A saliva humana é um fluído, que exerce diversas funções na saúde oral e geral. A análise do proteoma das glândulas salivares em especial da glândula parótida, são importantes para a compreensão das proteínas individuais presentes na saliva humana e do seu comportamento na saúde, para desta forma entender a patogênese de certas doenças. Esse trabalho é um catálogo de todas as proteínas expressas na saliva da glândula parótida de indivíduos saudáveis em fluxo contínuo de alta intensidade (1ml/min), de baixa intensidade (0,25ml/min) e na situação de estresse. Também foram realizadas as análises quantitativas e qualitativas da saliva avaliada em pool salivar ou individualmente. As proteínas foram identificadas através de técnicas em espectrometria de massas. Os resultados mostraram uma grande variação individual e as proteínas identificadas estão envolvidas em numerosos processos celulares, desde função estrutural até atividades catalíticas/enzimáticas. Esse estudo tenta, pela primeira vez, criar um padrão ouro para a coleta salivar, possibilitando a comparação entre pesquisas para melhor compreensão da composição salivar. / Human saliva is a fluid that performs various functions in oral and general health. The analysis of the proteome of the salivary glands, especially the parotid gland, are important to understanding the individual proteins present in human saliva and their behavior in health. This work is a catalog of all the proteins expressed in saliva of the parotid gland of healthy individuals in continuous flow of high intensity (1ml / min), low intensity (0.25ml / min) and in the stress situation. Quantitative and qualitative analyzes of saliva evaluated in a salivary pool or individually were also performed. Proteins were identified by mass spectrometric techniques. The results showed a large individual variation and the proteins identified are involved in numerous cellular processes, from structural function to catalytic / enzymatic activities. This study attempts, for the first time, to create a gold standard for salivary collection, making it possible to compare researches for a better understanding of salivary composition.

O gênero Lactobacillus é o principal grupo de bactérias contaminantes em dornas de fermentação para produção de etanol em larga escala. A alta proliferação destes microrganismos prejudica a viabilidade de cepas de Saccharomyces cerevisiae selecionadas, podendo diminuir a produção de etanol nas dornas de fermentação. Os métodos mais utilizados para identificação destes microrganismos são bioquímicos e moleculares baseados na sequência do DNA, que são muito demorados, onerosos e muitas vezes remetem a resultados ambíguos. MALDI-TOF MS é uma poderosa ferramenta de identificação microbiana e foi testada neste trabalho para identificação de diferentes isolados de Lactobacillus e S. cerevisiae presentes no processo de produção de etanol. Os métodos de preparo e aplicação da amostra para aquisição espectral foram estabelecidos, tanto para bactérias quanto para leveduras. Vinte e sete isolados de Lactobacillus foram identificados pela região 16S rDNA e dois genes housekeeping, pheS e groEL e, três cepas de leveduras selecionadas do processo foram identificadas pela região ITS e 28S nr-LSU. As identificações genômicas foram contrastadas com as identificações obtidas com o perfil proteico por MALDI-TOF MS e 97% dos Lactobacillus tiveram a mesma classificação molecular que o gene pheS, eleito como o mais discriminatório, e 100% das cepas de leveduras foram classificadas como S. cerevisiae por ambas as técnicas. A técnica MALDI- TOF MS se mostrou altamente eficiente para discriminação intraespecífica de leveduras e interespecífica de Lactobacillus, não havendo apenas discriminação para isolados classificados como L. casei pelos genes housekeeping. Além disso, quando comparado o poder discriminatório da técnica MALDI-TOF MS em relação ao banco de dados espectral disponível no Biotyper e, posteriormente, ao banco de dados complementar criado neste trabalho com os microrganismos próprios do processo de produção de etanol, houve um aumento de 57 a 100% das repetições que foram identificadas ao nível de espécie com alta confiabilidade. Desta forma, os resultados deste estudo mostraram que a técnica MALDI-TOF MS pode ser utilizada como uma alternativa rápida e eficaz para identificação de Lactobacillus e Saccharomyces do processo etanólico. / The genus Lactobacillus is the main group of contaminating bacteria in fermentation tanks for large-scale ethanol production. The high proliferation of these organisms affect the viability of selected strains of Saccharomyces cerevisiae, which can reduce the production of ethanol in fermentation tanks. The most used methods for identifying these microorganisms are biochemical and molecular based on DNA sequence, which are very time-consuming, costly and often revert to ambiguous results. MALDI-TOF MS is a powerful microbial identification tool and it was tested in this work to identify different isolates of Lactobacillus and S. cerevisiae present in the ethanol production process. The sample preparation and application in the MALDI plate for spectral acquisition were established for both bacteria and yeasts. Twenty-seven isolates of Lactobacillus were identified by the 16S rDNA region and two housekeeping genes (pheS and groEL genes) and three yeast strains selected from the process were identified by the ITS and 28S nr-LSU regions. The genomic identifications were compared with the MALDI-TOF MS protein profiles and 97% of the Lactobacillus had the same molecular classification as the pheS gene, which was chosen as the most discriminatory gene, and 100% of the yeast strains were classified as S. cerevisiae by both techniques. The MALDI-TOF MS technique proved highly efficient for intraspecific yeast and interspecific discrimination of Lactobacillus, and there was no discrimination for isolates classified as L. casei by housekeeping genes. Furthermore, when compared to the discriminatory power of MALDI-TOF MS technique in relation to spectral database available on Biotyper and subsequently, the complementary database created in this work with the microorganisms themselves in the ethanol production process, there was an increase from 57 to 100% of the repetitions that were identified at the species level with high reliability. Thus, the results of this study showed that the MALDI-TOF MS technique can be used as a fast and efficient alternative for the identification of Lactobacillus and Saccharomyces of the ethanolic process.

INTRODUÇÃO: A endometriose é doença ginecológica prevalente, com intervalo de tempo longo entre o início dos sintomas e o diagnóstico definitivo. A endometriose profunda intestinal se apresenta com sintomas mais severos, e maior morbidade cirúrgica. Um método minimamente invasivo para o diagnóstico precoce se faz necessário, e impediria a progressão para as formas mais profundas da doença. Estudos de biomarcadores com técnicas em proteômica podem trazer melhor entendimento das bases moleculares da doença, possibilidade de diagnóstico precoce, e do desenvolvimento de terapias-alvo. OBJETIVO: Comparar o perfil de expressão de proteínas do endométrio tópico entre pacientes saudáveis e com endometriose profunda intestinal, por técnica de espectrometria de massas shotgun. MÉTODOS: Estudo caso-controle exploratório, com total de 24 pacientes divididas em dois grupos: pacientes com endometriose profunda intestinal com comprovação cirúrgica, e pacientes do grupo controle saúdavel submetidas a cirurgia de laqueadura tubárea. Amostras de endométrio tópico foram obtidas por meio de auxílio de catéter de aspiração. As amostras foram submetidas a extração, digestão, dessalinização peptídica, e analisadas seguindo uma abordagem de espectrometria de massas shotgun, label-free de DDA (aquisição dependente de dados), utilizando o instrumento Orbitrap Elite (Thermo Fisher, EUA). RESULTADOS: a análise proteômica dos resultados foi realizada através do software Progenesis QI (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK), e resultou em um painel de 595 proteínas diferencialmente expressas entre os grupos controle e endometriose. Os resultados revelaram diferentes moléculas de acordo com a fase do ciclo menstrual, e o estádio da doença. As principais proteínas com expressão aumentada no grupo de pacientes com endometriose incluíram SETSIP, SRRM2, CAPS, H2AFV e SAFB, enquanto moléculas reguladas negativamente incluíram BPIFB1, FAM184A, SLPI, PIGR, JCHAÍNA, HLA-A e LTF. As proteínas diferenciais entre os grupos apresentaram o câncer como principal doença associada (p - valor de 4,14E-02 - 3,91E-08), de acordo com as análises realizadas pelo software IPA (Ingenuity Pathway Analysis System; Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA). As principais proteínas com expressão aumentada nos estádios mais avançados da doença foram CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6, e foram descritas relacionadas a metástases e pior prognóstico de diversos tipos de cânceres. CONCLUSÃO: CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6 são proteínas com expressão aumentada no endométrio das pacientes portadoras de endometriose profunda intestinal em estádios avançados. O presente estudo revelou proteínas diferencialmente expressas na endometriose em associação com diversos tipos de cânceres. Os achados constituem possíveis marcadores para o desenvolvimento de técnicas para o diagnóstico minimamente invasivo, e potenciais alvos terapêuticos para a doença / INTRODUCTION: Endometriosis is a prevalent gynecological disease, with a long time elapsed from onset of symptoms to definitive diagnosis. Deep intestinal endometriosis presents with more severe symptoms, and greater surgical morbidity. A minimally invasive method for early diagnosis becomes necessary and would prevent progression to the deeper presentations of the disease. Studies of biomarkers with proteomics techniques can provide a better understanding of the molecular basis of the disease, the possibility of early diagnosis, and the development of targeted therapies. OBJECTIVE: To compare the expression of eutopic endometrial proteins between healthy and deep intestinal endometriosis patients, using a shotgun mass spectrometry technique. METHODS: An exploratory case-control study with a total of 24 patients divided in two groups: patients with intestinal deep endometriosis with surgical confirmation, and patients in the healthy control group submitted to tubal ligation surgery. Eutopic endometrial samples were obtained by aspiration catheter. The samples were submitted to extraction, digestion, peptide desalting and analyzed using a DDA (data-dependent acquisition) label-free mass spectrometry approach by the Orbitrap Elite instrument (Thermo Fisher, USA). RESULTS: Proteomic analysis was performed using the Progenesis QI software (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK) to profile 595 differentially expressed proteins between the control and endometriosis groups. The results revealed different molecules according to the phase of the menstrual cycle and stage of disease. Top upregulated molecules included SETSIP, SRRM2, CAPS, H2AFV, and SAFB, whereas downregulated molecules included BPIFB1, FAM184A, SLPI, PIGR, JCHAIN, HLA-A, and LTF. Among top diseases associated molecules between groups were related to cancer (p - value of 4.14E-02 - 3.91E-08), according to the analysis performed by IPA software (Ingenuity Pathway Analysis System, Ingenuity Systems, Redwood City, CA, USA). Top upregulated proteins among patientes with advanced stage of endomeriosis were CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6. Those proteins were related to metastasis and poor survival of several cancer types. CONCLUSION: CHMP4B, DES, EIF3I, CDH13, LIMS1, HSPA4, HSP90AB1, TUBB, NPM1, MYL6 are among the top upregulated proteins in patients with advanced stage of deep intestinal endomeriosis. The present study revealed proteins differentially expressed in endometriosis as potential biomarkers for the development of techniques for minimally invasive diagnosis, and potential therapeutic targets for the disease

A metabolômica é uma ciência emergente na era pós-genômica que almeja a análise abrangente de pequenas moléculas orgânicas em sistemas biológicos. Técnicas de cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC-MS) figuram como as abordagens de amostragem mais difundidas. A extração e detecção simultânea de metabólitos por LC-MS produz conjuntos de dados complexos que requerem uma série de etapas de pré-processamento para que a informação possa ser extraída com eficiência e precisão. Para que as abordagens de perfil metabólico não direcionado possam ser efetivamente relacionadas às alterações de interesse no metabolismo, é estritamente necessário que os metabólitos amostrados sejam anotados com confiabilidade e que a sua inter-relação seja interpretada sob a pressuposição de uma amostra conectada do metabolismo. Diante do desafio apresentado, a presente tese teve por objetivo desenvolver um arcabouço de software, que tem como componente central um método probabilístico de anotação de metabólitos que permite a incorporação de fontes independentes de informações espectrais e conhecimento prévio acerca do metabolismo. Após a classificação probabilística, um novo método para representar a distribuição de probabilidades a posteriori em forma de grafo foi proposto. Uma biblioteca de métodos para o ambiente R, denominada ProbMetab (Probilistic Metabolomics), foi criada e disponibilizada de forma aberta e gratuita. Utilizando o software ProbMetab para analisar um conjunto de dados benchmark com identidades dos compostos conhecidas de antemão, demonstramos que até 90% das identidades corretas dos metabólitos estão presentes entre as três maiores probabilidades. Portanto, pode-se enfatizar a eficiência da disponibilização da distribuição de probabilidades a posteriori em lugar da classificação simplista usualmente adotada na área de metabolômica, em que se usa apenas o candidato de maior probabilidade. Numa aplicação à dados reais, mudanças em uma via metabólica reconhecidamente relacionada a estresses abióticos em plantas (Biossíntese de Flavona e Flavonol) foram automaticamente detectadas em dados de cana-de-açúcar, demonstrando a importância de uma visualização centrada na distribuição a posteriori da rede de anotações dos metabólitos. / Metabolomics is an emerging science field in the post-genomic era, which aims at a comprehensive analysis of small organic molecules in biological systems. Techniques of liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS) figure as the most widespread approaches to metabolomics studies. The metabolite detection by LC-MS produces complex data sets, that require a series of preprocessing steps to ensure that the information can be extracted efficiently and accurately. In order to be effectively related to alterations in the metabolism of interest, is absolutely necessary that the metabolites sampled by untargeted metabolic profiling approaches are annotated with reliability and that their relationship are interpreted under the assumption of a connected metabolism sample. Faced with the presented challenge, this thesis developed a software framework, which has as its central component a probabilistic method for metabolite annotation that allows the incorporation of independent sources of spectral information and prior knowledge about metabolism. After the probabilistic classification, a new method to represent the a posteriori probability distribution in the form of a graph has been proposed. A library of methods for R environment, called ProbMetab (Probilistic Metabolomics), was created and made available as an open source software. Using the ProbMetab software to analyze a set of benchmark data with compound identities known beforehand, we demonstrated that up to 90% of the correct metabolite identities were present among the top-three higher probabilities, emphasizing the efficiency of a posteriori probability distribution display, in place of a simplistic classification with only the most probable candidate, usually adopted in the field of metabolomics. In an application to real data, changes in a known metabolic pathway related to abiotic stresses in plants (Biosynthesis of Flavone and Flavonol) were automatically detected on sugar cane data, demonstrating the importance of a view centered on the posterior distribution of metabolite annotation network.

Apesar da importância econômica e ambiental que a madeira representa como fonte natural e renovável de energia e fibras, pouco é conhecido sobre os processos celulares, moleculares e bioquímicos envolvidos com a sua formação. Usando metodologias proteômicas como 2D-PAGE e espectrometria de massas foi iniciada a análise do proteoma do caule de Eucalyptus grandis em diferentes estádios de desenvolvimento (5 meses, 3 anos e 6 anos). O presente trabalho baseou-se especificamente na idade de cinco meses. As plantas tiveram suas folhas, raízes e cascas removidas e seus caules foram macerados em almofariz com nitrogênio líquido e as proteínas extraídas pelo método de extração fenólica. As proteínas foram separadas por eletroforese bidimensional em fitas IPG com gradiente de pH imobilizado linear de 4-7 na primeira dimensão e gel de poliacrilamida (12,5%) na segunda dimensão. A coloração dos géis foi realizada com coomassie G250. Foram detectados 438 spots e um total de 168 spots foram retirados do gel, digeridos com tripsina e submetidos ao sequenciamento por espectrometria de massas através do sistema LCMS/ MS. O sequenciamento por MS apresentou uma eficiência de 72,02% possibilitando a identificação de 121 spots, enquanto que 35 (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados. Entre as proteínas identificadas 22 foram representadas por mais de um spot, podendo indicar a ocorrência e eventos provenientes do splicing alternativo, modificações pós-traducional, variações alélicas de uma mesma proteína ou degradação da amostra. Entre os spots analisados, 22,02% estão relacionados com a produção de energia, (17,86%) metabolismo, (13,69%) processes celulares, (0,60%) transporte, (8,33%) componentes estruturais, (5,36%) metabolismo macromolecular, (4,17%) proteínas putativas, (20,83%) não apresentaram homologia com nenhuma base de dados e (7,14%) não demonstraram resultado. A comparação realizada entre o volume de 59 proteínas e os seus respectivos transcritos demonstrou que não existe correlação entre mRNA e as proteínas do caule. O método possibilitou uma rápida e precisa separação e identificação das proteínas do caule de Eucalyptus grandis que são diferencialmente expressas durante a fase de crescimento de cinco meses. / The process of wood formation is an important economical factor for the forestry industry and it is also of ecological importance, although little is known about the proteins involved in wood formation. The sequencing, identification and analysis of proteins provides such information of wood formation. Using proteomics techniques such as two-dimensional gel electrophoresis and mass spectrometry we have started a proteomic analysis of wood formation in Eucalyptus grandis at different stages of development (5 months, 3 and 6 years old). This work presents data related to the stage of 5 months. Using high resolution 2DE with linear pH gradient ranging from 4 to 7, a total of 438 spots were detected. However, only 168 spots were analyzed by LC ESIMS/ MS and 121 were identified (72.02%) while 35 (20.83%) presented no homology in the database used. Overall, 22 proteins appeared as multiple spots and accounted for most of the proteins found in the group. This observation may reflect post-translation modification, alternative splicing events, isozyme variation, allelic variation of the same protein, but also protein degradation. Over the 168 spots analysed, (22.02%) play a role in energy, (17.86%) metabolism, (13.69%) cellular processes, (0.60%) transport, (8.33%) structural components, (5.36%) macromolecular metabolism, (4.17%) putative protein, (20.83%) no homology and (7.14%) no result. For 59 proteins, the spot volume was compared with their respective transcript with mRNAs extracted from wood forming tissue. The method provided a faster and accurate tool for separation and identify of protein which are differentially expressed under different stages of development in Eucalyptus grandis.

Globalmente, os problemas de poluição são mais severos em regiões densamente povoadas ou industrializadas. A Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) é um exemplo de megalópole com um conjunto único de emissões, insolação e condições meteorológicas que determinam sua elevada poluição atmosférica. Entre os compostos mais tóxicos presentes nesta atmosfera estão os aldeídos, moléculas de grande potencial mutagênico e carcinogênico que podem ser originados da oxidação de combustíveis fósseis e etanol, além de possuir fontes endógenas. Sua adição covalente em biomoléculas como DNA e proteínas é estudada como mecanismo de sua ação mutagênica e carcinogênica. Desenvolvemos um método ultrassensível de HPLC acoplado à espectrometria de massas para análise simultânea de vários adutos de DNA com aldeídos presentes na atmosfera urbana como formaldeído, acetaldeído, crotonaldeído e acroleína, além de modificações oxidativas. Foram utilizados para validação da metodologia células modelo de Anemia Fanconi e tecido de músculo de ratos modelo para ELA (Esclerose Lateral Amiotrófica), os quais apresentaram níveis basais dos adutos de formaldeído, acetaldeído, acroleína e crotonaldeído. Outros modelos de exposição aos aldeídos foram utilizados na validação desta metodologia, como a fumaça de cigarro de tabaco e de cannabis sendo que a formação desses adutos também foi verificada em DNA de timo de bezerro. Pela primeira vez, foi mostrada a formação inequívoca do aduto de acetaldeído (1,N2-propanodGuo) em pulmões e cérebros de ratos Wistar expostos à 10 ppb de acetaldeído isotopicamente marcado e sua estrutura confirmada por espectrometria de massas de alta resolução. Esse resultado comprova o mecanismo de formação do aduto por meio da adição de duas moléculas de acetaldeído in vivo por inalação e em baixa concentração, sendo crucial para formulação de políticas públicas por agências ambientais. / Globally, air pollution problems are more severe in densely populated or industrialized regions. The Metropolitan Region of São Paulo (RMSP) is an example of a megalopolis with a unique set of emissions, insolation and meteorological conditions that determinates its high atmospheric pollution. Among the most toxic compounds present in this atmosphere are aldehydes, molecules of great mutagenic and carcinogenic potential that can be originated from the oxidation of fossil fuels and ethanol, besides having endogenous sources. Its covalent addition in biomolecules like DNA and proteins is studied as a mechanism of its mutagenic and carcinogenic action. We developed an ultra-sensitive HPLC method coupled with mass spectrometry for the simultaneous analysis of several DNA adducts with aldehydes present in the urban atmosphere as formaldehyde, acetaldehyde, crotonaldehyde and acrolein and oxidative lesions as well. To validate the method, we used a cell model of Fanconi Anemia and muscle tissue from a rat model for ALS (Amyotrophic Lateral Sclerosis) which presented basal levels of the adducts of formaldehyde, acetaldehyde, acrolein and crotonaldehyde. Other models of exposure to aldehydes were used to validate the method, such as tobacco and cannabis smoke and the formation of these adducts was also verified in Calf Thymus DNA. For the first time, the unequivocal formation of the acetaldehyde (1, N2-propanodGuo) adduct was shown in lungs and brains of Wistar rats exposed to 10 ppb of isotopically labeled acetaldehyde and its structure was confirmed by high resolution mass spectrometry. This result confirms the mechanism of adduct formation by the addition of two molecules of acetaldehyde in vivo by inhalation of a low concentration of acetaldehyde, being crucial for the formulation of public policies by environmental agencies.

O Brasil é um país de vocação florestal, mantendo atualmente grandes áreas reflorestadas com Eucalyptus, cuja madeira é utilizada como matéria-prima em diversas indústrias de base florestal. A projeção é de uma crescente demanda de madeira e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira para um produto final. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário, tecido que constitui a madeira. O desenvolvimento de tecnologias proteômicas, que permitem analisar os genes diretamente ao nível de seus produtos, pode contribuir para o maior entendimento dos processos relacionados à formação da madeira. O objetivo principal deste trabalho foi identificar as proteínas mais abundantemente expressas na região cambial, envolvidas na formação da madeira de Eucalyptus grandis, aos 6,3 anos de idade. A região cambial foi caracterizada por células do câmbio e por células diferenciadas em floema e xilema secundários. A amostragem foi realizada por meio da abertura de painéis nas árvores, seguido da raspagem de sua casca interna e da superfície do fuste. Foram testados dois métodos de extração de proteínas, que utilizam ácido tricloroacético e fenol, respectivamente, a fim de avaliar qual deles proporciona a obtenção de extratos protéicos concentrados e livres de contaminantes. Ensaios foram realizados para ajustar o tempo e o tampão de focalização isoelétrica das proteínas. Um extrato contendo cerca de 500 μg de proteínas foi utilizado para a preparação dos géis 2D de pH 4-7. Dois tipos de coloração de géis foram avaliados. Os spots foram recortados para proceder a digestão tríptica das proteínas. A solução contendo os peptídeos de uma amostra foi analisada por espectrometria de massa. As seqüências experimentais foram contrastadas com uma base de seqüências peptídicas e um banco de ESTs espécie-específico. As imagens dos géis bidimensionais foram analisadas, com a finalidade de fazer inferências sobre o nível de expressão de cada proteína identificada na região cambial, como também correlacioná-la com a expressão de seu transcrito correspondente. O método com fenol mostrou-se o mais eficiente para extrair proteínas da região cambial. Foi observado que as proteínas foram totalmente focalizadas a 74.000 Vh. A coloração com Coomassie Brilliant Blue G-250 permitiu a revelação de um número maior de spots e mostrou-se compatível com a espectrometria de massa. A análise LC/MS/MS das amostras permitiu a identificação de 69 spots, correspondendo a 41 proteínas distintas da região cambial, sendo 34,15% delas, representadas em múltiplos spots, As proteínas identificadas exercem seu papel biológico na produção de energia (22%), em processos celulares (19,5%), como componentes estruturais (17,1%), nos metabolismos de aminoácidos (14,6%) e macromolecular (19,5%), e no transporte de moléculas (2,4%). Oito spots mostraram similaridade de seqüências em ambas bases de dados, mas nenhuma função foi atribuída a eles. A análise da correlação revelou uma tendência para um grupo restrito de proteínas, de que os transcritos que se mostraram pouco abundantes corresponderam a proteínas altamente expressas na região cambial. / Brasil is a country with forestry inclination, currently keeping large areas planted with Eucalyptus, which wood is used as raw material in several forest-based industries. The projection is an increasing demand of wood and, as a function of it, it is necessary to link new strategies to the programs of genetic improvement that result not only in the increase of the productivity, but also in the adequacy of characters of wood quality for a final product. The wood quality depends on several properties of secondary xylem, a tissue that forms the wood. The development of proteomic technologies, which permit to analyze directly the genes at their products’ level, can contribute to a better comprehension of the processes related to the wood formation. The main objective of this work was to identify the most abundant proteins expressed in the cambial region that are involved in the Eucalyptus grandis wood formation at 6.3 years of age. The cambial region was characterized by cambium cells differentiated into secondary phloem and xylem. The sampling was performed by means of opening panels in the trees, followed by rubbing their internal barks and the stem surface. Two protein extraction methods were tested. These methods use trichloroacetic acid and phenol, respectively, in order to evaluate which one proportionates the acquisition of concentrated proteic extracts and is free from contaminants. Essays were performed to adjust the time and the buffer for isoelectric focus of proteins. Extracts containing around 500 μg of protein were used to prepare 2D gels with pH ranging from 4 to 7. Two types of gel staining were evaluated. The spots were cut out in order to obtain the tripitic digestion of the proteins. The solution containing peptides from each sample was analyzed by mass spectrometry. The experimental sequences were contrasted in a peptidic sequences base and in a speciespecific ESTs. The bidimensional gels images were analyzed in order to make inferences about the level of expression of each protein identified in the cambial region, as well as to correlate them with the expression of its corresponding transcript. The method using phenol showed to be more efficiently to extract proteins from the cambial region. It was observed that the proteins were totally focused at 74,000 Vh. The staining with Coomassie Brilliant Blue G-250 allowed the revealing of a higher number of spots and showed to be compatible with mass spectrometry. The LC/MS/MS sample analyses allowed the identification of 69 spots, corresponding to 41 different proteins from the cambial region, where 34.15% of them were represented in multiple spots. The identified proteins play their biological role in the production of energy (22%), in cellular processes (19.5%), as structural components (17.1%), in metabolism of aminoacids (14.6%) and macromolecular metabolism (19.5%), and in the transportation of molecules (2.4%). Eight spots showed similarity in sequences in both databases, but no function was attributed to them. The correlation analysis revealed a tendency for a restrict group of proteins, whose transcripts showed a little abundant, corresponds to proteins highly expressed in the cambial region.

Os frutos de S. saponaria, espécie bastante abundante em São Carlos e outras regiões do Brasil são ricos em glicosídeos anfifílicos, ou seja, compostos por uma parte polar e outra apolar. Devido a esta peculiaridade tendem a formar espuma mostrando propriedades químicas semelhantes às dos tensoativos. Alguns destes glicosídeos pertencem à classe das saponinas e são constituídos por uma aglicona de estrutura carbônica a qual está ligada a uma ou duas cadeias de açúcar. O interesse pelas propriedades tensoativas deste glicosídeos motivou o estudo destas substâncias para uso em eletroforese capilar. Os frutos foram extraídos com metanol e fracionados em coluna cromatográfica preparativa utilizando sephadex LH-20 como fase estacionária. Após a eluição, as frações foram analisadas por espectrometria de massas e estudadas por eletroforese capilar. A eletroforese capilar de zona mostrou-se uma técnica viável para o estudo das frações obtidas. Embora um grau de pureza elevado não tenha sido alcançado, a fração B foi utilizada como aditivo para tampão em cromatografia eletrocinética micelar (MEKC) e uma interação diferenciada foi observada do nitrobenzeno com o tampão aditivado em relação ao tampão com SDS puro. / Sapindus saponaria is a very abundant species in São Carlos and others regions of Brazil. Fruits of S. saponaria have a high content of glycosides which possess well-defined regions of hydrophobic and hydrophilic feature denominated amphiphilic molecule. Thus, this can form a foam showing chemical proprieties equals to surfactants. Some glycosides belong to class of saponins and are composed of carbonic structure designates aglycone, which is linked in one or two sugar chains. The purpose of the present study was the use of glycosides due to their surfactants properties in further applications of capillary electrophoresis. The extraction of crude fruits was carried out with methanol and this extract was fractionated in Sephadex LH-20. The fractions were analyzed for mass spectrometry and studied in capillary electrophoresis (CE). This is a feasible technique for the study of fractions obtained. Although a high degree of purity was not reached, the fraction B were used as additive for the electrolyte background in MEKC. The nitrobenzene showed different interaction with micellar system in the electrolyte background with fraction B.

During the last 21,000 years, the planet underwent major changes. The atmospheric CO2 concentration increased ∼50% (Monnin et al., 2001) and the mean global temperature increased 4.0±0.8°C until pre-industrial times (Annan and Hargreaves, 2013). As a consequence of this warming, the huge ice sheets that covered North America, Northern Europe and part of Eurasia melted and the polar and subpolar ocean surface received a large amount of freshwater from these retracting ice sheets. The input of freshwater alters pressure gradients on the sea surface and also the density of water masses. Since the ocean circulation is partially driven by density differences, the deglacial meltwater has the potential to affect the ocean circulation. In this PhD thesis, the impacts of meltwater input since the Last Glacial Maximum into the high latitudes, especially of the Atlantic Ocean, are studied using the results of a transient simulation of the last 22 thousand years with NCAR-CCSM3. The main results show that: (1) the Atlantic Meridional Overturning Circulation (AMOC) slowed down during freshwater discharge events near dense water formation regions; (2) North Atlantic Deep Water (NADW) was absent in the beginning of the deglaciation, while its intermediate version -- Glacial North Atlantic Intermediate Water (GNAIW) -- was being formed; (3) GNAIW was a fresh and cold water mass, very similar to the Antarctic Intermediate Water (AAIW) in the thermohaline domain; (4) the deep and abyssal Atlantic basin was dominated by AABW in the first half of the simulation; (5) the transition from GNAIW to NADW occurred after the Heinrich Stadial 1; (6) when the NADW appeared, around 12 thousand years ago (ka), AABW retracted and was constrained to lie near the bottom; (7) the presence of a low-salinity layer in the Southern Ocean surface around ∼14,000 years ago prevented the release of heat from deep waters to the atmosphere, warming the AABW; (8) the Antarctic Coastal Current (ACoC) was reinforced by the meltwater discharge from the Antarctic ice sheet. Using the Indian Ocean as a comparison, it was observed that the North Atlantic affected the western tropical Indian through atmosphere, while climatic variations associated with the Southern Hemisphere were transmitted via ocean -- especially through intermediate waters. Although the initial conditions in the glacial and modern ocean are different, this study may be used to foresee the possible responses of the ocean to the accelerated melting of glaciers and ice sheets, which are associated with dramatic climate changes. / Durante os últimos 21.000 anos, o planeta sofreu grandes mudanças. A concentração de CO2 atmosférico aumentou cerca de ∼50% (Monnin et al., 2001) e a temperatura média global aumentou 4,0±0,8°C até a época pré industrial (Annan and Hargreaves, 2013). Como consequência deste aquecimento, os grandes mantos de gelo que cobriam a América do Norte, o norte da Europa e parte da Eurásia derreteram e o oceano polar e subpolar recebeu grandes quantidades de água doce destes mantos em retração. A entrada de água doce altera gradientes de pressão na superfície do mar e também a densidade de massas de água. Como a circulação oceânica é parcialmente forçada por diferenças de densidade, a água de degelo tem o potencial de afetar esta circulação. Nesta tese de Doutorado, os impactos da entrada de água de degelo no oceano desde o Último Máximo Glacial em altas latitudes, especialmente do Oceano Atlântico, são estudados usando os resultados de uma simulação transiente dos últimos 22 mil anos com o modelo NCAR-CCSM3. Os principais resultados mostram que: (1) a circulação de revolvimento meridional do Atlântico enfraqueceu durante eventos de descarga de água doce próxima a regiões de formação de água densa; (2) a Água Profunda do Atlântico Norte (APAN) estava ausente no começo da deglaciação, enquanto sua versão intermediária -- Água Glacial Intermediária do Atlântico Norte (AGIAN) -- era formada; (3) AGIAN era uma massa d\'água doce e fria, semelhante à Água Intermediária Antártica (AIA) no domínio termohalino; (4) as camadas profundas e de fundo da bacia do Atlântico eram dominadas pela Água de Fundo Antártica (AFA) na primeira metade da simulação; (5) a transição de AGIAN para APAN ocorreu após o Heinrich Stadial 1; (6) quando a APAN apareceu, cerca de 12 mil anos atrás (ka), a AFA retraiu e ficou limitada às camadas de fundo; (7) a presença de uma camada de baixa salinidade na superfície do Oceano Austral há ∼14 mil anos impedia a liberação de calor das águas profundas para a atmosfera, aquecendo a AFA; (8) a Corrente Costeira Antártica foi intensificada pela descarga de água de degelo proveniente do manto de gelo Antártico. Usando o Oceano Índico como comparação, foi observado que o Atlântico Norte afetou o Índico oeste tropical através de processos atmosféricos, enquanto variações climáticas associadas ao Hemisfério Sul foram transmitidas via oceano -- especialmente através das camadas intermediárias. Embora as condições iniciais dos oceanos glacial e moderno sejam diferentes, este estudo pode ser usado para prever as possíveis respostas do oceano ao presente derretimento acelerado de geleiras e mantos de gelo associado a mudanças climáticas abruptas.

A presença de nove ésteres (acetato de etila, butanoato de etila, hexanoato de etila, lactato de etila, octanoato de etila, nonanoato de etila, decanoato de etila, octanoato de isoamila e dodecanoato de etila) foi investigada por cromatografia gasosa hifenada à espectrometria de massas via injeção direta de amostras (ID-CG-EM). Cento e trinta e seis amostras de aguardente de cana foram coletadas durante sua destilação em diferentes produtores em diferentes cidades localizadas no interior do estado de São Paulo. Também foram analisadas 21 amostras de cachaça comercial, 10 amostras de rum e 10 amostras de uísque importados e obtidos em lojas \"duty free shop\". A metodologia analítica desenvolvida para análise de ésteres demonstrou-se apropriada para a determinação destes compostos em bebidas destiladas, sendo simples (injeção direta), seletiva e relativamente rápida. Apresentou baixos limites de detecção e quantificação e boa repetibilidade. O acetato de etila é o principal éster presente nas bebidas destiladas seguido pelo lactato de etila. Em todas as amostras de bebidas destiladas analisadas neste trabalho foi detectada a presença do éster lactato etila. A presença deste éster está relacionada com a contaminação do mosto por bactérias (Lactobacillus spp) responsáveis pela fermentação láctica. A concentração de lactato de etila nas amostras de cachaça e rum é muito superior à encontrada nas amostras de uísque. A análise multivariada dos resultados analíticos aplicada ao banco de dados dos ésteres juntamente com as concentrações de carbamato de etila e benzaldeído levaram à formação de dois grupos bem distintos: amostras destiladas em alambiques de cobre e amostras destiladas em colunas de aço inox. Os modelos estatísticos gerados pelas análises exploratórias de PCA, PLS e LDA utilizando o carbamato de etila, benzaldeído, decanoato de etila e o dodecanoato de etila como discriminantes revelaram ser possíveis a diferenciação entre estes dois grupos de destilados com uma porcentagem de acerto de 81% para PCA, 78,4 % para a PLS e 97,6% para LDA. Os métodos cromatográficos sugeridos pelo Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) para a determinação de ésteres não englobam o monitoramento do lactato de etila, subestimando o resultado final. / The presence of nine esters (ethyl acetate, ethyl butanoate, ethyl hexanoate, ethyl lactate, ethyl octanoate, ethyl nonanoate, ethyl decanoate, isoamyl octanoate, and ethyl dodecanoate) was investigated by gas chromatography hyphenated to a mass spectrometry through sample direct inject (DI-GC-MS). One hundred and thirty six sugar cane spirits collected immediately after its distillation from different producers and different cities located in the countryside of São Paulo state. Also, it was analyzed 21 commercial samples of cachaça, 10 samples of rum and 10 samples of whiskey imported and purchased from the duty free shop. The analytical method applied to esters analysis was appropriated for the determination of these compounds in distilled spirits, since it is simple (direct inject), selective and reasonably fast. It presented low detection and quantification limits and good reproducibility. Ethyl acetate is the main ester present in the distilled spirits followed by ethyl lactate. Ethyl lactate was detected in all the distilled beverage samples analyzed herein. The occurrence of this ester is related to bacterial contamination of must (Lactobacillus spp) responsible for the lactic fermentation. The ethyl lactate content in cachaça and rum samples are superior that presented by whiskey samples. The multivariate analysis of the analytical results applied to the esters data set jointly with the content of ethyl carbamate and benzaldehyde lead to the clustering of two quite distinct groups: sugar cane spirits distilled in copper alembic and sugar cane spirits distilled in stainless steel column. The resulting statistical model generated by PCA, PLS and LDA exploratory analysis employing ethyl carbamate, benzaldehyde, ethyl decanoate, and ethyl dodecanoate as discriminators was able to distinguish between these two groups with a accuracy of 81 % for PCA, 78,4 % for PLS and 97,6 % for LDA. The chromatographic method recommended by the Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) for the esters determination does not include the monitoring of ethyl lactate leading to a underestimating of the final result.