Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-10-21Bitstream added on 2014-12-02T11:21:14Z : No. of bitstreams: 1 000681505.pdf: 1855418 bytes, checksum: 77e9f62fa9efa050254d87aa50d63c9a (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Curcumin, um polifenol derivado do tumérico (Curcuma longa) modula a atividade dos fatores de transcrição NF-ĸB e AP-1 e reduz a expressão de uma série de mediadores inflamatórios. Suas aplicações terapêuticas têm sido estudadas em uma variedade de condições, tais como colite, artrite reumatóide, câncer, psoríase; mas este é o primeiro estudo avaliando seus efeitos na doença periodontal in vivo. O inicio e progressão da doença periodontal ocorre como consequência da resposta do hospedeiro aos microorganismos do biofilme dental. Uma resposta imune imprópria induz à produção exagerada de citocinas inflamatórias e consequentemente à perda de inserção periodontal e reabsorção óssea. No estudo in vitro, uma linhagem celular de macrófagos de camundongo (Raw 264.7) foi estimulada com LPS de E.coli na presença e ausência de concentrações não citotóxicas de curcumin e de inibidores bioquímicos de NF-ĸB e p38 MAPK. RT-qPCR e ELISA foram usados para determinar a expressão de IL-6, TNF-alpha, COX-2/PGE2 em nível de mRNA e proteína. O efeito do curcumin sobre a ativação das MAPKinases e NF-kB induzida por LPS foi avaliado por westernblot. No estudo in vivo, a doença periodontal experimental foi induzida em ratos pela colocação de ligaduras ao redor dos primeiros molares inferiores e injeção de LPS nos tecidos gengivais da região palatina entre os primeiros molares superiores (30 ug LPS, 3 vezes/semana por 2 semanas). Curcumin foi administrado aos animais diariamente por gavagem oral em duas doses (30 e 100 mg/Kg) durante as duas semanas do experimento, iniciando no dia anterior à indução da doença periodontal. Os animais controle receberam ligaduras e injeções de LPS, mas somente o veículo óleo de milho por gavagem. Os animais do grupo controle negativo não foram manipulados. RT-qPCR e ELISA foram usados para determinar a expressão de IL-6, TNF-alpha e PGE2 no... / Curcumin, a polyphenol derived from turmerics (Curcuma longa), has been shown to down regulate the activity of transcription factors NF-ĸB and AP-1 and to inhibit the expression the several inflammatory mediators. Its therapeutic applications have been studied in a variety of conditions, including as colitis, rheumatoid arthritis, cancer, psoriasis; but this is the first study to assess the effects of curcumin on periodontal disease in vivo. Periodontal disease initiation and progression occurs as a consequence of the host response to microorganisms of the dental biofilm. An improper immune response leads to overproduction of inflammatory cytokines and consequently periodontal attachment loss and bone resorption. In vitro study, we stimulated Raw 264.7 murine macrophages with E.coli LPS in the presence and absence of noncytotoxic concentrations of curcumin and of the biochemical inhibitors of NF-kB and p38 MAPK. RT-qPCR and ELISA were used to determine the expression of IL-6, TNFalpha and Cox-2/PGE2 at mRNA and protein levels. Western-blot was used to assess the effect of curcumin on LPS-induced activation of MAPKinases and NF-kB. In the vivo study, experimental periodontal disease was induced in rats by placing cotton ligatures around both lower first molars and injecting LPS in the gingival tissues on the palatal aspect of upper first molars (30 ug LPS, 3 times/week for 2 weeks). Curcumin was given to the rats by daily oral gavage in two doses (30 and 100 mg/Kg) during the 2 week-duration of the experiment. Control animals received ligatures and injection of LPS but only the corn oil vehicle by gavage and negative control animals were untouched. RT-qPCR and ELISA were used to determine the expression of IL-6, TNFalpha and PGE-2 synthase on the gingival tissues. The inflammatory status was evaluated by stereometric analysis, whereas modulation of p38 MAPK and NK-kB signaling was assessed by western...

Made available in DSpace on 2015-01-26T13:21:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-07-31Bitstream added on 2015-01-26T13:30:39Z : No. of bitstreams: 1 000797469_20150731.pdf: 232290 bytes, checksum: 8b79e45ee61c9f4bcba697b70de0dd8d (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-03T12:21:06Z: 000797469_20150731.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-03T12:22:20Z : No. of bitstreams: 1 000797469.pdf: 489622 bytes, checksum: 0ef36ba06e14e49b785561d2153aacbb (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os macrófagos desempenham um papel importante na eliminação do M. Leprae (ML). Estas células participam do reconhecimento de patógenos e ativação do sistema imune, no entanto na hanseníase virchowiana elas se tornam alvos, servindo de habitat para o bacilo, que ali se protege da ação do sistema imune. Assim, este estudo teve por objetivo avaliar a função macrofágica de pacientes com hanseníase virchowiana (LLP) em termos de expressão de marcadores de superfície e produção de mediadores inflamatórios. Além disso, considerando o possível envolvimento dos inflamassomas na resposta dos macrófagos ao ML, foi avaliada a expressão de genes do complexo do inflamassoma. Para tanto, macrófagos diferenciados a partir de monócitos sanguíneos de LLP e indivíduos saudáveis (HC) foram cultivados com ML. A expressão dos marcadores de ativação CD40 e ICAM, e dos receptores do tipo Toll envolvidos no reconhecimento do ML, TLR1 e TLR2, foi avaliada por citometria de fluxo. A produção de citocinas pró (TNF e IL-1β) e anti-inflamatórias (IL-10 e IL-1RA) foi determinada por ELISA e a produção de H2O2 foi avaliada por ensaio colorimétrico. A expressão relativa dos genes NLRP1, NLRP3, NLRC4, CASP1, IL1B e IL18 foi avaliada por PCR em tempo real. ML induziu expressão semelhante de CD40 e ICAM em HC e LLP, assim como dos TLR1 e TLR2. TNF e IL-1β mostraram comportamento diferente, sendo que o ML estimulou uma produção significativa de TNF em HC e LLP, mas não induziu a secreção de IL-1β. H2O2 não foi significativamente induzida pelo ML em LLP. Nenhuma diferença foi encontrada para as citocinas anti-inflamatórias entre HC e LLP. A análise da expressão de genes relacionados aos inflamassomas mostrou que ML é capaz de induzir o gene da IL-1β, mas não dos receptores analisados. Os dados aqui reportados mostrando deficiência na secreção de IL-1β em macrófagos estimulados com ML e a baixa quantidade de H2O2 produzida ... / Macrophages play a major role in the elimination of M. leprae (ML). These cells participate in pathogen recognition and activation of the immune system. However in the lepromatous leprosy macrophages become targets, serving as habitat for the bacillus that protects itself from the action of the immune system. This study aimed to evaluate the macrophage function in lepromatous leprosy patients (LLP) in term of surface molecules expression and cytokine and H2O2 production. Moreover, considering the possible involvement of inflammasome complex in macrophage response against ML, inflammasome genes expression was evaluated. ML induced surface expression of activation markers CD40 and ICAM in healthy controls (HC) and LLP macrophages in a similar way, as well as TLRs involved in ML recognition (TLR1 and TLR2). Pro-inflammatory cytokines TNF and IL-1β showed a different behavior. ML was able to induce TNF in HC and LLP, but not IL-1β. Similarly, ML induced significant production of H2O2 in HC but not in LLP macrophages. No difference was found in the production of anti-inflammatory molecules IL-10 and IL1RA in HC and LLP macrophages stimulated with ML. When inflammasome genes expression was analyzed an up-regulation of IL1B gene was observed in both HC and LLP macrophages stimulated with ML. Together, our data indicate that the deficiency in the production of IL-1β and H2O2 in lepromatous leprosy patients combined with IL1B gene expression induction by M. leprae suggested that even if surface recognition of ML and general activation of macrophages are apparently normal, the bacteria is able to inhibits the pathways leading to I IL-1β and H2O2 production, possibly affecting inflammasome activation

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-12-01Bitstream added on 2014-06-13T20:35:40Z : No. of bitstreams: 1 voltan_ar_me_arafcf.pdf: 3523715 bytes, checksum: a45dbb04885b30d3dab365502064fdcf (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico, agente de doença granulomatosa crônica denominada de paracoccidioidomicose (PCM), com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até disseminadas evoluindo para letalidade. O fungo tem capacidade de aderir, extravasar e invadir barreiras impostas pelos tecidos do hospedeiro. Em ensaios in vitro verificou-se que P. brasiliensis pode aderir e invadir células epiteliais, aparecendo algumas vezes internalizado dentro de um vacúolo. A identificação do mecanismo pelo qual este fungo adere, invade e sobrevive no interior da célula hospedeira é campo fértil para a descoberta de sua patogênese. Para tanto, a análise de proteínas presentes no microrganismo e nas células do hospedeiro e também os marcadores da via endocítica para co-localizar os microrganismos no interior das mesmas é o objetivo deste estudo. Assim, foi realizada a infecção de células epiteliais A549 e macrófagos AMJ2-C11com P. brasiliensis (Pb18) nos períodos de 3, 5, 8, 24 e 3, 5, 10 e 24h, respectivamente e feitas análises por técnicas de imunofluorescência para as proteínas de junções compactas, junções aderentes, junções tipo fenda e proteínas de ancoramento intracelular, bem como as proteínas da via endocítica. Entres estas, foram ensaiadas a expressão de clatrina, Rab7 e LAMP-1 por imunofluorescência e EEA1, Rab7 e LAMP-1 por imunoblot. As proteínas de junções foram expressas nas células, bem como na parede do fungo. A clatrina foi evidente na célula e aparentemente mais expressa na parede do fungo. Nas células A549 não houve alteração na expressão de Rab7 e LAMP-1, tanto na imunofluorescência quanto no imunoblot, sendo que para EEA1 e Rab5 não foi evidenciada alteração na expressão pela técnica de imunoblot. Rab7 foi expressa nos macrófagos, localizada na periferia das células e também no... / Paracoccidioides brasiliensis is a thermally dimorphic fungus, the etiologic agent of paracoccidioidomycosis (PCM). PCM is a polymorphic disease manifested by an array of diverse clinical manifestations and varying organ involvement. P. brasiliensis may actively penetrate the mucocutaneous surface and parasitize epithelial cells, thus evading the host defenses and reaching deeper tissues. The ability of this fungus to adhere to and invade non-professional phagocyte cells has been observed. In vitro assays verify that P. brasiliensis can adhere and could appear internalized within vacuole. The identification of the mechanism by which this fungus adheres, invades and survivor inside the host cell is a fertile area for discover their pathogenesis. The aim of this study was analyzed the junctions proteins in the fungus and the host cells, as well as the endocytic markers to colocate the microorganisms inside the cells. Thus, the infection was performed in A549 epithelial cells and macrophages AMJ2-C11 with P. brasiliensis (PB18) for periods of 3, 5, 8, 24 and 3, 5, 10 and 24 h, respectively, and the immunofluorescence analysis was developed for the proteins claudin-1, claudin-4, E-cadherin, conexin 43, talin e vinculin, and the endocytic proteins. The macrophages and the cells A549 have been blemish along anti-clatrin, anti-Rab7 and anti-LAMP-1. The junctions’ proteins have been expressed at the cells, as well as on the wall from the fungus. The clathrin was present at the cells and apparently more expressed on the fungus wall. Rab7 and LAMP-1 were not expressed in the cells A549 as demonstrated by the imunofluorescence and the imunoblot. On the contrary Rab7 was expressed in macrophages located at the periphery of the cells and also in the own fungus. The expression of LAMP-1 apparently not presented alteration both at the imunofluorescence and at the imunoblot. The expression of EEA1 was... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador: Beatriz Maria Machado de Medeiros / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Iracilda Zeppone Carlos / Resumo: A infecção por Y. pseudotuberculosis é a causa de doenças intestinais e extraintestinais. A resolução da infecção está relacionada com a ativação de células Th1. Macrófagos e células dendríticas são capazes de orientar a resposta imune adaptativa através da produção de citocinas e apresentação de antígenos às células T. Estas células metabolizam L-arginina por duas vias, utilizando as enzimas iNOS ou arginase. O metabolismo de L-arginina é um importante parâmetro para discriminar o estado de ativação destas células. O objetivo deste estudo foi verificar a influência da infecção por Y. pseudotuberculosis sobre o comportamento de macrófagos e células dendríticas de camundongos resistentes (C57BL/6) e suscetíveis (BALB/c). Macrófagos peritoneais e células dendríticas esplênicas foram obtidos em 12 horas, 1º, 3º e 5º dias pós-infecção, cultivados, e foi determinada a produção de NO, atividade da arginase, produção de citocinas e capacidade imunoestimulatória destas células. Durante a infecção, macrófagos e células dendríticas de camundongos C57BL/6 infectados produziram quantidade maiores de NO, IL-12 e TNF- , enquanto as células de camundongos BALB/c infectados apresentaram maior atividade da arginase e produção de IL-10. A infecção provocou uma diminuição na capacidade de estimulação de macrófagos e células dendríticas, com menor proliferação de células T nos camundongos BALB/c. Estes resultados sugerem que os mecanismos responsáveis pela resistência e suscetibilidade à infecção podem estar relacionados com diferenças no estado de ativação de macrófagos e células dendríticas. / Abstract: Y. pseudotuberculosis infection is the cause of intestinal or extraintestinal diseases. The resolution of infection is connected with activation of Th1 cells. Macrophages and dendritic cells are able to orient the adaptive immune response through the production of cytokines and antigen presentation to T-cells. These cells metabolize L-arginine by two pathways, using the iNOS or arginase enzymes. L-arginine metabolism is an important parameter to discriminate the activate state of these cells. The objective of this study was to verify the influence of Y. pseudotuberculosis infection on the behavior of macrophages and dendritic cells from susceptible (BALB/c) and resistant (C57BL/6) mice. Peritoneal macrophages and splenic dendritic cells were obtained on the 12 h, 1st, 3rd, 5th day post-infection, cultured, and the NO production, arginase activity, cytokines production and immunostimulatory capacity of these cells was determined. During the infection, macrophages and dendritic cells from infected C57BL/6 mice produced higher amounts of NO, IL-12 and TNF- , while the cells from infected BALB/c mice presented higher arginase activity and IL-10 production. The infection leads to a decrease in the immunostimulatory capacity of macrophages and dendritic cells, with T-cell proliferation smaller in the BALB/c mice. These results suggest that mechanisms responsible for the resistance and susceptibility to infection may be connect with differences in the activation state of macrophages and dendritic cells. / Mestre

Orientadores: Vitor Baranauskas, Elaine Conceição de Oliveira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Elétrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-18T06:09:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_VaniaDanielaRamosda_M.pdf: 1200986 bytes, checksum: ea703367a77fd7a3b81588f401b24a2f (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: A utilização da nanotecnologia emerge com potencial para aplicação na área biomédica, no diagnóstico e tratamento patológico, transporte de fármacos e transporte intracelular de moléculas. Dentre as nanopartículas, os nanotubos de carbono (NT) pertencem a uma nova classe de material para aplicação na área biomédica. Devido ao seu tamanho reduzido, os NT podem ser internalizados por diferentes células, como os fagócitos e células tumorais. Embora vários mecanismos de internalização de nanopartículas tenham sido descritos, o mecanismo pelo qual isso ocorre ainda não é bem entendido. O receptor MARCO, que é um receptor de membrana celular expresso em macrófagos, células dendríticas e algumas células endoteliais e está ligado à remoção de partículas inertes parece estar relacionado à internalização de NT. Assim, o objetivo desse estudo foi estudar a internalização de NT por macrófagos (MO), células dendríticas (DC) e células de carcinoma pulmonar de Lewis (3LL), e sua relação com a expressão do receptor MARCO. Assim como, estudar a produção de citocinas pelas DC e MO incubados com os NT. Os MO foram obtidos do baço e as DC obtidas da medula óssea de camundongos C57Bl/6, e células da linhagem 3LL foram cultivadas em nosso laboratório. As células foram incubadas com NT de parede múltipla, marcados com o corante PKH26 em diferentes tempos. DC MO e 3LL internalizam os NT, porém somente os dois primeiros tipos celulares expressaram MARCO. As células 3LL apesar de internalizarem grande quantidade de NT após 12 e 24 horas, não expressam MARCO. Ao bloquear o receptor com anticorpo anti-MARCO nas DC e MO observamos diminuição na internalização dos NT.Os resultados demonstram que DC são aquelas que mais internalizam os NT e tem a maior expressão de MARCO. Estudos sobre modificações estruturais na célula foram observadas através da espectroscopia Raman. A análise da expressão gênica para citocinas demonstraram aumento na expressão de RNAm para citocina pró-inflamatória TNF? em MO e DC incubadas com NT / Abstract: The aplication of nanotechnology emerges with potential for application in the biomedical area, pathological diagnosis and treatment, drug transport and intracellular transport of molecules. Among the nanoparticles, carbon nanotubes (NT) belong to a new class of material for application in the biomedical area. Due to its small size, the NT can be internalized by various cells such as phagocytes and tumor cells. Although several mechanisms of internalization of nanoparticles have been described, the mechanism by which this occurs is not well understood. The MARCO receptor, which is a cell membrane receptor expressed on macrophages, dendritic cells and some endothelial cells and is linked to the removal of inert particles appears to be related to the internalization of NT. Thus, the aim was to study the internalization of NT by macrophages (MO), dendritic cells (DC) cells and Lewis lung carcinoma (3LL) and its relationship with the expression of receptor MARCO. As well as studying the production of cytokines by DC and MO were incubated with NT. The MO were obtained from the spleen and the DC obtained from bone marrow of C57BL / 6 and 3LL cell lines were cultured in our laboratory. The cells were incubated with NT (multi wall) , labeled with PKH26 dye at different times. DC, MO and 3LL internalize the NT, but only the DC and MO express MARCO. 3LL cells internalize despite large amount of NT at 12 and 24 hours, but not express MARCO. By blocking the receptor with anti-MARCO in MO and DC, were decreased the internalization of NT. The results demonstrate that DC internalize more NT than other cells and have the highest expression of MARCO. Studies on structural changes in the cell were observed by Raman spectroscopy. The analysis of gene expression for cytokines showed increased expression of mRNA for proinflammatory cytokine TNF in MO and MO incubated with NT / Mestrado / Eletrônica, Microeletrônica e Optoeletrônica / Mestre em Engenharia Elétrica

Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T22:06:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Albuquerque_MarcosEduardoLamasde_M.pdf: 618346 bytes, checksum: d8a7d01dacd5919516d8000db3c0e660 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: A leishmaniose tegumentar é uma parasitose causada por protozoários do gênero Leishmania que acomete preferencialmente a pele e/ou as mucosas e caracteriza-se pelo aparecimento de lesões ulcerosas. Histologicamente, esta lesão caracteriza-se pela desintegração da epiderme e da membrana basal, com grande incidência de histiócitos, linfócitos, granulomas e proliferação de parasitos. Como conseqüência, a região lesada apresenta redistribuição de vasos sanguíneos, e dificuldades na difusão de oxigênio, resultando em microambiente hipóxico. Macrófagos se adaptam a hipóxia, alterando seu metabolismo, produção de linfocinas e atividade fagocítica. No presente trabalho comparamos os efeitos da hipóxia (6% O2) e da normóxia (21% O2) na infecção in vitro de macrófagos humanos obtidos de monócitos de sangue periférico com o parasito Leishmania amazonensis. Culturas de macrófagos humanos expostos a hipóxia antes da infecção com L. amazonensis mostraram redução na porcentagem de células infectadas quando comparadas com culturas de macrófagos humanos que permaneceram em normóxia. Nós também investigamos se a hipóxia estaria inviabilizando a sobrevivência dos macrófagos (teste do MTT) e induzindo a produção da linfocina TNF-a (boiensaio com células L929). Macrófagos humanos submetidos à hipóxia não mostraram diferenças significativas em relação viabilidade quando comparados aos macrófagos que permaneceram em ambiente normóxico culturas de macrófagos humanos estimulados com LPS e submetidos a períodos de hipóxia produziram mais TNF- a do que culturas de macrófagos estimulados com LPS que permaneceram em normóxia. Porém quando infectados com L. amazonensis, macrófagos estimulados com LPS em hipóxia mostraram produção significativamente menor de TNF- a quando comparados a macrófagos não infectados e estimulados por LPS, em ambiente hipóxico. Verificamos também que a produção de TNF- a nas culturas de macrófagos infectados com L. amazonensis, estimuladas com LPS, em hipóxia foi similar a produção de TNF- a dos macrófagos infectados com L. amazonensis, estimulados com LPS, mas que permaneceram em normóxia. Nossos resultados indicam que hipóxia altera a susceptibilidade de macrófagos humanos obtidos de monócitos de sangue periférico para a infecção com L. amazonensis, e que a produção de TNF- a não está envolvida no mecanismo pelo qual estas células controlam a carga parasitária / Abstract: The tegumentary leishmaniasis is a parasitic disease caused by protozoa Leishmania which attacks skin and/or mucosal tissues. The lesions are histologically characterized by degeneration of epidermal and the basal membranes with infiltration of histiocytes, lymphocytes, granuloma and parasite proliferation. Cutaneous lesions are associated with rearrangement of the blood vessels and decreased oxygen diffusion, resulting in a hypoxic microenvironment. Macrophages adapt to hypoxia altering their metabolism, lymphocytes production and phagocytosis activity. In the present study we have compared the effect of hypoxia (6% O2) with normoxia (21% O2) in human macrophages, derived from peripheral blood monocytes, infected with Leishmania amazonensis. Human macrophages exposed to hypoxia before infection with L. amazonensis showed a reduction of the percentage of infected cells. Cell viability was tested by MTT and TNF- a production was detected by bioassay using cell line L929. Human macrophages exposed to hypoxia showed similar viability when compared with human macrophages in normoxia. Human macrophages stimulated with LPS and exposed to hypoxia increased TNF- a production when compared with macrophage timulated by LPS cultured in normoxia. However, macrophage, infected with L. amazonensis stimulated with LPS and exposed to hypoxia showed a reduction in TNF- a production when compared with non infected macrophage, stimulated with LPS and exposed to hypoxia. We also observed that TNF- a production in L. amazonensis infected macrophages stimulated with LPS and exposed to hypoxia was similar to TNF- a production of infected macrophages stimulated with LPS, in normoxia. Our data indicated that hypoxia cam alter human macrophages susceptibility to L. amazonensis infection and no correlation between TNF-a production and control of parasite infection in this cells under hypoxia conditions / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Orientadores: Francesco Langone, Leonilda Maria Barbosa dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T19:17:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RodriguezdelaHoz_CristianeLucia_D.pdf: 3716352 bytes, checksum: 29e8652cc135a71b48d8a6442b69e187 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A isoforma induzível da sintase do óxido nítrico (iNOS) e o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-a) estão envolvidos em processos inflamatórios desmielinizantes como a síndrome de Guillain Barré e seu modelo animal, a neurite experimental auto-imune (EAN). A presença dessas moléculas foi investigada no sistema nervoso periférico de ratos Lewis em diferentes fases da EAN. Raízes nervosas oriundas dos segmentos medulares torácico 12 (T12) a lombar 3 (L3) (raízes adjacentes à intumescência lombar), cauda eqüina e nervos ciáticos foram coletados e processados para dupla imunofluorescência. Paralelamente, esses espécimes foram analisados quanto à desmielinização e degeneração axonal, por meio de histoquímica de Sudan Black e imunofluorescência para neurofilamentos, respectivamente. Todos os animais com EAN apresentaram células inflamatórias com imunorreatividade para iNOS e TNF-a, correspondendo a macrófagos e polimorfonucleares (neutrófilos). Essas células contendo iNOS e TNF-a foram observadas nos ratos Lewis exibindo os primeiros sinais clínicos da EAN. Sua população tornou-se numerosa durante a fase de agravamento do quadro clínico, diminuiu no decorrer da fase de recuperação e não foi observada nos animais clinicamente recuperados. Conforme o estágio da EAN, essas células contendo iNOS e TNF-a foram encontradas nas diferentes regiões nervosas analisadas. No início dos sinais clínicos observou-se algumas células iNOS/TNF-a-imunorreativas em vasos da cauda eqüina e do nervo ciático. Na fase em que os animais apresentaram paraparesia, houve um aumento dessa população celular ao redor de vasos e infiltrados inflamatórios nos gânglios sensitivos, na cauda eqüina e nas raízes nervosas T12-L3. Alterações na bainha de mielina e nos neurofilamentos não foram detectadas. Com a evolução da EAN, os animais desenvolveram paraparesia severa. Nesta fase, numerosas células com imunorreatividade para iNOS e TNF-a distribuíram-se ao redor de infiltrados inflamatórios e no tecido endoneural das raízes espinhais e do nervo ciático. Próximo às regiões de infiltrado, algumas fibras nervosas apresentaram bainha de mielina fragmentada ou mais delgada. Alguns axônios no nervo ciático exibiram imunomarcação dos neurofilamentos menos intensa, fragmentada ou aglomerada. Na fase de recuperação, raras células iNOS/TNF-a-imunorreativas foram encontradas em vasos das raízes nervosas T12-L3 e do nervo ciático. Em algumas raízes da cauda eqüina, essas células foram observadas em maior número. O auge da desmielinização foi verificado no nervo ciático nesse estágio, com a presença de vários fragmentos e ovóides de mielina. Os neurofilamentos imunomarcados, por sua vez, apresentaram-se contínuos, porém mais delgados do que os normais. Na fase de resolução da EAN não foram evidenciadas células duplamente imunorreativas. A bainha de mielina recobrou seu aspecto normal nas raízes nervosas, enquanto que no nervo ciático, bainhas de mielina e neurofilamentos imunomarcados delgados foram observados em meio a bainhas e imunomarcação de neurofilamentos mais grossas. Nossos resultados sugerem uma correlação entre a presença da iNOS e TNF-a nas diferentes regiões nervosas e os sinais clínicos exibidos pelo animal com EAN. Além disso, o acentuado processo desmielinizante que ocorre no nervo ciático é capaz de promover alterações estruturais nos neurofilamentos, provavelmente afetando o funcionamento normal dos axônios / Abstract:Inducible nitric oxide synthase (iNOS) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-a) are involved in inflammatory processes such as Guillain Barré Syndrome and its animal model, Experimental Autoimmune Neuritis (EAN). In this study, the presence of these molecules was investigated in the peripheral nervous systems of Lewis rats at different stages of EAN. Thoracic 12 (T12) to lumbar 3 (L3) spinal roots adjacent to lumbar intumescence, cauda equina and sciatic nerves were obtained and processed for double immunofluorescence. These specimens were also analyzed for myelin and axonal degeneration using Sudan Black histochemistry and neurofilament immunolabelling, respectively. All the immunized animals showed double iNOS and TNF-a immunoreactivity in inflammatory cells such as macrophages and polymorphonuclears (neutrophils). These cells were observed in Lewis rats exhibiting the first clinical signs of EAN. Their population increased during the worsening of the disease, diminished during the recovery phase and had disappeared completely in clinically recovered rats. Depending on the EAN phase, iNOS and TNF-a bearing cells were found in the different regions of peripheral nervous system analyzed. At the onset of clinical signs, some iNOS and TNF-a immunoreactive cells were observed in vessels of the cauda equina and the sciatic nerve. In mildly paraparetic rats, an increase in the amount of these cells around vessels and inflammatory infiltrates in the dorsal root ganglia, cauda equina and T12-L3 spinal roots was observed. Changes in the myelin sheath and neurofilaments were not detected. As the EAN evolved, the rats developed severe paraparesis. At this stage, numerous iNOS and TNF-a bearing cells were observed around inflammatory infiltrates and in the endoneurium of the spinal roots and the sciatic nerve. Some nerve fibers near to infiltrated regions showed a thinner or even fragmented myelin sheath. Some sciatic nerve axons exhibited a less intense, fragmented or clustered neurofilament immunolabelling. During recovery stage, rare iNOS/TNF-a immunoreactive cells were detected in vessels of T12-L3 spinal roots and the sciatic nerve. An increased number of these cells was observed in some nerve fibers of cauda equina. The peak stage of demyelination was verified in the sciatic nerve by the presence of several myelin ovoids. Neurofilaments showed continuous immunolabelling, but were more slender than the neurofilaments in naïve rats. Double-immunoreactive cells were not evidenced during the recovery stage. In nerve roots, the myelin sheath recovered its normal appearance, while in sciatic nerves, slenderer myelin sheaths and immunolabelled neurofilaments were observed among thicker ones. Our results suggest that there is a close association between the presence of iNOS and TNF-a bearing cells in the various regions of the peripheral nervous system and the clinical signs exhibited by the animals. Furthermore, the acute demyelinating process in sciatic nerves also promotes structural changes, probably affecting the normal functioning of axons / Doutorado / Biologia Celular / Doutor em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Wirla Maria da Silva Cunha Tamashiro / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T02:54:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cecilio_CarlaAparecida_D.pdf: 7009820 bytes, checksum: 20e3b071e5deb361ebcb1af96dff15a6 (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Porque as alterações dependentes de idade no sistema imune inato são pouco estudadas, no presente trabalho comparamos macrófagos de camundongos BALB/c jovens (8 semanas de idade) e velhos (72 semanas de idade) quanto às atividade de iNOS e de arginase, bem como a produção de citocinas. Avaliações iniciais realizadas em macrófagos peritoneais (M?P) naïve ou elicitados de camundongos BALB/c jovens mostraram níveis detectáveis de atividade arginase mesmo na ausência de estímulos indutores. Apenas IL-4 induziu aumento da atividade arginase nessas células, enquanto LPS e induziram atividade iNOS. O LPS inibiu a atividade de arginase induzida por IL-4 em e em macrófagos derivados de medula óssea (M?MO). A IL-4 inibiu a produção de NO em M?P naïve e em M?MO, mas não teve efeito em M?P elicitados. A fagocitose de zimosan ou de linfócitos apoptóticos, mas não de Leishmania major, resultou em aumento da atividade arginase em macrófagos elicitados e apenas a fagocitose de zimosan induziu aumento da atividade arginase nos macrófagos naïve. A fagocitose de quaisquer das partículas testadas resultou em aumento de atividade arginase quando IL4 foi adicionada em dose sub-ótima às culturas de M?P; a adição de dose sub-ótima de IFN-? resultou em aumento de atividade arginase apenas em M?P de BALB/c elicitados que fagocitaram Leishmania major. Comparativamente, M?P de camundongos C57BL/6 mostraram atividade arginase muito mais reduzida que os camundongos BALB/c após a fagocitose de qualquer das partículas testadas. A fagocitose de zimosan ou de linfócitos apoptóticos, mas não de L. major, induziu a atividade arginase em M?P elicitados de C57Bl/6 e a adição de IFN-? elevou de modo significativo a atividade arginase nessas células. Da mesma forma que em BALB/c, os M?P de C57BL/6 não mostraram atividade iNOS após a fagocitose de qualquer das partículas testadas, na presença ou ausência de estímulos inflamatórios. Nossos resultados mostram ainda que o envelhecimento altera algumas das atividades de macrófagos de camundongos BALB/c. Nesse sentido, verificamos que M?P de camundongos jovens apresentaram atividade iNOS e arginase mais elevadas do que M?P de camundongos idosos. M?MO de camundongos jovens ou velhos não diferiram significativamente na atividade iNOS, mas a atividade arginase foi mais elevada nos M?MO de animais velhos. A expressão da arginase induzida por IL-4 foi mais elevada em M?P naïve de animais jovens do que de velhos, mas foi igualmente elevada em M?P elicitados e M?MO de camundongos jovens e velhos. Não se observou diferença na expressão de iNOS induzida por IFN-? em M?P ou M?MO de BALB/c jovens ou velhos. A produção de IL-1? induzida por LPS foi mais elevada em macrófagos elicitados de camundongos velhos e a de TNF-? foi mais elevada nos macrófagos elicitados de camundongos jovens. A estimulação de M?MO com LPS resultou apenas em produção de TNF-?, cujos níveis foram mais elevados nas células de camundongos velhos. Nossos resultados apontam diferenças dependentes da idade em macrófagos teciduais e diferenciados in vitro. Com relação aos macrófagos teciduais, as alterações mais notáveis dependentes da idade foram a redução da produção de TNF-? e da atividade de iNOS. Tendo em vista a importância desses dois mediadores para a eficiente eliminação de patógenos, a sua redução em macrófagos de camundongos velhos pode contribuir para a maior susceptibilidade às infecções na velhice / Abstract: Given that the age-dependent changes in the innate immune system are poorly studied in the present study we investigated the activity of iNOS and arginase, as well as cytokine production in macrophages from BALB/c young (8 weeks old ) and old (72 weeks old). Initial assessments carried out on peritoneal macrophages (PM?) or elicited from naive BALB/c mice showed that these young phagocytes have detectable levels of arginase activity, even in the absence of inducing stimuli. Only IL-4 induced increased arginase activity in these cells, while LPS and IFN-? induced iNOS activity. LPS inhibited the arginase activity induced by IL-4 in PM? and macrophages derived from bone marrow (BMM?). IL-4 inhibited NO production in naïve PM? and BMM? in MO, but had no effect on M?P elicited. Phagocytosis of zymosan or apoptotic lymphocytes, but not from Leishmania major, resulting in increased arginase activity in elicited macrophages and only the phagocytosis of zymosan induced an increase in arginase activity in naïve macrophages. Phagocytosis of any of the tested particles resulted in an increase in arginase activity when IL4 was added to sub-optimal dose to cultures of PM?, the addition of sub-optimal dose of IFN-? resulted in increased arginase activity only in PM? of BALB/c elicited that phagocytized Leishmania major. Comparatively, PM? of C57BL/6 showed arginase activity much lower than the BALB/c after the phagocytosis of any of the tested particles. Phagocytosis of zymosan or apoptotic lymphocytes, but not L. major, induced arginase activity in PM? elicited from C57BL/6 and the addition of IFN-? significantly increased arginase activity in these cells. Just as in BALB/c, PM? C57BL/6 iNOS showed no activity after phagocytosis of any particles tested either in the presence or absence of inflammatory stimuli. Our results also show that aging alters some of the activities of macrophages from BALB/c. Similarly, we found that PM? of young mice showed activities iNOS and arginase higher than PM? of old mice. BMM? of young and old mice did not differ significantly in iNOS activity, but arginase activity was higher in BMM? in older animals. The expression of arginase-induced IL-4 was higher in PM? of naïve young mice, but was also high in M?P elicited AND BMM? of young and old mice. No difference was observed in the expression of iNOS induced by IFN-? in both PM? and BMM? of BALB/c young and old. The production of IL-1 ? induced by LPS was higher in elicited macrophages from aged mice and TNF-? was higher in elicited macrophages from young mice. Stimulation of BMM? with LPS only resulted in production of TNF-?, whose levels were higher in cells of aged mice. Our results suggest age-dependent differences in tissue macrophages and differentiated in vitro. With respect to tissue macrophages, the most notable changes were the age-dependent reduction of and activity of iNOS. Given the importance of these two mediators in the efficient elimination of pathogens, the reduction in macrophages of aged mice may explain the increased susceptibility to infections in old age / Doutorado / Imunologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Mário José Abdalla Saad / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campionas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-20T00:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_BrunodeMelo_D.pdf: 4847412 bytes, checksum: e05413650182e8b4049ebd41d6f06e7b (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A ingestão de alimentos ricos em gordura leva à obesidade e inflamação crônica sub-clínica, a qual desenvolve papel importante na resistência à insulina. Aumentados níveis circulantes de citocinas pró-inflamatórias, ácidos graxos livres e lipopolissacarídeos ativam o sistema imune inato, que desencadeia inflamação e aumento na expressão de citocinas, levando à resistência à insulina. Dessa forma, nós investigamos o efeito da modulação da flora intestinal, na resistência à insulina e avaliamos o baço como uma nova fonte de inflamação e células do sistema imune, responsáveis pela resistência à insulina induzida por obesidade, cujas funções ainda não estão completamente determinadas. Para investigar os efeitos da modulação da flora intestinal, nós submetemos camundongos a dieta hiperlipídica com antibióticos ou em regime de pair-feeding por oito semanas e realizamos análises metagenômicas de amostras de DNA provenientes das fezes dos camundongos. A fim de avaliar a influência do baço no metabolismo, nós realizamos esplenectomia em camundongos e induzimos obesidade com a utilização de dieta rica em gordura, além de fazer abordagens proteômicas para determinar novas moléculas que poderiam estar envolvidas na inflamação e migração de células. Em ambos os experimentos, glicose, insulina e citocinas circulantes foram avaliadas, assim como as vias de sinalização da insulina e inflamatória em fígado, músculo e tecido adiposo, como também avaliamos a infiltração de macrófagos no fígado e no tecido adiposo. A flora intestinal estava extremamente modificada pelo tratamento com antibióticos, reduzindo a prevalência de Bacteroidetes e Firmicutes, a quantidade de bactérias no intestino e LPS circulante, bem como glicemia, insulinemia e citocinas. Este quadro também apresentou regulação negativa do TLR4 e redução na inflamação, a qual induziu aumento na sensibilidade à insulina, além da notável redução de macrófagos infiltrados nos tecidos dos camundongos tratados com antibióticos. Em camundongos obesos esplenectomizados, houve grande aumento na sensibilidade à insulina, refletida por redução na glicemia, insulinemia e TNF-'alfa' circulante quando comparado com camundongos obesos. A inflamação estava reduzida no fígado, músculo e tecido adiposo dos camundongos obesos esplenectomizados, e como consequência, a via de sinalização de insulina estava mais ativa em comparação aos camundongos obesos que tiveram os baços mantidos. Também houve uma imensa redução na infiltração de macrófagos, no fígado e no tecido adiposo dos camundongos esplenectomizados após a indução de obesidade, quadro semelhante ao encontrado na indução da infiltração de macrófagos pela lipólise. A análise proteômica do baço indicou que GMF-'gama' está mais expresso nos camundongos obesos em relação aos magros, dado confirmado por immunoblot. Concluindo, a modulação da flora intestinal por uma terapia com antibióticos reduziu os níveis circulantes de LPS, inflamação e infiltração de macrófagos, aumentando a sensibilidade à insulina em camundongos alimentados com dieta hiperlipídica. Além disso, a esplenectomia também reduziu a inflamação e promoveu melhora na sensibilidade à insulina, bem como inibiu a infiltração de macrófagos induzida pela obesidade, fenômeno que pode ser coordenado pelo baço e quimiocinas, e possivelmente pelo GMF-'gama', uma nova proteína, que estariam envolvidas na regulação da migração celular e estabelecimento de resistência à insulina / Abstract: A high-fat diet intake induces obesity and chronic subclinical inflammation, which play important roles in insulin resistance. Increased circulating levels of proinflammatory cytokines, free fatty acids and lipopolysaccharides activate innate immune system, which triggers inflammation and cytokine expression, leading to insulin resistance. Thus, we investigated the effect of gut microbiota modulation, on insulin resistance and evaluated the spleen as a novel source of inflammation and immune cells, responsible for the obesity-induced insulin resistance, which roles are not yet fully understood. To investigate microbiota modulation effects, we submitted Swiss mice to a high-fat diet with antibiotics or pair-feeding for eight weeks and performed metagenomic analyses from mice fecal DNA samples. In order to evaluate the spleen influence over the metabolism, we performed splenectomy in Swiss mice and induced obesity with a high-fat diet and performed proteomic approaches to determine novel molecules that could promote inflammation and immune cell migration. In both experiments, blood glucose, serum insulin and cytokines were evaluated, as well as liver, muscle and adipose tissue insulin and inflammatory signaling pathway, and liver and adipose tissue macrophage infiltration. Gut microbiota was greatly modified by the antibiotic treatment, reducing Bacteroidetes and Firmicutes prevalence, overall bacterial count and circulating LPS, as well as fasting blood glucose and serum insulin and cytokines. It also promoted TLR4 downregulation and reduction in inflammation, which promoted improvement in insulin sensitivity, besides a striking reduction in macrophage infiltration in antibiotic-treated mice. In splenectomized obese mice, a great improvement in insulin sensitivity was seen, reflected by blood glucose, serum insulin and TNF-'alpha' levels reduction. Inflammation was reduced in the liver, muscle and adipose tissue of obese splenectomized mice, in consequence, insulin signaling was improved when compared to obese mice that maintained the spleen. There was an immense reduction in liver and adipose tissue macrophage infiltration in splenectomized mice after obesity induction, which was repeated when we observed lipolysis-induced adipose tissue macrophage infiltration. Spleen proteomic studies indicated that GMF-'gamma' is overexpressed in obese mice compared to lean ones. In conclusion, gut microbiota modulation by antibiotic therapy reduced circulating LPS levels, inflammation and macrophage infiltration, improving insulin sensitivity in mice fed a high-fat diet. In addition, splenectomy also reduced inflammation and promoted insulin sensitization, as well as inhibited obesity-induced macrophage infiltration, which can be ruled by the spleen and chemokines, and possibly by GMF-'gamma', a novel protein, that could be involved in the regulation of cell migration and insulin resistance settlement / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutor em Ciências

Orientadores: Marcus Alexandre Finzi Corat, Anderson de Oliveira Lobo / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-26T10:38:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Paula_MirianMichelleMachadode_M.pdf: 2407271 bytes, checksum: 8f5ae942d781fb23b3d817baa3c8a868 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As promessas da utilização de nanotubos de carbono (CNTs) para fins biomédicos se esbarram em algumas dificuldades. Muitos estudos de nanotoxicologia foram realizados analisando propriedades destes materiais em causar injúrias no tecido vivo. Apesar das evidências da citotoxicidade dos CNTs, existe também um grande número de publicações de estudos de biomateriais baseados em CNTs que suportam sua biocompatibilidade. Segundo Lobo et al, 2009 (1), os nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNT) foram suficientes para obter biocompatibilidade. As estruturas de VAMWCNT alinhados revelaram que um ínfimo contato entre as estruturas das células e a nanotopografia é decisivo para garantir a bioatividade e eficiência no crescimento e espalhamento celular sem produzir efeitos citotóxicos. Resultados do nosso grupo mostrou características da adesão celular em substrato contendo VAMWCNT alinhado através da análise de proteínas envolvidas no mecanismo de adesão, assim como, estudo comparativo de preferência de substrato para proliferação e viabilidade celular onde verificou-se um melhoramento de adesão e espalhamento celular de acordo com o substrato de VAMWCNT utilizado, com ou sem tratamento de funcionalização a plasma de oxigênio. No entanto os substratos de VAMWCNT, apesar de atóxico, parecem provocar mudanças no comportamento celular principalmente no primeiro contato e durante o processo de adesão das células ao substrato. Neste estudo verificou-se que os substratos com VAMWCNT-O promoveram respostas pró-inflamatórias comparado ao controle. Os substratos com tratamento a plasma de oxigênio mostraram promover um maior estimulo celular dos macrófagos quanto a expressão de interleucina 6 além disso, verificou uma correlação entre os substratos hidrofílicos em maior produção de citocinas com o aumento de migração celular de células mononucleares da medula óssea in vivo. Mostrando, assim, que estes substratos podem acarretar uma melhora na estimulação do recrutamento celular e que podem favorecer o processo regenerativo de um tecido lesionado. Estes resultados demonstram um potencial do uso deste biomaterial na medicina regenerativa no futuro / Abstract: The promise of the use of carbon nanotubes (CNTs) for biomedical purposes faces some difficulties. Many studies of nanotechnology has been realized by analyzing the properties of these materials causing tissue injury in vivo. Despite evidence of cytotoxicity of CNTs, there are also a large number of published studies of biomaterials based on CNTs that support the idea of their biocompatibility. According to Lobo et al, 2009 (1), carbon nanotube multi-wall (MWCNT) showed biocompatibility. Vertically aligned VAMWCNT revealed that the contact between the structures of the cells and nanotopography is crucial to ensure bioactivity, cell growing and cell spreading, avoiding cytotoxic effects. Results from our group have showed cell adhesion on substrate containing VAMWCNT, as well as, variability of cell adhesion and spreading according to wet-ability features after oxygen plasma treatment (VAMWCNT-O) and density of the VAMWCNT substrate. However, VAMWCNT-O substrates, although nontoxic, seem to cause changes in cell behavior in the first contact and during the process of cell adhesion to the substrate. To better understand the behavior of cells on the substrates of VAMWCNT-O, in the present study, we analyzed the properties of macrophages to trigger inflammatory response in contact with substrates containing CNTs correlating it with mononuclear bone marrow cells migration. It was found that substrates with carbon nanotubes promoted pro-inflammatory responses compared to the control. The substrates after oxygen plasma treatment showed higher stimulation of macrophages as expression of interleukin 6 and SDF-1. They showed direct correlation with increasing bone marrow cell migration in vitro and in vivo. These substrates leaded to an improvement to cell recruitment and stimulation, which might support the process of regenerating an injured tissue by using them in regenerative medicine / Mestrado / Clinica Medica / Mestra em Clínica Médica