A quantificação da angiogênese e das metaloproteinases pode ser útil na avaliação do comportamento dos colesteatomas, como marcadores de sua agressividade. Objetivo: Comparar os marcadores CD31, MMP2 e MMP9 entre pacientes pediátricos e adultos. Método: transversal. Grupos pediátricos(até 18 anos) e adultos(a partir de 19 anos). Coletados 120 colesteatomas, fixados em formol a 10%, preparadas cinco lâminas, de cada amostra, por técnicas histológicas habituais, observados: número de vasos sangüíneos(CD 31), marcação com MMP2 e MMP9, número de células na matriz e espessura na perimatriz. Dados analisados no SPSS através coeficiente Spearman, exato de Fisher e Mann-Whitney. Resultados: Colesteatomas distribuídos igualmente: 60 pediátricos(11,77±3,57anos); 60 adultos(38,29±14,51anos). CD31pediátrico 7(4 a 11), CD31adulto 4(0 a 10) (P=0,044). MMP2citoplasmática pediátrico 1(0 a 3), MMP2citoplasmática adulto 0(0 a 1) (P=0,006). MMP2nuclear pediátrico 0(0 a 1), MMP2nuclear adulto 0(0 a 1) (P=0,056). MMP9 pediátrico 2(0 a 4), MMP9 adulto 0(0 a 4) (P=0,049). O número de vasos sangüíneos e a quantificação das metaloproteinases estavam fortemente correlacionados com a espessura da perimatriz. Conclusões: Os colesteatomas pediátricos apresentam um grau inflamatório mais exacerbado, produzem mais metaloproteinases, fatores estes, que conjugados, poderiam caracterizar os colesteatomas pediátricos como mais agressivos que os colesteatomas adultos. / Cholesteatoma is an epidermal cyst with three distinct components: matrix, perimatrix and cystic content. The clinical significance of cholesteatoma lies in its association with potential intracranial complications due to bone destruction. Objective: To compare histological and immunohistochemistry analysis between pediatric and adult acquired. Methods: Cross-sectional study. The patients were divided in two groups, according to their age: 60 adults(>18 years old) and 60 children(until 18 years old). The cholesteatomas were fixed in formalin 10%. Five slides from each sample were prepared using standard histology techniques. Slides were analyzed according to average number of blood vessels (CD31), MMP2 and MMP9 positivity and thickness of the perimatrix. Data were analyzed using Mann-Whitney and Fisher's exact tests and Spearmann coeficient, with P values<0.05 considered significant. Results: Perimatrix thickness was 78(34-217); CD31 was 6(0-11), cytoplasmic MMP2 positivity was 0(0-2), nuclear MMP2 positivity was 0(0-1); MMP9 positivity was 2(0-4). Statistical difference, between children and adults, was found in perimatrix thickness(P=0.014); blood vessels(P=0.044); cytoplasmic MMP2(P=0.006), nuclear MMP2(P=0.056); MMP9(P=0.049). Conclusions: Pediatric cholesteatomas have a thicker perimatrix, a greater degree of inflammation, and produce more metalloproteinases than those of adult patients, we can suggest, with the combination of these factors, that cholesteatoma is more aggressive in children than in adults.

A quantificação da angiogênese e das metaloproteinases pode ser útil na avaliação do comportamento dos colesteatomas, como marcadores de sua agressividade. Objetivo: Comparar os marcadores CD31, MMP2 e MMP9 entre pacientes pediátricos e adultos. Método: transversal. Grupos pediátricos(até 18 anos) e adultos(a partir de 19 anos). Coletados 120 colesteatomas, fixados em formol a 10%, preparadas cinco lâminas, de cada amostra, por técnicas histológicas habituais, observados: número de vasos sangüíneos(CD 31), marcação com MMP2 e MMP9, número de células na matriz e espessura na perimatriz. Dados analisados no SPSS através coeficiente Spearman, exato de Fisher e Mann-Whitney. Resultados: Colesteatomas distribuídos igualmente: 60 pediátricos(11,77±3,57anos); 60 adultos(38,29±14,51anos). CD31pediátrico 7(4 a 11), CD31adulto 4(0 a 10) (P=0,044). MMP2citoplasmática pediátrico 1(0 a 3), MMP2citoplasmática adulto 0(0 a 1) (P=0,006). MMP2nuclear pediátrico 0(0 a 1), MMP2nuclear adulto 0(0 a 1) (P=0,056). MMP9 pediátrico 2(0 a 4), MMP9 adulto 0(0 a 4) (P=0,049). O número de vasos sangüíneos e a quantificação das metaloproteinases estavam fortemente correlacionados com a espessura da perimatriz. Conclusões: Os colesteatomas pediátricos apresentam um grau inflamatório mais exacerbado, produzem mais metaloproteinases, fatores estes, que conjugados, poderiam caracterizar os colesteatomas pediátricos como mais agressivos que os colesteatomas adultos. / Cholesteatoma is an epidermal cyst with three distinct components: matrix, perimatrix and cystic content. The clinical significance of cholesteatoma lies in its association with potential intracranial complications due to bone destruction. Objective: To compare histological and immunohistochemistry analysis between pediatric and adult acquired. Methods: Cross-sectional study. The patients were divided in two groups, according to their age: 60 adults(>18 years old) and 60 children(until 18 years old). The cholesteatomas were fixed in formalin 10%. Five slides from each sample were prepared using standard histology techniques. Slides were analyzed according to average number of blood vessels (CD31), MMP2 and MMP9 positivity and thickness of the perimatrix. Data were analyzed using Mann-Whitney and Fisher's exact tests and Spearmann coeficient, with P values<0.05 considered significant. Results: Perimatrix thickness was 78(34-217); CD31 was 6(0-11), cytoplasmic MMP2 positivity was 0(0-2), nuclear MMP2 positivity was 0(0-1); MMP9 positivity was 2(0-4). Statistical difference, between children and adults, was found in perimatrix thickness(P=0.014); blood vessels(P=0.044); cytoplasmic MMP2(P=0.006), nuclear MMP2(P=0.056); MMP9(P=0.049). Conclusions: Pediatric cholesteatomas have a thicker perimatrix, a greater degree of inflammation, and produce more metalloproteinases than those of adult patients, we can suggest, with the combination of these factors, that cholesteatoma is more aggressive in children than in adults.

Submitted by CARLUCI TAÍS BELTRAN null (carluci_beltran@hotmail.com) on 2016-08-12T19:11:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação 2016 - Carluci.pdf: 1181280 bytes, checksum: 002c3a18d9cad2605930430f08d31630 (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Paula Grisoto (grisotoana@reitoria.unesp.br) on 2016-08-16T13:06:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 beltran_ct_me_araca.pdf: 1181280 bytes, checksum: 002c3a18d9cad2605930430f08d31630 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-16T13:06:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 beltran_ct_me_araca.pdf: 1181280 bytes, checksum: 002c3a18d9cad2605930430f08d31630 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A doença periodontal (DP) e o diabetes mellitus (DM) são doenças inflamatórias crônicas, e quando associadas aumentam a destruição da região periodontal. Por esta razão, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel do diabetes sobre o processo inflamatório, reabsorção óssea alveolar, produção de metaloproteinase de matriz (MMP), colágeno e TGF-β1 em camundongos com DP experimental. Foram utilizados 40 camundongos Balb/c machos de 18 – 22 g, distribuídos igualmente em 4 grupos, sendo estes, normal (N), normal com doença periodontal (N+DP), diabético (DM) e diabético com doença periodontal (DM+DP). O diabetes foi induzido por tratamento com estreptozotocina 200 mg/kg por via intraperitoneal. Passados 7 dias os índices glicêmicos foram verificados, e os animais foram considerados diabéticos quando a glicemia apresentava-se igual ou superior a 250 mg/dL. Posteriormente, os camundongos do grupo com DP foram submetidos a uma ligadura em torno dos primeiros molares inferiores, e no 15º dia, estes animais foram eutanasiados e as amostras foram coletadas para as análises seguintes. O tecido gengival marginal foi coletado para as análises de marcadores inflamatórios, tais como, níveis de CXCL2, CCL3 e TGF-β1 por ELISA, expressão gênica de MMP-2, MMP-9, TGF-β1 e col1a2 por RT-PCR em tempo real, e atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 por zimografia. Os parâmetros de reabsorção de osso alveolar, recrutamento de neutrófilos e quantificação de colágeno também foram avaliados, pelo processamento histológico das hemimandíbulas, os quais apresentaram diferença significativa no grupo DM+DP. A DP foi capaz de aumentar a produção de CXCL2, CCL3 e TGF-β1, contudo somente a produção de CXCL2 e CCL3 foi aumentada no grupo DM+DP. A expressão gênica de MMP-2 não apresentou diferença estatística nos grupos analisados, em contrapartida a expressão de MMP-9 foi diminuída com a DP, apresentado diferença significativa no grupo DM+DP, assim como a expressão de TGF-β1 e col1a2. Nos grupos com DP, houve aumento significativo na atividade de MMP-2 e MMP-9, com potencializada atividade de MMP- 2 no grupo DM+DP. Em resumo, nós observamos que o DM mais a DP agravam a resposta inflamatória e processo destrutivo na região periodontal, caracterizada por aumento da migração de neutrófilos, reabsorção óssea, aumento na produção de CXCL2 e CCL3, aumento na atividade de MMP-2 e diminuição da porcentagem de colágeno, sugerindo assim um desequilíbrio no reparo tecidual da região periodontal. / Periodontal disease (DP) and diabetes mellitus (DM) are chronic inflammatory diseases that when associated increase destruction in the periodontal region. Then, the aim of our study was to evaluate the role of DM in inflammatory process, bone resorption, matrix metalloproteinase (MMP), collagen and TGF-β1 production during periodontal disease experimental in mice. Forty Balb/c mice 18-22 g were used, divided equally into 4 groups, normal (N), normal with periodontal disease (N+DP), diabetic (DM), diabetic with periodontal disease (DM+DP). The diabetes was induced by 200 mg/kg streptozotocin via intraperitoneal. After of 7 days the glycemic indices was evaluated, and animals were considered diabetics than blood glucose has become equal to or greater than 250 mg/dL. Mice of the DP group had a ligature around the first molars, and 15th day, the animals were euthanized and samples were collected for the following analyzes. The gingival tissue was collected to analysis inflammatory markers, such as CXCL2, CCL3 and TGF-β1 levels by ELISA; gene expression of MMP-2, MMP-9, TGF-β1 and col1a2 by real time RT-PCR; and MMP-2 and MMP-9 enzyme activity by zymography. The parameters of alveolar bone resorption, neutrophil recruitment and collagen quantification also were evaluated by histological processing of the hemimandibles, which showed significant difference in DM+DP group. Periodontal disease was able to increase CXCL2, CCL3 and TGF-β1 production, however only CXCL2 and CCL3 production were increased in the DM+DP group. Gene expression of MMP-2 was not significant altered in the groups analyzed, however expression de MMP-9 was reduced in the DP, meanly in the DM+DP group, well as expression of TGF-β1 and col1a2. In addition, groups with periodontal disease showed significant enhance in the activity of the MMP-2 and MMP-9, with high level activity of MMP-2 in the DM+DP group. In summary, it was possible to observe that diabetes plus DP aggravate inflammatory and destructive process of periodontal region, characterized by increased in the neutrophil migration and bone resorption, higher CXCL2 and CCL3 production, and increase in the MMP-2 activity with change of the amount of collagen, suggesting an imbalance in tissue repair of periodontal region.

A quantificação da angiogênese e das metaloproteinases pode ser útil na avaliação do comportamento dos colesteatomas, como marcadores de sua agressividade. Objetivo: Comparar os marcadores CD31, MMP2 e MMP9 entre pacientes pediátricos e adultos. Método: transversal. Grupos pediátricos(até 18 anos) e adultos(a partir de 19 anos). Coletados 120 colesteatomas, fixados em formol a 10%, preparadas cinco lâminas, de cada amostra, por técnicas histológicas habituais, observados: número de vasos sangüíneos(CD 31), marcação com MMP2 e MMP9, número de células na matriz e espessura na perimatriz. Dados analisados no SPSS através coeficiente Spearman, exato de Fisher e Mann-Whitney. Resultados: Colesteatomas distribuídos igualmente: 60 pediátricos(11,77±3,57anos); 60 adultos(38,29±14,51anos). CD31pediátrico 7(4 a 11), CD31adulto 4(0 a 10) (P=0,044). MMP2citoplasmática pediátrico 1(0 a 3), MMP2citoplasmática adulto 0(0 a 1) (P=0,006). MMP2nuclear pediátrico 0(0 a 1), MMP2nuclear adulto 0(0 a 1) (P=0,056). MMP9 pediátrico 2(0 a 4), MMP9 adulto 0(0 a 4) (P=0,049). O número de vasos sangüíneos e a quantificação das metaloproteinases estavam fortemente correlacionados com a espessura da perimatriz. Conclusões: Os colesteatomas pediátricos apresentam um grau inflamatório mais exacerbado, produzem mais metaloproteinases, fatores estes, que conjugados, poderiam caracterizar os colesteatomas pediátricos como mais agressivos que os colesteatomas adultos. / Cholesteatoma is an epidermal cyst with three distinct components: matrix, perimatrix and cystic content. The clinical significance of cholesteatoma lies in its association with potential intracranial complications due to bone destruction. Objective: To compare histological and immunohistochemistry analysis between pediatric and adult acquired. Methods: Cross-sectional study. The patients were divided in two groups, according to their age: 60 adults(>18 years old) and 60 children(until 18 years old). The cholesteatomas were fixed in formalin 10%. Five slides from each sample were prepared using standard histology techniques. Slides were analyzed according to average number of blood vessels (CD31), MMP2 and MMP9 positivity and thickness of the perimatrix. Data were analyzed using Mann-Whitney and Fisher's exact tests and Spearmann coeficient, with P values<0.05 considered significant. Results: Perimatrix thickness was 78(34-217); CD31 was 6(0-11), cytoplasmic MMP2 positivity was 0(0-2), nuclear MMP2 positivity was 0(0-1); MMP9 positivity was 2(0-4). Statistical difference, between children and adults, was found in perimatrix thickness(P=0.014); blood vessels(P=0.044); cytoplasmic MMP2(P=0.006), nuclear MMP2(P=0.056); MMP9(P=0.049). Conclusions: Pediatric cholesteatomas have a thicker perimatrix, a greater degree of inflammation, and produce more metalloproteinases than those of adult patients, we can suggest, with the combination of these factors, that cholesteatoma is more aggressive in children than in adults.

Orientador: José Eduardo Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T09:07:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_AnnaLauraBecharaJacob_D.pdf: 12479529 bytes, checksum: a0414f163dce135319bdfb549308977a (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A exposição ao mercúrio (Hg) causa efeitos deletérios à saúde, incluindo doenças cardiovasculares. Embora os mecanismos não estejam precisamente definidos, metaloproteinases (MMPs) -2 e -9 podem estar envolvidas. Expressão e atividades aumentadas destas MMPs são demonstradas em diversas condições patológicas, e estudos demonstraram que os níveis circulantes de MMPs poderiam ser usados como marcadores de risco cardiovascular. O gene que codifica a MMP-9 apresenta polimorfismos que afetam a expressão e o nível de atividade desta enzima, sendo que dois deles, presentes na região promotora [C- 1562T e (CA)n], são funcionalmente importantes, tendo sido associados a diversas doenças. Investigamos se existe associação entre os níveis circulantes de MMP-2, MMP-9 e seus inibidores endógenos (TIMPs) -2 e -1 com os níveis circulantes de Hg, em indivíduos expostos ao metal por consumo de peixes, na Amazônia Brasileira. Em seguida, examinamos se os polimorfismos da MMP-9 afetam os níveis circulantes de MMP-9, nestes indivíduos. Para isso, analisamos as concentrações de Hg no sangue e plasma desses indivíduos por espectrometria de massas com plasma indutivamente acoplado (ICP-MS). As concentrações de MMPs e TIMPs foram medidas nas amostras de plasma por zimografia e ELISA, respectivamente. Espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram medidas no plasma, para dosar estresse oxidativo. Os níveis de selênio (Se) foram determinados por ICP-MS, por este ser um antioxidante. O DNA genômico foi extraído das amostras de sangue e os genótipos dos polimorfismos C- 1562T e (CA)n foram determinados. A relação entre os bioindicadores de Hg e os níveis de MMPs, assim como a relação entre os genótipos da MMP-9 e os níveis de MMP-9 foram examinados usando modelos de regressão múltipla. Não foi encontrada relação entre Hg no sangue ou plasma e MMPs. Contudo, Hg no plasma foi negativamente associado com os níveis de TIMPs, resultando em aumento nas razões MMP-9/TIMP-1 e MMP-2/TIMP-2, o que indica uma associação positiva entre Hg no plasma e o grau de atividade de MMP-9 e MMP-2. Os polimorfismos da MMP-9 não se relacionaram aos níveis de MMP-9 quando todos os indivíduos foram analisados juntos. No entanto, quando dividimos a população estudada em terços, com base nas concentrações plasmáticas de Hg, o polimorfismo (CA)n afetou o grau de atividade da MMP-9 no grupo com níveis mais baixos de Hg no plasma. Os níveis de MMP-9 foram mais altos em pessoas com genótipos que incluíam o alelo com mais de 21 repetições CA (alelos H), e menos naqueles cujo genótipo incluía alelos com menos de 21 repetições CA (alelos L). Nos grupos com níveis intermediários ou altos de Hg no plasma, este polimorfismo não teve efeito. Nenhuma associação foi encontrada entre o polimorfismo C- 1562T e os níveis de MMP-9, nos três grupos. Esses achados mostram o efeito do Hg sobre o grau de atividade de MMPs,e que o efeito do Hg sobre a MMP-9 é modulado pelo polimorfismo (CA)n da MMP- 9. O aumento do grau de atividade poderia aumentar o risco de desenvolvimento de doenças cardiovasculares em pessoas expostas ao Hg, principalmente nas que apresentam o genótipo HH. / Abstract: Mercury (Hg) exposure causes health problems, including cardiovascular diseases. Although the mechanisms are not precisely defined, metalloproteinases (MMP) -2 and -9 may be involved. Increased expression and activities of these MMPs are demonstrated in several pathological conditions, and recent studies have demonstrated that circulating levels of MMPs could be used as a blood-borne biomarker for cardiovascular risk, even in healthy individuals. The gene encoding MMP-9 presents genetic polymorphisms which affects the expression and activity level of this enzyme, two of them, present in the promoter region [C- 1562T and (CA)n] are functionally relevant, having been involved in several diseases. We investigated if the association between circulating levels of MMP-2, MMP- 9 and their endogenous inhibitors (TIMPs) -2 and -1 with circulating levels of Hg in individuals exposed to metal through consumption of fish in the Brazilian Amazon. Then, we examined whether these MMP-9 polymorphisms affect circulating MMP-9 net levels in persons exposed to mercury. For this purpose, we analyzed the concentrations of blood and plasma Hg by inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS). MMPs and TIMPs concentrations were measured in plasma samples by zymography and ELISA, respectively. Thiobarbituric acid-reactive species (TBARS) were measured in plasma to assess oxidative stress. Selenium (Se) levels were determined by ICPMS, because it is an antioxidant. Genomic DNA was extracted from whole blood, and genotypes for the C- 1562T and the microsatellite (CA)n polymorphisms were determined. The relationships between biomarkers of Hg and MMPs levels, as well as the relationship between MMP-9 genotypes and MMP-9 levels, were examined using multivariate regression models. No relationship was found between Hg in blood or plasma and MMPs. However, plasma Hg levels were negatively associated with TIMPs levels, and thereby with increasing MMP-9/ TIMP-1 and MMP-2/TIMP-2 ratios, thus indicating a positive association between plasma Hg and circulating net MMP-9 and MMP-2 activities. The polymorphisms of MMP-9 were not related to MMP-9 net levels when all subjects were analyzed together. However, when we divided the population into tertiles of plasma Hg concentrations, the polymorphism (CA)n affected MMP-9 concentrations and MMP-9/TIMP-1 ratios in people with lower levels of Hg. MMP-9 levels were higher in persons with genotypes including alleles with more than 21 CA repeats (H alleles) and lower in those whose genotype including alleles with less than 21 CA repeats (L alleles). Conversely, this polymorphism had no effects in persons with intermediate or high plasma Hg level. No association was found between the C-1562T polymorphism and MMP-9 levels in the three groups. These findings show the effect of Hg on MMP-9 net, and that this effect is modulated by the (CA)n polymorphism of MMP-9. The increase in MMPs levels could increase the risk of developing cardiovascular diseases in persons exposed to Hg, especially those with HH genotype. / Doutorado / Doutor em Farmacologia

Orientador: Paulo Pinto Joazeiro / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:41:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rosa_RenataGiardini_M.pdf: 17497902 bytes, checksum: 703ffbe86316dbd66437c0d105646fed (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Durante a prenhez de alguns roedores ocorre um acentuado processo de remodelação da sínfise púbica (SP). No camundongo, esta articulação fibrocartilaginosa é gradativamente formada por um tecido conjuntivo fibroso, resultando no ligamento interpúbico (LI) entre os coxins de cartlagem na etapa final da prenhez. Logo após o parto, este ligamento é rapidamenteremodelado e o espaço entre os ossos púbicos se fecha por volta do quinto dia pós-parto. Sabe-se que o hormônio relaxina facilita o crescimento e remodelação dos órgãos do trato reprodutor feminino, alterando a regulação dos processos bioquímicos envolvidos na remodelação da matriz extracelular (MEC) do útero gravídico e da cérvice. Porém pouco se conhece sobre a sínfise em relação ao envolvimento de metaloproteinases (MMPs) nessa remodelação. Assim como, da participação de células inflamatórias, que poderiam estar envolvidas no processo de remodelaçãoda sínfise púbica do camundongodurantea prenhez. Neste estudo, foram utilizadas sínfises de camundongos virgens e ligamento interpúbico de animais prenhes para a detecção de MMPsin vivo e in vitro (explante de 24 horas). As MMPs da família das gelatinases (MMP-2 e MMP-9) foram caracterizadas pela zimografia e por meio de ensaios imunohistoquímicos,assim como a MMP-8 (colagenase2) associada,quase que exclusivamente, com o processo inflamatório. Também foram utilizadas microscopia eletrônica de transmissão e microspia de luz associada às colorações seletivas para evidenciar os tipos celulares que poderiam estar participandodo processo de remodelaçãoda sínfise púbica. A zimografia demonstrou a presença das gelatinases MMP-2 e MMP-9, ambas como pré e pró-enzimas, na SP e no LI. Imunohistoquímicadetectou a reação positivade gelatinasese também de MMP-8em células seme~hantesaos fibroblastos. A caracterização morfológica evidenciou que as células semelhantesa fibroblastos na sínfise de animais virgens estão próximasa matriz pericelular, ao passo que durante a prenhez, há um aumento deste subcompartimento, entre célula e matriz. As análises qualitativas e quantitativas, mostramum reduzido númerode granulócitosna sínfise de animaisvirgens e no ligamento intepúbico durante a prenhez. Dados obtidos neste trabalho suportam a hipótese de que as gelatinases estão envolvidas na remodelação da sínfise por processos intrínsecos, evidenciando que tanto as modificaçõesdo fenótipo de células semelhantes a fibroblastos, como as modificaçõesquímicas da MEC, são fundamentais para o rearranjo desta articulação durante a prenhez, parto e pós-parto no camundongo. A extensão da remodelação da MEC sugere o papel dos hormônios da prenhez na modulação da interação célula-matriz independentemente de uma reação do tipo inflamatória descrita em outros órgãos durante a prenhez / Abstract: During pregnancy of some rodents a deep remodeling occurs in the pubic symphysis (PS). In the mouse, these fibrocartilagenousarticulation are gradually replaced by a dense connective tissue, forming the interpubic ligament (IL) at the end of pregnancy. Right after birth, this ligament is rapidly remodeled and the space between the two bones is quickly closed, five days after birth. It is well known that hormones such as relaxin, facilitates the growth and remodeling of organs in female reproductive tract, changing the regulation of biochemical processes that are involved in the remodeling of the extracellular matrix (ECM) of the uterus and cervix during pregnancy. However, little are known about pubic symphysis in when the subject is the involvement of metalloproteinases (MMPs) in this remodeling, as well as the participation of inflammatorycells that could be involved in the remodeling process of the mouse pubic symphysisduring pregnancy. In this study were used pubic symphysis of virgin mice and interpubic ligament in pregnant animais for the detection of MMPs in vivo and at in vitro (24h explants). MMPs from the gelatinase family (MMP-2 and MMP-9) were characterized by zymography and by immunohistochemistryessays, also MMP-8 (collagenase 2) that is believed to be associated almost exclusively with an inflammatory processoTransmission electron microscopy and light microscopy was also used associated with selectively staining, to evidence type of cells that could be involved in the pubic symphysis remodeling. Zymographydemonstratedthe presenceof gelatinases MMP-2 and MMP- 9 both in inactive and active forms, at the PS and IL. Immunohistochemistry,at the pubic symphysis and interpubic ligament, detected the expression of gelatinases and also MMP-8 in cells that were similar to fibroblasts. Morphological characterization evidenciated that cells that are similar to fibroblasts in the pubic symphysis of virgin animais are closely related to the pericellular region, being that during pregnancy,these spaces suffers an increase in this sub-compartment between cell and matrix. Qualitative and quantitative , analysis demonstratedlittle granulocytes in the pubic symphysis of virgin animais and in the interpubic ligament during pregnancy. Results that were obtained from this work support the hypothesis that the gelatinases could be involved in pubic symphysis remodeling through intrinsic processes, being evident that, both cellular phenotype modifications and also chemical modifications of the ECM, are fundamental to the rearrange of this articulation during mouse pregnancy, birth and pos-partum. The extensive remodeling of the ECM suggests hormonal role of the pregnancy in the modulation of the interaction between cell-matrix independently of an inflammatoryreaction in other organs during pregnancy / Mestrado / Histologia / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientadores: Sergio Luis Felisbino, Luis Fernando Barbisan / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-08T07:33:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pires_PauloWagner_M.pdf: 1285792 bytes, checksum: 779a7152ec83e03f0f0320e646f206bf (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: O carcinoma hepatocelular (HCC) é a quinta neoplasia humana mais freqüente no mundo e o abuso crônico do álcool é um conhecido fator de risco, embora uma direta correlação entre o consumo de etanol e o desenvolvimento do HCC permaneça incerta. O presente estudo foi delineado para avaliar os efeitos promotores diferenciais da ingestão crônica de etanol sobre a remodelação e persistência de lesões pré-neoplásicas (LPN) positivas para a forma placentária da glutationa S-transferase (GST-P) e para o fator de crescimento e transformação-alfa (TGF-a) no modelo de hepatocarcinogênese do hepatócito resistente. Noventa e quatro ratos Wistar machos com seis semanas de idade foram aleatoreamente distribuídos em cinco grupos experimentais: grupo G1, controle não-tratado com água e ração basal de livre acesso; G2, não tratado, ração equivalente ao consumo do grupo G3, e maltodextrina dissolvida em água (calorias equivalentes às fornecidas pelo etanol); G3, tratado com etanol a 5% (v/v) na água e ração basal de livre acesso; G4, dietilnitrosamina (DEN, 200 mg/kg de peso corpóreo) e 2-acetilaminofluoreno (2AAF) 200 ppm por três semanas, com ração basal equivalente ao consumo do grupo G5 e maltodextrina dissolvida na água; G5, DEN/2-AAF mais etanol 5% (v/v) e ração basal de livre acesso. Todos os animais foram submetidos à hepatectomia parcial de 70% na 3ª semana e eutanasiados na 12ª e 22ª semanas. Amostras de fígado foram coletadas e processadas histologicamente para detecção de lesões pré-neoplásicas e neoplásicas e contagem de hepatócitos em apoptose em cortes corados por hematoxilina/eosina, análise imunocitoquímica para antígeno nuclear de proliferação celular ¿ PCNA, GST-P e TGF-a e para análise bioquímica de zimografia (atividade de gelatinases). Ao final do tratamento com o etanol, observou-se aumento da porcentagem da área hepática ocupada por LPN GST-P positivas do tipo persistente (P < 0,001), do número de LPN TGF-a-positivas (P< 0,001) e do número e multiplicidade de tumores hepáticos (P < 0.001) em G5, quando comparado com G4. Além disso, observou-se um aumento do índice de proliferação pelo PCNA (fase-S), mas sem alteração nos índices de apoptose, em ambas LPN em remodelação ou persistente em G5 em relação ao grupo G4 ao final da 22ª semana (P <0,001), quando comparado com G4. A atividade de gelatinases (metaloproteinases ¿2 e ¿9) no fígado não foi alterada pelo tratamento com etanol. Os resultados sugerem que a ingestão crônica de etanol promove o crescimento seletivo de LPN GST-P positivas do tipo persistente, especialmente, com associada à co-expressão de TGF-a, sem mudanças na atividades das gelatinases / Abstract: Hepatocellular carcinoma (HCC) is the fifth most frequent cancer in the world and chronic ethanol abuse is a known risk factor, although a direct correlation between ethanol consumption and development of HCC remains uncertain. The present study was designed to evaluate the differential promoting effects of a long-term ethanol intake on remodeling/persistence of gluthatione S-transferase placental form (GST-P) and transforming growth factor alpha (TGF-a) positive preneoplastic lesions (PNL) using the resistant hepatocyte model. Six-week old male Wistar rats were randomly alocated into 5 experimental groups: G1 group, non-treated and water and chow food ad libitum; G2 group, non-treated and pair-fed chow food (restricted to match that of G2 group) and a maltodextrin solution in tap water (matched ethanol-derived calories); G3 group, drinking ethanol 5% ethanol (v/v) and solid food ad libitum;; G4 group, diethylnitrosamine (DEN, 200 mg/kg body weight) plus 200 ppm of 2-acetylaminofluorene (2AAF) for 3 weeks and pair-fed chow food (restricted to match that of G5 group) and a MD solution in tap water (matched ethanol-derived calories); G5 group, DEN/2-AAF treatments plus ethanol 5% (v/v) in tap water and chow food ad libitum. All animals were subjected to 70% partial hepatectomy at week 3 and killed at weeks 12 and 22. Liver samples were collected for histology (preneoplastic and neoplastic lesions and apoptosis detection) and immunohistochemistry (proliferating cell nuclear antigen ¿PCNA, GST-P and TGF-a) and gelatin zymography (metalloproteinases ¿2 and ¿9, also known as gelatinases, activities). At the end of ethanol treatment, there was an increase in percent of liver area occupied by persistent GST-P-positive PNL (P < 0.001), number of TGF-a-positive PNL (P< 0.001) and in number per group and multiplicity of liver tumors (P < 0.001) in DEN/2-AAF-ethanol group (G5) when compared to respective control group (G4 ¿ DEN/2-AAF). In addition, an increase in PCNA labeling indexes (S-phase), but not in the apoptosis rates, in both remodeling and persistent PNL was observed in DEN/2-AAF-ethanol group (G5) at 22 week (P <0.001), when compared to DEN/2-AAF group (G4). Liver gelatinases activities were not altered by ethanol treatment. The results suggest that chronic ethanol. Group(G) at 22 week(P<0.001), when compared to DEN/2-AAF group(G4).Liver gelatinases activities were not altered by ethanol treatment. The results suggest that Chronic ethanol intake promotes a selective growth of persistent GST-P positive PNL, specially, with co-expression of TGF- a, without changes in gelatinases activities / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

A resistência que apresentam as serpentes peçonhentas às suas próprias peçonhas, assim como a resistência observada em alguns animais está bem documentada, e é atribuída a fatores solúveis presentes no seu plasma, soro ou músculo. No caso das serpentes peçonhentas estes fatores as amparam de sofrer danos decorrentes da própria peçonha. No presente trabalho foi isolado do soro da serpente Bothrops alternatus um inibidor de metaloproteases, denominado BaltMPI, mediante cromatografia em DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL e cromatografia de fase reversa em C18, com uma recuperação proteica de 0,3%. A massa molecular determinada para o BaltMPI por SDS - PAGE foi de 60,5 kDa, e por espectrometria de massas MALDI/TOF de 42,4 kDa. Seu ponto isoelétrico, determinado por focalização isoelétrica, é 5,27. Portanto, o BaltMPI, é um SVMPIs com caráter ácido, pertencente aos SVMPIs de baixa massa molecular. Os primeiros 60 aminoácidos da região N-terminal do BaltMPI foram determinados mediante degradação de Edman, e apresentou alto grau de homologia com a sequência para a mesma região de outros SVMPIs isolados a partir do soro de serpentes peçonhentas. Outros segmentos da sequência também foram determinados após clivagem com tripsina e posterior análise por espectrometria de massas. Posteriormente realizou-se o alinhamento da sequência parcial determinada para o BaltMPI, com a sequência do BJ46a, um SVMPI proveniente da Bothrops jararaca, encontrando alta homologia entre elas. Tanto o soro da serpente, quanto o inibidor, BaltMPI, inibiram a atividade hemorrágica da Batroxase, uma SVMP da classe P-I, e a da BjussuMP-I, uma SVMP da classe P-III. Já, em relação à DHM da Batroxase, foi determinado que o BaltMPI tem uma DIHM de 5ug, e uma CE50% de 0,857ug. O BaltMPI também apresentou um efeito inibitório sobre a ação proteolítica da Batroxase, sobre os substratos: fibrinogênio, fibrina e azocaseína. Sobre a atividade fibrinogenolítica da serinoprotease BjSP, o BaltMPI não apresentou um efeito inibitório, corroborando assim com a especificidade descrita para inibir as SVMPs que possuem os SVMPIs. O BaltMPI inibiu a ação hemorrágica e proteolítica da Batroxase, ao formar um complexo mediante ligações não covalentes com esta SVMP. O inibidor BaltMPI, ao igualmente aos demais SVMPIs descritos, é estável em uma ampla faixa de pH (1 - 9), e a temperaturas elevadas, sendo que em temperaturas acima de 60°C foi observada uma diminuição na sua capacidade de inibir a atividade hemorrágica da Batroxase. A inibição da atividade hemorrágica da Batroxase, quando avaliado o potencial do BaltMPI como complemento à soroterapia, foi menor à inibição observada ao realizar os testes com incubação prévia entre o inibidor e a metaloprotease. No entanto, os resultados obtidos são promissores, reforçando o grande potencial que os SVMPIs possuem, tanto como ferramentas moleculares, como opção para o tratamento dos acidentes ofídicos, em especial o acidente botrópico, no qual as SVMPs tem papel fundamental na fisiopatologia observada, e que conduz à alta morbidade associada com este tipo de acidente. / Resistance exhibited by snakes to their own venom, as well as resistance observed in some animals has been well recorded, and has also attributed to soluble factors present in the plasma, serum or muscle. In the case of poisonous snakes, these factors protect them from damages caused by their own venom. An inhibitor, named as BaltMPI, was isolated from the snake´s serum of Bothrops alternates. This inhibitor was isolated through several chromatographic steps including DEAE Sepharose(TM), Superdex(TM) 200, MonoQ(TM) 5/50 GL and C-18 reverse phase, with a protein yield of 0.3%. Molecular mass of 60.5 kDa for BaltMPI was determined by SDS - PAGE and 42.4 kDa by MALDI/TOF mass spectrometry. Its isoelectric point, determined by isoelectric focalization, was 5.27. According to the obtained data, it was established that BaltMPI is an SVMPIs of acid character, belonging to low molecular mass SVMPIs. The first 60 aminoacids from the N-terminal region were determined by Edman degradation. This parcial sequence showed high homology to the corresponding sequence of other SVMPIs isolated from poisonous snake´s serum. Other segments from the sequence were also determined after cleavage with tripsine and MS analyses. Consequently, alignment of the partial sequence of BaltMPI with the sequence of BJ46a, a SVMPI from Bothrops jararaca, was made finding high homology. Both, snake´s serum and BaltMPI, inhibited the hemorragic activity of Batroxase, a class P-I SVMP, and of BjussuMP-I, a class P-III SVMP. When compared to the Batroxase DHM, it was determined a DIHM of 5?g and a CE50% of 0.857?g. BaltMPI also exhibited an inhibitory activity against the proteolitic effect of Batroxase on fibrinogen, fibrin and azocasein as substrates. On the fibrinogenolitic activity of serineprotease BjSP, BaltMPI did not showed inhibitory effect, demonstrating its specificity for inhibiting SVMPs that SVMPIs possess. BaltMPI inhibits the hemorragic and proteolitic action of Batroxase by forming a complex through non covalent linkages with that SVMP. BaltMPI, as well as other reported SVMPIs, is stable in a very high range of pH (1-9), and at high temperatures, although above 60°C a decrease in its inhibition capacity to the hemorrhagic activity of Batroxase. Inhibition of the hemorrhagic activity of Batroxase, when BaltMPI potencial as serum-therapy complement was evaluated, was less than the inhibition observed when tests by previously incubating inhibitor and metalloprotease were made. However, the results obtained are encouraging, highlighting the potential that these kind of proteins, SVMPIs, have as molecular tools, optional treatments for ophidic accidents, specially bothropic accident, in which SVMPs have a fundamental role in the observed physiopathology, leading to a high associated morbidity to this kind of accidents.

As metaloproteases AAA/FtsH são componentes chave do controle da qualidade das proteínas inseridas nas membranas de mitocôndrias e cloroplastos. Em Arabidopsis thaliana, as proteases FtsH presentes nas membranas dos tilacóides formam um complexo heterohexamérico composto pelas subunidades FtsH1/FtsH5 (tipo A) e FtsH2/FtsH8 (tipo B). Este complexo está envolvido na reciclagem de proteínas foto-danificadas, especialmente da proteína D1, centro de reação do PSII. Algumas linhas de evidências indicam ainda que existe um limiar de concentração das proteases FtsH, necessário para a correta formação e desenvolvimento dos cloroplastos. Apesar da extensiva caracterização genética e molecular das proteases FtsH, o mecanismo regulatório do complexo FtsH dos cloroplastos não foi totalmente elucidado até o momento, contudo existem evidências de que a sua ativação pode estar relacionada a alta incidência luminosa e a outras condições de estresse. A presença de fatores proteicos auxiliares, foi testada como hipótese alternativa por nosso grupo, através do uso da protease FtsH5 como isca em um ensaio de duplo híbrido de leveduras. Este ensaio identificou uma proteína interagente putativa, nomeada FIP (FtsH5 Interacting Protein), a qual comprovadamente interage com FtsH5 e está localizada nas membranas dos tilacóides. De modo a investigar o papel regulatório putativo de FIP sobre a atividade do complexo FtsH, nós analisamos os padrões de expressão em uma ampla gama de condições de estresse a partir de dados públicos de microarranjos de DNA. Os perfis de expressão indicam que FIP pode ser um regulador negativo da atividade do complexo. Os resultados também sugerem que o complexo pode estar envolvido na resposta do cloroplasto a diferentes tipos de condições de estresse. O estudo da história evolutiva das proteínas interagentes FtsH5 e FIP evidenciou que as sequências homólogas a FIP são encontradas exclusivamente em musgos e plantas superiores, sugerindo assim que a origem de FIP pode estar relacionada a colonização terrestre. Todos os genes codificantes das proteases FtsH do complexo foram usados como \"query\" na busca por sequências homólogas, permitindo a classificação das proteases FtsH nos tipos A e B por inferência filogenética Bayesiana. Análises filogenéticas Bayesianas também foram feitas para FIP e as proteases FtsH tipos A e B, independentemente. A análise Mirrortree suportou a existência de coevolução entre FIP e as proteases FtsH tipo A. Por outro lado, nenhuma correlação foi encontrada entre FIP e as proteases FtsH tipo B, o que corrobora nossas observações experimentais anteriores. Além disso, o agrupamento portador de homólogos FIP pôde ser recuperado em uma filogenia mais completa das proteases FtsH do tipo A. Análises subsequentes mostraram que ambas as proteínas interagentes estão extensivamente sobre seleção negativa e que proteases FtsH tipo A são bastante conservadas, principalmente nos seus domínios internos. / Eukaryotic AAA/FtsH metalloproteases display a key role in the protein quality control of membrane-inserted proteins in mitochondria and chloroplasts. In Arabidopsis thaliana, chloroplast thylakoidal membranes FtsH proteases form a heterohexameric complex made by FtsH1/FtsH5 (type A) and FtsH2/FtsH8 (type B) subunits. This complex is involved in protein turnover of photo-damaged proteins, in particular the D1 protein at the PSII reaction center. Several lines of evidence also indicate that a FtsH threshold level is necessary for the proper formation and development of chloroplasts. Despite extensive genetic and molecular characterization of the FtsH proteases, the regulatory mechanism of the FtsH complex in chloroplasts has not yet been fully elucidated, however, there are evidences that its activation might be related to high light incidence and other stress conditions. The presence of auxiliary protein factors, as an alternative hypothesis, was tested by our group, through the use of the protease FtsH5 as bait in a yeast two-hybrid assay. This essay identified a putative interacting protein named FIP (FtsH5 Interacting Protein), which has been proved to interact with FtsH5 and be located at the thylakoid membranes. In order to investigate a putative regulatory role of FIP on FtsH complex activity, we analyzed gene expression patterns in a wide range of stress conditions from public DNA microarray data. The expression profiles indicate that FIP could be a negative regulator of the FtsH complex activity. The results also suggest that the complex may be involved in the chloroplast response to different types of stress conditions. In order to shed some light on the evolutionary history of FtsH5 and FIP interacting proteins, we have shown that FIP\'s homologous sequences were exclusively found in mosses and higher plants, suggesting that FIP origin might be related to the plant terrestrial colonization. All Arabidopsis FtsH complex-encoding genes were used as \"query\" sequences in search for homologous sequences, allowing us to classify the FtsH proteases in type A and B by Bayesian phylogenetic inference. Bayesian phylogenetic analyses were also run for FIP and FtsH types A and B proteases, independently. Mirrortree analysis supported coevolution between FIP and type A FtsH proteases. On the other hand, no correlation was found between FIP and type B FtsH homologues, which support our previous experimental observations. In addition, the FIP bearing cluster could be recovered in a more complete type A FtsH phylogeny. Subsequent analyzes have shown that both interacting proteins are extensively under negative selection and that type A FtsH are very conserved, mainly in its inner domains.

Orientador: Brenda Paula Figueiredo de Almeida Gomes / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-24T18:03:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Herrera_DanielRodrigo_D.pdf: 1815873 bytes, checksum: c8ecc16aeec2193dae476030ea7ba24d (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O principal fator de virulência das bactérias Gram-negativas é representado pela liberação de seus subprodutos [Lipopolissacarídeos (LPS) ¿ endotoxinas] presentes na membrana externa do envelope celular bacteriano. O acumulo destes componentes bacterianos no canal radicular e a sua saída para os tecidos periapicais estimula o sistema imune do hospedeiro produzindo uma reação antígeno-anticorpo que gera uma resposta inflamatória a nível periapical. Esta reação é caraterizada pela expressão de mediadores químicos e enzimas, tais como as citocinas pró-inflamatórias e as metaloproteinases (MMPs). Assim, foram objetivos do presente estudo: 1) avaliar a influência do conteúdo infeccioso diante as diferentes etapas do tratamento endodôntico de dentes com infecção primária, na resposta imune do hospedeiro para a produção de interleucina 1 alfa (IL-1?), 1 beta (IL-1?), fator de necrose tumoral alfa (TNF-?), prostaglandina E2 (PGE2), MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 correlacionando esses níveis com os sinais e sintomas clínicos (capitulo 1); 2) avaliar o efeito da ativação do EDTA 17% com ultrassom na redução do conteúdo infeccioso de dentes com infecção primária (capitulo 2); 3) investigar os níveis de endotoxinas de dentes com infecção primária, antes e após o preparo químico-mecânico (PQM) e determinar seu potencial antigênico contra fibroblastos 3T3 através da atividade gelatinolítica de MMPs (capitulo 3). Método: Foram selecionados 24 pacientes com necessidade de intervenção endodôntica por necrose do tecido pulpar e presença de lesão periapical. Amostras do conteúdo do canal radicular foram coletadas antes do PQM (S1), depois do PQM (S2) e depois do uso de EDTA 17% (S3) com e sem ativação com ultrassom (G1 e G2, respectivamente). Amostras para quantificação de citocinas e MMPs foram coletadas passando um cone de papel 2 mm além do ápice radicular depois do PQM. As amostras microbiológicas foram processadas por cultura para contagem de unidades formadoras de colônia (UFC) e identificação. PCR foi realizado utilizando primers espécie-específicos. As amostras de LPS foram analisadas pelo método Limulus Amoebocyte Lysate (LAL). As coletas de citocinas e MMPs foram quantificadas utilizando kits específicos pelo ensaio imunoenzimático de absorção (ELISA). A atividade gelatinolítica foi avaliada por zimografia. Os níveis de produção das citocinas e MMPs foram correlacionados individualmente com os sinais e sintomas clínicos [dor à percussão (POP), dor à palpação (TOP), presença de exudato (EX)]. O teste de Pearson foi utilizado para avaliar a correlação entre endotoxinas e a produção de citocinas e MMPs. Os testes de Friedman e Wilcoxon compararam os níveis de endotoxina e carga microbiana em cada tempo operatório. Os dados obtidos pela atividade gelatinolítica foram analisados pelos testes de ANOVA e Tuckey. O nível de significância foi estabelecido em 5% (p<0,05). Resultados: IL-1?, IL-1?, TNF-?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 e MMP-13 foram detectados em todas as amostras. Foi encontrada correlação positiva entre os níveis de endotoxinas e de todas as citocinas e MMPs avaliadas (p<0,05). EX foi correlacionado positivamente com TNF-?, enquanto os níveis de IL-1?, PGE2 e MMP-8 foram correlacionados com sintomatologia dolorosa (POP/TOP) (p<0,05). O PQM reduziu significativamente os níveis de endotoxina e da carga bacteriana (p<0,05). Maiores níveis de redução de endotoxinas foram registrados quando a irrigação com EDTA foi ativada com ultrassom. Não foram encontradas diferenças significativas na redução da carga bacteriana entre G1(99.98%) e G2 (99.93%) (p>0,05). Foi encontrada correlação entre os níveis de entotoxinas (S1) e a expressão de MMP-2 por fibroblastos. Não foi observada atividade gelatinolítica para MMP-9. Conclusão: 1) O conteúdo infeccioso/endotóxico é um potente estímulo para a resposta imune do hospedeiro na produção de IL-1?, IL-1?, TNF?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13. 2) O PQM consegue reduzir significativamente a carga microbiana e os níveis de endotoxinas. Adicionalmente, a ativação do EDTA com ultrassom promove uma redução maior dos níveis residuais de endotoxinas. 3) O conteúdo infeccioso/endotóxico é um potente estímulo para a expressão gênica de MMP-2 por fibroblastos 3T3 / Abstract: Lipopolysaccharides (LPSs, known as endotoxins) present on the outer layers of Gram-negative bacterial envelope, and released during bacteria multiplication and death, can egress into periradicular tissues, acting as one of the most potent stimuli for immunocompetent cells in the release of inflammatory mediators and matrix metalloproteinases (MMPs). Thus, the objectives of this study were: 1) To evaluate the influence of primarily infected root canal contents (bacterial and endotoxin contents) on host-immune response by interleukin (IL)-1?, IL-1?, tumor necrosis factor ? (TNF-?), prostaglandin E2 (PGE2), matrix metalloproteinases (MMP) MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13 production and to correlate their levels with clinical features (chapter 1); 2) To investigate the influence of 17% ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) ultrasonic activation after chemo-mechanical preparation (CMP) on eliminating/reducing oral bacterial lipopolysaccharide (LPS, known as endotoxins) and cultivable bacteria in teeth with pulp necrosis and apical periodontitis (chapter 2); 3) To investigate the endotoxin levels from primary endodontic infection before and after CMP, and to determine their antigenicity against 3T3 fibroblasts through gelatinolytic activity of MMPs (chapter 3). Methods: Root canal content samples were taken from 24 primarily infected root canals with apical periodontitis by using sterile/apyrogenic paper points. Samples were taken at different clinical times: S1- before CMP; S2- after CMP; S3- after EDTA: G1- with ultrasonic activation (n=12) and G2- without ultrasonic activation (n=12). PCR technique (16S rRNA) was used for the detection of the target bacteria. Culture techniques were used to determine the number of colony-forming units (CFU). Limulus Amebocyte Lysate (LAL) was used to measure endotoxin. Cytokines and MMPs levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) from samples that were taken passing 2 mm through the root apex after CMP. The levels of MMP-2 and MMP-9 gelatinolytic activity were measured using the zymography technique. The Pearson coefficient was used to correlate the amount of endotoxins with cytokine and MMP levels. Clinical data were set as dependent variables and correlated by individual correlation with each cytokine and MMP level. Friedman¿s and Wilcoxon tests was used to compare the amount of bacteria and endotoxin contents at each clinical time. Data obtained from gelatinolytic activity was analysed using Anova and Tukey¿s tests. The significance levels always were set at 5% (p<0,05). Results: IL-1?, IL-1?, TNF-? and PGE2, as well as, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13 were detected in all samples. A correlation between endotoxin levels with cytokines and MMPs production was found (p<0.05). Root canal exudation was positively correlated with high levels of TNF-?, and symptomatic teeth were correlated with IL-1?, PGE2 and MMP-8 (p<0.05). CMP were effective in reducing endotoxins and bacterial load (p<0.05). Higher values of endotoxin reduction were achieved when EDTA received ultrasonic activation compared with the no-activation group (p<0.05). No differences were found in the bacterial load reduction after EDTA when comparing G1 (99.98%) and G2 (99.93%) (p>0.05). A correlation was found between the levels of endotoxins and MMP-2 expression (p<0.05). No gelatinolytic activity of MMP-9 was observed. Conclusion: 1) Primarily infected root canal infection contents are potent stimuli factor for host-immune response by the production of IL-1?, IL-1?, TNF-?, PGE2, MMP-2, MMP-3, MMP-8, MMP-9 and MMP-13. 2) Although CMP was effective in reducing bacteria and endotoxins, it was not able to eliminate them from all root canals analyzed. The ultrasonic activation of EDTA was efficient in reducing even more the endotoxins levels in the root canals of teeth with pulp necrosis and apical periodontitis. 3) Root canal content from primary endodontic infection showed gelatinolytic activity for MMP-2 / Doutorado / Endodontia / Doutor em Clínica Odontológica