Abstract: The fungus - host interaction results in a complex process whose knowledge allows a better understanding of the pathogenesis of systemic mycoses. Paracoccidioides species are causative agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a progressive, chronic and systemic disease , geographically confined to Latin America. The fungus is thermally and infection occurs after inhalation of conidia or hyphal fragments, which on contact with the host can be transformed into yeast forms. This event is important for the establishment of PCM besides other factors related to the host-fungus interaction. The fungal virulence is described as a highly complex event that enables the expression of multiple genes of the fungus in different stages of infection and can be strongly associated with the development of the disease. Adherence and survival within the host are extremely important for the establishment of pathogenesis. Paracoccidioides spp differentially expressed some genes during the dimorphic fungus transition, having low expression levels in the mycelial form compared with yeast-form, suggesting that these factors were likely to be in the composition of molecular strategies of P. brasiliensis that uses to morpho- adaptation and survival in the host. The aim of this study was to compare the gene expression of the some virulence factors of Paracoccidioides species by real-time PCR. For the assays, the infection was performed with the yeast and mycelial phase of P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (P01) in pulmonary epithelial cells (MRC-5) and alveolar macrophages (AMJ2 -C11) using RT- PCR. The genes chosen for this study were those which express the 43 kDa glycoprotein (gp43), enolase, glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), 14-3-3 (30kDa), phospholipase, protease and hemolysin (Duf gene). The results showed a significant increase in the levels expression of enolase, gp43 and GAPDH in the yeast phase of P. brasiliensis. Enolase was more ... / Mestre

Orientador: Cecília Laluce / Banca: Maria Lucia Gonsales da Costa Araujo / Banca: Juliana Audi Giannoni / Resumo: Diversos estados fisiológicos têm sido descritos para células de levedura durante o cultivo, como células lesionadas, células mortas e células viáveis, mas não cultiváveis (VBNC). No entanto, pouca atenção ainda é dada à formação de células viáveis, mas não cultiváveis em leveduras e seus impactos sobre o processo de fermentação. O estado VBNC, também conhecido como estado de "dormência celular" pode ser definido como um estado fisiológico em que os micro-organismos não são capazes de crescer em meios bacteriológicos, mas apresentam características de células vivas. Fatores químicos e ambientais têm sido relatados para induzir um estado VBNC, incluindo a falta de nutrientes, temperaturas extremas, concentrações osmóticas e oxigênio. As células de levedura no estado VBNC podem exercer influencias sobre o rendimento de biocombustível gerado no final do processo. As leveduras industriais utilizadas neste estudo foram coletadas em uma usina sucroalcooleira localizada na cidade de Américo Brasiliense-SP-Brasil. Para fornecer evidências da existência de um estado VBNC em leveduras investigou-se a capacidade das células ao entrarem no estado VBNC, aplicando estresse térmico (40°C) e osmótico (30% de sacarose). Populações viáveis foram monitoradas utilizando o corante azul de metileno, e as populações cultiváveis foram identificadas por semeadura em meio de cultura. Todos os procedimentos foram realizados em triplicata, para todas as amostras e os dados amostrais foram submetidos à análise de variância (ANOVA). Após 48 horas no período de tempo em estresse, a comparação entre as células viáveis e as células cultiváveis demonstrou a presença de células viáveis, mas não cultiváveis. Além disso, a remoção do estresse permitiu que as células fossem novamente capazes de crescer, fornecendo evidências da existência de um estado VBNC em leveduras. / Abstract: Several physiological conditions have been described for yeast cells during cultivation, such as injured cells, dead cells and viable cells, but not culturable (VBNC). However, little attention is still given to the formation of viable cells, but not cultivable in yeast and its impact on the fermentation process. The VBNC state, also known as state of "numbness cell" can be defined as a physiological condition in which the microorganisms are not able to grow on bacteriological media, but that present characteristics of living cells. Chemical and environmental factors have been reported to induce VBNC state, including a lack of nutrients, temperature extremes, osmotic concentration and oxygen. The yeast cells in the VBNC state may influence the yield of biofuel generated at the end of the process. The yeasts used in this study were collected in a sugarcane mill located in Américo Brasiliense-SP-Brazil. To provide evidence of the existence of a state in yeast VBNC investigated the ability of cells to enter the VBNC state, applying heat stress (40°C) and osmotic (30% sucrose). Viable populations were monitored using the methylene blue dye, and cultivated populations were identified by inoculation in culture. All procedures were performed in triplicate for all samples and sample data were submitted to analysis of variance (ANOVA). After 48 hours the time of stress, the comparison between viable cells and culturable cells showed the presence of viable cells, but not culturable. Moreover, removal of stress the cells were allowed to grow again able, providing evidence for the existence of a VBNC state in yeast. / Mestre

Orientador: Ana Marisa Fusco de Almeida / Coorientador: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Edwil Aparecida de Lucca Gattás / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: Atualmente o Brasil possui uma estimativa de produção de bioetanol com a safra de 2013/14 de 27,17 bilhões de litros. Esta produção é derivada de um processo de fermentação das usinas sucroalcooleiras brasileiras e caracteriza-se atualmente como um processo semi-contínuo. A levedura Saccharomyces cerevisiae é a mais abrangente nos processos de fermentação, por ser adaptável aos diferentes ambientes, possuindo uma rica diversidade de perfis fenotípicos e genotípicos, evidenciando que as interações entre fatores ambientais e este organismo influenciam na identificação de características essenciais e específicas nos processos fermentativos. A construção de um banco de organismos relacionados com a produção de etanol é indispensável aos interesses de pesquisadores do programa Bioen da UNESP. Assim, é de fundamental importância a existência de uma coleção de linhagens de leveduras, com potencial fermentativo elevado. Em estudo anterior, desenvolvido por nosso grupo, foram selecionadas de uma usina brasileira duas linhagens (ZFC4 e ZFD4) com características potencialmente diferenciais no processo de produção de etanol. Com base nestes dados o objetivo deste estudo foi primeiramente analisar características genotípicas e fenotípicas das linhagens ZFC4 e ZFD4 para identificação de fatores genéticos funcionais por meio de sequenciamento do DNA e RNA global de nova geração Hiseq Ilumina e posteriormente, as linhagens selecionadas foram rastreadas por combinações com os padrões industriais (PE-2, CAT e SA-I), visando à seleção de associações sinérgicas promissoras no processo de fermentação para o setor sucroalcooleiro. Para tanto as associações destas linhagens foram avaliadas quanto ao crescimento celular, assimilação de açucares, tolerância à temperatura e ao etanol e capacidade fermentativa. Todas as combinações realizadas entre os padrões e as linhagens ZFC4 e ZFD4 foram sinérgicas para ... / Abstract: Brazil currently has an estimated production of bioethanol with crop 2013/14 from 27.17 billion liters. This production is derived from a fermentation process of Brazilian sugarcane mills and is characterized today as a semi-continuous process. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most comprehensive in fermentation processes, by being adaptable to different environments, having a rich diversity of phenotypic and genotypic profiles, showing that the interactions between environmental factors and influences in this organism identification of essential and specific features in the fermentative process. The construction of a bank of organisms related to ethanol production is vital to the interests of researchers Bioen UNESP program. Thus, it is fundamental to the existence of a collection of yeast strains with high fermentation potential. In a previous study conducted by our group, were selected from a Brazilian plant two strains (ZFC4 and ZFD4) with potentially differential characteristics in the ethanol production process. Based on these data, the aim of this study was first to analyze genotypic and phenotypic characteristics of strains ZFC4 and ZFD4 to identify functional genetic factors through sequencing DNA and RNA global new generation HiSeq Ilumina and subsequently selected strains were screened for combinations with industry standards (PE-2, CAT and SA-I), aiming at selecting promising synergistic associations in the fermentation process for the alcohol sector. For both the associations of these strains were evaluated for cell growth, assimilation of sugars, tolerance to temperature and ethanol and fermentative capacity. All combinations made between the patterns and ZFC4 and ZFD4 strains were synergistic for all parameters analyzed, especially in relation to resistance to high ethanol concentrations and temperature. Importantly, our lines alone were as effective as the fermentation patterns, however these in combination ... / Mestre

Orientador: Débora Colombi / Coorientador: Paulo Eduardo Martins Ribolla / Banca: Maria da Graça Stupiello Andrieta / Banca: Sandra Regina Ceccato Antonini / Banca: Celso Marino / Banca: Eduardo Bagagli / Resumo: O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de álcool de cana de açúcar, sendo responsável por uma produção anual de aproximadamente 27 bilhões de litros. O álcool é produzido através da fermentação do caldo de cana-de-açúcar e/ou melaço por células de levedura da espécie Saccharomyces cerevisiae. Embora, atualmente, muitas indústrias utilizem cepas selecionadas de S. cerevisiae como iniciadoras, a condição não estéril dos substratos torna este processo sujeito a constantes contaminações por bactérias e linhagens de leveduras nativas de Saccharomyces cerevisiae e não-Saccharomyces cerevisiae. Estas leveduras nativas dominam rapidamente a população iniciadora do processo por serem cepas genética e fisiologicamente adaptadas às condições daquele ambiente. Tais leveduras podem prejudicar o processo fermentativo, porém, algumas entre elas, podem apresentar características positivas. Atualmente no Brasil várias indústrias acompanham a dinâmica populacional da fermentação por cariotipagem. No entanto este método é dispendioso, demorado e pouco acurado quando se compara a outros métodos moleculares mais sensíveis. Este trabalho se propõe a utilizar a técnica de PCR microssatélite para diferenciar linhagens de leveduras presentes no processo de fermentação em usinas de álcool, acompanhar a dinâmica populacional de uma usina durante uma safra e estudar a diversidade genética e a estrutura populacional das cepas nativas presentes no processo industrial de produção do álcool combustível. O trabalho também visa investigar a presença de single nucleotide polymorphism (SNP) ou mutações de base única nas cepas nativas de Saccharomyces cerevisiae isoladas deste processo e relacioná-los à capacidade de floculação e à tolerância ao ambiente industrial estressante. Durante o trabalho... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Brazil is the major world producer of ethanol from sugar cane, producing about 27 billion liters of ethanol a year. Alcohol is the result of sugar cane juice/ molasses fermentation by Saccharomyces cerevisiae yeast cells. Although many sugar mills in Brazil currently start the fermentation process by inoculating selected Saccharomyces cerevisiae commercial strains, it often occurs the incoming of bacteria, native Saccharomyces and non-Saccharomyces yeast strains because of its unsterile condition. In this process these indigenous strains outnumber the population inoculated and those which are genetically and physiologically better adapted tend to dominate. These strains may either show desirable fermentative qualities or not. The method currently used in Brazil to investigate sugar cane must population is electrophoresis karyotyping, however this method is expensive, time consuming and not very accurate when compared with other more sensitive molecular methods. This work aimed at using microsatellite PCR method for differentiating yeasts strains from alcohol plants fermentation process, monitoring population dynamic of a bioethanol fuel plant during a harvest season and studying the genetic diversity and population structure of native strains from bioethanol production industrial process. This work also aimed at investigating SNPs occurrence among Saccharomyces cerevisiae native strains that could be related with flocculation and stressful industrial environment tolerance. Twenty- four microsatellite loci were tested and 12 of them were polymorphic and capable of differentiating the commercial selected strains BG-1, CAT-1, PE-2 e SA-1 from each other and also capable of screening indigenous strains from the inoculated ones. Four loci were used for monitoring Usina São Manoel harvest season during 2008 where were observed... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Juan Lucas Argueso / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-16T23:40:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Galzerani_Felipe_M.pdf: 2436643 bytes, checksum: ea790894d475c5a1b97c1d97f93475fa (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A crise energética e a preocupação ambiental têm feito do etanol uma fonte de energia renovável atrativa. Brasil e Estados Unidos têm se destacado nos últimos anos como os dois maiores produtores deste importante recurso energético. O etanol brasileiro é produzido pela fermentação da sacarose da cana-de-açúcar pela levedura Saccharomyces cerevisiae. Cepas laboratoriais de S. cerevisiae estão entre os organismos mais bem caracterizados pela biologia moderna. Durante décadas elas passaram por uma série de modificações genéticas com a criação de mutações em genes marcadores que atualmente viabilizam procedimentos de manipulação genética. Em contraste, o processo de fermentação industrial é realizado por cepas selvagens, mas que permanecem ainda inexploradas geneticamente, dificultando a aplicação de técnicas de manipulação genética. O presente estudo teve como objetivo "domesticar" a linhagem JAY270, um isolado da cepa industrial Pedra-2, tornando-a de fácil manipulação genética, plataforma para a introdução de características que melhorem o desempenho dela nas indústrias. A estratégia de domesticação foi baseada no sistema de manipulação Delitto Perfetto, para que o seu genoma altamente heterozigoto fosse preservado e assim mantivesse as suas características de interesse industrial. Dois cassetes integrativos com marcas de seleção diferentes foram construídos a partir de plasmídeos e utilizados na deleção das duas cópias do gene URA3 da levedura. O fragmento homólogo de reparo foi usado na retirada das marcas genéticas de seleção evitando a permanência de quaisquer resquícios de transgenia. Ao final do processo de domesticação a JAY270 passou a apresentar auxotrofía para uracila, mantendo intacta a sua arquitetura genômica heterogênea e, assim, o seu vigor híbrido, os quais têm sido relacionados à boa atividade fermentativa da linhagem industrial. Embora tenha sido um processo bastante laborioso, este resultado deverá facilitar novos estudos que necessitem de técnicas de manipulação genética como a do Delitto Perfetto para melhorar características fermentativas da linhagem industrial. / Abstract: The energy crisis and the environmental concern have made ethanol an attractive renewable energy source. Brazil and the United States have been, in the last years, the largest producers of this important energy resource. Brazilian ethanol is produced through fermentation of sucrose from sugar cane by Saccharomyces cerevisiae yeasts. Laboratory strains of S. cerevisiae are among the most well characterized organisms in modern biology. For decades they have undergone a series of genetic changes with the creation of mutations in markers genes that now enable current procedures for genetic manipulation. In contrast, the industrial fermentation process is carried out by wild strains that remain as of yet genetically unexplored hindering the application of genetic engineering techniques. The objective of the present study was to domesticate the JAY270 diploid strain, which is an isolate of the industrial yeast Pedra-2, simplifying its genetic manipulation into a biological platform for the introduction of characteristics that improve its performance in industries. The genetic manipulation strategy was based on the Delitto Perfetto procedure to preserve the highly heterogeneous genome of the JAY270 strain including its genetics properties related to characteristics of industrial interest. Two integrative cassettes containing different genetic markers were constructed from plasmids to be used in deletion of both copies of the URA3 gene of the JAY270 strain. A repair homologous fragment was employed in the removal of the selective markers used during the manipulation steps, avoiding any remaining transgenic traces. The auxotrophy to uracil was achieved after complete deletion of the URA3 genes from the JAY270 diploid genome. The heterogeneous genomic architecture of the JAY270 was maintained as well as its hybrid vigor related to fermentative characteristics of industrial interest. The auxotrophic yeast generated in this study will facilitate the application of genetic engineering techniques such as Delitto Perfetto to achieve improvement in the industrial fermentation traits of the wild strain. / Mestrado / Genetica de Microorganismos / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Jose Francisco Hofling, Marta Cristina Teixeira Duarte / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-06T08:53:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Furletti_VivianFernandes_M.pdf: 1126113 bytes, checksum: d4a24df57fea2a22c72726fc7f3e1ea6 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A suscetibilidade a antifúngicos foi avaliada para espécies de Candida spp isoladas de três diferentes sítios da cavidade oral de 19 pacientes com doença periodontal, a saber: bolsa periodontal, mucosa bucal e sulco gengival. Um total de 140 amostras de leveduras foram isoladas e identificadas por métodos comumente utilizados em Micologia. Destas, 105 foram identificadas como C. albicans, 16 como C. tropicalis, 5 como C. parapsilosis, 4 como C. krusei, 3 como C. famata, 3 como C. norvegensis, 3 como C. dubliniensis e 1 como C. lusitaniae. As leveduras foram testadas frente aos antifúngicos fluconazol, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B de acordo com a padronização do NCCLS. Dentre as amostras de C. albicans, 88% apresentaram susceptibilidade dependente da concentração (SDC) e 3,6% resistência à pelo menos um antifúngico azólico. Entre as outras espécies, 57% apresentaram SDC e 42,8% resistência a pelo menos um dos azólicos testados. Quanto a anfotericina B, 90% das C. albicans e 74,3% das não-albicans foram resistentes a este antifúngico. Não houve ocorrência de resistência para o fluconazol e apenas 3,6% das C. albicans e 40% das ¿não-albicans¿ foram SDC para este antifúngico. Os valores da Concentração Inibitória Mínima CIM50 e CIM90 dos antifúngicos azólicos para as amostras de C. albicans foram inferiores aos encontrados para as demais espécies. Para a anfotericina B, os valores de CIM50 e CIM90 não foram diferentes entre C. albicans e demais espécies. Apesar do baixo índice de resistência, foi observada elevada ocorrência de SDC para itraconazol e cetoconazol. Foi possível concluir que pacientes com doença periodontal apresentaram níveis de colonização por Candida spp relevantes, principalmente na mucosa bucal e bolsa periodontal, com uma importante ocorrência de SDC e resistência aos antifúngicos testados, o que está de acordo com dados recentes sobre a diminuição da sensibilidade a antifúngicos entre espécies de Candida / Abstract: The susceptibility to antifungal was evaluated for Candida spp isolated from three different sites of the oral cavity from 19 patients with periodontal illness, known as: periodontal pocket, oral mucosa and ridge gengival. A total of 140 yeasts were isolated and identified by classical methods in Micology. From this, 105 were identified as C. albicans, 16 as C. tropicales, 5 as C. parapsilosis, 4 as C. Krusei, 3 as C. famata, 3 as C.norvegensis, 3 as C.dubliensis and 1 as C. lusitaniae. The antifungal Fluconozole, Itraconazole, Ketoconazole and Anfotericin B were tested against the yeasts according to the NCCLS padronization. Among the samples of C. albicans, 88% showed susceptibility depending on the concentration (SCD) and 3,6% were resistant to at least one antifungal azoles studied. Among other species, 57% presented SDC and 42,8% showed resistance to at least one of the antifungal azoles tested. Regarding to Anfotericin B, 90% of the C. albicans isolates and 3% of the ¿non- albicans¿ showed resistance to this antifungal drug. There was no occurrence of resistance to the Fluconozale and only 3,6% of C. albicans and 40% of the ¿non-albicans¿ were SDC to this antifungal. The values of Minimum Inhibitory Concentration (MIC50 and MIC90) of the antifungal azoles to the samples of C. albicans were inferior to the ones found in the other species. For the Anfoterecin B, the values of MIC50 and MIC90 were not different among C. albicans and the other species. Besides the low percentage indice of resistance, it was observed high occurrence of SDC to Itraconazole and Cetoconazole. Patients with periondontal illness presented relevant levels of colonization by Candida spp, mainly at the oral mucosa and periodontal pocket showing important occurrence of SDC and resistance against the antifungals drugs tested according to the recent literature data about the decrease of sensibility to antifungals among Candida species / Mestrado / Microbiologia e Imunologia / Mestre em Biologia Buco-Dental

Orientador: Pilar Rodriguez de Massaguer / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-03T09:33:57Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marcolino_VanessaAparecida_M.pdf: 839024 bytes, checksum: 8221cbe35310ad99667b00c446ed7dc1 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O consumo de bebida de uva pasteurizada, pronta para beber, vem aumentando nos últimos anos no Brasil. No ano de 2001, o consumo nacional foi de 11 milhões de litros, enquanto que nos primeiros 9 meses de 2002 este valor já ultrapassou 17 milhões, segundo Tetra Pak (2002). Com intuito de melhorar a qualidade microbiológica do produto, desde o início de sua produção até o final da linha de processo, foi realizada esta pesquisa, com base na investigação da presença de bolores termoresistentes e não termoresistentes em bebida com pH: 3,0 e o Brix: 14, produzida a partir das variedades Ceiber e Concordia. As análises realizadas incluíram desde a matéria-prima até o produto final, além da verificação da microbiota fúngica após 3 meses de vida útil do produto, a fim de se obter um produto microbiologicamente estável sob condições de armazenamento e, portanto, seguro para o consumidor. A amostragem foi realizada num total de 9 pontos, da linha de processamento, em cada uma das 6 coletas. No período de 27/01/2002 a 03/03/2002, foram feitas análises de 6 lotes do produto. A metodologia empregada para quantificação de bolores termoresistentes foi a descrita por Beuchat & Pitt (1992) com modificações preconizadas por Baglioni (1998); já para bolores e leveduras comuns foram utilizadas as análises preconizadas pelo Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods (A.P.H.A.) e Splittstoesser et ai (1993). Durante as análises dos 6 lotes amostrados, foram isoladas 25 linhagens fúngicas dentre as quais 24 apresentaram comportamento totalmente distinto, vindo posteriormente a confirmar sua termoresistência, após aplicação de choques térmicos seletivos. Os lotes 2 e 3 mostraram maior nível de contaminação por bolores termoresistentes apresentando 4,8 e 3,5 esporos/100ml, respectivamente, mesmo assim, a incidência foi baixa em geral menor que 5 esporos/100ml em todos os lotes. O lote 1 foi o responsável pela maior parte dos isolados termoresistentes, com 48% de cepas, representando 12 fungos diferentes. A incidência de leveduras em todos os lotes, foi alta e semelhante entre lotes, apresentando média de 7,55 x 106 UFC/ml, na matéria prima. Com intuito de demonstrar maior capacidade de resistência térmica de esporos mais velhos, foram utilizados esporos com idade de 1 mês e 3 meses. Todos os isolados, de ambas as idades, foram submetidos a choques térmicos programados que variaram de 85°C/15 min a 115°C/15 mino O isolado mais termoresistente, com 1 mês de idade, sobreviveu a 100°C/55 min, e foi identificado como Neosartorya fischeri, com parâmetros de D95°c= 1,66 min e Z= 11,98° C. Já o isolado de idade de 3 meses sobreviveu a 11 0°C/1 O min e foi identificado também como Neosartorya fischeri, com parâmetros de D95°c= 1,96 min e Z= 16,29° C. Os parâmetros cinéticos foram obtidos por linearização de Alderton & Snell (1970) devido ao comportamento não logarítmico de ambos os fungos. O processamento foi capaz de eliminar a contaminação fungíca no produto final e não se detectou bolores em produto final e produto final após 90 dias de vida útil. Existe, porém, a possibilidade de que bolores como Neosartorya fischeri sejam capazes de permanecer viáveis após o processo de pasteurização utilizado pela maioria das indústrias processadoras de bebida de uva, que aplicam binômios que variam entre 90-92°C/30 seg, devido à sua grande capacidade de termoresistência / Abstract: In Brazil the consuption of ready to drink pasteurized grape juice has increased in the last few years. In 2001, the national consumption was 11 million liters, however, in the first nine months of 2002, this number exceeded 17 million liters (Tetra Pak, 2002). The aim of this study was to quantify the incidence of heatresistant and non heat-resistant molds in the production line of juice formulated from Ceiber and Concordia grapes (pH: 3,0 and 14°Brix). The analysis was carried out from the raw material up to the final product, and afier 3 months of shelf-life to obtain the microbiological security of the product. Nine (9) points from the processing line were sampled for each batch. Six (6) production batches were analyzed from January 2ih, 2002 to March 3rd, 2002. The method of Beuchat and Pitt (1992) was used to quantify the heatresistant molds with the modifications suggested by Baglioni (1998). Common molds and yeast were anayzed according to the Compendium of Methods for the Microbiplogical Examination of Foods (A.P.H.A.) (1992), and Splittstoesser et ai (1993). Twenty-five (25) mold strains were isolated from the 6 batches, of which 24 showed completely different bahavior. Heat-resistance was confirmed in ali of the 24 strains, afier selective heat shocks. Batches 2 and 3 showed greater contamination with heat-resistant molds, showing 4,8 and 3,5 spores/100ml respectively in the raw material, however in general the contamination levei with heat-resistant strains was low, normally less than 5 spores/100ml. Batch 1 was responsible for the greatest variety of strains, 48% of the total, equivalent to 12 different molds. The highest incidence of yeasts was observed in the raw material, with levels of up to 106 CFU/ml. To confirm the greater heat-resistance of older spores when compared with younger spores, the heat-resistance test was carried out with 1 month and 3 months old spores. Ali the iso/ates, of both ages, were submitted to programmed heat shocks from 85°C/15 min up to 115°C/15 mino The most heat-resistant 1 month old mold spore survived 100°C/55 min and was identified as Neosartorya fischeri with D95°c= 1,66 min and Z= 11,98° C. The most heat-resistant 3 months old mold survived 11 0°C/1 Omin and was also identified as Neosartorya fischeri with D95°c= 1,96 min e Z= 16,29° C. The kinects parameters were realized using Alderton & Snell (1970) methodology becouse both molds present non logaritmical behavior. The process used was able to eliminate the mold contamination and its presence was not detected in the final product or in the final product after 3 months of shelf life. Nevertheless, molds like Neosartorya fischeri may survive the juice pasteurization process of 90-92°C/30 seconds commonly used in industry, because of the high heat-resistance of this mold / Mestrado / Mestre em Ciência de Alimentos

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2015-11-06T14:41:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1116633 bytes, checksum: fc318cc7ff97c79f0496b3e69c56e3fa (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-06T14:41:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1116633 bytes, checksum: fc318cc7ff97c79f0496b3e69c56e3fa (MD5) Previous issue date: 2013-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A levedura Kluyveromyces marxianus tem sido considerada uma candidata hospedeira para a síntese industrial de biomoléculas. Apesar de seu potencial, são poucos os estudos que relatam a expressão de proteínas heterólogas utilizando esta levedura. Neste trabalho, foi relatado pela primeira vez, a expressão da proteína do vírus da dengue em K. marxianus. O gene que codifica a proteína não estrutural (NS1) do vírus da dengue-1 foi integrado no genoma da levedura K. marxianus UFV-3 no locus LAC4, utilizando um vetor integrativo adaptado projetado para expressão de proteínas recombinantes em Kluyveromyces lactis. O gene de dengue-1 NS1 foi otimizado utilizando os códons preferenciais para aumentar os níveis de expressão de proteínas em leveduras. O gene sintético foi clonado “in frame” com o peptídeo sinal (mating-α-factor) de K. lactis e o plasmídeo recombinante obtido foi utilizado para transformar K. marxianus UFV-3 por eletroporação. As células transformantes selecionadas em YPD (yeast extract peptone dextrose) contendo 200 ug mL-1 de geneticina foram mitoticamente estáveis. A análise das linhagens recombinantes por meio de RT-PCR e a detecção da proteína utilizando Dot-blot confirmou a transcrição e a expressão dos peptídeos extracelulares. Após a indução com galactose, a proteína NS1 foi analisada por SDS-PAGE e Western blot. A produção da proteína foi investigada sob duas condições: com pulso de galactose e biotina com intervalos de 24 horas durante 96 horas após a indução e sem pulso de galactose e biotina. A atividade proteolítica não foi detectada no sobrenadante das culturas. Nossos resultados indicam que células recombinantes de K. marxianus podem ser consideradas boas hospedeiras para a produção de proteínas do vírus de dengue, que têm um potencial para aplicações em diagnósticos. / The yeast Kluyveromyces marxianus has been considered a candidate host for industrial synthesis of biomolecules. Despite its potential, there are few studies reporting the expression of heterologous proteins using this yeast. Here, it was reported for the first time a dengue viral protein expression in K. marxianus. The dengue virus type 1 nonstructural protein 1 (NS1) was integrated into the K. marxianus UFV-3 genome at the LAC4 locus using adapted integrative vector designed for high-level expression of recombinant protein in Kluyveromyces lactis. The gene of dengue-1 NS1 was optimized using preferential codons to increase the levels of proteins expression in yeast. The synthetic gene was cloned in frame with K. lactis mating-α-factor signal peptide and the recombinant plasmid obtained was used to transform K. marxianus UFV-3 by electroporation. The transformants cells selected in Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) containing 200 μg mL-1 Geneticin were mitotically stable. The analysis of recombinant strains by RT-PCR technique and the protein detection using blot analysis have confirmed both transcription and expression of the extracellular peptides. After induction with galactose, the NS1 protein was analyzed by SDS-PAGE and immunogenic detection. The protein production was investigated under two conditions: with galactose and biotin pulse at 24 hours intervals during 96 hours of induction and without galactose and biotin pulse. Protease activity was not detected into the medium. Our results indicate that the constructed recombinant K. marxianus can be considered good host for the production of dengue virus proteins, which have a potential for diagnostic applications.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T13:45:39Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600665 bytes, checksum: ee26156d6dc7124f99efde31caf1f198 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T13:45:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 600665 bytes, checksum: ee26156d6dc7124f99efde31caf1f198 (MD5) Previous issue date: 2010-04-12 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / A permease de lactose de Kluyveromyces lactis, Lac12, media o transporte de lactose e o de galactose de baixa afinidade. Aqui é apresentado o estudo do efeito de fontes de carbono na internalização de Lac12 através do uso de linhagens contendo o gene quimérico LAC12-GFP. Quando células de K. lactis pré-cultivadas em galactose ou lactose foram transferidas para um novo meio, Lac12-GFP foi removida da membrana plasmática e localizada intracelularmente. Surpreendentemente, mesmo a presença de galactose ou lactose no novo meio de transferência causou essa internalização, e a resposta celular foi diferente para esse dois açúcares. Os resultados obtidos revelam que o processo de internalização é dependente do tipo de açúcar presente e de sua concentração. A internalização de Lac12-GFP causou redução nas taxas de captação de lactose[C14] e também foi observada em uma linhagem mutante Klsnf1; portanto, esse evento independe da atividade de KlSnf1. Evidências indicam que glicose-6-fosfato é o sinal intracelular, uma vez que a internalização foi induzida por 2-deoxiglicose, e a inibição da atividade da enzima fosfoglimutase por lítio impediu a internalização por galactose, mas não por lactose ou glicose. A internalização não ocorreu em 6-deoxiglicose, e, em ausência de síntese protéica, o evento foi irreversível. / Kluyveromyces lactis Lac12 permease mediates lactose and low-affinity galactose transports. In this study we have investigated the effects of carbon sources on internalization of Lac12 by using a LAC12-GFP fusion construct. When galactose- or lactose-grown cells are shifted to a fresh sugar medium, Lac12-GFP is removed from the plasma membrane and localized intracellularly. Surprisingly, even galactose or lactose in the new media caused the internalization, and cells responded differently to theses two sugars. Our results reveal that this process is dependent of sugar species and also sugar concentration. Lac12-GFP internalization causes reduction on [C14]lactose uptake rates and also occurs in a Klsnf1 mutant strain; thereby, it is independent of KlSnf1 activity. We suggest that glucose-6-phosphate is the intracellular signal, since internalization was induced by 2-deoxyglucose and inhibition of phosphoglucomutase by lithium prevented galactose- but not lactose- or glucose-induced internalization. Lac12-GFP internalization was not triggered by 6-deoxyglucose, and was irreversible in absence of protein synthesis.

Orientadores: Anete Pereira de Souza, Sindélia Freitas Azzoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-26T11:41:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 CrivelenteHorta_MariaAugusta_D.pdf: 3752680 bytes, checksum: 5c6614f862b61ef2ba585e9b45933597 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Buscando contribuir com o desenvolvimento da tecnologia de produção do etanol de segunda geração, o presente estudo analisa o transcriptoma de T. harzianum IOC-3844 utilizando técnicas de sequenciamento high-thoughput. O principal objetivo dessas análises foi identificar, caracterizar e catalogar os transcritos expressos por T. harzianum relacionados com a degradação de substratos complexos, como o bagaço de cana de açúcar, revelando o conjunto de genes envolvidos na degradação da biomassa. A análise do transcriptoma do fungo Trichoderma harzianum sob condições que induzem a degradação da biomassa permitiu a identificação de sequências de genes potencialmente eficazes no processo de biodegradação, uma etapa essencial à compreensão do processo de hidrólise enzimática. O sequenciamento resultou em 246 milhões de sequências com 72 pb, o que corresponde a 14,7 GPB analisados. Após a montagem , 32.494 contigs foram gerados, submetidos à identificação e classificados de acordo com sua identidade. Todas as sequências de contigs foram comparados com o banco de dados do NCBI, Gene Ontology (GO terms), Enciclopédia de Genes Kyoto (KEGG), Carbohydrate Active-Enzymes (CAZYmes). Foram identificados 487 CAZymes no transcriptoma, inclusive aquelas ligadas as reações químicas de despolimerização de celulose e hemicelulose. As sequências classificadas como atividade catalítica (6.975) e atividade reguladora (143) podem estar envolvidas com esse tipo de reação.A análise permitiu definir o principal conjunto de genes envolvidos na degradação da celulose e de hemicelulose do T. harzianum , e genes acessórios relativos à despolimerização de biomassa. Uma análise dos níveis de expressão permitiu determinar os conjuntos de genes diferencialmente expressos em diferentes condições de cultivo. Os resultados obtidos acrescentam conhecimento sobre a constituição do genoma, as atividades de expressão gênica do fungo Trichoderma harzianum e fornece informações importantes a respeito dos mecanismos genéticos de degradação de biomassa que o fungo utiliza. As informações obtidas poderão ser utilizadas para outras espécies de fungos filamentosos com potencial para a biodegradação / Abstract: In order to contribute to the development of second-generation ethanol technology, this study analyzes the transcriptome of T. harzianum IOC-3844 using high-thoughput sequencing techniques. The main objective of this analysis was to identify, characterize and catalog the transcripts expressed by T. harzianum related to the degradation of complex substrates such as sugar cane bagasse, revealing the set of genes involved in the degradation of biomass. The analysis of the transcriptome of the fungus Trichoderma harzianum under conditions that induce the degradation of biomass allowed the identification of genes potentially effective in the biodegradation process, an essential step for understanding the enzymatic process. Sequencing resulted in 246 million sequences with 72 bp, which corresponds to 14.7 GBP analyzed. After assembly, 32,494 contigs were generated, identified and classified according to their identity. All sequence contigs were compared with NCBI database, Gene Ontology (GO terms), Kyoto Encyclopedia of Genes (KEGG), Carbohydrate Active-Enzymes (CAZYmes). 487 CAZymes were identified in the transcriptome, including those related to reactions of cellulose and hemicellulose depolymerization. Sequences classified as catalytic activity (6,975) and regulatory activity (143) may be involved with this type of reaction. This analysis define the set of genes involved in the degradation of cellulose and hemicellulose of T. harzianum, and accessories genes related to depolymerization of the biomass. An analysis of expression levels was used to calculate the set of differentially expressed genes in different culture conditions. The results add to knowledge about the composition of the genome and gene expression activity of the fungus Trichoderma harzianum, and provides important information regarding the genetic mechanisms of biomass degradation that the fungus uses. The information obtained may be used for other species of filamentous fungi with potential for biodegradation / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutora em Genética e Biologia Molecular