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Produção de proteínas quiméricas como bioferramentas no estudo da desintegrina e metaloprotease ADAM23

Souza, Ingrid Larissa Melo de January 2015 (has links)
Orientador : Prof. Dr. Silvio Marques Zanata / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular. Defesa: Curitiba, 31/03/2015 / Inclui referências : f. 155-165 / Resumo: ADAM23 é uma proteína transmembrana, da família ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease), altamente expressa em células neuronais, cujo papel biológico não está bem elucidado. Sabe-se que a ADAM23 está envolvida no processo de adesão celular em neuroblastomas através da interação com integrinas. Mecanismos de adesão celular envolvendo a ADAM23 humana, informações sobre o seu processamento intracelular e as propriedades do seu ectodomínio podem servir para a compreensão do papel estrutural e biológico dessa proteína. O presente estudo visou o desenvolvimento de vetores de expressão para a produção de quimeras protéicas constituídas pelo ectodomínio de ADAM23 e a região Fc de IgG humana (domínios CH2 e CH3). As quimeras serão utilizadas como bioferramentas no estudo do processamento de ADAM23 e da sua função na adesão e proliferação celular. Os fragmentos de nucleotídeos que codificam os resíduos 60-792 (ADAM23C1) e 287-792 (ADAM23C2) da ADAM23 humana foram clonados no vetor pINFUSE-hIgG1-Fc2 (secreção através do peptídeo sinal da IL-2) enquanto a sequência 1-792 foi clonada no vetor pcDNA3.1-hIgG1-Fc2 (secreção utilizando o peptídeo sinal da ADAM23). As três construções foram transfectadas nas linhagens N2A (neuroblastoma de camundongo), HEK-293T (rim humano) e CHO-K1 (ovário de hamster) e tanto os extratos celulares como os sobrenadantes de cultura foram analisados para a expressão das quimeras. A linhagem N2A apresentou a mais eficiente secreção das três proteínas quiméricas. As quimeras ADAM23C1 e ADAM23C2, foram adequadamente expressas e recuperadas dos sobrenadantes das culturas de células N2A e HEK-293T. A quimera ADAM23C3 (full-length do ecdomínio) foi identificada sempre na forma processada, indicando que seu peptídeo sinal foi reconhecido pelas maquinarias de secreção e processamento das células utilizadas. Diferentes métodos de purificação das quimeras foram comparados, sendo que a precipitação por sulfato de amônio mostrou-se ser o mais adequado, por aliar economicidade de recursos e retenção da estrutura da proteína. Paralelamente foi avaliada a expressão de ADAM23 em diferentes linhagens e tecidos, além do estabelecimento da localização celular das formas imatura e processada da ADAM23. Com a ajuda do anticorpo monoclonal DL11C8 foi possível determinar que a forma processada de ADAM23 (70 kDa) é a mais abundante no encéfalo de camundongos e é expressa na face externa da membrana plasmática da linhagem N2A. Estes dados mostram pela primeira vez que há uma baixa expressão da forma de 100 kDa (não-processada) no sistema nervoso, ao contrário do que foi observado em linhagens tumorais. A relevância da razão de expressão entre as formas imatura e processada para a função da ADAM23 no sistema nervoso, como a sua relevância na progressão do fenótipo tumoral merecem mais investigação. Palavras-chave: ADAM23. Ectodomínio. Desintegrina. Metaloprotease. Proteínas Fc quiméricas. / Abstract: ADAM23 is a transmembrane protein, member of ADAM (A Disintegrin and Metalloprotease) family, highly expressed in neuronal cells, whose biological role is not yet totally elucidated. It is known that ADAM23 is involved in the cellular adhesion process in neuroblastoma. ADAM23 interacts with integrins promoting cell adhesion. However, ADAM23 full-involvement in cellular adhesion mechanisms remains to be established. The present study aimed for the development of biological tools, particularly the production of expression vectors that code for chimeric proteins containing human ADAM23 ectodomain fused to a human IgG Fc region. Nucleotide fragments coding for the residues 60-792 (ADAM23C1) and 287-792 (ADAM23C2) were cloned in the vector pINFUSE-hIgG1-Fc2 while the sequence 1-792 (ADAM23C3) was inserted onto modified plasmid pcDNA3.1-hIgG1-Fc2. Three different cell lineages (N2A, HEK-293T and CHO-K1) were transfected with the expression plasmids and the chimeric proteins detected in both cell extracts and culture supernatants by monoclonal antibody DL11C8. N2A cell lineage presented the most efficient expression/secretion of the three chimeric proteins. CHO-K1 showed chimeric ADAM23C1 and ADAM23C2 secretion, although ADAM23C3 was not observed in supernatants. The full-length construction (C3) was always detected as a processed protein, indicating that endogenous ADAM23 signal peptide and processing signals were correctly translated by cellular host machinery. Several protocols were compared for purification of chimeric proteins from culture supernatant, being ammonium sulfate salting-out the most practical and convenient. Besides, it was established that mature ADAM23 (70 kDa) is the abundant form in the mouse brain and the processed protein is located at N2A cell surface. In addition it was showed, for the first time, that non-processed ADAM23 (100 kDa) has low expression in the central nervous system when compared with the processed 70 kDa form. Interestingly, tumoral cell lines (MDA-MB-435 and N2A) presented the opposite behavior. If the non-processed/mature ratio profile is specific for each cell line or has a role in the tumoral phenotype will be further investigated in future. Key words: ADAM23. Ectodomain. Disintegrin. Metalloprotease. Fc chimeric proteins.
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Monitoramento clínico do processo inflamatório periapical antes e após o uso de diferentes medicações intracanal através dos níveis de biomarcadores inflamatórios

Teixeira, Flávia Figueiredo Chaves [UNESP] 03 February 2015 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2016-06-07T17:12:01Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2016-06-07T17:16:33Z : No. of bitstreams: 1 000865423.pdf: 1848743 bytes, checksum: 5434932daa9880daa223b56bf1dbc009 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Os objetivos do presente estudo são: 1) Estudar o perfil inflamatório das lesões periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias através dos níveis das citocinas inflamatórias: IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica; 2) Investigar os níveis das metaloproteinases [MMP-1, -2 e -9], inibidores de metaloproteinase [TIMP-1 e -2] e complexos MMP/TIMP [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], presentes nos tecidos periapicais de dentes com infecções endodônticas primárias e lesão periapical; correlacionando com a presença de sintomatologia clínica e reabsorção óssea; 3) Correlacionar os níveis das citocinas inflamatórias [IL-1beta, IL-6 e TNF-alfa] e seus antagonistas [IL1-RA, IL6-RA, sTNF-R1], presentes nos tecidos periapicais; 4) Estudar a efetividade de diferentes medicações intracanal no controle do processo inflamatório periapical, através do monitoramento dos níveis de citocinas inflamatórias, [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1, -2 e -9], TIMP's [TIMP-1 e -2] e complexos [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2 MMP9/TIMP1, MMP9/TIMP2] coletadas dos tecidos periapicais. Vinte dentes unirradiculares com necrose pulpar e lesão periapical foram selecionados. Após o preparo biomecânico (PBM) os dentes foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de acordo com a medicação intracanal utilizada: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + solução salina fisiológica]; e Ca(OH)2+CLX [Ca(OH)2 + clorexidina gel 2%]. Para a análise dos biomarcadores inflamatórios, foram realizadas coletas utilizando cones de papel estéril/apirogênico, ultrapassando 2 mm além ápice para obtenção do fluído intersticial. As coletas foram realizadas em dois momentos operatórios : coleta após PBM (Coleta inicial-CIF1) e coleta após 14 dias de medicação intracanal (Coleta final-CFF2). Citocinas... / The aim of this study was: 1) To investigate the inflammatory profile of apical periodontitis disease present in primarily infected root canals determined by the levels of inflammatory cytokines : IL-1beta, IL-6, TNF-alfa; and to correlate with the presence of clinical features; 2) To investigate the levels of metalloproteinases [MMP-1, -2, -9], metalloproteinase inhibitors [TIMP-1 e -2] ; complexes MMP/TIMP [MMP1/ TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2], present in apical peridontitis disease from teeth with primary endodontic infection; and to correlate with the presence of clinical features; 3) To correlate the levels of IL-1beta, IL-6, TNF-alfa with their respectively antagonists - IL1-RA, IL6-RA, s TNF-R1, all present in apical peridontitis; 4) To evaluate the effectiveness of different root canal medications in the inflammatory process by monitoring the levels of inflammatory cytokines [IL-1beta, IL-6, TNF-alfa], MMP's [MMP-1,-2,-9]; TIMP [TIMP-1 and -2] and complexes [MMP1/TIMP1, MMP1/TIMP2, MMP2/TIMP1, MMP2/TIMP2, MMP9/TIMP1 e MMP9/TIMP2] in apical periodontitis. Twenty patients with single-rooted teeth that had necrotic pulp and periapical periodontitis will be selected. After BMP teeth will be randonly devided into 2 groups according to the root canal medication selection: Ca(OH)2+SSL [Ca(OH)2 + Saline Solution]; e Ca(OH)2+CHX [Ca(OH)2 + chlorhexidine gel 2%]. Samples will be collected from intersticial fluid by using sterile/ apyrogenic paper points. Samples will performed at two diferente times: After chemomechaical preparation (S1) and after 14 of root canal medication (S2). Inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be dosage by ELISA-assay. The levels of inflammatory cytokines, metalloproteinases and their antagonists will be typed on a spreadsheet and statiscally analyzed by SPSS for Windows and Statistic packpage 9.0. ...
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O papel do trânsito de cálcio e de compostos da matriz extracelular no modelo de insuficiência aórtica aguda experimental em ratos

Bussoni, Márjory Fernanda [UNESP] 12 September 2015 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2016-07-01T13:10:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-09-12. Added 1 bitstream(s) on 2016-07-01T13:14:12Z : No. of bitstreams: 1 000866809.pdf: 1747343 bytes, checksum: 1bd62536c1ab61130611dd2e937d842f (MD5) / Os mecanismos envolvidos na remodelação cardíaca por sobrecarga de volume e o momento que a hipertrofia excêntrica apresenta prejuízo da função cardíaca são pouco conhecidos. Objetivos: a) Comparar alterações morfofuncionais, celulares (hipertrofia) e intersticiais (fibrose) em diferentes momentos da evolução da insuficiência aórtica; b) Verificar quais dos seguintes mecanismos estão envolvidos na remodelação cardíaca induzida pela IAo e em qual momento esta alteração acontece: alteração na metaloprotease 2 (MMP2) e do inibidor tecidual de metaloprotease 1 (TIMP1), alterações dos RNAs mensageiros específicos para a codificação das proteínas envolvidas na homeostase do cálcio (Fosfolambam, Ryr e Serca2a), alterações da expressão de proteínas fosfolambam e Serca2a do trânsito de cálcio. Casuística e Métodos: Estudo experimental com 64 ratos Wistar machos, 32 animais submetidos à insuficiência aórtica aguda (grupo IAo) e 32 animais a procedimento simulado (grupo Controle). Todos os animais foram seguidos com 1, 4, 8 e 12 semanas através de ecocardiogramas seriados e, após eutanásia, foram analisada morfometria do tecido cardíaco, atividade da MMP2 e TIMP-1, expressão gênica por Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real das proteínas do trânsito de cálcio, expressão das proteínas Serca2a e fosfolambam pela técnica Western Blot. A análise estatística foi efetuada pela ANOVA de dois fatores; o pós teste de Holm Sidak; teste t grupo a grupo; Anova de 1 via, complementada por Tukey; correção por Bonferroni; teste de correlação de Spearman e teste de correlação de Pearson. Em todos os casos, o nível de significância adotado foi p<0,05. Resultados: Observou-se, na primeira semana, que o peso do VE e a pressão diastólica foi maior no grupo IAo. Na quarta semana, MMP2, TIMP-1, iMVE e fração de colágeno foram maiores no grupo IAo. A área do miócito e DDVE foram maiores... / The mechanisms that are involved in cardiac remodeling by volume overload and the moment the eccentric hypertrophy has impaired cardiac function are largely unknown. Objectives: a) to compare morphological, cell (hypertrophy) and interstitial (fibrosis) changes at different times of the evolution of aortic regurgitation (AR); b) to analyze which of the following mechanisms are involved in cardiac remodeling induced by aortic failure and at what moment this change takes place: change in the metalloprotease 2 (MMP 2) and tissue inhibitor of metalloproteinase 1 (TIMP1); changes of messenger RNAs to code proteins involved in calcium homeostasis (phospholamban, Ryr and SERCA2a), changes in expression of phospholamban and SERCA2a in the calcium transit. Methods: Experimental study with 64 male Wistar rats, 32 animals submitted to acute aortic regurgitation (AR group) and 32 animals sham procedure (Sham group). All animals were followed with 1, 4, 8 and 12 weeks by serial echocardiography and after euthanasia, were analyzed morphometry of cardiac tissue, the activity of MMP2 and TIMP-1, gene expression by RT-PCR of calcium homeostasis protein, SERCA2a and phospholamban expression by Western Blotting. Statistical analysis was performed by two-way ANOVA; the Holm Sidak post test; t test group to group; Anova one way, complemented by Tukey; Bonferroni correction; Spearman correlation test and Pearson's correlation test. In all cases, the significance level was set at p <0.05. Results: In the first week it was observed that weight of the LV and diastolic blood pressure were higher in the AR group. In the fourth week, MMP 2, TIMP-1, and collagen fraction were higher in the AR group. The myocyte area and left ventricle diastolic diameter (LVDD) were higher in the AR group compared to the sham group, from the eighth week. At weeks 8 and 12, the wall thickness (WT) was higher in the AR group than the...
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Estudos estruturais experimentais e teóricos com proteínas do veneno da serpente Bothrops jararacussu

Magro, Angelo José [UNESP] 22 November 2006 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:13Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-11-22Bitstream added on 2014-06-13T19:21:38Z : No. of bitstreams: 1 magro_aj_dr_botib.pdf: 2025292 bytes, checksum: b5afa7c16b45283a5c3bb7bdf4d2a561 (MD5) / Neste trabalho foram realizados estudos estruturais experimentais e teóricos com a BthA-I e a BjussuMP-I, duas proteínas isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A proteína BthA-I é uma fosfolipase A2 (PLA2) ácida com elevada atividade catalítica e que possui a capacidade de inibir a agregação de plaquetas e reduzir a pressão arterial. Cristais da BthA-I nativa e de sua forma quimicamente modificada pelo pBPB (brometo de p-bromofenacila), um conhecido inibidor de a PLA2s que também é capaz de suprimir os mecanismos farmacológicos próprios desta proteína, foram obtidos e submetidos a experimentos de difração de raios-X. A estrutura cristalina da BthA-I foi elucidada a 1,9 Å de resolução e o processamento dos dados experimentais revelou a presença de dois monômeros na unidade assimétrica. A análise estrutural destes monômeros revelou que a BthA-I dimérica possui uma conformação oligomérica distinta das demais PLA2s, onde os sítios catalíticos da molécula encontram-se expostos ao solvente. Apesar das condições de cristalização da BthA-I nativa, é possível sugerir que a forma dimérica desta proteína seja aquela encontrada predominantemente in vivo. A determinação estrutural da BthA-I quimicamente modificada pelo pBPB a 1,85 Å de resolução revelou a presença inequívoca de moléculas de inibidor covalentemente ligadas aos resíduos His48, localizados nos sítios de ligação de substrato dos dois monômeros do complexo. Três regiões do complexo BthA-I/pBPB são estruturalmente alteradas pela ligação do inibidor: os loops de ligação de Ca++ e as regiões de β-wing C-terminais. Estas mudanças estruturais são provavelmente derivadas da conformação oligomérica apresentada pelo complexo, cuja disposição pode explicar a supressão das atividades farmacológicas da BthA-I... / In this work were performed experimental and theoretical structural studies with BthA-I and BjussuMP-I, two proteins from the venom of Bothrops jararacussu. BthA-I, a high catalytic acidic phospholipase A2 (PLA2) with platelet aggregation inhibition, anticoagulant and hypotensive properties, was crystallized in its native form and complexed to pBPB (p-bromophenacyl bromide), a well-known inhibitor of PLA2s which also abolishes the biochemical activities of this protein. The crystal structure of BthA-I native was solved at 1.9 Å and the data processing showed two monomers in the unit cell. A novel dimeric conformation of this native protein with the active sites of the monomers exposed to the solvent was observed. Despite of the conditions used in the crystallization experiments, it is possible to suggest that the dimeric form must be predominantly found in vivo. The structural determination of BthA-I chemically modified by pBPB at 1.85 Å revealed the unambiguous identification of inhibitor molecules covalently bound to residues His48 in the substrate-binding clefts of both monomers of the complex. Three regions of BthA-I/pBPB complex are structurally altered by the binding of the inhibitor: the Ca++ -binding loops, the β-wings and the C-terminal regions. These structural changes are probably derived from the oligomeric state presented by the complex, which could explain the abolition of pharmacological activities of the pBPB-chemically modified BthA-I. A residue present in the “pancreatic” loops (Lys69), which is usually related to the anticoagulant effect of the BthA-I, is in the dimeric interface of the complex, supporting this hypothesis regarding the abolition of this and other activities caused by pBPB. The theoretical BjussuMP-I catalytic domain, a P-III metalloprotease, was built through folding recognition... (Complete abstract click electronic access below)
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Identificação de eventos moleculares associados à reestenose coronariana

Lara, Juliana Rodrigues January 2017 (has links)
Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Resumo: Atualmente, o procedimento mais utilizado para o tratamento das lesões coronarianas é a angioplastia com implante de stent. Embora existam vantagens com esse procedimento, a reestenose continua sendo um dos principais limitadores do sucesso terapêutico. Sabe-se que inflamação, com acúmulo de células mononucleares ativadas, pode contribuir para o desenvolvimento da reestenose. Assim, estratégias para a identificação de biomarcadores de risco e para a redução das taxas de reestenose representam desafios na área da cardiologia intervencionista. Desta forma, o presente estudo teve como objetivos a identificação de possíveis marcadores genéticos de risco (polimorfismo dos genes MMP-2, MMP-3, MMP-9 -1562, MMP-9 Arg 279 Gln, CYP2C19*2, NOS3 e IL-6), bem como a avaliação de eventos moleculares e bioquímicos (lesões oxidativas no DNA, perfil de expressão gênica e de citocinas) que possam estar envolvidos no desenvolvimento da reestenose. Foram avaliados 330 indivíduos, 220 pacientes coronarianos com e sem reestenose após implante de stent e 110 indivíduos controles (sem implante de stent e com obstrução coronariana menor que 20%). Os resultados mostraram aumento significativo de danos no DNA de células do sangue periférico nos pacientes com reestenose intra-stent, mas nenhuma alteração nos níveis plasmáticos de citocinas (IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-α). Com relação aos polimorfismos gênicos, os dados mostraram que o alelo G do gene MMP-9 (Arg279Gln) foi mais frequente nos pac... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor
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Subclonagem e expressão do domínio catalítico da jararagina: estudo do efeito das modificações pós-traducionais na atividade hemorrágica.

Sánchez, Liliana Torcoroma García 23 April 2004 (has links)
Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissLTGS.pdf: 3281640 bytes, checksum: 5c9229f622076d2863caa1030e6ddbab (MD5) Previous issue date: 2004-04-23 / Financiadora de Estudos e Projetos / Metalloproteases are Zn++-dependent peptidase enzymes, richly found in Crotalidae and Viperidae snake venoms. Most snake venom metalloproteases (svMPs) are active on extracellular matrix components and this effect is thought to result in bleeding as a consequence of the basement membrane disruption in capillaries. Jararhagin is a hemorrhagic svMP from Bothrops jararaca venom. This enzyme has proteolytic activity on fibrinogen and fibronectin and inhibits collagen-induced platelet-aggregation in vitro. Its amino acid sequence corresponds to a N-terminal metalloprotease domain, a disintegrin-like and a C-terminal Cysteine-rich, being classified as a P-III snake venom metalloprotease (svMP). This work describes the expression, purification and successful refolding of the recombinant catalytic domain of jararhagin. The heterologous protein was produced in E.coli, an in vivo expression system that does not make post-translational modifications. The recombinant refolded protein did not show any hemorrhagic activity in mice skin, as well as, the native deglycosylated jararhagin. However, they preserved their proteolytic activity on fibrinogen and fibronectin. It seems that the hemorrhagic properties of these hemorrhagins are dependent on post-translational modifications, whereas their proteolytic activity is not completely dependent on such modifications. / As metaloproteases são enzimas peptidases dependentes de zinco. Estas proteínas são ricamente encontradas em venenos de serpentes Crotalidae e Viperidae. Muitas Metaloproteases de Venenos de Serpentes (svMPs) são ativas sobre componentes da Matriz Extracelular (MEC) e este efeito pode resultar em hemorragia como conseqüência da degradação da membrana basal nos capilares. A Jararagina é uma svMP hemorrágica proveniente do veneno da Bothrops jararaca. Esta enzima tem atividade proteolítica sobre fibrinogênio e fibronectina e inibe a agregação plaquetária induzida pelo colágeno in vitro. Sua seqüência de aminoácidos corresponde a um domínio metaloprotease N-terminal, um domínio tipo desintegrina e um domínio rico em cisteína C-terminal, sendo classificada como uma metaloprotease de veneno de serpente (svMP) de classe P-III. Este trabalho descreve a expressão, purificação e re-enovelamento do domínio catalítico da Jararagina. A proteína heteróloga foi produzida em E.coli, um sistema de expressão in vivo, que não faz modificações pós-traducionais. A proteína recombinante enovelada não mostrou atividade hemorrágica sobre pele de camundongo. O mesmo resultado foi obtido para a proteína nativa deglicosilada. Porém, tanto a proteína recombinante, quanto a proteína nativa, tinham sua atividade proteolítica preservada sobre fibrinogênio e fibronectina. Em conclusão, parece possível que a propriedade hemorrágica da Jararagina seja dependente de modificações pós-traducionais, enquanto que sua atividade proteolítica não dependa completamente de tais modificações.
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Estudos estruturais experimentais e teóricos com proteínas do veneno da serpente Bothrops jararacussu /

Magro, Angelo José. January 2006 (has links)
Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Richard John Ward / Banca: Roberto Morato Fernandez / Banca: João Alexandre Ribeiro Gonçalves Barbosa / Resumo: Neste trabalho foram realizados estudos estruturais experimentais e teóricos com a BthA-I e a BjussuMP-I, duas proteínas isoladas do veneno de Bothrops jararacussu. A proteína BthA-I é uma fosfolipase A2 (PLA2) ácida com elevada atividade catalítica e que possui a capacidade de inibir a agregação de plaquetas e reduzir a pressão arterial. Cristais da BthA-I nativa e de sua forma quimicamente modificada pelo pBPB (brometo de p-bromofenacila), um conhecido inibidor de a PLA2s que também é capaz de suprimir os mecanismos farmacológicos próprios desta proteína, foram obtidos e submetidos a experimentos de difração de raios-X. A estrutura cristalina da BthA-I foi elucidada a 1,9 Å de resolução e o processamento dos dados experimentais revelou a presença de dois monômeros na unidade assimétrica. A análise estrutural destes monômeros revelou que a BthA-I dimérica possui uma conformação oligomérica distinta das demais PLA2s, onde os sítios catalíticos da molécula encontram-se expostos ao solvente. Apesar das condições de cristalização da BthA-I nativa, é possível sugerir que a forma dimérica desta proteína seja aquela encontrada predominantemente in vivo. A determinação estrutural da BthA-I quimicamente modificada pelo pBPB a 1,85 Å de resolução revelou a presença inequívoca de moléculas de inibidor covalentemente ligadas aos resíduos His48, localizados nos sítios de ligação de substrato dos dois monômeros do complexo. Três regiões do complexo BthA-I/pBPB são estruturalmente alteradas pela ligação do inibidor: os loops de ligação de Ca++ e as regiões de β-wing C-terminais. Estas mudanças estruturais são provavelmente derivadas da conformação oligomérica apresentada pelo complexo, cuja disposição pode explicar a supressão das atividades farmacológicas da BthA-I... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work were performed experimental and theoretical structural studies with BthA-I and BjussuMP-I, two proteins from the venom of Bothrops jararacussu. BthA-I, a high catalytic acidic phospholipase A2 (PLA2) with platelet aggregation inhibition, anticoagulant and hypotensive properties, was crystallized in its native form and complexed to pBPB (p-bromophenacyl bromide), a well-known inhibitor of PLA2s which also abolishes the biochemical activities of this protein. The crystal structure of BthA-I native was solved at 1.9 Å and the data processing showed two monomers in the unit cell. A novel dimeric conformation of this native protein with the active sites of the monomers exposed to the solvent was observed. Despite of the conditions used in the crystallization experiments, it is possible to suggest that the dimeric form must be predominantly found in vivo. The structural determination of BthA-I chemically modified by pBPB at 1.85 Å revealed the unambiguous identification of inhibitor molecules covalently bound to residues His48 in the substrate-binding clefts of both monomers of the complex. Three regions of BthA-I/pBPB complex are structurally altered by the binding of the inhibitor: the Ca++ -binding loops, the β-wings and the C-terminal regions. These structural changes are probably derived from the oligomeric state presented by the complex, which could explain the abolition of pharmacological activities of the pBPB-chemically modified BthA-I. A residue present in the "pancreatic" loops (Lys69), which is usually related to the anticoagulant effect of the BthA-I, is in the dimeric interface of the complex, supporting this hypothesis regarding the abolition of this and other activities caused by pBPB. The theoretical BjussuMP-I catalytic domain, a P-III metalloprotease, was built through folding recognition... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor
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Novos enfoques no estudo dos mecanismos de ação de metaloproteinases e outras proteínas tóxicas envolvidas no envenenemento ofídico e lonômico

Pinto, Antonio Frederico Michel January 2006 (has links)
Venenos e outras secreções animais vêm sendo explorados como fonte de substâncias ativas na hemostasia em mamíferos. Esses princípios ativos, com funções primárias na alimentação e defesa, afetam elementos chave de quase todas as vias fisiológicas animais, tendo um enorme potencial como base para o desenvolvimento de novas drogas. No envenenamento ofídico, hemorragias locais e sistêmicas são causadas em grande parte pela ação de metaloproteinases hemorrágicas presentes nos venenos (SVMPs). Os estudos com metaloproteinases até então descritos baseiam-se principalmente em metodologias bioquímicas clássicas. Neste trabalho, as metaloproteinases e suas interações com outras proteínas são abordadas através de técnicas de dinâmica molecular, ressonância plasmônica de superfície e proteômica quantitativa. O perfil de inibição da atividade proteolítica de SVMPs por inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs) foi avaliado. Experimentos de modelagem e dinâmica molecular mostraram similaridades nas bases moleculares da interação das TIMPs tanto com SVMPs quanto com metaloproteinases endógenas (MMPs e ADAMs), seus alvos fisiológicos. O domínio rico-em-cisteínas das SVMPs da classe PIII está envolvido na interação com proteínas de matriz extracelular. Os sítios de interação do domínio rico-em-cisteínas de jararragina com fator de von Willebrand (vWF) foram identificados por ressonância plasmônica de superfície. Um modelo de interação entre os domínios das duas proteínas foi proposto. Considerando a presença de domínios A de vWF em diversas proteínas de matriz extracelular, o domínio de rico-em-cisteínas funcionaria direcionando as metaloproteinases para substratos específicos, promovendo hemorragia. Além disso, através de uma metodologia de proteômica quantitativa, foi verificada pela primeira vez a ação proteolítica de metaloproteinases em proteínas de matriz extracelular íntegra de células em cultura. Já no envenenamento lonômico, um quadro clínico hemorrágico é observado apesar da ausência de metaloproteinases no veneno. O estudo de proteínas tóxicas da lagarta Lonomia obliqua baseia-se no isolamento e caracterização bioquímica dos princípios ativos relacionados com aspectos da patologia do envenenamento. Nos últimos anos, esses estudos se focaram em uma única secreção da lagarta, identificando o seu potencial pró-coagulante, fibrin(ogen)olítico, hemolítico, edematogênico e nociceptivo. Neste trabalho, foram identificadas diferenças quali-quantitativas em quatro secreções venenosas de L. obliqua. A diferente participação de cada uma dessas secreções durante o contato com as lagartas pode levar a grande variabilidade de sintomas e gravidade do acidente. Utilizando a metodologia de microarranjos de DNA, analisamos o efeito do veneno da lagarta no padrão de expressão gênica de células em cultura e identificamos a expressão aumentada de genes possivelmente relacionados ao quadro clínico do envenenamento. Proteínas potencialmente tóxicas de L. obliqua descritas em um estudo de transcriptoma, juntamente com os dados de expressão gênica aqui demonstrados possibilitam uma maior compreensão dos efeitos do veneno na hemostasia e sintomas do lonomismo. / Animal venoms and other secretions have been explored as source of active substances on the mammal hemostasis. These active principles, which have primary function in feeding and defense, act on key elements of almost all physiologic pathways and have an enormous potential in the development of new therapeutic drugs. In ophidic envenomations, local and systemic hemorrhages are caused mainly by the action of hemorrhagic metalloproteinases from the venom (SVMPs). Previous studies with metalloproteinases were based mostly in classical biochemical methodologies. Here, the metalloproteinases and their interactions with other proteins were examined by molecular dynamics, surface plasmon resonance and quantitative proteomics methodologies. The inhibition profile of the SVMPs proteolytic activity by tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs) was evaluated. Modeling and molecular dynamics procedures showed similarities in the molecular bases of the interaction of TIMPs both with SVMPS and endogenous metalloproteinases (MMPs and ADAMs). PIII SVMP cysteine-rich domain is involved in the interaction with extracellular matrix proteins. Using surface plasmon resonance, we identified the interaction sites between jararhagin cysteine-rich domain and von WIllebrand factor (vWF). An interaction model of these two proteins was proposed. Considering the presence of vWF A domains in several matrix proteins, the cysteine-rich domain probably works targeting the metalloproteinases to specific substrates, leading to hemorrhage. Moreover, using a quantitative proteomic approach, it was shown for the first time the metalloproteinases proteolytic action upon organized extracellular matrix proteins in culture cells. In lonomic envenomation, a hemorrhagic clinical profile is observed regardless the absence of metalloproteinases. The caterpillar's toxic proteins studies are based on isolation and biochemical characterization of active principles related to the patophisiology of the envenomation. In the last few years, these studies were focused on one caterpillar's secretion, containing pro-coagulant, fibrin(ogen)olytic, hemolytic, edematogenic and nociceptive activities. In this work, we identified quali-quantitative differences in four Lonomia obliqua venomous secretions. The different participation of each of these secretions during the accident could lead to the variability of symptoms and severity of the envenomation. Using a microarray methodology, we analyzed the effects of the caterpillar venom on the cultured cells gene expression profile and identified increased expression of genes possibly involved with the clinical manifestations. Potentially toxic proteins from L. obliqua identified in a transcriptome study, together with the gene expression data described here allow a better understanding of the venom effects in hemostasis during lonomism.
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Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.
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Metaloproteases de carrapato : perspectiva de antígeno para vacina

Ali, Abid January 2014 (has links)
As metaloproteases (MPs) são proteínas que participam em diversos processos fisiológicos e patológicos. Neste trabalho, relatamos a identificação de MPs em três carrapatos de importância econômica: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) e Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). O perfil transcricional em vários tecidos e fases de vida mostra que MPs são transcritas em glândula salivar durante a alimentação de fêmeas e não são transcritos no macho (com exceção de uma MP, BrRm-MP4) e ovos, o que sugere que esta família da proteínas são componentes funcionais necessários para interferir nas defesas do hospedeiro, apoiando o processo de hematofagia. A presença de um sítio de ligação de zinco, uma dobra“Met-turn” e um domínio rico em cisteína na região C-terminal indica que todas os transcritos obtidos codificam para a família de MPs reproplisina (metzincina). Uma das MPs de R. microplus (BrRm-MP4) foi selecionada para uma investigação mais aprofundada quanto ao potencial como um antígeno vacinal, devido ao seu padrão de transcrição ubíquos e devido àprevisão in silico de epítopos imunogênicos, em comparação com as demais MPs identificadas. BrRm-MP4 recombinante (rBrRm-MP4) foi expressa em Escherichia coli e testadas como um antígeno contra infestação de R. microplus. Imunoblot mostrou que o soro de bovinos imunizados com rBrRm-MP4 reconhece BrRm-MP4 da glândula salivar, ovário e larvas de R. microplus. Comparando com o controle, a vacinação com rBrRm-MP4 proporcionou uma redução de 43% no número de fêmeas adultas, redução de 14,80% na postura de ovos e redução de 17,53 % na capacidade de eclosão da larva, realizando um proteção total de 60% estatisticamente significativa. Os resultados indicam que rBrRm-MP4 é um potencial candidato a ser incluído como imunógeno em uma vacina anti-carrapato. / Metalloproteases (MPs) are proteins participating in several physiological and pathological processes. Here, we report the identification of MPs in three economically important ticks: Ixodes persulcatus (Ip-MPs), Rhipicephalus sanguineus (Rs-MPs) and Rhipicephalus microplus (BrRm-MPs). Transcriptional profile in various tissues and life stages revealed the presence of all MPs transcripts in salivary glands during feeding stages and absence in males (except one MP, BrRm-MP4) and eggs, suggesting this family proteins are functional components required to interfere with host defenses, supporting tick hematophagy. The presence of a zinc binding site, a “Met-turn” and C-terminal cysteine rich domain indicates all obtained transcripts encode for proteins belonging to the reproplysin (metzincin) family of MPs. A R. microplus MP (BrRm-MP4) was selected for further investigation concerning its potential as a vaccinal antigen due to its ubiquitous transcription pattern and in silico prediction of immunogenic epitopes, comparing to other obtained MPs. Recombinant BrRm-MP4 (rBrRm-MP4) was expressed in Escherichia coli and tested as an immune-protective antigen against R. microplus infestation. Immunoblot showed specific antibodies against rBrRm-MP4 in immunized calves sera. Sera from immunized calves recognized BrRm-MP4 in R. microplus salivary gland, ovary and larvae. Comparing to ticks reared non-vaccinated calves, rBrRm-MP4 provided 43% reduction in adult female number, 14.80% reduction in egg laying and 17.53% reduction in larva hatching capacity, performing an overall 60% statistically significant protection. We assume rBrRm-MP4 is a potential candidate to be included as immmunogen for further development in an anti-tick vaccine.

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