Made available in DSpace on 2015-04-20T12:22:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE MARIA ELIZABETH DE ASSIS ELIAS.pdf: 2432432 bytes, checksum: 765c92033a8d606f2e94e29da28e396b (MD5) Previous issue date: 2011-09-30 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / In the family Arecaceae, countless species produce edible fruits of significant nutritional value and high economic potential. Astrocaryum aculeatum G. Mey. is such a species, which its fruit is known as tucuma. This plant is a single-stipe palm with an erect trunk approximately 25 m high and 30 cm in diameter. It is propagated by seed and there is commonly a delay in germination start. Palms often show slow and irregular germination, and maturation is one of the factors involved. The process of seed maturation influences the physiological quality and its study in seed technology tries to determine the ideal harvest conditions for obtaining top quality seeds. Specifically, this work aims to identify the point of physiological maturity which produces Astrocaryum aculeatum seeds which have maximum viability and vigor. The investigation was carried out in three studies. To identify morphological indicators the morphological characteristics of the fruits and pyrenes were evaluated. For seeds, anatomical characteristics were used along with the qualitative and quantitative content of reserves. In the study concerning the influence of the period of time of ripening on the seedling emergence the following parameters were considered: the water content, the fresh and dry mass of the pyrene, accumulated reserves, percentage of germinability, seedling emergence, dead seeds, dormant seeds, the index of velocity, and the mean time of emergence. The study of post-harvest ripening was carried out on seeds obtained from fruits 0, 5, 10, 15 and 20 days after harvesting, and the parameters analyzed were: water content of the fruits, pyrenes and seeds, the percentage germinability, seedling emergence, dead seeds, protein content, the index of velocity, the mean time and final time of emergence. The point of seed physiological maturity of tucumã occurred between 153 and 169 days after the opening of the spathe. The color of the exocarp was not a good indicator of the seeds physiological maturity. Better morphological indicators were: yellow or deep viii orange color of the mesocarp, bright black color of the endocarp, light brown or dark-ferruginous brown color of the tegument, hard consistency of the endocarp, strong consistency of the endosperm, as well as the point maximum length, thickness and fresh mass of the pyrene. tucumã seeds have reserve materials of proteins, lipids and carbohydrates in the form of pectic polysaccharides. At 90 days after the opening of the spathe, the embryo displayed differentiation of the primordial leaves. The period of time influences the physiological and the germination of seeds of A. aculeatum. At 135 days after the opening of the spathe, the seeds showed a high percentage of seeds mortality and at 153 days there was a higher germinability and seedlings emergence. Tucumã seeds extracted from fruits harvested at the beginning of spontaneous detachment of the bunch, showed higher physiological performance than those subject to periods of post-harvest ripening. / Na família Arecaceae, inúmeras espécies produzem frutos comestíveis de significativo valor nutricional e alto potencial econômico. Dentre essas, encontra-se Astrocaryum aculeatum G. Mey., cujo fruto é conhecido como tucumã. A planta é uma palmeira monocaule, com tronco ereto, com até 25 m de altura e, aproximadamente, 30 cm de diâmetro. A propagação é feita por sementes que comumente demoram em iniciar o processo germinativo. As sementes das palmeiras, em geral, apresentam germinação lenta e irregular, e são influenciadas por fatores como a maturação. O processo de maturação fisiológica tem influência na qualidade fisiológica da semente, e seu estudo na tecnologia de sementes, visa determinar o ponto ideal de colheita para a obtenção de sementes de alta qualidade. Assim, o trabalho teve como objetivo identificar o ponto de maturidade fisiológica no qual ocorre a máxima capacidade de germinação e vigor das sementes de Astrocaryum aculeatum. O trabalho foi realizado em três estudos. Para a identificação dos indicadores morfológicos foram avaliadas as características morfológicas do fruto e do pireno. Nas sementes foram avaliados os aspectos anatômicos, além da qualificação e quantificação das reservas. No estudo da influência da idade de maturação fisiológica da semente sobre a emergência de plântulas avaliou-se: o teor de água, massa fresca e seca do pireno, reservas acumuladas, porcentagem de germinabilidade, de emergência, de sementes mortas, de sementes dormentes, o índice de velocidade e o tempo médio de emergência. O estudo de maturação pós-colheita foi realizado em sementes obtidas de frutos que ficaram em repouso, antes do beneficiamento, por períodos de 0, 5, 10, 15 e 20 dias pós-colheita, onde os parâmetros avaliados foram: o teor de água dos frutos, dos pirenos e das sementes, a porcentagem de germinabilidade, de emergência e de sementes mortas, o teor de proteína, o índice de velocidade de emergência e o tempo médio e final de emergência. O ponto de maturidade fisiológica da semente de tucumã ocorreu entre 153 a 169 vi dias após abertura da espata. A cor do exocarpo não foi um bom indicador da maturação fisiológica da semente, sendo considerados como melhores indicadores morfológicos: a cor do mesocarpo amarela ou laranja-escuro, a cor do endocarpo preto brilhante e a consistência pétrea, a cor do tegumento da semente, marrom-claro ou escuro ferrugíneo, consistência rígida do endosperma, além do ponto de máximo comprimento, espessura e massa fresca do pireno. A semente de tucumã apresentou como substâncias de reservas: proteínas, lipídios e carboidratos na forma de polissacarídeos pécticos. A partir de 90 dias após a abertura da espata, o embrião apresentou diferenciação nos primórdios foliares. A idade de maturação da semente teve influência na sua qualidade fisiológica e afetou o seu desempenho germinativo. Aos 135 dias após abertura da espata, as sementes apresentaram elevada mortalidade de sementes e aos 153 dias maior porcentagem de germinabilidade e emergência. As sementes de tucumã, extraídas de frutos colhidos no início do seu desprendimento natural da infrutescência, apresentaram desempenho fisiológico superior às submetidas a períodos de maturação pós-colheita.

As taxas de produção embrionária tanto da FIV (30-40%) como da TN (23%) ainda estão aquém do esperado. Desta forma, a pré-maturação com inibidores do ciclo celular é uma das alternativas que vem sendo estudada para aumentar a competência dos oócitos utilizados na PIV, na tentativa de otimizar o sucesso das biotécnicas. Sabe-se que neurotrofinas desempenham funções no sistema reprodutor. O BDNF é um exemplo de neurotrofina que parece estar relacionada com a maturação dos oócitos. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi de aperfeiçoar a pré-maturação e a maturação in vitro de oócitos bovinos submetidos posteriormente à ativação partenogenética, visando seu uso na biotécnica de transferência de núcleo. Oócitos bovinos foram submetidos à maturação na presença (MIV/BD) ou ausência (MIV) de BDNF ou pré-maturados com BLI e suplementados (BL/BD) ou não (BL) com a neurotrofina. Posteriormente foram avaliados quanto à taxa de maturação (metáfase II), ativação (formação de prónúcleo) e desenvolvimento embrionário (produção e qualidade dos blastocistos). Não houve diferença (P>0,05) entre taxas de MII após a maturação com ou sem BDNF. Porém, o grupo pré-maturado e suplementado (BL/BD n=73; 91,2%) apresentou maior taxa de MII (P<0,05) em relação ao grupo não suplementado (BL n=66; 76,7%). Oócitos maturados nas mesmas condições foram ativados quimicamente para análise do desenvolvimento embrionário. Os grupos MIV/BD (n=30; 71,4%) e MIV (n=41; 91.1%) apresentaram diferença (P<0,05) em relação à taxa de ativação. Porém, não foi observada diferença quanto aos outros parâmetros do desenvolvimento. Quando os oócitos foram pré-maturados a taxa de clivagem do grupo suplementado (BL/BD: n=227; 65,2%) foi superior (P<0,05) ao grupo não suplementado (BL: n=187; 57,7%), mas não foram observadas diferenças (P>0,05) para os outros parâmetros de desenvolvimento. A qualidade dos embriões ativados também não foi afetada pelos tratamentos. Os grupos submetidos à TN (MIV e BL/BD) apresentaram diferenças (P<0,05) para extrusão do 1°CP (n=639; 63,5% e n=693; 69,5%, respectivamente) e para taxa de fusão (n=345; 72,9% e n=397; 79,2%, respectivamente) não havendo diferença para nenhum outro parâmetro avaliado. A qualidade dos embriões clonados também foi avaliada e não foi observada diferença. Após a transferência dos embriões dos grupos MIV (n=28) e BL/BD (n=26) para as receptoras, os grupos foram capazes de produzir gestação avançadas (10,7 e 11,5%, respectivamente) de forma similar (P>0,05). Com base nestes resultados podemos concluir que a suplementação, tanto da maturação como a pré-maturação não causa prejuízo no posterior desenvolvimento embrionário. Ainda, embriões clonados produzidos a partir de oócitos bloqueados são capazes de estabelecer gestações avançadas em bovinos. / Embryo production rates obtained from both IVF (30-40%) and NT (23%) are still below the expected values. Therefore, oocyte pre-maturation using cell cycle inhibitors is one of the alternatives which has been studied to increase the competence of oocytes used for IVP, as an attempt to optimize the success rates of these biotechniques. Neurotrophins are known to play several roles in the reproductive system. BDNF is an example of a neurotrophin that seems to be related to oocyte maturation. Therefore, the objective of this study was to improve techniques of pre-maturation and maturation of bovine oocytes submitted to parthenogenetic activation, aiming for its use on cloning by nuclear transfer. Bovine oocytes were submitted to maturation either in presence (IVM/BD) or absence (IVM) of BDNF or pre-matured with BLI and supplemented (BL/BD) or not (BL) with the neurotrophin. Groups were evaluated for maturation rates (metaphase II), activation (pro-nucleus formation) and embryo development (blastocyst formation rate and quality). There was no difference (P>0.05) in MII rate after the maturation with or without BDNF. However, pre-maturation in the supplemented group (BL/BD, n=73; 91.2%) resulted in higher MII rate (P<0.05) when compared with the nonsupplemented group (BL, n=66; 76.7%). Oocytes which were matured under the same conditions were also activated chemically for embryonic development analysis. Activation rates were different (P<0.05) from IVM/BD groups (n=30; 71.4%) and IVM (n=41; 91.1%). However, no difference were observed for development parameters. When the oocytes were prematured, cleavage rates in the supplemented group were superior (P<0.05) than non supplemented group (BL/BD: n=227; 65.2%) and (BL: n=187; 57.7%), but no difference was observed for other developmental parameters. Embryo quality was also evaluated and no difference was observed between treatments. Groups submitted to NT (IVM and BL/BD) differed regarding (P<0.05) the 1stPB extrusion (n=639; 63.5% and n=693; 69.5%, respectively) and fusion rate (n=345; 72.9% and n=397; 79.2%, respectively), but did not present differences for other evaluated parameters. Embryo quality was evaluated again and no differences were observed. After the embryos were transferred to recipient cows, groups IVM (n=3; 10.7%) and BL/BD (n=3; 11.5%) were capable of producing advanced gestations at similar rates (P>0.05). Based on these results, it may be concluded that supplementation of both maturation and pre-maturation does not impair embryonic development. Additionally, cloned embryos produced from blocked oocytes are able to establish advanced gestation in cattle.

Apesar dos grandes avanços na produção in vitro (PIV) de embriões bovinos, a produção de blastocistos se mantém ainda aquém do observado in vivo, indicando que melhorais ainda são necessárias no processo de PIV. A competência para o desenvolvimento de oócitos tem sido relacionada, entre outros fatores, à interrupção do período de capacitação. Foi sugerido que o bloqueio meiótico poderia permitir ao oócito um tempo adicional para adquirir a competência. Embora ainda não se tenha melhorado o desenvolvimento embrionário com esse procedimento, o bloqueio meiótico com inibidores de cinases dependentes de ciclinas (CDK), como a butirolactona I (BLI), pode ser uma ferramenta útil na compreensão do desenvolvimento do oócito. O presente trabalho teve por objetivo averiguar o efeito da inibição de CDK com BLI, para bloquear temporariamente a retomada da meiose, sobre fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos. Oócitos bovinos obtidos de abatedouros foram bloqueados em vesícula germinativa (VG) in vitro com 10 µM de BLI por 24 h (BVG - bloqueado imaturo). Parte desses oócitos foi depois maturada in vitro por mais 24 h (BMII - bloqueado maturado). Como controles foram utilizados oócitos recém-aspirados dos folículos (VG - controle imaturo) ou maturados in vitro sem bloqueio meiótico prévio (MII - controle maturado). Os diferentes grupos de oócitos foram avaliados quanto a: 1) expressão de RNAm dos componentes do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e da MAPK; 2) expressão das proteínas do MPF (p34cdc2 e ciclina B1) e MAPK (p44 e p42); 3) atividade das proteínas MPF e MAPK durante a maturação in vitro de oócito submetidos ou não ao bloqueio da meiose pré-maturação e 4) a localização subcelular das proteínas p34cdc2, ciclina B1 e MAPK nos oócitos. Foi observado que: 1) a abundância relativa do RNAm de p34cdc2 e MAPK reduziu-se com a maturação, enquanto a ciclina B1 menteve-se estável; o bloqueio meiótico manteve o mesmo padrão de acordo com o estádio de maturação; 2) as proteínas de p34cdc2 e MAPK mantiveram-se estáveis durante a maturação, enquanto a ciclina B1 não foi detectada em oócitos imaturos e o foi nos maturados; o bloqueio meiótico também manteve a expressão das proteínas de acordo com o estádio de maturação; 3) as atividades de MPF e MAPK foram pouco afetadas pelo bloqueio meiótico; 4) as proteínas foram todas detectadas no citoplasma dos oócitos imaturos (bloqueados ou não) e maturados (bloqueados ou não), sendo apenas a p34cdc2 também localizada no núcleo de oócitos imaturos (bloqueados ou não). Diante dos resultados conclui-se que o bloqueio da meiose mantém o mesmo padrão de expressão, atividade e localização subcelular do MPF e da MAPK em oócitos imaturos e maturados, sugerindo que a tradução das mensagens, a ativação das cinases e a distribuição das proteínas foram controladas de acordo com o estádio da meiose, não sendo afetadas pelo bloqueio. / Although there have been great improvements in in vitro production (IVP) of bovine embryos, blastocyst production is still beyond that observed in vivo, indicating that more improvements are necessary in the IVP system. Developmental competence of oocytes has been related to, among other factors, the interruption in oocyte capacitation. Is has been suggested that meiosis block would allow the oocyte additional time to acquire competence. Although this procedure has not been successful in increasing embryo development, meiosis block with cyclin dependent kinase (CDK) inhibitors, such as butyrolactone I (BLI) can be a useful tool to study oocyte development. The present study aimed to assess the effects CDK inhibition with BLI, to temporarily block meiosis resumption, on factors involved in meiosis cell cycle control in bovine oocytes. Oocytes, obtained form slaughterhouse ovaries, were maintained in germinal vesicle (GV) arrest in vitro with 10 µM BLI for 24 h (BVG - blocked immature). A part of these oocytes was matured in vitro for another 24 h (BMII - blocked and matured). As controls, oocytes were also assessed soon after follicle aspiration (GV -immature control) or matured in vitro for 24 h without prior meiosis block (MII - matured control). The different groups of oocytes were assessed for: 1) mRNA expression for the MPF components (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK; 2) expression of MPF (p34cdc2 and cyclin B1) and MAPK (p44 and p42) proteins; 3) MPF and MAPK activities during maturation of oocytes submitted or not to prematuration meiosis block and 4) p34cdc2, cyclin B1 and MAPK subcellular localization within oocytes. During the study it was observed that: 1) relative abundance of p34cdc2 and MAPK mRNA was reduced after maturation, while cyclin B1 mRNA remained stable; meiosis block maintained the same pattern according to maturation stage; 2) p34cdc2 and MAPK proteins remained stable after maturation while cyclin B1 protein was undetected in immature oocytes and detected in the matured ones; meiosis block also maintained the same protein expression according to maturation stage; 3) MPF and MAPK activities were little affected by meiosis block and 4) all proteins were detected in the cytoplasm of immature (blocked or not) and matured (blocked or not) oocytes, and only showed a specific nuclear localizations in immature oocytes (blocked or not). According to the results it may be concluded that meiosis block maintained the same pattern of MPF and MAPK expression, activity and subcellular localization in immature and matured oocytes, suggesting that mRNA translation, kinase activation and protein distribution were controlled according to the maturation stage and were not affected by meiosis block.

Este trabalho teve objetivou-se avaliar o efeito da melatonina adicionada ao meio de maturação (meio B199) sobre a maturação nuclear, a distribuição dos grânulos corticais e dos microtúbulos, a produção in vitro de embriões e sobre a apoptose das células do cumulus (CC) e dos embriões. Os complexos cumulus-ovócitos (COCs), aspirados de folículos ovarianos obtidos de ovários de vacas oriundas de abatedouros, foram cultivados por 24 h, conforme os tratamentos: 1) Grupo Controle: meio B199 acrescidos de 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH; 2) Grupo MEL: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina; 3) Grupo MEL/FSH/LH: meio B199 com 1 µg/mL de melatonina e 0,5 µg/mL de FSH e 5,0 µg/mL de LH. Após a maturação in vitro (MIV), os COCs de todos os grupos foram submetidos à fecundação in vitro (FIV) e desenvolvimento embrionário in vitro. A condição de cultivo em todas as etapas foi microgotas, sob óleo de silicone, com atmosfera de 5% de CO2 em ar, a 38,5ºC. Foram avaliadas as taxas de clivagem e de embriões produzidos no dia 7 (D-7) pós-inseminação in vitro. Após a MIV, os ovócitos de todos os grupos também foram corados com Hoechst 33342, com anticorpo monoclonal anti-tubulina conjugada com FITC ou cultivados com aglutinina Lens Culinaris conjugada a FITC para avaliação da taxa de maturação nuclear (progressão da meiose), distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais, respectivamente. Para avaliação do grau de apoptose das CC e dos embriões, utilizou-se a técnica do cometa. Não houve diferença (P > 0,05) entre o grupo controle e os tratados com melatonina (MEL e MEL/FSH/LH) na taxa de ovócitos em metáfase II (66,18±4,04; 66,46±4,04 e 59,61±4,04), no percentual de blastocistos com baixo grau de apoptose (31,46±6,01; 38,36±6,01 e 32,92±6,01), na taxa de clivagem (85,70±2,47; 88,52±2,47 e 85,65±2,47) e nem na taxa de embriões no D-7 (54,47±3,67; 60,01±3,67 e 58,40±3,67). A distribuição dos microtúbulos e dos grânulos corticais também não foi alterada pelos grupos tratados com melatonina. O percentual de CC que não apresentaram dano no DNA no grupo MEL (37,64±2,41) foi superior (P<0,01) ao grupo MEL/FSH/LH (28,08±2,41) e ao grupo controle (17,83±2,41). Os resultados sugerem que a adição de melatonina durante o cultivo in vitro para maturação de ovócitos bovinos protegeu as CCs de danos no DNA promovendo a diminuição da incidência de apoptose e foi capaz de suportar o desenvolvimento embrionário produzindo taxas de embriões no D-7 similares as obtidas no sistema tradicional de produção in vitro de embriões. / The aim of this study was to examine the effect of addition of melatonin in maturation medium (B199) on the nuclear maturation, the cortical granules and microtubules distribution, the in vitro production of embryos and the DNA damage (apoptosis) of cumulus cells and embryos. The bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) aspirated from follicles from abattoir ovaries were cultured for 24 h according to treatments: 1) Control group: B199 medium with 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH; 2) MEL group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin; 3) MEL/FSH/LH group: B199 medium with 1 µg/ml melatonin, 0.5 µg/ml FSH and 5.0 µg/ml LH. After in vitro maturation (IVM) the COCs of all groups were submitted to in vitro fertilization and in vitro embryo development. All cultures were in droplets under oil, at 38.5ºC in na atmosphere of 5% CO2 in air. The cleavage rate and the percentage of embryos produced on Day 7 (D-7) after in vitro insemination were evaluated. After IVM, the oocytes of all groups were stained with Hoechst 33342, or stained with FITCconjugated anti-?-tubulin antibody or cultured with FITC-conjugated Lens Culinaris agglutinin to evaluate the nuclear maturation rate, microtubules and cortical granules distribution, respectively. The incidence of apoptosis of the CC and embryos was also measured by Comet assay. There was no difference (P > 0.05) among groups on metaphase II oocyte rates (Control = 68.18±4.04; MEL = 66.46±4.04; MEL/FSH/LH = 59.61±4.04), on the percentage of blastocysts with low incidence of apoptosis (Control = 31,46±6,01; MEL = 38,36±6,01; MEL/FSH/LH = 2,92±6,01), on cleavage rate (Control = 85.70±2.47; MEL = 88.52±2.47; MEL/FSH/LH = 85.65±2.47) and on D-7 embryo rate (Control = 54.47± 3.67; MEL = 60.01±3.67; MEL/FSH/LH = 58.40±3.67). The distribution of microtubules and cortical granules was not affected by the groups treated with melatonin. The percentage of cumulus cells with no DNA damage in MEL group (37.64±2.41) was significantly superior to MEL/FSH/LH (28.08±2.41) and control groups (17.83±2.41). The results suggest that the addition of melatonin to the IVM medium protected the cumulus cells from DNA damage by diminishing the incidence of apoptosis and also supported the embryo development by producing D-7 embryo rates similar to those obtained in traditional system of bovine embryo in vitro production.

A classificação da carne bovina quanto as suas características qualitativas tem extrema importância para indústria frigorífica, para que haja a padronização do produto final e que este possa ser destinado à nichos de mercados específicos. Sendo assim, o emprego de técnicas que possam identificar essas características e classificá-las de forma rápida, precisa e sem destruição do produto, torna-se imprescindível. Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar a acurácia na classificação da maciez da carne maturada por 7, 14, 21 dias ou não maturadas, além da classificação do pH e do tempo de maturação utilizando um sistema de imagem hiperespectral de bancada. O sistema de imagem hiperespectral (&lambda; = 928-2524 nm) foi utilizado para adquirir imagens do músculo Longissimus de bovinos Nelore. As imagens foram processadas sendo selecionada a região de interesse e extraídas as informações espectrais. Todos os modelos testados foram executados utilizando espectros completos e posteriormente, foram reavaliados, utilizando espectros parciais selecionados com base nos comprimentos de onda considerados mais importantes. Os modelos com melhor desempenho obtiveram uma acurácia geral de 89,8%; 84,8% e 93,6% na classificação das amostras nos atributos maciez, maturação e pH, respectivamente. Os resultados demonstram que o sistema de imagem hiperespectral pode ser considerado uma tecnologia viável para classificação de características qualitativas da carne de bovinos Nelore. / The beef classification as its qualitative traits is extremely important for beef industry to provide the standardization of the commercial product and that it can be allocated to specific market. Thus, the use of techniques that can identify these traits and classify them quickly, accurately and without destroying the product, it is essential. The aim of this study was to evaluate the accuracy in the classification of the tenderness of Nellore beef aged for 7, 14, 21 days or not aged and classification of aging time and pH using a bench-top hyperspectral imaging system. A hyperspectral imaging system (&lambda; = 928-2524 nm) was used to collect images of the Longissimus of Nellore cattle. The images were processed, being selected region of interest and extracted spectra image. All models tested were performed using full spectra and subsequently were assessed using partial spectra selected according to the wavelengths considered more important. The models with better performance achieved an overall accuracy of 89.8%; 84.8% and 93.6% in the classification of samples in the attributes tenderness, aging and pH, respectively. The results demonstrate that the hyperspectral imaging system may be considered a viable technology for beef qualitative traits classification.

A maturação in vitro do oócito é um dos fatores limitantes na produção in vitro de embriões. In vivo, esta maturação é um processo altamente orquestrado no qual a meiose é retomada pela onda de gonadotrofina que antecede a ovulação e que induz à queda dos níveis de AMPc no oócito. No entanto, os oócitos aspirados ao serem retirados dos folículos ovarianos retomam espontaneamente a maturação comprometendo a competência de seu desenvolvimento. O AMPc é sintetizado pela adenilato ciclase (AC) e degradado pelas fosfodiesterases (PDE), existindo algumas relacionadas à degradação do AMPc e outras do GMPc. Sendo assim, a proposição deste trabalho foi averiguar a contribuição de diferentes isoformas de fosfodiesterases na retomada da meiose e nos níveis de GMPc, AMPc e ainda, determinar quando há manutenção de AMPc em níveis elevados observando sua influência na competência oocitária e ativação da MAPK. Para isso, os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram maturados in vitro na ausência, presença ou associação de inibidores de PDEs-AMPc e GMPc específicas e FSHr. As amostras foram avaliadas em relação a: 1) taxa de maturação; 2) níveis intracelulares de AMPc e GMPc nos CCOs; 3) taxa de desenvolvimento de blastocistos ; 4) ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. Os resultados obtidos no primeiro experimento indiaram que o inibidor da PDE3 foi o mais eficaz (p&lt;0,05) em atrasar a retomada da meiose, às nove horas de maturação, porém, isolado ou em associação com o inibidor da PDE8, não foi capaz de alterar (p&gt;0,05) os níveis de AMPc. No experimento dois, o inibidor da PDE5 isolado não influenciou a retomada da meiose (p&gt;0,05), porém, quando associado aos inibidores da PDE3 e 8 houve atraso na retomada (p&lt;0,05) e ainda alteraram os níveis de GMPc e AMPc (p&lt;0,05) nas primeiras horas de maturação. O experimento três mostrou a influencia do FSHr durante a MIV, o qual estimulou a retomada da meiose, mas em associação com inibidores da PDE5 e 8 atrasa a retomada (p&lt;0,05). Além disso, o FSHr provoca aumento do nível de AMPc e sua associação com inibidores de PDE5 e PDE8 ocasionou elevação adicional (p&lt;0,05). As condições de cultivo estudadas no experimento quatro mostraram que a maturação induzida (pré-MIV de duas horas com agentes para elevar AMPc seguindo de 22 horas de MIV com FSH associado a inibidores de PDEs) atrasaram a retomada da meiose às nove horas de maturação, mas não afetaram progressão da meiose às 24, 28 e 30 horas. Os tratamentos, porém, não melhoraram a competência oocitária após a fertilização in vitro e ocasionaram pequenas variações na ativação da MAPK em oócitos e células do cumulus. / In vitro maturation of oocytes is a limiting factor in the in vitro production of bovine embryos. In vivo, this maturation is a highly orchestrated process in which meiosis resumption by the gonadotropin surge that precedes ovulation induces the decrease in cAMP levels in the oocyte. However, when oocytes are removed from follicles, they spontaneously resume maturation compromising the competence for its development. cAMP is synthesized by adenylyl cyclase (AC) and degraded by phosphodiesterases (PDE), and there are some PDEs related to degradation of cAMP and/or cGMP. Thus, the purpose of this work was to investigate the contribution of different isoforms of phosphodiesterases in the resumption of meiosis and levels of cAMP and, also, to determine differences in signaling pathways when maintaining high levels of cAMP and its influence on oocyte competence. For this purpose, cumulus-oocyte complexes (COC) were matured in vitro in the presence, absence or combination of inhibitors of cAMP- and cGMP-specific PDEs and FSH. Samples be were evaluated in relation to: 1) maturation rate, 2) intracellular levels of cAMP and cGMP in COCs, 3) rate of blastocyst development and 4) activation of MAPK in oocytes and cumulus cells. The results of the first experiment showed that the PDE3 inhibitor is more effective (p &lt;0.05) in delaying meiosis resumption, at nine hours of maturation, but was not capable of altering cAMP levels (p&gt; 0.05) either alone or in combination with the PDE8 inhibitor. In experiment two, the PDE5 inhibitor alone did not affect the meiosis resumption (p&gt; 0.05), however, when associated with PDE3 and PDE8 inhibitors it delayed their resumption (p &lt;0.05) and also altered cGMP and cAMP levels of (p &lt;0.05) in the early hours of maturation. The third experiments showed the influence of FSHr during IVM, which stimulated the resumption of meiosis, but in combination with PDE5 and PDE8 inhibitors meiosis was delayed (p &lt;0.05). Furthermore, FSHr causes increased levels of cAMP and its association with PDE5 and PDE8 inhibitors caused an additional increase (p &lt;0.05). Culture conditions studied in experiment four showed that induced maturation (pre-IVM for two hours with agents to elevate cAMP followed by 22 hours IVM with FSH associated with PDE inhibitors) delayed the resumption of meiotic maturation at nine hours, but has no effect on meiosis progression at 24, 28 and 30 hours. The treatments, however, did not improve oocyte competence after in vitro fertilization and caused minor variations in the activation of MAPK in oocytes and cumulus cells.

O óxido nítrico (NO) é um mensageiro químico encontrado em diversos tipos celulares como células endoteliais, neurônios e macrófagos. A síntese do NO é realizada pela ação da enzima óxido nítrico sintase (NOS). Um dos mecanismos de ação do NO é dado pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs), resultando na produção de monofosfato cíclico de guanosina (GMPc), um mensageiro secundário nessa via de sinalização celular. O GMPc por sua vez é capaz de modular a atividade de algumas fosfodiesterases (PDEs), enzimas responsáveis pela degradação do GMPc e de outro nucleotídeo cíclico, o monofosfato cíclico de adenosina (AMPc). O objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da elevação dos níveis de NO por meio do doador de óxido nítrico (SNAP) e o uso de inibidores de diferentes isoformas de fosfodiesterases no meio de cultivo durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre a retomada da meiose, concentração de NO e níveis de GMPc e AMPc. Deste modo, os complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos foram cultivados por até 9 horas com o doador de NO (SNAP - 10-7 M) associado ou não ao inibidor de GCs (ODQ - 10-5 M) e associado ou não aos inibidores das fosfodiesterases, PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) e PDE8 (Dipiridamole - 50&micro;M). As amostras foram avaliadas quanto a taxa de retomada da meiose, níveis de NO (9h de MIV) e níveis dos nucleotídeos cíclicos GMPc e AMPc (0, 1, 2 e 3h de MIV). O SNAP retardou o rompimento da vesícula germinativa com 9horas de cultivo (P&lt;0,05) e quando o SNAP foi associado ao ODQ o efeito foi revertido (P&gt;0,05). A inclusão de SNAP no cultivo, os níveis de NO foram elevados (P&lt;0,05). Os níveis de GMPc só foram influenciados positivamente pelo SNAP com 1 hora de cultivo (P&lt;0,05) e após 2 e 3 horas, esta influência não persistiu (P&gt;0,05), visto que o ODQ aboliu o efeito. A influência do SNAP foi devido ao estímulo da GCs. Para os níveis de AMPc, o doador de NO não foi capaz de influenciar suas concentrações durante as 3 horas de cultivo (P&gt;0,05). Quando o SNAP foi associado ao Sildenafil (SNAP+SIL) não houve diferença em relação ao grupo imaturo (P&gt;0,05), porém, também não se diferiu do tratamento SNAP e controle (P&gt;0,05). Para as taxas de retomada de meiose todos os tratamentos foram eficientes e conseguiram retardar a quebra da vesícula germinativa diante do grupo controle (P&lt;0,05), sendo o grupo SNAP+CIL mais eficiente. Para os níveis de AMPc, nem mesmo com a utilização de inibidores das PDE3 e PDE8 foi possível atenuar a queda do nucleotídeo. Em conclusão, o SNAP exerceu influência na retomada da meiose, na concentração de NO e nos níveis de GMPc sendo que sua ação se deve à atividade da GCs. Não houve influência sobre os níveis de AMPc, quando o SNAP foi associado a inibidores específicos de fosfodiesterases, mesmo quando apresentaram efeito sobre a retomada da meiose. A via NO/GCs/GMPc não parecer atuar sobre a via PDE3/AMPc, sugerindo a ação de outras vias no controle da meiose. / Nitric oxide (NO) is a chemical messenger found in many cell types such as endothelial cells, neurons and macrophages. The synthesis of NO is made by the action of nitric oxide synthase (NOS). One of the mechanisms of action of NO is given by the activation of the enzyme soluble guanylate cyclase (sGC), resulting in the production of cyclic guanosine monophosphate (cGMP), a secondary messenger in this pathway of cell signaling. The cGMP in turn is capable of modulating the activity of some phosphodiesterases (PDEs), enzymes responsible for degradation of cGMP and other cyclic nucleotide, cyclic adenosine monophosphate (cAMP). The objective of this study was to investigate the effects of elevated levels of NO via nitric oxide donor (SNAP) and the use of inhibitors of phosphodiesterase isoforms in the culture medium during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes on resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP and cAMP levels. Thus, the complexes cumulus-oocyte (COCs) were cultured for cattle up to 9 hours with the NO donor (SNAP - 10-7 M) with or without the inhibitor of sGC (ODQ - 10-5 M) and with or without to inhibitors of phosphodiesterase PDE5 (Sildenafil - 10&micro;M), PDE3 (Cilostamide - 20&micro;M) and PDE8 (Dipyridamole - 50&micro;M). The samples were evaluated for the rate of resumption of meiosis, levels of NO (9h - IVM) and levels of cyclic nucleotides cGMP and cAMP (0, 1, 2 and 3h - IVM). The SNAP delayed with germinal vesicle breakdown of 9hours cultivation (P &lt; 0.05) when SNAP was associated with ODQ was reversed the effect (P&gt; 0.05). The inclusion of SNAP cultivation, NO levels were increased (P&lt;0.05). cGMP levels were positively influenced only by the snap 1 hour in culture (P&lt;0.05) and after 2 and 3 hours, this effect was not maintained (P&lt;0.05), whereas ODQ abolished the effect. The influence of SNAP was due to stimulation of GCs. For cAMP levels, the NO donor was not able to influence their concentrations during the 3 h incubation (P&gt;0.05). When SNAP was associated with Sildenafil (SIL+SNAP) there was no difference compared to the immature group (P&gt;0.05), however, also did not differ from SNAP treatment and control (P&gt;0.05). Rates for resumption of meiosis all treatments were efficient and able delay before germinal vesicle breakdown in the control group (P&lt;0.05), with SNAP+CIL group more efficient. For cAMP levels, even with the use of inhibitors of PDE3 and PDE8 was possible to alleviate the decrease of the nucleotide. In conclusion, SNAP exerted influence on the resumption of meiosis, the concentration of NO and cGMP levels and that its action is due to a GCs activity. There was no effect on cAMP levels, when SNAP was associated with specific phosphodiesterase inhibitors, even when presented effect on the resumption of meiosis. The pathway NO/sGC/cGMP seem not act on the pathway PDE3/AMPc, suggesting the action of other pathways in the control of meiosis.

Estudou-se a evolução morfológica de precipitados .. em matriz .. Cu-Al, através de tratamentos isotérmicos interrompidos por têmpera, em amostras previamente solubilizadas desde o início da precipitação, até o crescimento competitivo. Caracterizou-se a forma dos precipitados após tratamentos em diversas temperaturas, por microscopia ótica e microscopia eletrônica de varredura, de estruturas atacadas profundamente. A forma dos precipitados após tratamentos prolongados a 700 ºC tende a ser esférica, enquanto nos tratamentos a 600 ºC, tende a ser facetada. Com temperaturas decrescentes de 700 º para 600 ºC a forma passa gradualmente de esférica para facetada. Verificou-se que a distribuição espacial dos precipitados depende da velocidade de aquecimento. Com altas velocidades (tratamento em banho de sal), a distribuição é homogênea; com velocidade de aquecimento lentas (tratamento em forno de mufla) os precipitados apresentam-se alinhados, indicando nucleação heterogênea. O crescimento competitivo foi caracterizado através de medidas das distribuições de tamanhos de precipitados. Esta medida foi realizada utilizando micrografias de secções polidas, com um equipamento semi-automático. As medidas de distribuição de tamanhos das secções de precipitados foram processadas para a obtenção da distribuição de diâmetros reais dos precipitados através de um programa de computador utilizando o algoritmo de Saltykov. ......... / The morphological evoluation of .. precipitates in a . Cu-Al matrix has been studied from the beginning of precipitation until coarsening, using isothermal treatments on previously solubilized samples. The shape of precipitates after treatments at many temperatures was studied using Optical Microscopy and Scanning Electron Microscopy of deep etched samples. The precipitates treated for long periods at 700 ºC approach an spherical shape, while treatments at 600 ºC the precipitates become faceted. The special distribution of the precipitates are determined by the heating rate from room temperature to isothermal treatment temperature. With high heating rates the distribution is homogeneous. With low heating rate the precipitates are arranged in rows, due to heterogeneous nucleation. Coarsening was studies by measuring the distribution of precipitate sizes on microphotographs of polished sections using a semi-automatic device. The mesures of section sizes were processed to obtain the real diameter distribution using a computer program based on Saltykov\'s algoritm. .....

O interesse em criopreservar tecido ovariano, embriões e oócitos, principalmente quando se trata de pacientes oncológicas que irão ser submetidas a tratamentos potencialmente esterilizantes, vem crescendo nas últimas duas décadas. Uma das técnicas propostas para se preservar a fertilidade destas pacientes é o congelamento de oócitos, podendo estes ser obtidos já maturados in vivo após a hiperestimulação ovariana controlada ou na forma de oócitos imaturos na ausência de estimulação, nestes casos procede-se a maturação in vitro (MIV) de oócitos pré congelamento. No entanto sabe-se que a criopreservação causa danos de viabilidade e perda do potencial reprodutivo destes oócitos. Alguns autores têm demonstrado que esses danos podem ser reduzidos por meio de cultivos que modulam o perfil lipídico tanto de oócitos como embriões, fazendo com que estes sejam menos susceptíveis ao congelamento. Uma das técnicas que permite a verificação da composição lipídica de células e outras estruturas é a espectrometria de massas. Os objetivos deste estudo foram comparar o perfil lipídico de oócitos maturados in vitro na presença ou ausência de PL e correlacionar com o perfil lipídico e desenvolvimento embrionário dos embriões produzidos in vitro. Além disso, avaliamos o perfil lipídico dos meios de maturação usando oócitos bovinos como modelo experimental. CCOs foram maturados em meio TCM ou TCM + PL, contendo 10% de soro fetal bovino, 0,5 µg/ml de FSH, 5 ng/ml de LH e 1 mg/mL de 17?-estradiol em atmosfera úmida, com 5% de CO2 durante 24 horas. Após a MIV, os oócitos foram desnudados mecanicamente, lavados em PBS e armazenados a -80 ° C, até a análise de perfil lipídico. Oócitos, meios de maturação e blastocistos foram submetidos à técnica de MALDI-MS (ionização e dessorção a laser assistida por matriz /espectrometria de massas). Diferenças no perfil lipídico foram identificadas por PCA (análise de componentes principais). O perfil lipídico dos meios de maturação determinado por MALDI-MS permitiu a diferenciação entre TCM e TCM + PL. No entanto, a análise dos oócitos maturados in vitro demonstrou que o perfil lipídico dos grupos controle ou suplementado com PL não foram diferentes. Da mesma forma, não foram observadas diferenças no perfil lipídico e na embriogênese dos embriões resultantes. No entanto, diferenças no perfil lipídico entre COC e oócitos desnudos (ODs) maturados in vitro foram detectadas. Oócitos maturados com as células do cumulus contêm íons PC com maiores graus de insaturação dos resíduos de ácidos graxos, enquanto ODs contêm espécies de PC com ácidos graxos insaturados (18:0) ou monoinsaturados (18:1). O MALDI-MS permite a obtenção de perfis lipídicos informativos para meios de cultura e oócitos maturados in vitro. A identificação de mudanças no metabolismo lipídico de oócitos durante a MIV pode contribuir para determinar a suplementação lipídica adequada dos meios de MIV e soluções de vitrificação, contribuindo para otimizar os protocolos de criopreservação de oócitos humanos. / The interest in ovarian tissue, embryos and oocytes cryopreservation has been growing in the last two decades, especially in patients who are faced with potentially sterilizing treatments. One of the techniques proposed to preserve the fertility of these patients is the oocyte cryopreservation. The oocytes can be obtained matured in vivo after controlled ovarian hyperstimulation or as immature oocytes, in the absence of stimulation. In these cases, an option is to proceed the in vitro maturation (IVM) of oocytes before cryopreservation. However, it is known that damage induced by cryopreservation is associated with loss of viability and reproductive potential of oocytes. Some authors have demonstrated that such damage can be reduced by culture media that modulate lipid profile in both oocytes and embryos, making them less susceptible to freezing. One technique that enables the determination of the lipid composition of cells and other structures is mass spectrometry. The objectives of this study were to compare lipid profiles of oocytes matured in vitro in the presence or absence of PL and relate this information to lipid profile and preimplantational development of IVM-derived embryos. Also, we evaluated the lipid profiles of culture media using bovine oocytes as an experimental model. COCs were matured in TCM or TCM + PL, both containing 10% fetal calf serum, 0,5µg/ml FSH, 5 µg/mL LH, and 1 µg/mL 17?-estradiol, with 5% CO2 for 24 h. After IVM, oocytes were mechanically denuded, washed in PBS and stored at -80°C, until lipid analysis. Oocytes, maturation media and blastocysts were submitted to the MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry). Differences in lipid profile were addressed by principal component analysis. Maturation media lipid fingerprint by MALDI-MS allows differentiation among TCM and TCM+PL. However, the MALDI-MS of the in vitro matured oocytes demonstrated that lipid profile of control or PL-supplemented groups were not different. Similarly, no differences were observed in the lipid profile and embryogenesis of resulting embryos. Nevertheless, differences in lipid profiles between COCs and denuded oocytes (DOs) matured in vitro were indicated to occur. The former contain PC ions with higher degrees of unsaturation in the fatty acid residues, while DOs contain PC ions with unsaturated (18:0) or monoenoic (18:1) fatty acids. The MALDI-MS has allowed obtaining informative lipid profiles for culture media and IVM-oocytes. Identification of lipid changes during IVM may contribute to determine appropriate lipid supplementation of IVM/vitrification media and to improve cryopreservation of human oocytes.

O objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos de concentrações de 1-metilciclopropeno (1-MCP) em tempos de exposição na conservação de goiabas 'Pedro Sato'armazenadas sob condição ambiente e sob refrigeração. No primeiro experimento as goiabas foram tratadas com 0, 60, 120 e 240 nL.L -1 de 1-metilciclopropeno durante 3, 6 e 12 horas e armazenadas a 10ºC durante 14 e 21 dias (+ 2 dias a 25ºC). No segundo experimento as goiabas foram tratadas com 0, 100, 300 e 900 nL.L -1 de 1-metilciclopropeno durante 3, 6 e 12 horas e armazenadas a 25ºC. No terceiro experimento as goiabas foram tratadas com 0, 100, 300 e 900 nL.L -1 de 1-metilciclopropeno durante 3 horas e armazenadas a 25ºC e a 10ºC. No primeiro experimento as características físico-químicas foram avaliadas aos 14 e aos 21 dias após os tratamentos. No segundo experimento as características foram avaliadas quando os frutos atingiram o completo amadurecimento. No terceiro experimento as características físico-químicas foram avaliadas aos 2, 4, 6 e 8 dias de armazenamento para os frutos armazenados a 25ºC e aos 4, 8, 12 e 16 dias de armazenamento para os frutos armazenados a 10ºC. Os frutos tratados com 240 nL.L -1 de 1-MCP durante 6 e 12 h e armazenados durante 14 dias a 10ºC apresentaram melhor retenção da coloração da casca e menor incidência de podridão, porém quando colocados por 2 dias a 25ºC apesar de apresentarem melhor firmeza e menor incidência de podridões, não mantiveram a cor verde da casca. O 1-MCP não foi eficiente em retardar o amadurecimento dos frutos tratados nas concentrações de 60, 120 e 240 nL.L -1 e armazenados a 10ºC. A concentração de 300 nL.L -1 de 1-MCP durante 6 e 12 h e a concentração de 900nL.L -1 durante 3 horas, permitiram a conservação dos frutos por 9 dias sob condição ambiente. A aplicação de 1-MCP nas concentrações de 100, 300 e 900 nL.L -1 retardou o amadurecimento dos frutos armazenados tanto no ambiente como sob refrigeração. O tratamento com 900 nL.L -1 de 1-MCP durante 3 horas foi considerado o mais eficiente em retardar o amadurecimento dos frutos nas duas temperaturas de armazenamento. Este tratamento permitiu a conservação dos frutos por 16 dias em ambiente refrigerado. / The objective of this study was to study the effect of 1-methylcyclopropene (1-MCP) concentration and exposure time treatments on the postharvest conservation of 'Pedro Sato' guava fruits at room temperature and at refrigerated storage conditions. Three different experiments were carried out. In the first, guava fruits were treated with 0, 60, 120 or 240 nL.L -1 of 1-methylcyclopropene for 3, 6 or 12 hours and stored at 10ºC for 14 and 21 days (plus 2 days at 25ºC). In the second, the guava fruits, were treated with 0, 100, 300 or 900 nL.L -1 of 1-methylcyclopropene for 3, 6 or 12 hours and stored at 25ºC. In third, the guava fruits were treated with 0, 100, 300 or 900 nL.L -1 of 1-methylcyclopropene for 3 hours and stored at 25ºC and at 10ºC. The physical-chemical characteristics of the fruits were evaluated at 14 and 21 days, when the guavas fruits were completely ripen, and at the days 2, 4, 6 and 8 of storage for fruits stored under room temperature and at days 4, 8, 12 and 16 of storage for fruits storage under refrigerated conditions for the first, second and third experiment, respectively. Fruits treated with 240 nL.L -1 of 1-MCP for 6 and 12 hours stored for 14 days at 10ºC showed better retention of skin color and smaller decay incidence, although the fruits stored for 2 days at 25ºC showed better firmness and smaller decay incidence, all of the fruits not maintain green skin color. The 1-MCP concentrations of 60, 120 or 240 nL.L -1 and 10ºC storage conditions were not efficient on delaying treated fruit ripening. The concentration of 300 nL.L -1 of 1-MCP for 6 and 12 h, and the concentration of 900 nL.L -1 for 3 hours, allowed the better conservation of the fruits for 9 days at room temperature. 1-MCP was efficient on delaying fruits ripening under room temperature storage conditions. The 1-MCP 100, 300 or 900 nL.L -1 concentrations treatments delayed the ripening of fruits stored under room temperature and under refrigerated conditions. The 900 nL.L -1 of 1-MCP for 3 hours treatment was considered to be the most efficient on delaying fruits ripening in the both storage temperatures conditions. Also this treatment allowed conservation of the fruits for 16 days under refrigeration.