Orientadora: Cristiane Furuse / Banca: Ana Paula Dias Demasi / Banca: Ana Maria Pires Soubhia / Resumo: A célula mioepitelial é um componente de diversos órgãos glandulares, incluindo glândulas salivares e mamárias, que auxilia na excreção do conteúdo glandular, atuando também na sua embriogênese e morfogênese. Além de suas funções normais, ação supressora tumoral tem sido atribuída a esta célula. Utilizando como modelo o Carcinoma Ex-Adenoma Pleomórfico, neoplasia maligna proveniente da malignização das células do Adenoma Pleomórfico (AP), foi estudada a influência das células mioepiteliais neoplásicas no comportamento invasivo de células epiteliais malignas, em um estudo in vitro. Para isso, células de carcinoma epidermoide bucal (CAL 27, ATCC) e de carcinoma ductal (HS578T, ATCC) foram cultivadas em câmaras de invasão, sobre matrigel, com meios condicionados de células mioepiteliais de AP por 96 h. Foi calculado o índice de invasão, quantificada a secreção de MMPs-1,-2,-8,-9 e -13 e de TIMP-1 e -2, por meio de ELISA, e a atividade proteolítica por Zimografia. Os resultados foram submetidos à análise estatística e demonstraram que os meios condicionados de células mioepiteliais provocaram aumento do potencial invasivo de ambas as células malignas. Os meios condicionados exibiram, em geral, maiores quantidades e atividades proteolíticas de MMPs-1 e -2 e quantidades de TIMPs-1 e -2 do que as células malignas. A MMP-8 apresentou baixos níveis em todas as amostras e as MMPs-9 e -13 não foram detectadas. Nestas condições experimentais, as células mioepiteliais promoveram aumento do comportamento invasivo das células epiteliais malignas e as MMPs-1 e - 2 produzidas por elas podem estar envolvidas no processo / Abstract: The myoepithelial cell is a component of various glandular organs, including salivary and mammary glands, which aids in the excretion of glandular content, also acting in embryogenesis and morphogenesis of the gland. In addition to their normal functions, tumor suppressive action has been attributed to this cell. Using as a model the carcinoma ex pleomorphic adenoma, malignant neoplasm from the malignancy of pleomorphic adenoma cells (PA), the influence of neoplastic myoepithelial cells in the invasive behavior of malignant epithelial cells in an in vitro study was studied. Therefore, cells of oral squamous cell carcinoma (CAL 27, ATCC) and ductal carcinoma (HS578T, ATCC) were cultured in invasion chambers on matrigel with conditioned media of myoepithelial cells of PA for 96 hours. We calculated the invasion índex, quantified the secretion of MMP-1, -2, -8, -9 and -13 and TIMP-1 and -2 by ELISA and the proteolytic activity by zymography. The results were statistically analyzed and showed that the conditioned media of myoepithelial cells caused increased invasive potential of both malignant cells. The conditioned media showed, in general, larger amounts and proteolytic activities of MMP-1 and -2 and amounts of TIMP-1 and -2 than the malignant cells. MMP-8 was decreased in all samples and MMP-9 and -13 were not detected. Under these experimental conditions, myoepithelial cells caused an increase in invasive behavior of malignant epithelial cells and MMP-1 and -2 produced by them may be involved in the process / Mestre

Orientador: Winston Bonetti Yoshida / Coorientador: Alexandre Leme Godoy dos Santos / Banca: Trajano Sardenberg / Banca: Sérgio Swain Muller / Banca: Adriana Lucia Mendes / Banca: Beatriz Funayama Alvarenga Freire / Resumo: Introdução: A injeção de corticosteroide (CE) para tratamento de tendinopatias é recurso terapêutico muito utilizado na prática ortopédica; contudo há controvérsias clínicas e experimentais a respeito dos benefícios e complicações desse procedimento. Objetivo: Avaliar os efeitos histológico, biomecânico, a expressão das metaloproteinases (MMP-1 e MMP-2) e das interleucinas (IL-1 e IL-6) nos tendões calcâneos de coelhos submetidos a injeção de CE. Métodos: Setenta e três coelhos New Zealand foram randomizados e divididos em dois Grupos: Grupo Teste composto por trinta e sete animais submetidos a injeção intratendinosa de CE (0,2 ml de solução com 1,4 mg de betametasona) no tendão calcâneo do membro pélvico direito, e Grupo Controle composto por trinta e seis animais, no qual o mesmo animal possibilitou dois espécimes de tendão calcâneo (direito e esquerdo); o tendão do membro pélvico direito foi submetido a injeção de soro fisiológico (0,2 ml de solução de cloreto de sódio a 0,9 %) e recebeu denominação de Controle Placebo (CP); o tendão calcâneo do membro pélvico esquerdo, sem nenhum procedimento, foi utilizado como Controle Normal (CN). Quarenta e oito horas após o procedimento foi realizada eutanásia e os tendões foram dissecados e retirados em uma extensão de quatro centímetros de suas inserções nos ossos calcâneos. As análises histológicas, de resistência mecânica e as expressões das metaloproteinases e interleucinas foram realizadas por avaliador sem conhecimento dos grupos. Resultados: O Grupo Teste apresentou menor expressão da MMP-2 em relação aos espécimes do Grupo Controle (p= 0,027). No grupo Controle, os espécimes de tendão calcâneo dos membros pélvicos direitos (CP) mostraram maior quantidade de fibras colágenas grossas em relação aos de tendão calcâneo dos membros pélvicos esquerdos (CN) (p= 0,041). Nas comparações entre os grupos nas demais variáveis não... / Abstract: Introduction: The injection of corticosteroids (CE) for the treatment of tendinopathies is a therapeutic resource often used in orthopedic practice; however, there are clinical and experimental controversies regarding the benefits and complications of such practice. Objective: Is to evaluate the histological, biomechanical effects, and also the expression of metalloproteinases (MMP-1 and MMP-2) and interleukins (IL-1 and IL-6) on Achilles tendons of rabbits treated with CE injections. Methods: Seventy three New Zealand rabbits were randomly divided into two groups: The Test Group was comprised of thirty seven animals which underwent intratendineous injections of CE (0.2 ml of solution with 1.4 mg of betamethasone) in the Achilles tendon of the right pelvic limb, and the Control Group was comprised of thirty six animals, which provided two specimens of Achilles tendon (right and left); the Achilles tendon of the right pelvic limb underwent injections of saline solution (0.2 ml of 0.9% sodium chloride solution) and was called Placebo Control (CP); the Achilles tendon of the left pelvic limb received no medical procedure and was used as Normal Control (CN). Forty eight hours after the procedure, the animals were euthanized and the tendons were dissected and extracted at an extension of four centimeters (1.6 in) of its insertions in the calcaneus bones. The expressions of metalloproteinases and interleukins, mechanical resistance and histological analysis were all performed by an observer unaware of the groups Results: The Test Group has shown a smaller MMP-2 expression compared to those in Control Group (p= 0.027). In the Control Group, the Achilles tendon of the right pelvic limb (CP) has shown a greater amount of thick collagen fibers in comparison to those in left pelvic limb (CN) (p= 0.041). There were no other significant statistical difference between the groups when comparing other variables. Conclusions: Forty eight hours after the ... / Mestre

Orientador: Josimeri Hebling / Co-orientador: Débora Lopes Scheffel / Banca: Elisa Maria Aparecida Giro / Banca: Mariane Emi Sanabe / Resumo: Objetivo: Avaliar o efeito da aplicação de um primer experimental contendo carbodiimida (EDC) na atividade total de metaloproteinases (MMPs), na degradação do colágeno dentinário e na estabilidade longitudinal da união resina-dentina. Métodos: Foram desenvolvidos dois estudos para responder aos objetivos do trabalho. Estudo 1:Cem espécimes de dentina (1x1x6mm) foram obtidos de molares permanentes humanos hígidos. Cinquenta espécimes foram condicionados com ácido fosfórico 37% e tratados por 60s com (n=10): água deionizada (controle), EDC 0,5 mol/L, primer experimental (PE), primer experimental com EDC (PE+EDC) ou primer do sistema Scotchbond MP (SBMP). Após lavagem, os espécimes foram submetidos a um teste colorimétrico (SenSolyte) para a análise da atividade total de MMP. Outros 20 espécimes foram submetidos a um protocolo de indução de cárie. Esses e os demais 20 espécimes mantidos hígidos foram completamente desmineralizados em ácido fosfórico 10% por 18h e tratados como descrito acima. Os espécimes foram armazenados em solução semelhante à saliva por 15 dias a 37ºC, quando a saliva foi coletada para a quantificação de hidroxiprolina (HYP). Os dados foram submetidos aos testes ANOVA e Tukey (p<0,05). Estudo 2: Superfícies planas de dentina foram produzidas em 32 molares permanentes hígidos. Os dentes foram condicionados por 15s e tratados (n=8) como descrito no estudo 1, com exceção da água deionizada.Após o tratamento, o adesivo do sistema SBMP foi aplicado sobre todos os dentes seguido da construção de um bloco em resina composta. Os dentes foram seccionados em espécimes com área de secção transversal de 0,81 mm2, os quais foram armazenados em solução semelhante à saliva por 24h ou 6 meses previamente ao ensaio de microtração. Os dados em MPa foram submetidos aos testes de ANOVA a dois critérios fixos...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Objective: To evaluate the effect of an experimental primer containing EDC on the total matrix metalloproteinases (MMPs) activity, collagen degradation and resin-dentin bond stability. Methods: Two studies were developed to answer to the objectives of this dissertation. Study 1: One hundred dentin beams (1x1x6 mm) were obtained from sound human permanent molars. Fifty specimens were acid-etched with 37% phosphoric acid and treated for 60s with (n=10): deionized water (control), 0.5 mol/L EDC, experimental primer (EP), experimental primer with 0.5 mol/L EDC (EP+EDC) or Scotchbond MP primer (SBMP). After rinsing, the total MMP activity was assessed by a colorimetric assay (SenSolyte). Additionally, 20 specimens were subjected to a caries-inducing protocol. These and the remaining 20 sound specimens were completely demineralized in 10% phosphoric acid for 18h. The specimens were treated as mentioned above and stored in saliva-like solution for 15 days at 37°C. After this period, the saliva was collected for the quantification of hydroxyproline (HYP) release. MMP activity and HYP release were submitted to ANOVA and Tukey tests (p<0.05). Study 2: Flat dentin surfaces were obtained from 32 sound third molars. The dentin was acid-etched for 15s and treated (n=8) as described in the study 1, except for deionized water. After treatment, the bond of SBMP was applied to all teeth and resin blocks were constructed. After 24h, the teeth were cut into specimens with 0.81 mm2 of cross-sectional area, which were stored in saliva-like solution for 24h or 6 mo prior to microtensile testing. The bond strength values (MPa) were submitted to two-way ANOVA, Tukey and chi-square (χ2) tests (p<0.05). Types of fractures were descriptively analyzed. Results: All treatments reduced the activity of MMPs, however, 0.5 mol/L EDC (92%) and the EP+EDC (78%) were the most effective...(Complete abstract electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:53Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo1764_1.pdf: 2524003 bytes, checksum: 08f58cd79907281ae329a804438b38b7 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2006 / Hemorragia é uma patologia que ocorre devido à anormalidade das funções dos fatores da coagulação, do endotélio dos vasos sanguíneos e/ou das plaquetas. Enzimas da peçonha dos Viperídeos, designadas hemorraginas, toxinas hemorrágicas ou ainda fatores hemorrágicos são as principais responsáveis pelo quadro hemorrágico (local e sistêmico) apresentado nos acidentes por viperídeos. A espécie Bothrops leucurus é uma das mais importantes serpentes peçonhentas do Nordeste do Brasil. Neste trabalho foi realizada a purificação e caracterização parcial de duas toxinas hemorrágicas da peçonha de Bothrops leucurus. As hemorraginas Bleu-H1 e Bleu-H2 foram purificadas através de três passos cromatográficos: troca iônica de 600 mg da peçonha de B. leucurus, dividida em quatro alíquotas, em coluna de Mono Q (10 x 100 mm), seguida de gel em filtração TSK G-3000 (7,5 mm x 60 cm) e recromatografia em coluna de Mono Q (5 x 50 mm), obtendo rendimento de 0,1% para cada toxina. Os resultados do dot-blot indicam que ambas hemorraginas são metaloproteases. De acordo com os resultados da SDS-PAGE em condições redutoras, Bleu H1 é constituída de pelo menos seis cadeias (66, 63, 38, 28, 19 e 17 KDa), enquanto Bleu H2 revelou cinco cadeias (63, 41, 38, 28, 18, 16 kDa), sugerindo que as hemorraginas Bleu H1 e Bleu-H2 apresentem massas moleculares superiores a 278 KDa e 207 KDa, respectivamente. A SDS-PAGE sem a presença de agente redutor confirmou a homogeneidade de Bleu-H1. A Dose Mínima Hemorrágica (DMH) da peçonha de B. leucurus foi 1,96 &#956;g, e a de Bleu H1 e de Bleu H2 foram 1,23 &#956;g e 1,42 &#956;g, respectivamente. Bleu H1 e Bleu H2 apresentaram atividade ativadora de fator X, e capacidade de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222 e S-2238, sendo Bleu-H2 consideravelmente mais ativa do que Bleu-H1. Em conclusão, duas metaloproteinases ácidas da classe P-IV, com baixa atividade hemorrágica, alta atividade ativadora de fator X e capacidade de hidrolisar os substratos cromogênicos S-2222 e S-2238, denominadas Bleu- H1 e Bleu-H2, foram purificadas da peçonha de Bothrops leucurus

Orientador: Hernandes Faustino de Carvalho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-05T10:11:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peters_Helene_M.pdf: 3147205 bytes, checksum: 29d84ddab25f17a17efc857545126663 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: A próstata tem merecido crescente atenção devido à maior incidência de câncer prostático e outras afecções do órgão, que resultam do aumento na longevidade dos indivíduos do sexo masculino em todo o mundo. Além disto, o desenvolvimento e crescimento prostático normal apresenta regulação androgênica e está sujeito a uma série de disruptores endócrinos que afetam o seu crescimento e função, assim como predispõem ao desenvolvimento tumoral. Nosso interesse reside principalmente na remodelação prostática seguida à castração e nas interações epitélio estroma que ocorrem neste órgão. Neste trabalho, investigamos a expressão do inibidor de metaloproteinases (MMPs) RECK, em nível de RNAm, procurando correlacioná-Io com o desenvolvimento pós-natal e com a regressão prostática seguida à castração. Para isto, foram utilizadas técnicas de RT-PCR semiquantitativo, Real time RT-PCR e de hibridação in situ,pareados sempre que possível com a expressão do RNAm e com a atividade de algumas MMPs. Os resultados demonstram que o gene RECK é expresso na próstata ventral de ratos, que existe uma significativa redução na sua expressão ao longo do desenvolvimento pós-natal, que há mecanismos diferenciados controlando a expressão dos pares RECKlMMP-2 e MMP-7/MMP-14. Foi observado também um crescente aCÚInulo da forma ativa da MMP-9, conforme o animal se aproxima da idade adulta. Utilizando RT-PCR semiquantitativo, pudemos determinar que o conteúdo relativo do RNAm para o RECK após a castração não muda, embora haja uma inversão no balanço entre a expressão epitelial (células epiteliais) e estromal (células musculares lisas e fibroblastos), nesta situação. No conjunto, os resultados sugerem que o RECK é expresso por diferentes tipos celulares da próstata ventral de ratos, com mecanismos de regulação complexos provavelmente oriundos da existência de diferentes compartimentos no órgão, ao contrário do que se observa para células isoladas / Abstract: The prostate has deserved increasingly attention due to the growing incidence of prostatic cancer and other prostatic diseases, which can be related to the longevity increase of men around the world. Besides, the normal prostatic development is under androgen regulation and as so is subject to a series of endocrine disruptors which affect its growth and function and predisposes to prostate cancer. Our interest resides on the prostatic remodelling following castration and on the epithelial-stromal relationships known to occur in the organ. In this work, we have investigated the expression of the matrix metalloproteinase inhibitor RECK, at the rnRNA leveI, trying to correlate its expression with the post natal prostatic development and regression after castration, using semiquantitative RT-PCR, Real time RT-PCR and in situ hybridization, paralleled with the determination of some MMPs expression and activity. Tbe results demonstrate that RECK is expressed in the rat ventral prostate, that there is a significative reduction in its expression during the post natal development, which is paralleled by the expression of some MMPs and that the mechanisms controling the pairs RECKJMMP-2 and MMP-7/MMP-14 are different. It was also observed an increased proportion of the active form of MMP-9, as the animal approaches adulthood. Using semiquantitative RT-PCR, we could determine that the relative content ofRECK rnRNA remains unchanged by castration, spite detecting an inversion in the balance between the epithelial (epithelial cells) and stromal (smooth muscle cells and fibroblasts) in this situation. Taken together, the results indicate that RECK is expressed by different cell types of the rat ventral prostate, with regulatory mechanisms appearing more complex, likely resulting ftom the existence of different compartments in the organ opposing what was seen for isolated cells / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Carlos Alan Candido Dias-Junior / Resumo: O óxido nítrico (NO) é um gás produzido principalmente por células endoteliais, e durante a época gestacional, contribui para evitar aumento exacerbado da resistência vascular sistêmica (RVS), uma vez que, durante esse período, aumenta-se o volume sanguíneo e a frequência cardíaca. Quando, há disfunções endoteliais, reduz-se a biodisponibilidade de NO, provocando vasoconstrição e esta, por sua vez, consequentemente aumenta atividade das MMPs. Essa queda do NO e aumento das MMPs culminam em desordens hipertensivas gestacionais. Segundo estudos anteriores realizados em modelos de hipertensão em machos a doxiciclina, um antibiótico derivado das tetraciclinas, diminuiu a pressão arterial sistólica devido a sua capacidade de inibir a atividade das MMPs. No entanto, há escassez de trabalhos que desenvolveram estudos sobre os efeitos da doxicicilina em modelos animais de hipertensão gestacional. Por esse motivo, investigamos os efeitos da doxiciclina na inibição das MMPs na hipertensão gestacional, induzida pelo Nω-nitro-L-arginina-metil éster (LNAME) em ratas. Para tanto, realizamos zimografia para avaliar a atividade da MMP-2 e -9 na placenta, no útero e na aorta torácica. Ainda avaliamos a pressão arterial sistólica, o desenvolvimento feto-placentário e os metabólitos do NO. Também foi avaliada a capacidade antioxidante plasmática, os níveis plasmáticos de soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1) e o fator de crescimento placentário (PLGF). Nossos dados mostram que o tratament... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nitric oxide (NO) is a gas produced mainly by endothelial cells, and during the gestational period contributes to avoid an exacerbated increase in systemic vascular resistance (SVR), since during this period, there is a rise in blood volume and heart rate. When there are endothelial dysfunctions, the bioavailability of NO is reduced, causing vasoconstriction and this, in turn, consequently increases the activity of MMPs. This decrease in NO and increase in MMPs culminates in gestational hypertensive disorders. According to previous studies in non-gestational hypertension models, doxycycline, an antibiotic derived from tetracyclines, lowered systolic blood pressure due to its ability to inhibit MMP activity. However, there is a shortage of works that have developed studies on the effects of doxycycline in animal models of gestational hypertension. For this reason, we investigated the effects of doxycycline on the inhibition of MMPs in gestational hypertension, induced by Nω-nitro-L-arginine-methyl ester (L-NAME) in rats. We performed a zymography to evaluate the activity of MMP-2 and -9 in the placenta, uterus and thoracic aorta. We also evaluated systolic blood pressure, fetalplacental development and NO metabolites. Plasma antioxidant capacity, plasma levels of soluble fms-like tyrosine kinase-1 (sFlt-1) and placental growth factor (PLGF) were also evaluated. Our data shows that the treatment with L-NAME increased blood pressure and decreased the offspring of these animals. ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Julio Lopes Sequeira / Banca: Noeme Sousa Rocha / Banca: Osimar Carvalho Sanches / Resumo: O sarcoide equino é a neoplasia de pele mais prevalente na espécie equina, possuindo seis tipos clínicos descritos: verrucoso, misto, maligno, nodular, oculto, fibroblástico e o misto. Evidências demonstram uma importante influência do estroma no desenvolvimento e progressão dos tumores malignos. O arranjo e a quantidade de colágeno, a presença de miofibroblastos no estroma ou como componentes da neoplasia, assim como a expressão de metaloproteinases (MMPs) pelas células tumorais, tem sido apontados como elementos que podem indicar o comportamento da neoplasia. Os objetivos do presente trabalho foram associar aos diferentes tipos clínicos de sarcoide equino as expressões de MMP-1, MMP-2 e MMP-9, identificar a presença ou não de miofibroblastos pela expressão de α-SMA e as características e distribuição do colágeno presentes, afim de determinar possíveis marcadores do comportamento biológico da neoplasia. As características morfológicas microscópicas típicas dos sarcoides equinos estavam presentes nas amostra avaliadas, mas estas por si só não podem caracterizar um tipo clínico específico. O estroma tumoral nos tipos clínicos fibroblástico e verrucoso, nos cortes corados pelo método de picrosirius red e examinados sob luz polarizada, era constituído por fibras colágenas frouxas e delicadas, compatível com fibras imaturas comuns em lesões menos estáveis. Os miofibroblastos foram identificados no sarcoide equino e a variação observada na sua distribuição e intensidade de expressão de alfa-SMA foi observada mesmo dentro do mesmo tipo clínico. Os fibroblastos neoplásicos dos sarcoides equinos demonstram expressão MMP-1, MMP-2 e MMP-9. Os tipos clínicos verrucoso e misto apresentam maior expressão de MMP-2 do que tipo clínico nodular, sendo este achado compatível com o potencial de agressividade maior. Pode-se verificar que existem diferenças entre os tipos clínicos de sarcoide equino / Abstract: The equine sarcoid is the most prevalent skin cancer in equine, having six clinical types described: warty, mixed, malignant, nodular, hidden, fibroblast and mixed. Evidence has shown an important influence on stromal development and progression of malignant tumors. The arrangement and quantity of collagen, the presence of myofibroblasts in the stroma or as a tumor component as well as the expression of matrix metalloproteinases (MMPs) by tumor cells, have been identified as factors that may indicate the behavior of the tumor. The objectives of this study were associate the different clinical types of equine sarcoid to expressions of MMP-1, MMP-2 and MMP-9, to the presence or absence of myofibroblasts by α-SMA expression and the characteristics and distribution of collagen, in order to determine possible markers of the biological behavior of the tumor. Typical microscopic morphological characteristics of equine sarcoid were present in the samples evaluated, but these alone can't characterize a especific clinical type. In sections stained with picrosirius red method and examined under polarized light the tumor stroma in fibroblastic and verrucous clinical types, was composed of loose and delicate collagen fibers, compatible with immature fibers in less stable lesions. Myofibroblasts were identified in equine sarcoid and the variation in distribution and intensity of alpha-SMA expression was observed even within the same clinical type. The neoplastic fibroblasts in equine sarcoid demonstrate expression MMP-1, MMP-2 and MMP-9. The verrucous and mixed types have higher MMP-2 expression than nodular clinical type, and this finding is consistent with the more aggressive potential. So there are differences between the clinical types of equine sarcoid that can be seen by the use of histochemical and immunohistochemical techniques / Mestre

As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

Orientador: Fredererico Canato Martinho / Co-orientador: Márcia Carneiro Carneiro Valera / Banca: Ana Paula Martins Gomes / Banca: Izabel Coelho Gomes Camões / Resumo: Os objetivos do presente estudo são: 1) Estudar o perfil inflamatório das lesões periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias através dos níveis das citocinas inflamatórias: IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica; 2) Investigar os níveis das metaloproteinases [MMP-1, -2 e -9], inibidores de metaloproteinase [TIMP-1 e -2] e complexos MMP/TIMP [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], presentes nos tecidos periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias e lesão periapical; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica e reabsorção óssea; 3) Correlacionar os níveis das citocinas inflamatórias [IL-1beta, IL-6 e TNF-alfa] e seus antagonistas [IL1-RA, IL6-RA, sTNF-R1], presentes nos tecidos periapicais; 4) Estudar a efetividade de diferentes medicações intracanal no controle do processo inflamatório periapical, através do monitoramento dos níveis de citocinas inflamatórias, [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1, -2 e -9], TIMP's [TIMP-1 e -2] e complexos [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2 MMP9/TIMP1, MMP9/TIMP2] coletadas dos tecidos periapicais. Vinte dentes unirradiculares com necrose pulpar e lesão periapical foram selecionados. Após o preparo biomecânico (PBM) os dentes foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de acordo com a medicação intracanal utilizada: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + solução salina fisiológica]; e Ca(OH)2+CLX [Ca(OH)2 + clorexidina gel 2%]. Para a análise dos biomarcadores inflamatórios, foram realizadas coletas utilizando cones de papel estéril/apirogênico, ultrapassando 2 mm além ápice para obtenção do fluído intersticial. As coletas foram realizadas em dois momentos operatórios : coleta após PBM (Coleta inicial-CIF1) e coleta após 14 dias de medicação intracanal (Coleta final-CFF2). Citocinas... / Abstract: The aim of this study was: 1) To investigate the inflammatory profile of apical periodontitis disease present in primarily infected root canals determined by the levels of inflammatory cytokines : IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; and to correlate with the presence of clinical features; 2) To investigate the levels of metalloproteinases [MMP-1, -2, -9], metalloproteinase inhibitors [TIMP-1 e -2] ; complexes MMP/TIMP [MMP1/ TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], present in apical peridontitis disease from teeth with primary endodontic infection; and to correlate with the presence of clinical features; 3) To correlate the levels of IL-1beta, IL-6, TNF-alfa with their respectively antagonists - IL1-RA, IL6-RA, s TNF-R1, all present in apical peridontitis; 4) To evaluate the effectiveness of different root canal medications in the inflammatory process by monitoring the levels of inflammatory cytokines [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1,-2,-9]; TIMP [TIMP-1 and -2] and complexes [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2] in apical periodontitis. Twenty patients with single-rooted teeth that had necrotic pulp and periapical periodontitis will be selected. After BMP teeth will be randonly devided into 2 groups according to the root canal medication selection: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + Saline Solution]; e Ca(OH)2+CHX [Ca(OH)2 + chlorhexidine gel 2%]. Samples will be collected from intersticial fluid by using sterile/ apyrogenic paper points. Samples will performed at two diferente times: After chemomechaical preparation (S1) and after 14 of root canal medication (S2). Inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be dosage by ELISA-assay. The levels of inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be typed on a spreadsheet and statiscally analyzed by SPSS for Windows and Statistic packpage 9.0. ... / Mestre

Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 / Inclui referências : f. 155-165 / Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), altamente expressa em células neuronais, cujo papel biológico não está bem elucidado. Sabe-se que a ADAM23 está envolvida no processo de adesão celular em neuroblastomas através da interação com integrinas. Mecanismos de adesão celular envolvendo a ADAM23 humana, informações sobre o seu processamento intracelular e as propriedades do seu ectodomínio podem servir para a compreensão do papel estrutural e biológico dessa proteína. O presente estudo visou o desenvolvimento de vetores de expressão para a produção de quimeras protéicas constituídas pelo ectodomínio de ADAM23 e a região Fc de IgG humana (domínios CH2 e CH3). As quimeras serão utilizadas como bioferramentas no estudo do processamento de ADAM23 e da sua função na adesão e proliferação celular. Os fragmentos de nucleotídeos que codificam os resíduos 60-792 (ADAM23C1) e 287-792 (ADAM23C2) da ADAM23 humana foram clonados no vetor pINFUSE-hIgG1-Fc2 (secreção através do peptídeo sinal da IL-2) enquanto a sequência 1-792 foi clonada no vetor pcDNA3.1-hIgG1-Fc2 (secreção utilizando o peptídeo sinal da ADAM23). As três construções foram transfectadas nas linhagens N2A (neuroblastoma de camundongo), HEK-293T (rim humano) e CHO-K1 (ovário de hamster) e tanto os extratos celulares como os sobrenadantes de cultura foram analisados para a expressão das quimeras. A linhagem N2A apresentou a mais eficiente secreção das três proteínas quiméricas. As quimeras ADAM23C1 e ADAM23C2, foram adequadamente expressas e recuperadas dos sobrenadantes das culturas de células N2A e HEK-293T. A quimera ADAM23C3 (full-length do ecdomínio) foi identificada sempre na forma processada, indicando que seu peptídeo sinal foi reconhecido pelas maquinarias de secreção e processamento das células utilizadas. Diferentes métodos de purificação das quimeras foram comparados, sendo que a precipitação por sulfato de amônio mostrou-se ser o mais adequado, por aliar economicidade de recursos e retenção da estrutura da proteína. Paralelamente foi avaliada a expressão de ADAM23 em diferentes linhagens e tecidos, além do estabelecimento da localização celular das formas imatura e processada da ADAM23. Com a ajuda do anticorpo monoclonal DL11C8 foi possível determinar que a forma processada de ADAM23 (70 kDa) é a mais abundante no encéfalo de camundongos e é expressa na face externa da membrana plasmática da linhagem N2A. Estes dados mostram pela primeira vez que há uma baixa expressão da forma de 100 kDa (não-processada) no sistema nervoso, ao contrário do que foi observado em linhagens tumorais. A relevância da razão de expressão entre as formas imatura e processada para a função da ADAM23 no sistema nervoso, como a sua relevância na progressão do fenótipo tumoral merecem mais investigação. Palavras-chave: ADAM23. Ectodomínio. Desintegrina. Metaloprotease. Proteínas Fc quiméricas. / Abstract: ADAM23 is a transmembrane protein, member of ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family, highly expressed in neuronal cells, whose biological role is not yet totally elucidated. It is known that ADAM23 is involved in the cellular adhesion process in neuroblastoma. ADAM23 interacts with integrins promoting cell adhesion. However, ADAM23 full-involvement in cellular adhesion mechanisms remains to be established. The present study aimed for the development of biological tools, particularly the production of expression vectors that code for chimeric proteins containing human ADAM23 ectodomain fused to a human IgG Fc region. Nucleotide fragments coding for the residues 60-792 (ADAM23C1) and 287-792 (ADAM23C2) were cloned in the vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 while the sequence 1-792 (ADAM23C3) was inserted onto modified plasmid pcDNA3.1-hIgG1-Fc2. Three different cell lineages (N2A, HEK-293T and CHO-K1) were transfected with the expression plasmids and the chimeric proteins detected in both cell extracts and culture supernatants by monoclonal antibody DL11C8. N2A cell lineage presented the most efficient expression/secretion of the three chimeric proteins. CHO-K1 showed chimeric ADAM23C1 and ADAM23C2 secretion, although ADAM23C3 was not observed in supernatants. The full-length construction (C3) was always detected as a processed protein, indicating that endogenous ADAM23 signal peptide and processing signals were correctly translated by cellular host machinery. Several protocols were compared for purification of chimeric proteins from culture supernatant, being ammonium sulfate salting-out the most practical and convenient. Besides, it was established that mature ADAM23 (70 kDa) is the abundant form in the mouse brain and the processed protein is located at N2A cell surface. In addition it was showed, for the first time, that non-processed ADAM23 (100 kDa) has low expression in the central nervous system when compared with the processed 70 kDa form. Interestingly, tumoral cell lines (MDA-MB-435 and N2A) presented the opposite behavior. If the non-processed/mature ratio profile is specific for each cell line or has a role in the tumoral phenotype will be further investigated in future. Key words: ADAM23. Ectodomain. Disintegrin. Metalloprotease. Fc chimeric proteins.