Orientadores: Nelci Fenalti Hoehr, Marcos N. Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T15:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vellasco_AdrianaPaula_M.pdf: 26494237 bytes, checksum: e3ca52142658174c0e80e93ec61ac27d (MD5) Previous issue date: 2002 / Resumo: Dentre os aminotiois encontrados no plasma a cisteína, homocisteína e a glutationa constituem um sistema de defesa antioxidante extracelular. Em concentrações elevadas a homocisteína exerce ação oxidante, o que induz a formação de espécies reativas de oxigênio (ERO) sendo que a cisteína participa da autoxidação da homocisteína. Aumento dos níveis de cisteína pode ser um fator de risco cardiovascular bem como de lesões ateroscleróticas, indicando sua associação independente à doenças cardiovasculares. Contudo a associação de altos níveis de cisteína, homocisteína e LDL colesterol podem agir sinergicamente. Níveis alterados de cisteína também estão relacionados a inúmeras condições patológicas como mutações gênicas, doenças neurodegenerativas tais como as doenças de Alzheimer, Parkinson e Neuromotoras; AIDS e câncer. Assim, o desenvolvimento de novas metodologias com a finalidade de quantificar cisteína em sangue ou urina são úteis no diagnóstico de diversas doenças. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um método moderno e viável para quantificação de cisteína sérica. Para isso empregamos uma nova técnica: espectrometria de massas por introdução via membrana (MIMS), utilizando-se uma sonda de membrana DIMP (Direct Introduction Mass Spectrometry) operando no método T&R-MIMS (Trap and Release Membrane Introduction Mass Spectrometry). Analisando os espectros de massas obtidos durante as análises, a escolha do íon para o monitoramento da quantificação de cisterna foi o de m/z 220 que corresponde ao fragmento molecular por perda de um hidrogênio formando o íon '[M -H] POT +'. O íon de m/z 220 é o de maior intensidade (pico base) e presente em uma região do espectro menos suscetível a interferentes. Seu monitoramento por T&R-MIMS operando no modo SIM (monitoramento seletivo de íons) permite determinar a concentração de cisteína. Os resultados obtidos se mostraram satisfatórios: linearidade (r=0,998), repetibilidade com um desvio de 3% entre três medidas realizadas; limite de detecção de 2'mu'M e recuperação acima de 95%. Foram também realizados ensaios com amostras sanguíneas de quarenta doadores voluntários onde a concentração total de Cis em soro ficou entre 87 e 266 'mu' M/L com uma média '+ ou -' de 143, '+ ou -' 52,2 'mu'M/L / Abstract: The amino acid cysteine (Cys) and homocysteine (Hcy) takes part of a group of biological aminothiols in blood and others physiological fluids. These three thiols are involved in cellular homeostasis however altered levels of Cys and Hcy have been implicated in cardiovascular risk factor, and in a number of pathological conditions. A Mass Spectrometry method (DIMP/T&R-MIMS) for determination of cysteine (tCys) and homocysteine (tHcy) concentration directly from human blood after derivatization with ethyl chloroformate based on analyte preconcentration in a capillary silicone membrane and thermal desorbed to the gas phase using the heat radiation from the ionization filament using a new strategy for a trap & release and removable direct introduction membrane probe (DIMP), resulting in an technique with good sensitivity and stability. Cysteine and homocysteine determination was carried sample pumped continuously through the probe of the T&R-MIMS system for quantitation, during fifteen minutes (trapping step). After that occurs thermal desorption step needed for SVOC analysis in contact with the membrane, the volatile compounds permeates the membrane, and is ionized by electron impact (EI) and analyzed in the mass spectrometer. The method uses no chromatographic separation, is linear, reproducible, and displays limit of quantitation (2 'mu¿M) sufficiently below the threshold concentration of tCys and tHcy in plasma. Recovery experiments showed recoveries of 95% by Cys and 97% by Hcy. It also combines chemical, membrane, and mass spectrometric discrimination, and can be used to determine selected amino acids in human plasma simultaneously. After derivatization with ethyl chloroformate, many amino acids in aqueous solution are observed to be efficiently detected; hence T&R-MIMS is promising as a simple and sensitive technique for simultaneous quantitation of selected amino acids in plasma and urine, and in other aqueous matrices. Blood samples was analyzed by direct SIM monitoring and results showed with DIMP/T&R-MIMS potentiality in complex matrices / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Fábio Cesar Gozzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T16:09:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Koolen_HectorHenriqueFerreira_D.pdf: 16550075 bytes, checksum: 0fafb8ced0640f9080c108d7cb303ac4 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A espectrometria de massas (MS) consiste no estudo de íons na fase gasosa. O grande salto na utilização da MS devido ao desenvolvimento dos métodos de ionização por eletrospray (ESI), por J. B. Fenn e ionização/dessorção a laser auxiliada por matriz (MALDI) por M. Karas e F. Hillenkamp no final da década de 80 abriu espaço para o desenvolvimento de novos equipamentos, desta forma expandindo em muito a capacidade de análise de diversos analitos. Misturas complexas constituem um desafio até hoje, onde diversas técnicas são empregadas com o objetivo de se entender a constituição destas matrizes. Neste contexto a MS vêm sendo utilizada em conjunto com a mobilidade iônica (IM) em estudos com diversos analitos, como por exemplo, em proteômica e petroleômica. Este trabalho é constituído por dois capítulos, onde na primeira parte as técnicas foram utilizadas em experimentos de proteômica estrutural por meio de ligação cruzada. Estudos Fundamentais foram conduzidos de modo a serem exploradas as misturas complexas de peptídeos provenientes de experimentos utilizando-se uma classe pouco explorada de reagentes de ligação cruzada (imidoésteres). Para o segundo capítulo a mesmas técnicas foram utilizadas nas análises da fração pesada (asfaltenos) de petróleos brasileiros. A simplificação das amostras juntamente com a caracterização estrutural destes compostos por meio de suas sessões de choque de colisão (CCS) constituiu a estratégia de análise para este capítulo. Como resultados da primeira parte têm-se o estabelecimento das rotas de fragmentação de peptídeos modificados pelo reagente de ligação cruzada dimetil suberoimidato e a aplicação do mesmo em experimentos com sistemas proteicos reais. A IM foi aplicada de modo a se separar as espécies geradas após os experimentos reacionais dos peptídeos não modificados por meio de seus estados de carga o que possibilitou, uma rápida e simplificação deste tipo de mistura. Como resultados da segunda parte desta tese a IM foi empregada na caracterização das CCS de compostos modelo de asfaltenos e posteriormente em íons representativos da fração pesada. Os resultados foram validados mediante cálculos teóricos e espectrometria de massas de ultra-alta resolução. Os dados obtidos vão de encontro com os modelos de estruturas de arquitetura do tipo ilha previstos no modelo de Yen-Mullins, constituindo desta forma o primeiro estudo estrutural de asfaltenos usando-se estas técnicas combinadas / Abstract: Mass spectrometry (MS) constitutes the study of ions in the gas-phase, being the structural elucidation the main application of MS. With the development of ionization techniques such as electrospray (ESI), by J. B. Fenn and matrix assisted laser desorption by M. Karas and F. Hillenkamp in the later 80¿s allowed the development of new instruments, providing an expansion of the array of analytes suitable for MS analysis. Complex mixtures constitute a challenge nowadays, where diverse techniques are employed with the objective of understanding the chemical composition of such matrixes. In this sense MS have been used along with ion mobility (IM) in the study of different analytes (e.g. in Proteomics and Petroleomics). This works comprises two chapters, where in the first one the techniques were applied in structural proteomics by means of chemical cross-linking experiments. Fundamental studies were carried to explore complex mixtures of tryptic peptides after experiments with imidoesters reagents. For the second chapter the same techniques were applied in the analysis of the polar fraction of Brazilian petroleum¿s (asphaltenes), where beyond separations an structural study was carried out to verify the existing models regarding asphaltene structure. As results of the chapter 1 the behavior at the gas-phase of the peptides upon dissociation techniques was elucidated (fragmentation studies). The validation of imidates as cross-linking reagents was performed to real proteins. IM was applied to separate different charge states created by the modified peptides generated by the imidate reagent. As results from the second chapter IM was successfully applied, were the comparison with model compounds was done employing also other MS techniques such as ultra-high resolution (UHR) MS. The findings of this chapter reinforce the Yen-Mullins model that describes asphaltenes as compounds possessing island structures / Doutorado / Quimica Organica / Doutor em Ciências

Orientador : Anita Jocelyne Marsaioli / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-31T18:43:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_UbiratanFloresda_D.pdf: 5706639 bytes, checksum: 94f957d0ed353ee154da5088f0bd3843 (MD5) Previous issue date: 2001 / Doutorado

Orientador: Luzia Koike / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-20T11:06:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_ArildoJoseBrazde_M.pdf: 10877161 bytes, checksum: 27ce678ac3edb71413485d4dfe287cad (MD5) Previous issue date: 1994 / Mestrado

Orientador: Ahmed El-Dash / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-07-18T19:07:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 LicetiDibos_AtilioEnrique_M.pdf: 3741815 bytes, checksum: 5671174fd19539db0571a541f2eb48c9 (MD5) Previous issue date: 1993 / Resumo: O efeito da temperatura de extrusão e do teor de proteína da farinha de soja desengordurada (FSD) na qualidade tecnologica e nutricional do macarrão instantâneo de arroz foi estudado. Farinha de arroz foi misturada com vários níveis de FSD para se obterem teores de proteína de 15, 20 e 25%. A matéria-prima com os diversos níveis de proteína foi processada num extrusor de rosca única às temperaturas de 80, 100 e 120°C. O macarrão foi submetido aos vários testes tecnológicos para avaliar sua qualidade, tais como: índice de absorção e de solubilidade em água; viscosidades inicial a 30°C, a 90°C (no aquecimento) e a 50°C (no resfriamento); índice de proteína dispersível e teste de cozimento, avaliando-se a cor, aumento de peso e volume, perda de sólidos solúveis e firmeza do macarrão cozido. Os resultados dos testes tecnológicos foram estatisticamente avaliados pelo modelo de superfície de resposta. O macarrão também foi avaliado nutricionalmente, usando-se os seguintes testes: Quociente de eficiência protéica (PER), quociente protéico líquido (NPR), valor biológico (VB), digestibilidade e utilização líquida de proteína (NPU). Com o aumento da temperatura de extrusão verificou-se que índice de absorção (IAA), e de solubilidade em água (ISA) e a viscosidade inicial a 30°C (V30) aumentavam, e a viscosidade a 90°C (V90) e a capacidade de retrogradação diminuiram. O aumento da temperatura de extrusão influenciou também as ca¬racterísticas do macarrão cozido, tais como aumento do brilho e da cor amarela. Ao se aumentar o teor de proteína verificou-se que o IAA até 20%; o ISA e o índice de proteína dispersível (IPD) aumentavam e V30 diminuia. Foi concluído também que com o aumento do teor de proteína do macarrão cozido, o seu brilho, sua cor amarela, seu volume, seu peso e a perda de sólidos solúveis aumentava, enquanto que a firmeza do macarrão diminuia. O valor nutricional do macarrão também foi influenciado com a temperatura de extrusão e com o teor de proteína da FSD. Com o aumento da temperatura de extrusão verificou-se aumento no valor quociente protéico líquido (NPR), e com o aumento do teor de proteína da matéria-prima verificou-se uma diminuição no'valor do quociente de eficiência protéica (PER). O maior valor de PER foi atingido com a menor porcentagem de suplementação (12,9% de proteína), indicando o melhor balanço de aminoácidos. / Abstract: The effect of extrusion temperature and protein level of deffated soybean flour (DSF) on the quality of instant rice pasta was studied. Rice flour was mixed with various levels of DSF to obtain protein levels of 15, 20 and 25%. The raw material with the various protein levels, was processed in a single-screw extrusor, with temperatures of 80, 100 and 120°C. The pasta was submitted to various technology tests to evaluate, including: water absorption and solubility indices, initial viscosity at 30°C, and viscosity at 90°C (rising) and at 50°C (falling), protein dispersibility index (PDI), and the cooking test to evaluate color, gain in weight and volume, soluble solids loss and firmness of cooked pasta. All of the technological quality tests were statistically evaluated with response surface models. The pasta was also nutritionaly evaluated using the following tests: protein efficiency ratio (PER), net protein ratio (NPR), biological value (BV), digestibility and net protein utilization (NPU). With increasing extrusion temperature the water absorption (WAI) and solubility indices (WSI), and initial viscosity at 30°C (V30) increased, and the viscosity at 90°C (V90) and the retrogradation capacity, decreased. The increase in extrusion temperature also influenced the characteristics of the cooked pasta, such as increase of brightness and yellowness. With increasing the protein level, to 20% the WAI, the WSI and the PDI increased and V30 decreased. Also, with increasing the protein level of the cooked pasta, the brightness, the yellowness, volume, weight and the soluble solids loss, increased, but the firmness decreased. The nutricional value of the pasta was also affected by extrusion temperature and protein level of the DSF. With increasing extrusion temperature it was found that the NPR increased, and with increasing protein level the PER decreased. The maximum value of the PER was reached with the lowest level of protein assayed (12,9% of protein) indicating a better balance of aminoacids. / Mestrado / Mestre em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Maria Aparecida Carvalho de Medeiros / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Tecnologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T04:43:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Vilella_KellyAdrianaRibeiroTagliaferro_M.pdf: 2403765 bytes, checksum: 91f29c165c5f2b7217d7fc43cb9b5daf (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os resíduos de herbicidas triazínicos são compostos com moderada toxicidade, altamente persistentes no ambiente, contaminando os mananciais e águas subterrâneas e são muito utilizados em várias culturas, inclusive da cana-de-açúcar. Os herbicidas atrazina e simazina foram oxidados com 'H IND.2O IND.2' na presença de catalisadores biomiméticos (metaloporfirinas de ferro e rutênio) e os produtos gerados na reação foram analisados via cromatografia gasosa (GC, do inglês gás chromatography) associada à espectrometria de massas (MS, do inglês mass spectrometry), buscando elucidar os subprodutos. As reações de oxidação dos herbicidas triazínicos e os subprodutos gerados foram monitoradas por espectrofotometria na região do ultra violeta e visível (UV-Vis) e cromatografia gasosa (GC), utilizando-se o detector de captura de elétrons (ECD, do inglês elétron capture detector). Os rendimentos das reações de oxidação das triazinas com 'H IND.2O IND.2' e catalisadas pelas metaloporfinas de ferro (Fe(FTTPCl)) e rutênio (Ru(OCTTPP)), variaram de acordo com as condições de reações catalíticas. Foi observado que houve degradação significativa dos analitos (94,70% para a atrazina e 92,60% para a simazina utilizando a (Fe(FTTPCl)) e; 94,38% para a atrazina e 67,19% para a simazina utilizando a (Ru(OCTTPP))) e também foi observado a transformação dos herbicidas nos subprodutos desetilatrazina (DEA) e o deisopropilatrazina (DIA). Os dados de monitoramento das reações catalíticas por UV-Vis revelaram as estabilidades dos catalisadores (Fe(FTTPCl)) e (Ru(OCTTPP)), nas condições oxidantes das reações. Os resultados obtidos com a cromatografia gasosa acoplada com a espectrometria de massas (GC-MS), utilizando a técnica de ionização por impacto de elétrons ¿ (EI, do inglês electron ionization), full scan, com o modo positivo (EI+), associado a este pico revelaram o pico do íon molecular (m/z= 215, associado ao herbicida atrazina [M]+ e os principais fragmentos (m/z): 200(associado ao íon [M ¿ CH3]+), 173 e 138; sendo que o espectro de massa obtido após a reação de oxidação revelou o desaparecimento do pico associado aos herbicidas e formação de novos picos, associados a fragmentos de subprodutos. Similarmente, a identificação da simazina foi obtida com o modo positivo (EI+), tendo sido revelado o pico do íon molecular (m/z= 201) e os principais fragmentos (m/z): 186, 173 e 138 / Abstract: Waste triazine herbicides are compounds with moderate toxicity, highly persistent in the environment, contaminating water sources and groundwater are widely used in various cultures, including the cane sugar. The atrazine and simazine herbicides were oxidized with 'H IND.2O IND.2' in the presence of biomimetic catalysts (iron and ruthenium metalloporphyrins) and the products generated in the reaction were analyzed by gas chromatography (GC) associated with mass spectrometry (MS), to elucidate the by-products. The oxidation reaction of the triazine herbicide and by-products generated were monitored by spectrophotometry in the ultraviolet region and visible (UV-Vis) and gas chromatography (GC), using electron capture detector (ECD). Proceeds from the triazines oxidation reactions with 'H IND.2O IND.2' catalyzed by iron and metalloporphyrins (Fe (FTTPCl)) and ruthenium (Ru (OCTTPP)), varied according to the conditions of catalytic reactions. It was observed that there was significant degradation of the analytes (94.70% to 92.60% for atrazine and simazine using the (Fe(FTTPCl)) and; 94.38% to 67.19% for atrazine and simazine using the (Ru(OCTTPP))) and was also observed the transformation of herbicides in desethyl atrazine products (DEA) and the deisopropil atrazine (DIA). The monitoring data of catalytic reactions by UV-Vis revealed the stability of the catalysts (Fe(FTTPCl)) and (Ru(OCTTPP)) in oxidizing conditions of the reactions. The results obtained with gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) using the electron impact ionization technique (EI), full scan, positive mode (EI+), associated this peak revealed molecular ion peak (m/z = 215, associated with atrazine [M]+ and major fragments (m/z): 200 (associated with the ion [M - CH3]+), 173 and 138, and the mass spectrum obtained after the oxidation reaction revealed the disappearance of the peak associated with the herbicides and formation of new peaks associated with byproducts fragments. Similarly, the identification of simazine was obtained in the positive mode (EI+) and been revealed molecular ion peak (m / z = 201) and the principal fragments (m / z): 186, 173 and 138 / Mestrado / Tecnologia e Inovação / Mestra em Tecnologia

Orientador: Marcos Nogueira Eberlin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-27T06:50:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pudenzi_MarcosAlbieri_M.pdf: 6732140 bytes, checksum: 0b8176e8c477d9dca874d72376dfcae5 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Esse trabalho tem como objetivo conhecer e avaliar a ionização dos compostos polares no petróleo for Espectrometria de Massas por Ressonância Ciclotrônica de Íons com Transformada de Fourier (FTICR MS do inglês Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry), relacionando essa ionização com parâmetros experimentais e características intrínsecas das moléculas. No Capítulo 1 o tipo de amostra de interesse (petróleo) é abordado, tanto em suas características quanto em sua análise, definindo petroleômica e sua função. A espectrometria de massas é apresentada, então, como ferramenta de grande utilidade nos estudos petroleômicos, em especial aquela de ultra alta resolução como FTICR MS (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry) acoplada a fonte de ionização eletrospray (ESI). No Capítulo 2 a ferramenta estatística do planejamento de experimentos é apresentada e, então, utilizada em uma amostra real de petróleo de forma a relacionar os parâmetros operacionais da fonte de ESI com respostas avaliadas comumente em petroleômica. Aspectos interessantes das relações parâmetro-resposta surgem durante o estudo, mostrando que a análise de petróleo por ESI-FTICR MS, apesar de largamente utilizada na literatura, não é trivial e precauções devem ser tomadas durante a otimização dos parâmetros experimentais. No Capítulo 3 as técnicas de APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) e APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization) são abordadas e utilizadas, juntamente com ESI, para avaliar a ionização de padrões de compostos similares àqueles encontrados nas principais classes de compostos polares do petróleo. A análise pelas técnicas que ionizam de forma mais abrangente os compostos apresentaram comportamentos que tornam tais análises inviáveis. Uma reação de metilação que melhora a ionização de compostos sulfurados também é realizada em duas condições, comparando-se tais condições a partir dos espectros obtidos após suas análises. Conhecendo a ionização desses compostos padrões, é possível entender a petroleômica de forma mais ampla dando maior confiabilidade para estabelecer as relações composição-comportamento do petróleo / Abstract: The aim of this work is to know and evaluate the crude oil polar compounds ionization through Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry, relating this ionization with experimental parameters and intrinsic characteristics of molecules. On Chapter 1 the sample of interest (crude oil) is addressed, both in its characteristics and its analysis, defining petroleomics and its function. Mass spectrometry is then presented as a tool of great utility in petroleomic studies, in special the ultra high resolution one as FTICR MS coupled to eletrospray Ionization (ESI). On Chapter 2 the design of experiment statistic tool is presented and used in a real crude oil sample in order to relate operational parameters of ESI source to commonly evaluated responses in petroleomics. Interesting aspects regarding parameter-response relationships arises during the study, showing that the crude oil analysis using ESI-FTICR MS, while it is largely used in literature, it is not trivial and precautions have to be taken during the optimization of experimental parameters. On Chapter 3 APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization) and APPI (Atmospheric Pressure PhotoIonization) technics are addressed and used, along with ESI, to evaluate the ionization of standard compounds similar to those polar compounds found in crude oil. Analysis using sources that ionizes in the most comprehensive way has shown such behavior that makes the analysis unviable. A methylation reaction that improves the ionization of sulfur compounds is also made on two conditions, comparing these conditions through the obtained spectra after their analysis. By knowing the ionization of these standard compounds it is possible to understand the petroleomics in a much comprehensive way, providing reliability to stablish composition-behavior relations of crude oil / Mestrado / Quimica Organica / Mestre em Química

Submitted by Priscila Nascimento (pnascimento@icict.fiocruz.br) on 2012-11-13T17:28:10Z No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) / Made available in DSpace on 2012-11-13T17:28:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carlos-correa-netto.pdf: 1990428 bytes, checksum: 3a150480f1f6590c44a4c85210b6ccbb (MD5) Previous issue date: 2007 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Os animais peçonhentos são aqueles capazes de produzir e inocular veneno (peçonha) em suas vítimas. No Brasil, foram catalogadas, até o momento, 326 espécies de serpentes, dentre as quais cerca de 50 são peçonhentas e de grande interesse para a Saúde Publica. A Bothrops jararacussu é a espécie brasileira que possui a capacidade de produzir e inocular a maior quantidade de veneno. Nos acidentes ofídicos causados por estaespécie, a ação do veneno não é totalmente neutralizada pelo soro específico, o antibotrópico, sendo importante nestes casos a adoção de uma conduta terapêutica diferenciada através da administração do soro poliespecífico, o antibotrópico-crotálico. No entanto, considerando-se apenas os sintomas clínicos do paciente, o médico não tem como discriminar se o acidente foi provocado por B. jararacussuou por outra espécie do gênero. Vale ainda ressaltar que para as demais espécies do gênero Bothrops, o soro antibotrópico é o mais indicado, fato que impossibilita o médico de adotarcomo estratégia geral, a utilização do soro antibotrópico-crotálico como umaterapêutica única no acidente botrópico. Esta tese teve como objetivo a caracterização, através de técnicas de imunoquímica, do veneno de B. jararacussu e a identificação de possíveis biomarcadores para este veneno. Para a triagem dos biomarcadores foram produzidos soros espécie-específicos para os venenos de B. jararacussu (soro anti-jararacussu) e para B. jararaca(soro anti-jararaca). Nas análises por “imunoblotting” a partir do fracionamento por 2D-PAGE foi visto um bom reconhecimento por ambos os soros, principalmente das frações de alto peso do veneno de B. jararacussu, mostrando que estas frações são as mais imunogênicas neste veneno. A partir destes dados, foram identificadas no mapa bidimensional, as principais proteínas de baixa imunogenicidade deste veneno. Uma proteína de 60kDa e pI ácido foi identificada como uma serino proteinase. Esta identificação foi obtida a partir da homologia com uma protease com domínio tripsina, denominada BOTIN, presente no banco de dados de ESTs de B. insularis. Esta proteína de pI ácido (denominada Bjssu-pI2,2) foi, pela primeira vez, descrita nesta espécie. Na região básica, foram identificadas duas outras proteínas, as quais demonstraram um baixo reconhecimento tanto pelo soro homólogo (soro anti-jararacussu) como pelo heterólogo (soro anti-jararaca). A proteína de 29kDa foi identificada como uma serino proteinase da família S1 e a de 16kDa foi identificada como Botropstoxina-I (BthTX-I), a principal miotoxina doveneno de B. jararacussu. Desta forma, a abordagem desta tese através de técnicas como eletroforese bidimensional somado a técnicas sensíveis como "imunoblotting” e espectrometria de massas, se mostrou muito interessante para o estudo imunoquímico das frações do veneno de B. jararacussu. As diferenças no reconhecimento dos soros espécie-específicos frenteao veneno de B. jararacussupermitiram a identificação de três proteínas com potencial para serem utilizadas como ferramenta para o desenvolvimento de diagnóstico diferencial para esta espécie. Além disso, os resultados deste trabalho reforçam a questão da ineficiência do soro antibotrópico para a neutralização do veneno no acidente causado por esta espécie, podendo se relacionar a importância da fração crotálica para a neutralização de toxinas pouco imunogênicas do veneno de B.jararacussu, como é o caso da BthTX-I. / Poisonous animals are characterized by the ability to produce and inject venom (poison) in their victims. Until nowadays there are326 different species of snakes catalogued in Brazil and, among them 50 species are venomous and important regarding public health. The Bothrops jararacussuis the Brazilian specie that has the ability to produce and inoculates higher amounts of venom. In the reported cases concerning this specie, the action of this venom can not be efficiently neutralized with specific antivenin,the antibotropic serum. In such cases, the attendant must adopt a differentiated therapeutic conduct that consists in the administration of the antibotropic – crotalic serum. However, in considering just the clinical symptoms of the patient, the doctor is not able to distinguish if the accident was caused by B. jararacussuor another specimen from Bothrops genus. It is important to emphasize the fact that for other specimens from Bothrops genus, the antibotropic serum is the most indicated treatment and for this reason, it is inadequate forthe doctor adopt antibotropic – crotalic serum as a single therapeutic strategy. Inthis study we aimed to characterize specific biomarkers present in the venom of B. jararacussutrough the use 2D-PAGE combined with immunoblotting. To achieve this goal, we produced sera anti-jararacussu and anti-jararaca and cross-reacted this sera against their specific venom as well against each other. 2D-gel analyses reveled that the high–molecular–weight fractions ofboth venoms were well recognized by each specific anti-sera as well as bythe non-specific one. This suggests that the proteins present in the high–molecular–weight fraction of each venom are the most immunogenic. Also, the 2D PAGE allowed us to identify the less immunogenic proteins in these venoms. Among them is a 60 kDa acid protein identified as a serine protease due to its high homology with a protease called BOTIN that possess a trypsin domain present in ESTs data bank from B. insularis. This acidic protein characterized in this work was called Bjssu-pI2,2 and was for the first time described in this specie. The other proteins displaying low immunogenic properties were a 29 kDa protein identified as a serine protease from S1-family and a 16 kDa protein identified as a Bothropstoxin-I (BthTX-I),the major myotoxin from B. jararacussuvenom. Thus, the approach used in this thesis, based on bidimensional electrophoresis in combination with sensitive techniques such as immunoblotting and mass spectrometry, showed to be interesting for the immunochemistry study of the B. jararacussuvenom proteins. The three proteins here identified in thevenom of B. jararacussu present a potential use as biomarkers. Moreover, this study also shed light into the reasons why the anti-bothropic serum is so ineffective against the B.jararacussuvenom reinforcing the role of the anti-crotalic serum in neutralizing low immunogenic proteins from the B. jararacussuvenom, such as the BthTX-I.

Submitted by Biblioteca de Pós-Graduação em Geoquímica BGQ (bgq@ndc.uff.br) on 2017-05-12T17:42:45Z No. of bitstreams: 1 Mauricio Lorenzo Cerda Lema_2005.pdf: 2930600 bytes, checksum: 96deef360cac56ed150c1bc2a8766435 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T17:42:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mauricio Lorenzo Cerda Lema_2005.pdf: 2930600 bytes, checksum: 96deef360cac56ed150c1bc2a8766435 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Universidade Federal Fluminense. Instituto de Química. Programa de Pós-Graduação em Geoquímica, Niterói, RJ / Neste trabalho foram abordados os diversos compartimentos do sistema da baía de Mejillones do Sul (BM). O primeiro compartimento foi a coluna da água, com a avaliação das suas características físicas e químicas e taxa s de sedimentação de matéria particulada, o segundo foi o continente, como contribuinte do material eólico (poeira atmosférica) para a coluna d’água, e o terceiro, o sedimento, como compartimento de deposição de materiais oriundo do continente e da coluna d’água e com seu potencial de ressuspensão de matéria, que podem influenciar a quantidade e qualidade da sedimentação pelágica. As campanhas de amostragem abordaram diversas escalas tempor ais (mensal, quinzenal) numa estação fixa (Estação C) localizada na parte exterior da baía e mais profunda c.a. de 100 m de profundidade, e adjacente ao foco principal da ressurgência de Punta de Angamos (PA). Encontro -se uma clara sazonalidade das massas de água da superfície (0- 30 m). Por outro lado, as águas mais frias, densas e sub-óxicas da fonte de ressurgência, permaneceram a partir de 30 m até o fundo o ano inteiro na baia. Conforme diagramas T/S e OD/S, a baia se caracterizou pela interação entre 3 massas de á gua distintas: Água Superficial Subtropical (ASS), Água Sub-Antártida (ASA ), Água Sub-Superficial E quatorial (AESS = fonte da ressurgência). Os eventos de ressurgência e es tratificação, detectados através das series quinzenais no verão de 2004, foram corroborados através do uso do índice APS e registros diários da temperatura superficial. Identific ou-se claramente a alternãncia entre eventos moderados e curtos de ressurgência com duração entre 3 a 8 dias e períodos mais prolongados de estratificação alcançando 29 dias. Condições sub-óxicas a micro-óxicas com concentrações de nutrientes mais elevados já se desenvolvem entre 10 a 15 m de profundidade durante eventos fracos de ressurgência e no início da es tratificação. A ocorrência da denitrificação na coluna d’água pode ser evidenciada através da relação entre o oxigênio aparentemente utilizado (AOU) e o somatório das concentraçõ es das formas nitrog enadas oxidadas (N-NO 2 + N-NO 3 ). A variabilidade dos níveis de saturação de OD e de nut rientes e das razões N/P e Si:NID na superfície, indicaram a presença de uma dinâmica marcante entre os processos de respiração e produção primaria na coluna d ́á gua, como também, do aporte alóctone de nutrientes durante a ressurgência , e a difusão molecular de nutri entes durante a estratificação. As variações quinzenais dos fluxos totais do mate rial particulado coletado com as armadilhas instaladas na BM, sugerem que a sedimentação do material na coluna d’água encontra-se governados pela alternância entre os períodos de ressurgência e estratificação. A razão C/N na faixa de 7:1 a 11:1 encontrada no detrito orgânico coletado pelas armadilhas, indicou a presença de material ainda relativamente rico em nitrogênio semelhan te a do fitoplâncton intacto com uma pequena fração de material de trítico oriundo do mesmo. O detrito orgânico compreendeu células intactas, pe lotas fecais do zooplâncton e par tículas detríticas amorfas. Nas armadilhas de sedimentação observou-se um padrão de empobrecimento de nitrogênio em função da profundidade. Em geral os se dimentos superficiais recentes da BM demonstraram gradientes marcantes de enrique cimento de COP, NT e SPUD da costa até da margem costeira. Por outro lado, maiores concen trações de PIT e POT foram encontradas na estação A adjacente a costa, sugerindo influênc ia antropogênica, proveniente do assentamento urbano localizado no borde costei ro de Mejillones. A influência do material eólico sob a BM e a sua deposição no fundo foi relativamente pequena / En este trabajo fueron abordados los diversos compartimientos del sistema de bahía de Mejillones del Sur (BM). El primer compartimient o fue la columna de agua, con la evaluación de las características fí sicas e químicas e tazas de sedime ntación del material particulado, el segundo fue el continente, como contribuyente del material eólico (polvo atmosférico) para la columna de agua, y el tercero, el sediment o, como compartimiento de depositación del material oriundo del continente y la columna de agua y su potencial rol de resuspensión del material, que puede influencia r en la cantidad e calidad da sedimentación pelágica. Las campañas de muestreo abordaron diversas esca las temporales (mensual, quincenal) en una estación fija (Estación C) localizad a en la parte exterior de la bahía y mas profunda c.a. de 100 m de profundidad, y adyacente al foco prin cipal da resurgencia de Punta de Angamos (PA). Se encontró una clara estacionalidad de las masas de agua de la superficie (0- 30 m). Por otro lado, las aguas más frías, densas y sub-óxicas de la fuente de resurgencia, permanecieron a partir de 30 m hasta el fondo el año entero en la bahía. Conforme diagramas T/S y OD/S, la bahía se caracterizo por la inte racción entre 3 masas de água distintas: Água Superficial Subtropical (ASS), Á gua Sub-Antártida (ASA), Água Sub-Superficial Ecuatorial (AESS = fuente de la resurgencia). Los eventos de resurgencia y estratificación, detectados a través de las series quincena les del verano del 2004, fueron corr oborados a través del uso del índice APS y registros diarios de la temperatura superficial. Se identifico claramente la alternancia entre eventos moderados y cortos de resurgencia con duración entre 3 a 8 días y períodos mas prolongados de estratificación alcanzando 29 días. Condiciones sub-óxicas a micro-óxicas con concentraciones de nutrientes más elevados que se desarrollan entre 10 a 15 m de profundidad durante eventos débiles de resu rgencia en el inicio de la estratificación. A ocurrencia de la desnitrificación en la columna de agua puede ser evidenciada a través de la relación entre el oxigeno aparentemente utilizado (AOU) y la sumatoria de las concentraciones de las formas nitrogenadas oxidadas (N-NO 2 + N-NO 3 ). La variabilidad de los niveles de saturación de OD y de los nutrientes y las razones N/P y Si:N ID de la superficie, indicaron la presencia de una dinámica mar cante entre los procesos de respiración y producción primaria en la columna de agua, como también, el aporte aloctono de nutrientes durante a resurgencia, y la difusión molecula r de nutrientes durante la estratificación. Las variaciones quincenales de los flujos totales del material particulado colectado con las trampas instaladas en la BM, sugieren que la sedimentación del material en la columna de agua se encuentra gobernados por la alternancia entre lo s períodos de resurgencia e estratificación. Las razones C/N que se encontró entre 7:1 a 11:1 en el detrito orgánico colectado por las trampas, indico que la presenci a de material todavía es relativamente rico en nitrógeno semejante al del fitoplancton intacto con una pequeña fracción del material detrítico oriundo del mismo. El detrito orgánico compre ndió células intactas, pelotas fecales de zooplancton e partículas detríticas amorfas. En las trampas de sedimentación se observo un padrón de empobrecimiento de nitrógeno en f unción de la profundi dad. En general los sedimentos superficiales reci entes de la BM demostraro n gradientes marcantes de enriquecimiento de COP, NT e SPUD de la costa hasta el margen costero. Por otro lado, mayores concentraciones de PIT y POT fueron encontradas en la estación A adyacente a la costa, sugiriendo influencia antropogenica, prove niente del asentamiento urbano localizado en el borde costero de Mejillones. La influencia del material eólico sobre la BM y a su depositación en el fondo fue relativamente pequeña

Biotransformação é uma estratégia promissora para a descoberta de novas moléculas de interesse farmacêutico e industrial. Fungos têm demonstrado habilidade para biotransformar muitas moléculas naturais e sintéticas. Um produto natural muito estudado e de potencial para a indústria farmacêutica é o Lapachol, uma naftoquinona que apresenta uma ampla diversidade de atividades biológicas. Existem na literatura muitos estudos de biotransformação utilizando fungos, mas pouco se sabe sobre como esses microrganismos transformam essas moléculas, e quais proteínas e vias metabólicas estão envolvidas nesses processos. A proteômica tornou-se uma das principais abordagens para analisar e compreender os sistemas biológicos. Dessa forma, o objetivo desse estudo foi compreender o processo de biotransformação do lapachol pelo fungo Phanerochaete chrysosporium, identificando os biotransformados, suas atividades biológicas e investigando o proteoma do fungo durante o bioprocesso a fim de identificar as proteínas e as vias metabólicas envolvidas. O fungo foi capaz de biotransformar o lapachol e gerou dois análogos, um já teve sua estrutura elucidada e é inédita na literatura. O proteoma intracelular foi analisado por eletroforese bidimensional e, após análises quanti e qualitativas, as proteínas selecionadas foram submetidas à espectrometria de massas por MALDI-TOF/TOF. Após análises, com a ferramenta de bioinformática BLAST2GO, determinou-se que as enzimas identificadas hiperabundante e ou exclusivas da condição lapachol estavam principalmente envolvidas com processos de detoxicação e resposta ao estresse oxidativo. Além disso, foram detectadas diversas enzimas com atividade de oxirredução. Além do mais, a técnica de Shotgun LC-MS/MS foi realizada. A identificação e quantificação (label-free) das proteínas foram feitas através da análise de dados MS/MS brutos pelo software MaxQuant/Andromeda. As diferenças nas expressões das proteínas identificadas entre os grupos foram computadas usando o software Perseus. Este estudo foi capaz de identificar um total de 221 proteínas intracelulares e 28 extracelulares, sendo que 54 proteínas intracelulares e 4 proteínas extracelulares foram estatisticamente diferentes ou únicas para uma condição (lapachol ou controle). Manganês-peroxidase e ?-glicosidase, ambas enzimas com interesse biotecnológico, foram identificadas exclusivas e aumentada, respectivamente na condição lapachol, desssa forma, o lapachol pode ser um bom agente pró-oxidante, pois estimulou a produção dessas enzimas oxidativas. Époxido desidrogenase e álcool desidrogenase parecem estar envolvidas na rota de biotransformação do lapachol, a primeira catalisando a abertura do epóxido e a segunda, reduzindo regioseletivamente carbonilas. O derivado PC01 mostrou-se mais tóxico para células de adenocarcinoma mamário que o lapachol e 3 e 5 vezes menos tóxico para células epiteliais normais que cisplatina e lapachol, respectivamente, mostrando-se um composto promissor. Esta é a primeira vez que a proteômica foi utilizada para investigar a biotransformação do lapachol. / Biotransformation is a promising strategy to discovery of new molecules with pharmaceutical and industrial interest. Fungi have demonstrated the ability to biotransform many natural and synthetic molecules. A very studied natural product of potential for the pharmaceutical industry is Lapachol, a naphthoquinone with a great diversity of biological activities. There are many biotransformation studies in the literature using fungi but little is known about how these microorganisms transform these molecules, which proteins and metabolic pathways are involved in these processes. Proteomics has become one of the main approaches for analyzing and understanding biological systems. The objective of the present study was to understand the biotransformation process of lapachol by Phanerochaete chrysosporium, identifying the biotransformed and its biological activities and investigating the fungus proteome during the bioprocess to identify the proteins and the metabolic pathways involved. After 24 h of bioprocessing, the fungus was able to biotransform lapachol and generated two analogues, one already had its structure elucidated and is unpublished in the literature. The intracellular proteome was analyzed by two-dimensional electrophoresis and, after quantitative and qualitative analyzes, the selected proteins were submitted to MALDI-TOF/TOF mass spectrometry. After analysis, with the BLAST2GO bioinformatics tool, it was determined that the enzymes identified as hyperabundant and exclusive to the lapachol condition were mainly involved with detoxification and oxidative stress response processes. Moreover, several enzymes with oxreduction activity were detected. In addition, the Shotgun LC-MS/MS technique was performed on intracellular and extracellular proteins. Identification and quantification (label-free) of the proteins were performed by the analysis of MS/MS raw data using MaxQuant/Andromeda software. Differences in the expressions of the proteins identified between the groups were computed using Perseus software. This study was able to identify a total of 221 intracellular and 28 extracellular proteins. 54 intracellular proteins and 4 extracellular proteins were different or unique statistics for a condition (lapachol or control). Manganese-peroxidase and ?-glycosidase, both enzymes of biotechnological interest, were identified exclusively and increased respectively in the lapachol condition, thus, lapachol may be a good pro-oxidant agent, since it stimulated the production of these oxidative enzymes. Epoxide dehydrogenase and alcohol dehydrogenase appear to be involved in the lapachol biotransformation route, the first catalyzing the epoxide opening and the second, regioselectively reducing carbonyls. The PC01 derivative was shown to be more toxic to mammary adenocarcinoma cells than lapachol and approximately 3 to 5 times less toxic to normal epithelial cells than cisplatin and lapachol, showing a promising compaund. To our best knowledge, this is the first time that proteomics has been used to investigate the biotransformation of lapachol.