Orientador: Hélio José Montassier / Banca: João Pessoa Araujo Júnior / Banca: Valéria Marçal Félix de Lima / Banca: Edison Luiz Durigon / Banca: Jesus Aparecido Ferro / Resumo: O vírus da Bronquite infecciosa (VBI) é um Coronavírus aviário que infecta aves domésticas de corte e postura, ocasionando grandes perdas econômicas na indústria avícola. Dada a natureza altamente contagiosa e aguda da doença, há uma grande necessidade do desenvolvimento de métodos diagnósticos que possam ajudar na detecção e/ou caracterização de estirpes variantes do VBI. Sendo assim, para auxiliar no diagnostico laboratorial da infecção, foi construída uma biblioteca de fragmentos de anticorpos monoclonais pela técnica de Phage-display. Para tanto, após a imunização de galinhas com a estirpe vacinal H120, foi extraído o RNA total do baço das aves imunizadas e amplificadas as cadeias variáveis leve e pesada que foram unidas por linker, originando o fragmento gênico de cadeia única scFv. Após a realização de três ciclos de seleção foram obtidos 400 clones que foram avaliados em ensaios de ELISA e Western blotting para averiguação da especificidade dos mesmos frente às proteínas da estirpe H120. Após realização dos testes foram selecionados dois clones, um que apresentou grande reatividade para com a proteína de nucleocapsídeo (N) (scFv-N) e o outro com reatividade para com a subunidade 1 da glicoproteína de superfície (S) (scFv-S1). O anticorpo scFv-S1 quando utilizado em ensaio de vírus-neutralização em ovos embrionados mostrou titulo significativo de proteção. Já em testes de ELISA utilizando estirpes de referência e isolados brasileiros de campo do VBI, o anticorpo scFv-N foi capaz de detectar todas as estirpes (H120, M41, Arkansas, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), enquanto que o scFv-S1 pode discriminar as estirpes pertencentes ao sorotipo Massachusetts (H120, M41 e IBVSC01) das demais estirpes variantes avaliadas. Os fragmentos de anticorpos scFv-N e scFv-S1 também mostraram bons resultados quando utilizados na técnica... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Infectious bronchitis virus (IBV), the coronavirus of the chicken, is one of the main causes of economic loss within the poultry industry, affecting the performance of meattype and egg-laying domestic fowls. Given the highly contagious and acute nature of the disease, there is an urgent need for the development of diagnostic assays that can detect and/or characterize IBV strains. In order to improve the laboratory diagnosis of IBV infection, phage-displayed recombinant antibody library derived from splenic mRNA of chickens immunized with H120 vaccine strain of infectious bronchitis virus (IBV) was constructed as single chain variable fragments (scFv) by overlap extension polymerase chain reaction (PCR) of the individual heavy (VH) and light (VL) chain variable gene segments. After three rounds of panning selection, ten scFv phage display antibodies of 400 randomly chosen clones were demonstrated to react with IBV antigens by ELISA. The western blot analysis selected two scFv antibodies reacting strongly with nucleocapsid (N) (scFv-N) protein or subunit 1 of spike glycoprotein (S1) (scFv-S1) of IBV. The anti-S1 scFv antibody showed a significant neutralization titre in embryonating chicken egg test. In ELISA analysis using reference IBV strains and Brazilian field isolates, the anti-N scFv antibody was able to detect all strains (H120, M41, ARKANSAS, IBVPR05, IBVPR02, IBVPR01, IBVSC01), while the anti-S1 could discriminate Massachusetts serotype (H120, M41 and IBVSC01) between variant strains. A scFv-based indirect immunoperoxidase (IP) procedure was also applied to detect infectious bronchitis virus (IBV) antigens in formalin-fixed tracheal tissue sections. Thus, the results showed that scFv-N and scFv-S1 antibodies can be used for the detection and differentiation of IBV strains. / Doutor

Submitted by Pedro Silva Filho (pfsilva@ipen.br) on 2017-11-17T17:17:04Z No. of bitstreams: 0 / Made available in DSpace on 2017-11-17T17:17:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / Linfomas são cânceres que se iniciam a partir da transformação maligna de um linfócito no sistema linfático. Os linfomas são divididos em duas categorias principais: os linfomas de Hodgkin e todos os outros linfomas, denominados linfomas não-Hodgkin (LNH). Os pacientes com LNH são comumente tratados com radioterapia apenas ou combinada com quimioterapia utilizando-se de anticorpo monoclonal anti-CD20, principalmente o rituximab (MabThera&reg). O uso de anticorpos monoclonais (Acm) conjugados à quelantes bifuncionais radiomarcados com radionuclídeos metálicos ou lantanídeos é uma realidade de tratamento para portadores de LNH pelo princípio de radioimunoterapia (RIT). Este estudo concentrou-se nas condições de conjugação do anticorpo monoclonal rituximab (MabThera&reg) com grupamentos quelantes bifuncionais DOTA e DTPA. Na marcação dos Acm conjugados com lutécio-177, foram estudadas as condições de pré-purificação do Acm, condições de conjugação, determinação de número de quelantes acoplados à molécula do anticorpo, purificação do anticorpo conjugado, radiomarcação do anticorpo conjugado, com lutécio-177, purificação do anticorpo marcado, a ligação específica in vitro dos compostos marcados às células Raji, e distribuição biológica em camundongos BALB/c sadios. As três metodologias empregadas na pré-purificação do anticorpo (diálise, cromatografia de exclusão molecular com coluna Sephadex G-50 e ultrafiltração) demonstram-se eficientes e proporcionaram recuperação da amostra superior a 90%. A metodologia de ultrafiltração foi considerada a mais simples e prática, podendo ser aplicada a procedimentos rotineiros de produção de radiofármacos. Além disso, proporcionou a recuperação final de amostra de 97% em microlitros. Nas conjugações do anticorpo com os quelantes DOTA e DTPA em razões molares diferentes do Acm:quelante, observou-se número de grupamentos quelantes acoplados à molécula do Acm proporcional à razão molar estudada. Quando foi avaliada a influência de condições diferentes de conjugação no número de quelantes acoplados à molécula do Acm, não foram observadas diferenças significativas, com resultados de pureza radioquímica (PR) inferior a 80% em todas as condições estudadas. Na comparação de métodos de purificação do Acm conjugado, a abordagem inédita apresentada neste estudo, na qual a cromatografia de exclusão molecular foi combinada com a ultrafiltração resultou em maior eficiência na purificação e preservação da estrutura do anticorpo. Nos estudos de radiomarcação do anticorpo conjugado com DOTA e DTPA, os imunoconjugados de DTPA apresentaram, de forma geral, maior eficiência de marcação com resultados reprodutíveis quando comparados com os imunoconjugados de DOTA, considerando-se as diferentes razões molares utilizadas. As metodologias cromatográficas empregadas no controle de pureza radioquímica do composto radiomarcado proporcionaram a discriminação das diferentes espécies radioquímicas no meio de marcação. A metodologia de purificação do composto conjugado e radiomarcado utilizada proporcionou a obtenção de compostos com alta pureza radioquímica, 97,4±1,3% (DOTA 1:50) e 98,7±0,2% (DTPA 1:50). Nos estudos de ligação específica às células tumorais Raji, o anticorpo conjugado com quelante DTPA nas razões molares de 1:50 e 1:20 apresentaram perfil semelhante de ligação, com aumento da porcentagem de ligação específica proporcional à concentração celular, enquanto que o imunoconjugado na razão molar de 1:10 apresentou alta porcentagem de ligação não específica. Os resultados obtidos nos estudos de biodistribuição in vivo do anticorpo conjugado e radiomarcado nem sempre se mostraram compatíveis com a biodistribuição de anticorpos radiomarcados íntegros. No caso do quelante DOTA, o imunoconjugado obtido a partir da razão molar 1:20, apresentou melhores características de biodistribuição. No caso do quelante DTPA, a razão molar utilizada pareceu refletir diretamente no clareamento sanguíneo do anticorpo e todas as razões molares utilizadas apresentaram instabilidade in vivo. / Tese (Doutorado em Tecnologia Nuclear) / IPEN/T / Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares - IPEN-CNEN/SP

Orientadores: Dagmar Ruth Stach-Machado, Marcos Antonio Machado / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-11T17:36:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peroni_LuisAntonio_D.pdf: 5677765 bytes, checksum: 2a4cb6ec8aba9b1ec6655c771981377f (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Este trabalho visou efetuar a identificação dos epitopos das prottnas recombinantes CB-22 e CB-104 do capsídeo do Cítrus tristeza vírus (CTV), reconhecidos pelos anticorpos monoclonais (MAb) produzidos por Stach-Machado e colaboradores (2000). Assim, os epitopos reconhecidos pelos MAbs 30.G.02 e 37.G.ll, correspondem às seqüências de aminoácidos NLHIDPTLI e TQQNAALNRDLF, localizadas nas posições 32 a 40 e 50 a 61 das proteínas recombinantes CB-22 e CB-104. O epitopo reconhecido pelo MAb 39.07 que apresenta especificidade apenas para a CB-104, homóloga aos isolados severos do CTV corresponde a seqüência TDVVFNSKGIGN, localizados na posição 120 a 131 da proteína. Estes dados corroboram com os ensaios de ELlSA, confirmando o MAb 30.G.02 como um anticorpo universal, atuando quer como anticorpo de captura ou de detecção em ELlSA Sandwich, uma vez que, seu epitopo é conservado em 87.2% dos isolados de CTV. O MAb 37.G.ll deve ser adotado apenas como anticorpo de detecção pois reconhece uma seqüência encontrada em 62,6% dos isolados, permitindo uma identificação ampla, sem efetuar a diferenciação de estirpes. O MAb 39.07 foi classificado como "forte", pois seu epitopo está presente em apenas 19,7% das seqüências, sendo estas provenientes de isolados fortes do CTV de todo o mundo. A utilização de peptídeos lineares não permitiu a identificação e caracterização do epitopo do MAb 1C.04-12, confirmando dados preliminares de nosso laboratório que permitiram inferir que o mesmo reconhece um epítopo conformacional. O conhecimento das características estruturais da proteína do capsídeo viral possibilita obtenção de informações relevantes quanto às suas propriedades biológicas, como a participação na organização e montagem da partícula viral, proteção do material genético, interação com o inseto-vetor e com a planta hospedeira e também, pela "movimentação" da partícula viral no processo de infecção na planta. Considerando que até a presente data não existem dados disponíveis no Protein Data Bank (PDB) sobre a estrutura tridimensional da proteína do capsídeo do CTV, efetuamos o estudo estrutural da CB-22, utilizando Dicroísmo Circular (CD) e Difração de Raios X a Baixo Ângulo (SAXS). A análise dos dados de CD mostrou um espectro característico de proteínas cuja estrutura secundária é predominantemente formada por a-hélices, sendo este resultado coerente com a estrutura secundária predita pelo software PSIPRED. Os estudos de SAXS revelaram uma proteína altamente oligomerizada com estruturas formadas por subunidades, que variam de acordo com a concentração da mesma em solução. Este resultado, embora tenha impossibilitado a resolução e modelagem da estrutura secundária da CB-22, demonstrou que esta proteína recombinante mantém a função da proteína nativa, responsável pela formação do capsídeo vira!. Assim sendo, podemos postular a sua utilização como uma molécula carreadora, podendo ser aplicada em protocolos de vacinação ou no transporte dirigido de ácidos nucléicos ou proteínas. Por fim, este trabalho estabeleceu diagnósticos imunomoleculares como Imunocaptura-PCR (IC-PCR) e Imuno-PCR (I-PCR) para a detecção da bactéria gramnegativa Xylella jastid[osa, agente etiológico da Cvc. Os ensaios imunomoleculares apresentaram o limite de detecção muito superior aos diagnósticos utilizados na rotina como ELlSA e PCR, sendo o limite de detecção do IC-PCR e do I-PCR de 103 a 101 células, respectivamente. Portanto, estes métodos são uma alternativa viável para efetuar o diagnóstico da CVC e também em estudos epidemiológicos, com a vantagem de eliminar as etapas de extração e concentração do material genético bacteriano, permitindo um diagnóstico acurado dessa doença / Abstract: This work aims to carry out the identification of epitopes of the Citrus tristeza virus (CTV) recombinant coat protein (CB-22 and CB-l04) which are recognized by four monoclonal antíbodies (MAb) produced by Stach-Machado et aI. (2000). MAb 1C.04-12 recognizes CB-22 protein, homologous to CTV isolates that induce weak symptoms in indicators plants; while MAb 39.07 reacts to CB-l04 protein, homologous to severe CTV isolates and, MAbs 30.G.02 and 37.G.ll recognize both proteins. MAb 30.G.02 recognized the sequence formed by amino acids NLHIDPTLI, located at positions 32 to 40, while MAb 37.G.ll recognized the amino acids from 50 to 61, whose sequence is TQQNAALNRDLF. On the other hand, the MAb 39.07 recognized the sequence TDVVFNSKGIGN, located at positions 120 to 131 in CB-l04 protein. MAb 30.G.02 was considered a Universal antibody, once its epitope is conserved in 87.2% of CTV isolates, and can be applied as a coating antibody or even as a detection antibody in ELlSA Sandwich assays. The epitope of MAb 37.G.ll is conserved in 62.6% of sequences and, can be applied as detection antibody, allowing a quick and wide range screening but without strains differentiation. Finally, MAb 39.07 was classified as "Severe" antibody, once its epitope is present at only 19.7% of CTV sequences, which were derived frem severe worldwide CTV isolates. The technique of linear peptides did not allow the epitope determination of MAb 1C.04-12, since this antibody may recognize a conformational epitope in the CB-22 tridimensional structure, according to the early data from our laboratory showing that this MAb did not recognize the CB-22 under denaturating conditions, confirming the conformational nature of its eptiope. The knowledge about structural features of viral coat protein enables acquiring relevant information about biological properties of this protein. The coat protein plays an essential role in the organization and assembly of viral particle, acts in genetic material protection and, probably is involved in the interaction with insect-vector and with host plant, being responsible for the movement of viral particle in the infection processo However, there are not any data in Protein Data Bank (PDB) about the secondary and tertiary structures of CTV coat protein, and so, this work carried out a structural study about CB-22 by Circular Oichroism Spectroscopy (CO) and Small-Angle X-ray Scattering (SAXS). The CO data analysis demonstrated a spectrum characteristic of proteins whose secondary structure is predominantly formed by a-helixes, and these results are coherent of predicted structure by PSIPREO software. The SAXS data revealed a highly oligomeric protein comprising many subunits whose quantities are dependent and vary according to the protein concentration in solution. These data, although had impaired the modeling and resolving of CB-22 secondary structure, demonstrated that this recombinant protein maintain the function of native protein, responsible for the assembly of CTV capsid, and this structure without bacterial ONA is also called virus-/ike, which allows to postulate its usefulness as nucleic acid ca rrier in vaccination protocols. Finally, the third objective of this work was the establishment of immunomolecular diagnosis to gram-negative bacterium, Xy/ella fastidiosa, which causes Citrus Variegated Chlorosis in Brazil. We carried out two immunomolecular assays, like !mmmuno,Çapture PCR and !mmuno-PCR for direct detection of X. fastidiosa without ONA isolation. Whereas the reactivity of ELlSA and PCR ranged from 106 to 104 bacterial cells, the IC-PCR sensitivity was up to 103 and the detection limit of I-PCR was up to 101 bacterial cells. Therefore, ICPCR and I-PCR assays provide an alternative for quick and very sensitive rnethods to screening X. fastidiosa, with the advantage of not requiring any concentration or ONA purification steps while still allowing an accurate diagnosis of Cvc / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Nesse trabalho avaliamos a proteção que o anticorpo monoclonal (AcM) contra CMH e contra Hsp60 fornecem aos animais infectados com as leveduras de Paracoccidioides brasiliensis e P. lutzii em modelo profilático. O tratamento com os AcMs de isotipos IgG2a e IgG2b foram protetores, induzindo a secreção das citocinas IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a, padrão de resposta imune Th1. Nós mostramos por imunomarcação que moléculas de CMH e Hsp60 estão acessíveis na célula. E o anticorpo monoespecífico contra CMH e os anticorpos policlonais contra melanina, gerados nesse trabalho foram eficazes nos ensaios in vitro de proteção. Foram gerados anticorpos monoclonais contra glicoproteina extraída de Pb18, o AcM reconheceu, por imunomarcação, estruturas internas e a parede celular da levedura. Avaliamos um novo modelo de hospedeiro, com o uso da larva Galleria mellonella, o que pode servir de triagem e reduzir desta forma o uso excessivo de camundongos, as leveduras P. lutzii e H. capsulatum são letais para as larvas e evocam resposta celular que se organizam semelhante a um granuloma. / In this work we evaluated the protection that the monoclonal antibody (MAb) against Hsp60 and against CMH provides the animals infected with the yeast Paracoccidioides brasiliensis and P. lutzii in prophylactic model. The treatment with the MAbs of IgG2a and IgG2b isotypes were protective, inducing the secretion of IL-12p70, IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a, Th1 pattern of immune response. We show by immunogold that Hsp60 and MHC molecules are accessible on the cell. And the monospecific antibody against HCM and polyclonal antibodies against melanin, generated in this study were effective in in vitro assays of protection. Monoclonal antibodies were generated glycoprotein extracted from Pb18, Mab recognized by immunogold, internal structures and cell wall material. Evaluated a new type of host, using the larvae Galleria mellonella, which can serve as a screening and reduce thus the overuse of mice, yeast P. lutzii and H. capsulatum are lethal to larvae and evoke cellular responses that are organized like a granuloma.

A partir de células de osteossarcoma humano (MG-63) que tem características de osteoblastos imaturos produzimos anticorpos monoclonais (Mabs) nomeados PSP 4-5, PSP 42-22 e PSP 85-9. Esses anticorpos reconhecem antígenos de 100, 26 e 20 kDa respectivamente. Avaliamos a especificidade dos mesmos, testando suas expressões em cortes congelados de tecidos oriundos da mesma célula mesenquimal, ou seja, osso, cartilagem, músculo cardíaco e tecido adiposo. Os anticorpos marcaram o periósteo, com distintos padrões de expressão, porém o PSP 42-22 foi o mais específico marcando a camada osteogênica do periósteo. Os anticorpos marcaram também células ósseas. Diante desses resultados nosso objetivo, no presente estudo, foi identificar os antígenos reconhecidos por esses anticorpos usando clonagem e sequenciamento dos genes em biblioteca de cDNA com capacidade de expressão proteica. Outro objetivo foi testar os anticorpos, pela técnica de imunohistoquímica (IHQ), em tumores ósseos primários visando estabelecer os padrões de marcação e se diferenciavam os diferentes tipos de tumores. Os antígenos reconhecidos pelos anticorpos PSP 42-22 e PSP 85-9 foram isolados, purificados e sequenciados. Devido ao elevado peso molecular do PSP 4-5 necessitaremos de outras técnicas para isolar o clone que codifica seu antígeno. O sequenciamento do clone isolado pelo PSP 42-22, mostrou uma sequência com 99% de homologia descrita no \"Homo sapiens\" como sendo \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". A proteína SDCCAG3 foi descrita pela primeira vez em 1998 como um antígeno de câncer de cólon reconhecido por anticorpo autólogo. Vale lembrar que antígeno reconhecido pelo nosso anticorpo tem um peso molecular de aproximadamente 26 kDa, inferior ao da proteína SDCCAG3. Essa diferença poderia ocorrer devido a uma diferença no local da tradução do mRNA das células MG-63, produzindo uma proteína menor (isoforma), ou no clone isolado (3B2-3-1), poderia ocorrer uma mutação produzindo uma proteína mais curta que se expressaria na membrana celular ao contrário de uma proteína mais longa. Já o alinhamento das sequências obtidas dos clones isolados utilizando o PSP 85-9, mostrou uma sequência com 100% de concordância descrita com a porção não codante da proteína \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1)\" portanto um falso positivo; já o clone 1A5-1-3, mostrou uma sequência de 99% de homologia com a proteína \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8\". Trata-se de uma proteína de membrana, com 6 isoformas diferentes que pode interagir com o receptor de serotonina. O resultado da IHQ nos tumores ósseos testados mostrou que o PSP 4-5 se expressou predominantemente no citoplasma de osteossarcoma, condrossarcoma e leiomiossarcoma e no núcleo de osteoblastoma. O anticorpo PSP 42-22 não reconheceu nenhum antígeno nos tumores avaliados. Quanto ao anticorpo PSP 85-9 nos condrossarcomas e leiomiossarcomas a expressão foi predominante citoplasmática e nos osteossarcomas e osteoblastoma foi nuclear. Em conclusão, identificamos os antígenos de dois dos anticorpos estudados que apresentam potencial diagnóstico diferencial em tumores ósseos primários / From human osteosarcoma cells (MG-63), which have characteristics of immature osteoblasts, we produced monoclonal antibodies (Mabs) named PSP 4-5, PSP 42-22 and PSP 85-9. These antibodies recognize antigens with 100, 26 and 20 kDa, respectively. We evaluated their specificity by testing their expression in frozen tissue sections from the same mesenchymal cells, that is, bone, cartilage, cardiac muscle and adipose tissue. The antibodies stained the periosteum, with distinct patterns of expression, but PSP 42-22 was the most specific, scoring the osteogenic layer of the periosteum. The antibodies also marked bone cells. With these results, our goal in this study was to identify the antigens recognized by these antibodies using cloning and sequencing of the genes in the cDNA library with capacity of protein expression. Another objective was to test the antibodies by immunohistochemistry (IHC) in primary bone tumors to establish standards for marking and whether they set apart different types of tumors. The antigens recognized by the PSP 42-22 and PSP 85-9 antibodies were isolated, purified and sequenced. Due to the high molecular weight of PSP 4-5 we will need other techniques to recognize its antigen. Sequencing of the clone isolated using the PSP 42-22 showed a sequence with 99% homology described in \"Homo sapiens\" as being \"serologically defined colon cancer antigen 3 (SDCCAG3), transcript variant 3\". The SDCCAG3 protein was first described in 1998 as a colon cancer antigen recognized by autologous antibody. It is worth remembering that the antigen recognized by our antibody has a molecular weight of approximately 26 kDa, lower than the SDCCAG3 protein. This difference could be due to a difference in mRNA translation site of MG-63 cells producing a lower protein; or on the isolated clone (3B2-3-1) a mutation could occur producing a shorter protein that expresses in the cell membrane instead of a longer protein. The alignment of the sequences obtained from isolated clones using the PSP 85-9 showed a sequence with 100% of homology described with the non-coding protein portion \"Homo sapiens microtubule associated protein, RP/EB family, member 1 (MAPRE1), mRNA\" therefore, a false positive; 1A5-1-3 clone showed a 99% homology sequence with the protein \"Homo sapiens Yip1 interacting factor homolog B (S. cerevisiae) (YIF1B), transcript variant 8, mRNA\". It is a membrane protein with 6 different isoforms which can interact with the serotonin receptor. The result of IHC in bone tumors tested showed that PSP 4-5 expressed predominantly in the cytoplasm of osteosarcoma, chondrosarcoma, leiomyosarcoma and osteoblastoma in was in nucleus. The PSP 42-22 antibody did not recognize any antigen in the tumors examined. As for the PSP 85-9 antibody in chondrosarcoma and leiomyosarcoma, the expression was predominantly cytoplasmic and the osteoblastoma was nuclear in osteosarcomas. In conclusion, we have identified the antigens of two of the antibodies studied which have potential differential diagnosis in primary bone tumors

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vanusa_hora.pdf: 894481 bytes, checksum: 1cff4e13f238f761e9054b5864d2655e (MD5) Previous issue date: 2006-10-30 / Schistosomiasis, caused by Schistosoma mansoni, is the second most prevalent parasitic disease worldwide causing chronic disease in millions of people in developing countries. Similarly, fascioliasis, caused by the trematode Fasciola hepatica, represents a recognized unsolved agricultural problem responsible for economic losses as well as causing a significant number of human infections worldwide. Although chemotherapy for both parasites has been available, this approach has limitations, including high reinfection rates in endemic areas. Vaccines represent the most attractive long-term alternative to invert this scenario. Accordingly, the World Health Organization selected S. mansoni fatty acid-binding protein 14kDa (Sm14) as one out of two anti-schistosome vaccine priority candidates for human clinical trials. Furthermore, Sm14 is the only vaccine candidate to have been shown to afford significant immune protection against both of the above-mentioned helminthes. The objective of this study was to develop and evaluate in mice a recombinant subunit vaccine containing the Sm14 fused to the B subunit of the heat-labile enterotoxin of Escherichia coli (LTB), which is a potent immunoadjuvant; furthermore, was describe the production and characterization of monoclonal antibodies (MAbs) against the Sm14 for use as a tool to detect and characterize Sm14 and for development of future diagnostic test. The ltb and sm14 gene were obtained by PCR amplification from E. coli DNA and plasmid pAESm14, respectively, and fused by PCR. The recombinant chimera was expressed in E. coli and purified by nickel affinity chromatography. Groups of outbreed Swiss mice were immunized with three footpad doses of either rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 plus aluminum hydroxide (Al(OH)3), rSm14 plus Al(OH)3, rLTB or Al(OH)3. Levels of protection were determined by number of worms recovered after S. mansoni cercarial challenge. The pooled sera of immunized mice were evaluated by ELISA and Western blot. The results showed that the chimera protein was able to elicit specific antibody production to rSm14 and rLTB, however the use of LTB as adjuvant to rSm14 immunization failed to enhance protection against challenge. Furthermore, seven MAbs were obtained after immunization of BALB/c mice with rLTB/Sm14. MAbs isotyping revealed that five were of the isotype IgG1, one belonged to the IgG2b isotype and another to the IgM isotype. These MAbs will be usefull for monitoring protein expression in recombinant systems, protein stability and may have potential for developing diagnostic test. / A esquistossomose, causada por Schistosoma mansoni, é a segunda doença parasitária mais prevalente no mundo causando doença crônica em milhões de pessoas em países em desenvolvimento. Semelhantemente, a fasciolose, causada pelo trematódeo Fasciola hepatica, representa um reconhecido problema agrícola responsável por perdas econômicas assim como causa um significante número de infecções em humanos por todo mundo. Embora a quimioterapia para ambos os parasitas esteja disponível, ela tem apresentado limitações, incluindo altas taxas de reinfecção em áreas endêmicas. Vacinas representam a alternativa mais atraente para inverter este cenário. Assim, a Organização Mundial da Saúde selecionou a proteína ligadora de ácidos graxos 14kDa de S. mansoni (Sm14) como uma de duas candidatas à vacina anti-esquistossomose prioritárias para triagem clínica em humanos. Além disso, a Sm14 é a única proteína candidata a vacina que induz imunidade protetora significativa contra ambos os helmintos acima mencionados. O objetivo deste estudo foi desenvolver e avaliar em camundongos uma vacina de subunidade contendo a Sm14 fusionada com a subunidade B da enterotoxina termolábil de Escherichia coli (LTB), a qual é um potente imunoadjuvante; além disso, foi descrever a produção e caracterização de anticorpos monoclonais (MAbs) contra a Sm14 para usa-los como uma ferramenta para detectar e caracterizar a Sm14 e para o desenvolvimento de futuro teste diagnóstico. Os genes ltb e sm14 foram amplificados por PCR a partir do DNA de E. coli e do plasmídeo pAESm14, respectivamente, e fusionados por PCR. A quimera recombinante foi expressa em E. coli e purificada por cromatografia de afinidade em coluna com níquel. Grupos de camundongos suíços não singênicos foram imunizados por via subcutânea com três doses de rLTB/Sm14, rLTB/Sm14 mais hidróxido de alumínio (Al(OH)3), rSm14 plus Al(OH)3, rLTB ou Al(OH)3. Os níveis de proteção foram determinados através do número de parasitas recuperados após desafio com cercárias de S. mansoni. O pool de soros dos camundongos imunizados foi avaliado por ELISA e Western blot. Os resultados mostraram que a proteína quimera foi capaz de estimular a produção de anticorpos específicos para Sm14 e LTB, contudo o uso de LTB como adjuvante para imunização de rSm14 falhou em aumentar a proteção contra o desafio. Além disso, sete MAbs foram obtidos após imunização de um camundongo BALB/c com rLTB/Sm14. A isotipagem dos MAbs revelou que cinco foram do isotipo IgG1, um pertencente ao isotipo IgG2b e outro ao isotipo IgM. Estes MAbs serão úteis para monitorar a expressão da proteína em sistemas recombinantes, a estabilidade protéica e pode ter potencial para desenvolver teste diagnóstico.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_flavia_vasconcellos.pdf: 444073 bytes, checksum: 28496ede24da5ffceb810c4c3dfa434f (MD5) Previous issue date: 2007-04-27 / Leptospirosis is an infectious disease caused by pathogenic spirochetes of the genus Leptospira that can affect vital organs such as lungs, liver and kidneys. The illness is characterized by an acute bacteremic phase of approximately one week, followed by an immune phase in which specific antibodies are found in blood and leptospires are eliminated in urine. Clinical signs in the initial phase of leptospirosis can be confused with other feverish diseases, making laboratory diagnosis of extreme importance to start antibiotic treatment. The existing laboratory tests for early diagnosis of leptospirosis are based on IgM detection and are of low sensitivity. Thus, there is an urgent need for development of new diagnostic strategies for use in the acute phase of leptospirosis. In the present work monoclonal antibodies (MAbs) and polyclonal IgY were used in the standardization of three different antigen capture ELISA formats for direct detection of leptospires in blood during the acute phase of the disease. Detection limit of leptospires in human sera experimentally contaminated ranged from 10 5 to 10 7 cells per millilitre in the different formats. The ELISA format with the best performance was able to detect 10 5 leptospires per millilitre of human sera, using as capture antibody a MAb against LipL32, the major outer membrane protein of pathogenic leptospires, and as detection antibody biotinilated policlonal IgY against a pathogenic serovar of Leptospira interrogans. Although this format did not present the adequate sensitivity for detection of circulating leptospires at the levels existing in blood in the initial phase of the disease, it can be improved in order to do so. / A leptospirose é uma doença infecciosa causada por espiroquetas do gênero Leptospira que pode afetar diversos órgãos vitais como pulmões, fígado e rins. A doença caracteriza-se por uma fase inicial bacterêmica de aproximadamente uma semana, seguida de uma fase imune na qual anticorpos específicos são detectados no sangue e leptospiras são eliminadas na urina. Os sinais clínicos da fase inicial da leptospirose podem ser confundidos com diversas doenças febris, o que torna o diagnóstico laboratorial extremamente importante para decidir sobre o início do tratamento com antibióticos. Os testes laboratoriais existentes para o diagnóstico na fase inicial da doença são todos baseados na detecção de IgM e apresentam baixa sensibilidade. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolvimento de novas estratégias de diagnóstico precoce da leptospirose. Neste trabalho foram utilizados anticorpos monoclonais (MAbs) e anticorpo policlonal (IgY) para padronizar três formatos de ELISA de captura de antígeno para uso na detecção direta de leptospiras no sangue durante a fase aguda da doença. O limite de detecção de leptospiras em soro humano experimentalmente contaminado variou entre 10 5 e 10 7 células por mililitro nos diferentes formatos. O formato que apresentou melhor desempenho detectou 10 5 leptospiras por mililitro de soro, e utilizou como anticorpo de captura um MAb contra LipL32, a principal proteína de membrana externa de leptospiras patogênicas, e como anticorpo de detecção IgY biotinilada, produzida contra um sorovar patogênico de Leptospira interrogans. Embora este formato não apresente ainda a sensibilidade adequada para detectar o nível de leptospiras circulantes no sangue na fase inicial da doença, ele possui potencial para ser aperfeiçoado de forma a atingir aquele nível.

Abstract Osteoporosis is a disease characterized by abnormalities in the amount and architectural arrangement of bone tissue, which leads to impaired skeletal strength and increased susceptibility to fractures. Type 5 tartrate-resistant acid phosphatase (TRACP, AcP5) has been suggested to participate directly in bone resorption. In this study, baculovirus expression vector system in insect cells was used to gain large amounts of recombinant type 5 acid phosphatase for structure determination, structure-based functional studies and production of monoclonal antibodies. Active and inactive forms of the enzyme were separated from each other by cation-exchange chromatography, and characterized. The enzyme was crystallized and the three-dimensional structure was determined. Based on the three-dimensional structure of the active site five different enzyme variants were constructed, produced in insect cells, and purified. The wild type enzyme and the mutated forms were characterized, and their kinetic parameters were determined. The importance of amino acids that were expected to be essential for the acid phosphatase activity was confirmed. The acid phosphatase activity and reactive oxygen species generating activity of this dual enzyme proved to exploit different amino acids in their reaction mechanisms. Further studies are needed to clarify the physiological substrates of TRACP in vivo. The findings of this study could form a base for construction of inhibitors for TRACP that could be useful therapeutic agents for osteoporosis and related bone disorders.

No description available.

<p>LC-MS of protein drugs requires new ideas in bonded phase design rather than adapting bonded phases from the realm of small-molecule drugs. The polymer-shell bonded phase is designed to interact with larger molecules and to shield proteins from the silica substrate. The particles consist of a core of solid silica and a shell of dense polymer brush. The polymer layer is thick enough to protect the protein from interactions with silanols to reduce peak tailing. The polymer contains multiple functional groups that introduce more selectivity. This design gives unprecedented LC resolution and MS sensitivity. Our group has developed polymer shell bonded phases for hydrophobic interaction chromatography (HIC-MS) of antibody-drug conjugates (ADCs), hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC-MS) of glycoproteins, and reversed-phase liquid chromatography (RPLC-MS) of monoclonal antibodies. Since HIC is not in-line compatible with MS due to the high salt levels, it is laborious to identify the constituents of HIC peaks. An MS-compatible alternative to HIC is reported here: native reversed phase liquid chromatography (nRPLC). This employs a mobile phase 50 mM ammonium acetate for high sensitivity in MS, and elution with a gradient of water/isopropanol. The nRPLC-MS data show that all ADC species, ranging from drug-to-antibody ratios of 1 to 8, remained intact and native on the column. As we adapt this concept to intact proteins, we find that lysozyme and α-chymotrypsinogen A are both eluted in their native conformations. We also use the polymer-shell concept to resolve IgG1 free thiol variants by RPLC-MS with 0.5% formic acid. Since there are always other variants besides the intended ones, the need for high MS sensitivity is desired to distinguish subtle mass change between disulfide bond and free thiols. Overall, MS sensitivity increases 10X relative while all of the thiol variants are well resolved by the polymethylmethacrylate bonded phase.</p>