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Estudo da relação estrutura-função da proteína antiofídica DM43

Trugilho, Monique Ramos de Oliveira January 2009 (has links)
Made available in DSpace on 2014-12-05T18:41:19Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) monique_trugilho_ioc_dout_2009.pdf: 10986205 bytes, checksum: 7de098da6c6025322360c2bb8516382d (MD5) Previous issue date: 2014-11-18 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A proteína antiofídica DM43 isolada do soro do gambá Didelphis aurita inibe o efeito hemorrágico e a atividade proteolítica de metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs). Ao se ligar às SVMPs, o homodímero de DM43 se dissocia e cada monômero se liga a uma molécula de metaloprotease. O monômero é composto de três domínios tipo-imunoglobulina, dois dos quais são glicosilados. Para investigar a relação estrutura-função de DM43, os genes codificantes para esta proteína e para seus domínios foram clonados nos vetores pET101D/TOPO ou pET102D/TOPO; neste último, a proteína recombinante foi expressa em fusão com a tiorredoxina. Expressamos as construções obtidas em bactérias competentes da linhagem BL21 Star (DE3) de E. coli, na forma de corpúsculos de inclusão. Após purificação e reenovelamento por diálise, os espectros de dicroísmo circular (CD) na região do ultravioleta distante indicaram uma mistura de \03B1-hélices e folhas \03B2 pregueadas para os domínios recombinantes expressos em fusão com a tiorredoxina. A identidade das proteínas recombinantes foi confirmada, tanto por immunoblotting com anticorpo policlonal contra DM43, quanto por espectrometria de massas (MS/MS). Entretanto, nenhum dos domínios recombinantes, isolados ou combinados, foi capaz de inibir a atividade proteolítica da jararagina, uma metaloprotease de Bothrops jararaca. Ao contrário, os domínios fusionados com a tiorredoxina foram degradados quando incubados com esta SVMP. Estes resultados podem indicar que a glicosilação é funcionalmente importante e/ou que a conformação nativa multidomínio é necessária para a atividade biológica deste inibidor. Para melhor entender seus requisitos estruturais, estudamos a DM43 nativa após degradação proteolítica. Sob condições nativas, a digestão limitada de DM43 com tripsina ou quimotripsina gerou vários fragmentos, mas nenhum peptídeo ativo contra a SVMP foi obtido. Sob condições desnaturantes, a digestão extensiva de DM43 pela endoproteinase Lys-C produziu peptídeos menores. Mesmo sem atividade biológica contra a jararagina, três destes peptídeos foram capazes de interagir com esta SVMP. Após sequenciamento por MS/MS, cada peptídeo foi localizado em um domínio diferente de DM43. Estes resultados parecem sugerir a participação conjunta dos três domínios na interação com as SVMPs / The antiophidic protein DM43 isolated from Didelphis aurita serum inhibits the hemorrhagic effect and the proteolytic activity of snake venom metalloproteinases (SVMPs). Upon SVMP addition, DM43 homodimer dissociates and one subunit binds to one SVMP. The 43 kDa monomer is composed of three immunoglobulin-like domains, two of which are glycosylated. To investigate the structure-function relationship in this protein, the genes encoding DM43 and its domains were separately cloned into pET101D/TOPO or pET102D/TOPO vector, this last with the fusion partner thioredoxin. The obtained constructions were expressed in BL21 Star (DE3) competent E. coli cells as inclusion bodies. After purification and dialysis refolding, circular dichroism (CD) spectra in the far UV region of the recombinants domains with fusion partner indicated the presence of folded proteins with both alpha-helix and beta-sheet. The identities of the recombinant proteins were confirmed by immunoblotting with polyclonal antibodies against serum DM43 and by mass spectrometry (MS/MS). However, none of the domains either isolated or in combination, were able to inhibit the proteolytic activity of jararhagin. In contrast, thioredoxin-fused domains were readily digested by this SVMP. These results may indicate that glycosylation is functionally important for DM43 and/or that a multidomain native conformation is necessary for the biological activity of the inhibitor. To better understand its structural requirements, serum DM43 was studied after proteolytic degradation. Under native conditions, limited digestion of DM43 by trypsin or chymotrypsin generated various fragments, but no active peptide against SVMP was obtained. Extensive digestion of denatured DM43 by Lys-C endopeptidase produced smaller peptides. Even though not able to neutralize the proteolytic activity of jararhagin, three DM43 Lys-C peptides were able to bind to SVMP. After sequencing by MS/MS, each peptide was localized to one DM43 domain. Taken together, these results seem to reinforce the participation of all three domains of DM43 in the interaction with SVMPs
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Transcritoma da glândula venenífera da serpente Bothrops neuwiedi: montagem, anotação e identificação de proteínas de interesse farmacológico

Alvarenga, Valéria Gonçalves January 2014 (has links)
Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:25Z No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-16T13:07:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-16T13:07:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertacao_BCM_ValeriaGoncalvesdeAlvarenga.pdf: 2433244 bytes, checksum: 6d9050cc301a43b883c66359a399af90 (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / Os componentes de venenos de serpentes são importantes ferramentas para a pesquisa científica, desenvolvimento de drogas, e para o diagnóstico de várias doenças. Descrevemos a montagem de novo e análise do transcritoma da glândula de veneno de uma serpente amplamente distribuída no Brasil a Bothrops neuwiedi. Com base em 9.500.000 sequências identificamos várias sequências inteiras codificantes de toxinas. A mais abundante expressão foi de transcritos de metaloproteinases de veneno de serpentes (SVMPs), que apresentou o maior percentual de sequências mapeadas em um transcriptoma de referência (34,40 %), seguido por lectinas tipo C (25,20 %), fosfolipases A2 (14,20%) e serino-proteinases (7,51 %). Devido à importância fisiopatológica no envenenamento e seu potencial uso como um modelo para o desenvolvimento biotecnológico de fármacos, as SVMPs tornaram-se o principal alvo deste estudo, para o qual realizamos análises filogenéticas com o objetivo de contribuir para uma melhor compreensão da biodiversidade e dos mecanismos moleculares subjacentes a evolução destas proteínas, e também contribuir para a descoberta de novos compostos com potencial ação terapêutica / The snake venom’s components are sources of drug and physiological research tools for diagnosis of several diseases. We describe the de novo assembly and analysis of the venom-gland transcriptome of a widly distributed snake in Brazil (Bothrops neuwiedi). Based on 9.500.000 reads of quality-filtered, we identified several full-length toxin-coding sequences. The most highly expressed group of toxin was the SVMPs (snake venom metalloproteinase), which accounted for the highest percentage of reads to the reference transcriptome (34.40%), followed by C-type lectins (25.20%), phospholipases A2 (14.20%) and serine proteinases (7.51%). Due to pathophysiological importance in the poisoning and its potential use as a model for biotechnology development, the snake venom metalloproteinases (SVMP) became the main target in this study. Therefore we performed phylogenetic analyzes of the SVMPs in order to contribute to a better understanding of the biodiversity of these proteins underlying molecular and evolutionary mechanisms, and contribute to the discovery of new compounds with have potential in therapeutics.
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Caracterização da porção glicídica de BJ46a, um inibidor de metaloproteinases de venenos de serpentes

Bastos, Viviane de Almeida January 2014 (has links)
Made available in DSpace on 2016-03-28T12:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 2 viviane_bastos_ioc_mest_2014.pdf: 2675273 bytes, checksum: 6a189033d3ff541cc2d725c46f10a929 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O envenenamento por serpentes é uma condição de saúde negligenciada que registra altas taxas anuais de mortalidade e morbidade. A administração do soro antiofídico, quando apropriada, é eficaz na neutralização dos efeitos sistêmicos do envenenamento, mas novas abordagens terapêuticas são necessárias para a redução dos índices de morbidade. A resistência natural da serpente Bothrops jararaca ao seu próprio veneno é atribuída parcialmente à presença de uma glicoproteína sérica, BJ46a, que atua como um inibidor natural de metaloproteinases de venenos de serpentes (SVMP). O objetivo principal do trabalho foi caracterizar a porção glicídica de BJ46a e sua relevância para a atividade biológica do inibidor. As análises demonstraram que a porção glicídica de BJ46a é composta primariamente por N-glicosilações complexas e sialiladas, ancoradas nas posições Asn76, Asn185, Asn263 and Asn274. Após incubação prolongada (72h) de BJ46a com exoglicosidases e PNGase F, foi possível remover substancialmente a parte glicídica do inibidor BJ46a extensivamente desglicosilada foi capaz de interagir com a metaloproteinase jararagina (SVMP de classe P-III) e inibir efetivamente sua atividade proteolítica sobre azocaseína. Além disso, também analisamos a interação de BJ46a com diferentes metaloproteinases isoladas de venenos de serpentes. O inibidor foi capaz de interagir com as SVMP (classe P-I) BaP1, atroxlisina-I e leucurolisina-a, inibindo sua atividade fibrinogenolítica. O entendimento estrutural da inibição de metaloproteinases por BJ46a pode levar ao desenho racional de peptídeos inibitórios que venham a ser utilizados tanto na terapia antiofídica quanto em outras patologias / Snake bite en venoming is a neglected health condition that inflicts high rates of mortality and morbidity every year. The antivenom treatment, when properly administered, is effective in ne utralizing the systemic effects but new approaches are needed to address the issue of morbidity. The resistance of the venomous snake Bothrops jararaca against its own venom is pa rtly attributed to a serum glycoprotei n, BJ46a , that acts as a natural snake venom metalloproteinase inhibitor. Our main goal was to characterize the glycan moiety of BJ46a and its releva nce to its biological activity. The analyses have shown that the glyc an portion of BJ46a is composed primarily by sialylated, complex - type N - glycans attached in the positions Asn76, Asn185, Asn263 and Asn274. Substantial glycan removal from BJ46a in native conditions was attained by prolonged incubation (72h) with exoglycos idases and PNGase F. Extensively deglycosylated BJ46a was able to interact with the class PIII metalloproteinase jararhagin and effectively inhibit its proteolytic activity upon azocasein. Also, we analyzed the interaction of BJ46a with different metallop roteinases isolated from snake venoms. The inhibitor was able to interact with the class P - I metalloproteinases BaP1, atroxlysin - I and leucurolysin - a inhibiting their fibrinogenolytic activities. The understanding of the structural requirements for the met alloproteinase inhibition by BJ46a could lead to the rational design of synthetic peptides that could be used in antiophidic therapy as well in other pathologies
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Purificação e Caracterização Parcial de duas Hemorraginas Ativadoras de Fator X da Peçonha de Bothrops leucurus (jararaca do rabo branco) (Wagler, 1824)

Mendes Correia, Juliana January 2006 (has links)
Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1764_1.pdf: 2524003 bytes, checksum: 08f58cd79907281ae329a804438b38b7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Hemorragia é uma patologia que ocorre devido à anormalidade das funções dos fatores da coagulação, do endotélio dos vasos sanguíneos e/ou das plaquetas. Enzimas da peçonha dos Viperídeos, designadas hemorraginas, toxinas hemorrágicas ou ainda fatores hemorrágicos são as principais responsáveis pelo quadro hemorrágico (local e sistêmico) apresentado nos acidentes por viperídeos. A espécie Bothrops leucurus é uma das mais importantes serpentes peçonhentas do Nordeste do Brasil. Neste trabalho foi realizada a purificação e caracterização parcial de duas toxinas hemorrágicas da peçonha de Bothrops leucurus. As hemorraginas Bleu-H1 e Bleu-H2 foram purificadas através de três passos cromatográficos: troca iônica de 600 mg da peçonha de B. leucurus, dividida em quatro alíquotas, em coluna de Mono Q (10 x 100 mm), seguida de gel em filtração TSK G-3000 (7,5 mm x 60 cm) e recromatografia em coluna de Mono Q (5 x 50 mm), obtendo rendimento de 0,1% para cada toxina. Os resultados do dot-blot indicam que ambas hemorraginas são metaloproteases. De acordo com os resultados da SDS-PAGE em condições redutoras, Bleu H1 é constituída de pelo menos seis cadeias (66, 63, 38, 28, 19 e 17 KDa), enquanto Bleu H2 revelou cinco cadeias (63, 41, 38, 28, 18, 16 kDa), sugerindo que as hemorraginas Bleu H1 e Bleu-H2 apresentem massas moleculares superiores a 278 KDa e 207 KDa, respectivamente. A SDS-PAGE sem a presença de agente redutor confirmou a homogeneidade de Bleu-H1. A Dose Mínima Hemorrágica (DMH) da peçonha de B. leucurus foi 1,96 μg, e a de Bleu H1 e de Bleu H2 foram 1,23 μg e 1,42 μg, respectivamente. Bleu H1 e Bleu H2 apresentaram atividade ativadora de fator X, e capacidade de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222 e S-2238, sendo Bleu-H2 consideravelmente mais ativa do que Bleu-H1. Em conclusão, duas metaloproteinases ácidas da classe P-IV, com baixa atividade hemorrágica, alta atividade ativadora de fator X e capacidade de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222 e S-2238, denominadas Bleu- H1 e Bleu-H2, foram purificadas da peçonha de Bothrops leucurus
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Expressão do Reck, um inibidor de metaloproteinases de matriz, no desenvolvimento pos-natal e na regressão prostatica pos-castração / Expression of Reck, an inhibitor of matrix metalloproteinases, in the prostatic postnatal development and involution after castration

Peters, Helene 25 August 2005 (has links)
Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peters_Helene_M.pdf: 3147205 bytes, checksum: 29d84ddab25f17a17efc857545126663 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A próstata tem merecido crescente atenção devido à maior incidência de câncer prostático e outras afecções do órgão, que resultam do aumento na longevidade dos indivíduos do sexo masculino em todo o mundo. Além disto, o desenvolvimento e crescimento prostático normal apresenta regulação androgênica e está sujeito a uma série de disruptores endócrinos que afetam o seu crescimento e função, assim como predispõem ao desenvolvimento tumoral. Nosso interesse reside principalmente na remodelação prostática seguida à castração e nas interações epitélio estroma que ocorrem neste órgão. Neste trabalho, investigamos a expressão do inibidor de metaloproteinases (MMPs) RECK, em nível de RNAm, procurando correlacioná-Io com o desenvolvimento pós-natal e com a regressão prostática seguida à castração. Para isto, foram utilizadas técnicas de RT-PCR semiquantitativo, Real time RT-PCR e de hibridação in situ,pareados sempre que possível com a expressão do RNAm e com a atividade de algumas MMPs. Os resultados demonstram que o gene RECK é expresso na próstata ventral de ratos, que existe uma significativa redução na sua expressão ao longo do desenvolvimento pós-natal, que há mecanismos diferenciados controlando a expressão dos pares RECKlMMP-2 e MMP-7/MMP-14. Foi observado também um crescente aCÚInulo da forma ativa da MMP-9, conforme o animal se aproxima da idade adulta. Utilizando RT-PCR semiquantitativo, pudemos determinar que o conteúdo relativo do RNAm para o RECK após a castração não muda, embora haja uma inversão no balanço entre a expressão epitelial (células epiteliais) e estromal (células musculares lisas e fibroblastos), nesta situação. No conjunto, os resultados sugerem que o RECK é expresso por diferentes tipos celulares da próstata ventral de ratos, com mecanismos de regulação complexos provavelmente oriundos da existência de diferentes compartimentos no órgão, ao contrário do que se observa para células isoladas / Abstract: The prostate has deserved increasingly attention due to the growing incidence of prostatic cancer and other prostatic diseases, which can be related to the longevity increase of men around the world. Besides, the normal prostatic development is under androgen regulation and as so is subject to a series of endocrine disruptors which affect its growth and function and predisposes to prostate cancer. Our interest resides on the prostatic remodelling following castration and on the epithelial-stromal relationships known to occur in the organ. In this work, we have investigated the expression of the matrix metalloproteinase inhibitor RECK, at the rnRNA leveI, trying to correlate its expression with the post natal prostatic development and regression after castration, using semiquantitative RT-PCR, Real time RT-PCR and in situ hybridization, paralleled with the determination of some MMPs expression and activity. Tbe results demonstrate that RECK is expressed in the rat ventral prostate, that there is a significative reduction in its expression during the post natal development, which is paralleled by the expression of some MMPs and that the mechanisms controling the pairs RECKJMMP-2 and MMP-7/MMP-14 are different. It was also observed an increased proportion of the active form of MMP-9, as the animal approaches adulthood. Using semiquantitative RT-PCR, we could determine that the relative content ofRECK rnRNA remains unchanged by castration, spite detecting an inversion in the balance between the epithelial (epithelial cells) and stromal (smooth muscle cells and fibroblasts) in this situation. Taken together, the results indicate that RECK is expressed by different cell types of the rat ventral prostate, with regulatory mechanisms appearing more complex, likely resulting ftom the existence of different compartments in the organ opposing what was seen for isolated cells / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural
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Efeitos da doxiciclina relacionados à inibição das metaloproteinases em modelo de pré-eclâmpsia induzida por l-name em ratas

Nascimento, Regina Aparecida do. January 2018 (has links)
Orientador: Carlos Alan Candido Dias-Junior / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um gás produzido principalmente por células endoteliais, e durante a época gestacional, contribui para evitar aumento exacerbado da resistência vascular sistêmica (RVS), uma vez que, durante esse período, aumenta-se o volume sanguíneo e a frequência cardíaca. Quando, há disfunções endoteliais, reduz-se a biodisponibilidade de NO, provocando vasoconstrição e esta, por sua vez, consequentemente aumenta atividade das MMPs. Essa queda do NO e aumento das MMPs culminam em desordens hipertensivas gestacionais. Segundo estudos anteriores realizados em modelos de hipertensão em machos a doxiciclina, um antibiótico derivado das tetraciclinas, diminuiu a pressão arterial sistólica devido a sua capacidade de inibir a atividade das MMPs. No entanto, há escassez de trabalhos que desenvolveram estudos sobre os efeitos da doxicicilina em modelos animais de hipertensão gestacional. Por esse motivo, investigamos os efeitos da doxiciclina na inibição das MMPs na hipertensão gestacional, induzida pelo Nω-nitro-L-arginina-metil éster (LNAME) em ratas. Para tanto, realizamos zimografia para avaliar a atividade da MMP-2 e -9 na placenta, no útero e na aorta torácica. Ainda avaliamos a pressão arterial sistólica, o desenvolvimento feto-placentário e os metabólitos do NO. Também foi avaliada a capacidade antioxidante plasmática, os níveis plasmáticos de soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1) e o fator de crescimento placentário (PLGF). Nossos dados mostram que o tratament... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nitric oxide (NO) is a gas produced mainly by endothelial cells, and during the gestational period contributes to avoid an exacerbated increase in systemic vascular resistance (SVR), since during this period, there is a rise in blood volume and heart rate. When there are endothelial dysfunctions, the bioavailability of NO is reduced, causing vasoconstriction and this, in turn, consequently increases the activity of MMPs. This decrease in NO and increase in MMPs culminates in gestational hypertensive disorders. According to previous studies in non-gestational hypertension models, doxycycline, an antibiotic derived from tetracyclines, lowered systolic blood pressure due to its ability to inhibit MMP activity. However, there is a shortage of works that have developed studies on the effects of doxycycline in animal models of gestational hypertension. For this reason, we investigated the effects of doxycycline on the inhibition of MMPs in gestational hypertension, induced by Nω-nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME) in rats. We performed a zymography to evaluate the activity of MMP-2 and -9 in the placenta, uterus and thoracic aorta. We also evaluated systolic blood pressure, fetalplacental development and NO metabolites. Plasma antioxidant capacity, plasma levels of soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1) and placental growth factor (PLGF) were also evaluated. Our data shows that the treatment with L-NAME increased blood pressure and decreased the offspring of these animals. ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Estudo da atividade biológica do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da botropasina / Biological activity study of ecd motif of disintegrinlike domain of bothropasin

Ike, Priscila Tomie Leme 10 May 2011 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T20:36:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 3688.pdf: 6082954 bytes, checksum: f6fdd051724ed3aaef16251694cb2648 (MD5) Previous issue date: 2011-05-10 / Universidade Federal de Sao Carlos / Integrins are cell surface receptors that mediate cell adhesion and platelet aggregation, although they do part of important physiological processes in the organism, are also related pathologies such as tumorigenesis, metastasis and thrombosis. Thus integrins are important targets in development of drugs for the treatment of these diseases. Snake venoms metalloproteases (SVMPs) of PII and PIII class possessing a disintegrin domain, capable of binding to integrins inhibiting its activity, have been widely studied for this purpose. PII-SVMPs bind integrins via the RGD motif found in disintegrin domain. PIII-SVMPs have three domains: metalloprotease (M), disintegrin-like (D) with the ECD motif instead of RGD and 'Cysteine-rich' domain (C). PIII-SVMPs containing only DC domains are able to interact with integrins inhibiting cell adhesion and platelet aggregation. However it is not known which region of these molecules is involved in binding to integrins, and two regions are identified as likely responsible for integrin-ligand interactions: the motif ECD and a region called the hyper variable region (HVR) present in some PIII-SVMPs. The intention here was to assist the understanding of this interaction, assessing the importance of ECD motif present in disintegrin-like domain of Bothropasin, a PIIISVMP. For the three-dimensional structure of bothropasin, we have that in the ECD motif, aspartic residue (D) made a interaction with calcium ions, and cysteine (C) is involved in a disulfide bridge, but the glutamic acid (E) which is very reactive, is free to interact with other molecules. Thus, the proposal was to obtain a recombinant molecule consisting in the D and C domains of bothropasin (BDC) and a mutant molecule (BDC-ACD), where the glutamic residue of EDC motif present in disintegrin-like domain of BDC is replaced by a alanine residue. BDC-ACD, was obtained by PCR (Polymerase Chain Reaction) using the QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, with the DNA template pGEX-4T-BDC and primers containing the desired mutation. The recombinant proteins were expressed in the soluble form in fusion with glutathione Stransferase protein. Purification of recombinants proteins was made in Glutathione Sepharose resin and the fusion proteins, immobilized on the resin were cleaved with enzyme thrombin. BDC and BDC-DCA were evaluated for their ability to inhibition of platelet aggregation which found that the mutation did not cause a significant change in protein activity, indicating that the glutamic residue of ECD motif is not involved in connection with integrins. Were also assayed for inhibition of adhesion of breast adenocarcinoma cells (MDA-MB- 231) to collagen and no inhibition was observed suggesting that, like the other PIII-SVMPs, BDC interact with α2 subunits of intergrins, which are not expressed in tested cells. / As integrinas são receptores de superfície celular capazes de mediar a adesão celular e a agregação plaquetária, que embora façam parte de importantes processos fisiológicos no organismo também estão relacionados a patologias como tumorogênese, metástase e trombose. Deste modo as integrinas constituem importantes alvos no desenvolvimento de drogas para o tratamento dessas doenças. Metaloproteases de venenos de serpentes (SVMPs) das classes PII e PIII por possuírem um domínio desintegrina, capazes de se ligar às integrinas inibindo sua atividade, têm sido amplamente estudadas com esse intuito. PIISVMPS se ligam as integrinas através do motivo RGD que se encontra no domínio desintegrina. PIII-SVMPs possuem três domínios: metaloprotease (M), tipo-desintegrina (D) que apresenta o motivo ECD invés de RGD, e rico em cisteína (C). PIII-SVMPs contendo apenas os domínios DC são capazes de interagir com integrinas inibindo adesão celular e agregação plaquetária. Contudo não se sabe qual região dessas moléculas está envolvida na ligação às integrinas, sendo que duas regiões são apontadas como prováveis responsáveis pela interação integrina-ligante: o motivo ECD e uma região denominada região hiper variável (HVR) presente em algumas PIII-SVMPs. Foi pretendido aqui colaborar para o entendimento dessa interação, avaliando a importância do motivo ECD do domínio tipo-desintegrina da Botropasina, uma PIII-SVMP. Pela estrutura tridimensional da botropasina, tem-se que no motivo ECD o resíduo aspártico (D) faz uma interação com íon cálcio, e a cisteína (C) está envolvida em uma ponte dissulfeto, porém o glutâmico (E) que é bastante reativo, encontra-se livre para interagir com outras moléculas. Assim, a proposta deste trabalho foi obter a molécula recombinante constituída pelos domínios D e C da botropasina (BDC), e também uma molécula mutante (BDC-ACD), onde o glutâmico do motivo EDC do domínio tipo-desintegrina da BDC foi substituído por um resíduo de alanina. BDC-ACD, foi obtida através de PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) com a utilização do QuikChange@ Site-Directed Mutagenesis Kit, tendo como DNA molde pGEX-4T-BDC e primers contendo a mutação desejada. As proteínas recombinantes foram expressas na forma solúvel em fusão com a proteína glutationa S-transferase. A purificação das proteínas recombinantes foi feita em resina Glutathione Sepharose e as proteínas de fusão, imobilizadas na resina, foram clivadas com a enzima trombina. BDC e BDCACD foram avaliadas quanto a sua capacidade de inibição da agregação plaquetária onde foi verificado que a mutação realizada não alterou significativamente a atividade das proteínas, indicando que o glutâmico do Dissertação de Mestrado de Priscila Tomie Leme Ike vi motivo ECD não está envolvido na ligação com a integrina. Também foram realizados ensaios de inibição da adesão de células de adenocarcinoma da mama (MDA-MB-231) ao colágeno e não houve inibição da adesão celular sugerindo que, assim como outras PIII-SVMPs, a BDC possa interagir com subunidades α2 de intergrinas, que não estavam expressas nas células testadas.
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Diabetes promove potencialização da reabsorção óssea alveolar e causa desequilíbrio entre MMPS e colágeno em camundongos com doença periodontal experimental /

Beltran, Carluci Taís. January 2016 (has links)
Orientadora: Sandra Helena Penha de Oliveira / Banca: Letícia Helena Theodoro / Banca: Ana Paula Campanelli / Resumo: A doença periodontal (DP) e o diabetes mellitus (DM) são doenças inflamatórias crônicas, e quando associadas aumentam a destruição da região periodontal. Por esta razão, o objetivo do nosso trabalho foi avaliar o papel do diabetes sobre o processo inflamatório, reabsorção óssea alveolar, produção de metaloproteinase de matriz (MMP), colágeno e TGF-β1 em camundongos com DP experimental. Foram utilizados 40 camundongos Balb/c machos de 18 - 22 g, distribuídos igualmente em 4 grupos, sendo estes, normal (N), normal com doença periodontal (N+DP), diabético (DM) e diabético com doença periodontal (DM+DP). O diabetes foi induzido por tratamento com estreptozotocina 200 mg/kg por via intraperitoneal. Passados 7 dias os índices glicêmicos foram verificados, e os animais foram considerados diabéticos quando a glicemia apresentava-se igual ou superior a 250 mg/dL. Posteriormente, os camundongos do grupo com DP foram submetidos a uma ligadura em torno dos primeiros molares inferiores, e no 15º dia, estes animais foram eutanasiados e as amostras foram coletadas para as análises seguintes. O tecido gengival marginal foi coletado para as análises de marcadores inflamatórios, tais como, níveis de CXCL2, CCL3 e TGF-β1 por ELISA, expressão gênica de MMP-2, MMP-9, TGF-β1 e col1a2 por RT-PCR em tempo real, e atividade enzimática de MMP-2 e MMP-9 por zimografia. Os parâmetros de reabsorção de osso alveolar, recrutamento de neutrófilos e quantificação de colágeno também foram avaliados, pelo ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Periodontal disease (DP) and diabetes mellitus (DM) are chronic inflammatory diseases that when associated increase destruction in the periodontal region. Then, the aim of our study was to evaluate the role of DM in inflammatory process, bone resorption, matrix metalloproteinase (MMP), collagen and TGF-β1 production during periodontal disease experimental in mice. Forty Balb/c mice 18-22 g were used, divided equally into 4 groups, normal (N), normal with periodontal disease (N+DP), diabetic (DM), diabetic with periodontal disease (DM+DP). The diabetes was induced by 200 mg/kg streptozotocin via intraperitoneal. After of 7 days the glycemic indices was evaluated, and animals were considered diabetics than blood glucose has become equal to or greater than 250 mg/dL. Mice of the DP group had a ligature around the first molars, and 15th day, the animals were euthanized and samples were collected for the following analyzes. The gingival tissue was collected to analysis inflammatory markers, such as CXCL2, CCL3 and TGF-β1 levels by ELISA; gene expression of MMP-2, MMP-9, TGF-β1 and col1a2 by real time RT-PCR; and MMP-2 and MMP-9 enzyme activity by zymography. The parameters of alveolar bone resorption, neutrophil recruitment and collagen quantification also were evaluated by histological processing of the hemimandibles, which showed significant difference in DM+DP group. Periodontal disease was able to increase CXCL2, CCL3 and TGF-β1 production, however only CXCL2 and CCL3 producti... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Monitoramento clínico do processo inflamatório periapical antes e após o uso de diferentes medicações intracanal através dos níveis de biomarcadores inflamatórios /

Teixeira, Flávia Figueiredo Chaves. January 2015 (has links)
Orientador: Fredererico Canato Martinho / Co-orientador: Márcia Carneiro Carneiro Valera / Banca: Ana Paula Martins Gomes / Banca: Izabel Coelho Gomes Camões / Resumo: Os objetivos do presente estudo são: 1) Estudar o perfil inflamatório das lesões periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias através dos níveis das citocinas inflamatórias: IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica; 2) Investigar os níveis das metaloproteinases [MMP-1, -2 e -9], inibidores de metaloproteinase [TIMP-1 e -2] e complexos MMP/TIMP [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], presentes nos tecidos periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias e lesão periapical; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica e reabsorção óssea; 3) Correlacionar os níveis das citocinas inflamatórias [IL-1beta, IL-6 e TNF-alfa] e seus antagonistas [IL1-RA, IL6-RA, sTNF-R1], presentes nos tecidos periapicais; 4) Estudar a efetividade de diferentes medicações intracanal no controle do processo inflamatório periapical, através do monitoramento dos níveis de citocinas inflamatórias, [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1, -2 e -9], TIMP's [TIMP-1 e -2] e complexos [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2 MMP9/TIMP1, MMP9/TIMP2] coletadas dos tecidos periapicais. Vinte dentes unirradiculares com necrose pulpar e lesão periapical foram selecionados. Após o preparo biomecânico (PBM) os dentes foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de acordo com a medicação intracanal utilizada: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + solução salina fisiológica]; e Ca(OH)2+CLX [Ca(OH)2 + clorexidina gel 2%]. Para a análise dos biomarcadores inflamatórios, foram realizadas coletas utilizando cones de papel estéril/apirogênico, ultrapassando 2 mm além ápice para obtenção do fluído intersticial. As coletas foram realizadas em dois momentos operatórios : coleta após PBM (Coleta inicial-CIF1) e coleta após 14 dias de medicação intracanal (Coleta final-CFF2). Citocinas... / Abstract: The aim of this study was: 1) To investigate the inflammatory profile of apical periodontitis disease present in primarily infected root canals determined by the levels of inflammatory cytokines : IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; and to correlate with the presence of clinical features; 2) To investigate the levels of metalloproteinases [MMP-1, -2, -9], metalloproteinase inhibitors [TIMP-1 e -2] ; complexes MMP/TIMP [MMP1/ TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], present in apical peridontitis disease from teeth with primary endodontic infection; and to correlate with the presence of clinical features; 3) To correlate the levels of IL-1beta, IL-6, TNF-alfa with their respectively antagonists - IL1-RA, IL6-RA, s TNF-R1, all present in apical peridontitis; 4) To evaluate the effectiveness of different root canal medications in the inflammatory process by monitoring the levels of inflammatory cytokines [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1,-2,-9]; TIMP [TIMP-1 and -2] and complexes [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2] in apical periodontitis. Twenty patients with single-rooted teeth that had necrotic pulp and periapical periodontitis will be selected. After BMP teeth will be randonly devided into 2 groups according to the root canal medication selection: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + Saline Solution]; e Ca(OH)2+CHX [Ca(OH)2 + chlorhexidine gel 2%]. Samples will be collected from intersticial fluid by using sterile/ apyrogenic paper points. Samples will performed at two diferente times: After chemomechaical preparation (S1) and after 14 of root canal medication (S2). Inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be dosage by ELISA-assay. The levels of inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be typed on a spreadsheet and statiscally analyzed by SPSS for Windows and Statistic packpage 9.0. ... / Mestre
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O papel do trânsito de cálcio e de compostos da matriz extracelular no modelo de insuficiência aórtica aguda experimental em ratos

Bussoni, Márjory Fernanda. January 2015 (has links)
Orientador: Paula Schmidt Azevedo Gaiolla / Coorientador: Marcos Ferreira Minicucci / Banca: Meliza Goi Roscani / Banca: Bertha Furlan Polegato / Banca: Paula Felippe Martinez / Resumo: Os mecanismos envolvidos na remodelação cardíaca por sobrecarga de volume e o momento que a hipertrofia excêntrica apresenta prejuízo da função cardíaca são pouco conhecidos. Objetivos: a) Comparar alterações morfofuncionais, celulares (hipertrofia) e intersticiais (fibrose) em diferentes momentos da evolução da insuficiência aórtica; b) Verificar quais dos seguintes mecanismos estão envolvidos na remodelação cardíaca induzida pela IAo e em qual momento esta alteração acontece: alteração na metaloprotease 2 (MMP2) e do inibidor tecidual de metaloprotease 1 (TIMP1), alterações dos RNAs mensageiros específicos para a codificação das proteínas envolvidas na homeostase do cálcio (Fosfolambam, Ryr e Serca2a), alterações da expressão de proteínas fosfolambam e Serca2a do trânsito de cálcio. Casuística e Métodos: Estudo experimental com 64 ratos Wistar machos, 32 animais submetidos à insuficiência aórtica aguda (grupo IAo) e 32 animais a procedimento simulado (grupo Controle). Todos os animais foram seguidos com 1, 4, 8 e 12 semanas através de ecocardiogramas seriados e, após eutanásia, foram analisada morfometria do tecido cardíaco, atividade da MMP2 e TIMP-1, expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real das proteínas do trânsito de cálcio, expressão das proteínas Serca2a e fosfolambam pela técnica Western Blot. A análise estatística foi efetuada pela ANOVA de dois fatores; o pós teste de Holm Sidak; teste t grupo a grupo; Anova de 1 via, complementada por Tukey; correção por Bonferroni; teste de correlação de Spearman e teste de correlação de Pearson. Em todos os casos, o nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Observou-se, na primeira semana, que o peso do VE e a pressão diastólica foi maior no grupo IAo. Na quarta semana, MMP2, TIMP-1, iMVE e fração de colágeno foram maiores no grupo IAo. A área do miócito e DDVE foram maiores... / Abstract: The mechanisms that are involved in cardiac remodeling by volume overload and the moment the eccentric hypertrophy has impaired cardiac function are largely unknown. Objectives: a) to compare morphological, cell (hypertrophy) and interstitial (fibrosis) changes at different times of the evolution of aortic regurgitation (AR); b) to analyze which of the following mechanisms are involved in cardiac remodeling induced by aortic failure and at what moment this change takes place: change in the metalloprotease 2 (MMP 2) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1); changes of messenger RNAs to code proteins involved in calcium homeostasis (phospholamban, Ryr and SERCA2a), changes in expression of phospholamban and SERCA2a in the calcium transit. Methods: Experimental study with 64 male Wistar rats, 32 animals submitted to acute aortic regurgitation (AR group) and 32 animals sham procedure (Sham group). All animals were followed with 1, 4, 8 and 12 weeks by serial echocardiography and after euthanasia, were analyzed morphometry of cardiac tissue, the activity of MMP2 and TIMP-1, gene expression by RT-PCR of calcium homeostasis protein, SERCA2a and phospholamban expression by Western Blotting. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA; the Holm Sidak post test; t test group to group; Anova one way, complemented by Tukey; Bonferroni correction; Spearman correlation test and Pearson's correlation test. In all cases, the significance level was set at p <0.05. Results: In the first week it was observed that weight of the LV and diastolic blood pressure were higher in the AR group. In the fourth week, MMP 2, TIMP-1, and collagen fraction were higher in the AR group. The myocyte area and left ventricle diastolic diameter (LVDD) were higher in the AR group compared to the sham group, from the eighth week. At weeks 8 and 12, the wall thickness (WT) was higher in the AR group than the... / Doutor

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