Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-05Bitstream added on 2014-06-13T20:35:40Z : No. of bitstreams: 1 marcos_cm_me_arafcf.pdf: 2508470 bytes, checksum: bc1a1f1c4040c405fe6c122e87b067ff (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de géis de eletroforese bidimensional do cell-free do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 54 kDa e pI 5,6 e mostraram homologia com enolase de Paracoccidioides brasiliensis e outros fungos. A proteína foi purificada através de eletroeluição e utilizada para a produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia de fluorescência não foi possível observar a localização exata desta proteína, apenas que se encontra aparentemente distribuídapor todo o fungo, foi possível verificar alterações no citoesqueleto de pneumócitos durante a infecção por P. brasiliensis. A localização foi confirmada por microscopia imunoeletrônica a presença de enolase foi detectada principalmente na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e também no citoplasma, ela se demonstrou mais expressa quando este fungo foi cultivado em meio onde houve acréscimo de sangue de carneiro e durante a situação de infecção a pneumócitos. A enolase purificada foi capaz de se ligar a fibronectina, fibrinogênio, laminina, plasminogênio, colágenos tipo I e IV. Foi confirmado que a ligação desta proteína à pneumócitos é influenciada pela sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp contida provavelmente nos receptores da matriz extracelular presentes na célula do hospedeiro. Essas informações indicam que a enolase possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do... / Paracoccidioides brasiliensis is an important human pathogen that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with a wide distribution in Latin America. The ability of P. brasiliensis to cause not only human diseases but also mycoses with a variety of clinical manifestations from localized forms to the disseminated disease progressing to lethality, probably depends on the relationship between the virulence of the fungus, its ability to interact with and to invade the surface structures of the host and the immune response of the host. The adhesion of the pathogen leads to the recognition of carbohydrate and protein ligands on the surface of the host cell or proteins of the extracellular matrix (ECM). The large number of tissue types that fungi can colonize and infect suggests that they use a variety of surface molecules for adhesion.Understanding the interactions between P. brasiliensis and the host tissue depends on the study of the different steps of the process of colonization, especially adhesion, in which the pathogen recognizes ligands on the surface of host cells. This study aimed to verify the role of enolase in the host cell-fungus interaction and the ability of enolase to bind to extracellular matrix components, to determine its subcellular localization. The data revealed that fibronectin is the major ligand of enolase. Evaluation of the location of enolase at an ultrastructural level revealed that it is distributed in various cellular compartments, but at a high level in the cell wall. This suggests that enolase performs additional functions related to the glycolytic pathway and also plays a role of adhesion in P. brasiliensis. Therefore, this study increases the knowledge about the characteristics of enolase and its influence on the binding process of P. brasiliensis

Resumo: A paracoccidioidomicose (PCM) é micose sistêmica causada pelos fungos dimórficos Paracoccidioides brasiliensis (espécies cripticas S1, PS2, PS3) e Paracoccidioides lutzii (Pb01-like espécies), endêmica na América Latina, principalmente no Brasil. A capacidade de causar micose com grande variedade de manifestações clínicas, desde formas localizadas até doença disseminada evoluindo para letalidade, depende da virulência do fungo e de sua habilidade em interagir com as estruturas superficiais do hospedeiro e invadi-las, e a resposta imunológica deste último. P. brasiliensis tem a capacidade de aderir e invadir células epiteliais de linhagens humanas e animais e o processo de invasão do fungo afeta a estrutura do citoesqueleto, interferindo em aspectos morfológicos da actina, tubulina e citoqueratina, indicando a participação funcional dos microfilamentos e microtúbulos neste mecanismo. Em estudos prévios foi identificada adesina de P. brasiliensis de 30 kDa, ligante de laminina, caracterizada como uma proteína pertencente à família 14-3-3. O objetivo deste trabalho foi produzir a proteína recombinante, verificar o papel desta na interação do fungo com células epiteliais pulmonares de linhagem contínua. Para tanto, com o anticorpo anti-14-3-3 foi verificada a sua localização, tanto nas formas leveduriformes do fungo como no processo de interação. A clonagem foi realizada em vetor de clonagem pCR2.1-TOPO - pET32a, para permitir a expressão da proteína Pb14-3-3r com cauda de histidina no espaço periplasmático de E. coli. A fração periplasmática foi purificada por cromatografia de afinidade seguida de eletroeluição. Foi possível verificar alteração do padrão de distribuição de actina quando as células foram tratadas com a proteína recombinante e nativa. A proteína 14-3-3 apresenta distribuição ubíqua na... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (cryptic species S1, PS2, PS3) and Paracoccidioides lutzii (Pb01-like species), endemic in Latin America, mainly Brazil. The ability to cause mycosis with a variety of clinical manifestations, from localized forms to disseminated disease progressing to lethality, possibly depends on the relationship between the virulence of these, the ability to interact with the surface structures of the host and invade them, and this immune response. P. brasiliensis has the ability to adhere and o invade human and animal epithelial cells lineage and the process of invasion of the fungus affects the structure of the cytoskeleton, morphological interfering with actin, tubulin and cytokeratin morphology, indicating the functional participation of microfilaments and microtubules in this mechanism. Previous study identified a 14-3-3 protein (30 kDa) that acts as a P. brasiliensis adhesin (laminin ligand) and this protein contributes to the virulence of this important fungal pathogen. The objective of this study was to produce recombinant protein, to verify the role of the interaction of the fungus with lung epithelial cells of continuous lineage. To do so, with the anti-14-3-3 was verified its location, both in the forms of the fungus and yeast in the process of interaction. The cloning was done in cloning vector pCR2.1-TOPO - pET32a to allow expression of protein Pb14-3-3r-tailed histidine periplasmic space of E. coli. The periplasmic fraction was purified by affinity chromatography followed by electroelution. It was possible to see change in the pattern of distribution of actin when cells were treated with recombinant and native protein. The 14-3-3 protein has ubiquitous distribution in yeast cells of P. brasiliensis (strain 18/S1) have a certain... (Complete abstract click electronic access below) / Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Alexandra Ivo de Medeiros / Banca: Clayton Luiz Borges / Banca: Oscar Zaragoza Hernandez / Doutor

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Carlos Alberto de Oliveira / Banca: Alexandre Batista Duarte / Banca: José Carlos Rebuglio Vellosa / Banca: José Maurício Sforcin / Resumo: esporotricose é uma micose subcutânea causada pelo fungo dimórfico Sporothrix schenckii, apresentando em geral, lesões cutâneas com proliferação via vasos linfáticos especialmente em pacientes imunocomprometidos, o que pode levar a doença sistêmica. Os macrófagos têm um papel importante na resposta imune inata contra diversos patógenos e dependendo do estimulo recebido podem ser polarizados em M1 e M2, os quais apresentam propriedades distintas, sendo que os primeiros possuem atividades proinflamatórias e o segundo anti-inflamatória. Desta forma, o objetivo do trabalho foi verificar a participação das populações de macrófagos M1 e M2 através da avaliação das citocinas IL-12, IL-23, IL-10 e TGF-β, da produção de NO e da atividade da enzima arginase, juntamente com a avaliação fenotípica dessas populações durante todo período experimental. Os resultados revelaram que as células do exsudato peritoneal dos camundongos dos grupos infectados quando desafiadas ex vivo com o exoantígeno e o extrato lipídico foram capazes de levar a produção de IL-12, IL-10 e TGF- β durante todo o período experimental. A produção de IL-23 ocorreu na 2ª e 4ª semana mediante o desafio com o exoantígeno e em todo período experimental com o EL. A fenotipagem revelou a presença de macrófagos tanto M1 quanto M2 durante todo o período experimental, com aumento da expressão do receptor CD206 (M2) no período tardio da infecção, o que explica a produção dos mediadores tanto inflamatórios (IL-12 e IL-23) quanto anti-inflamatórios (IL-10 e TGF- β) encontrados durante toda a cinética. Além das citocinas também foi observada a produção de óxido nítrico e a atividade da enzima arginase. Desta forma os resultados encontrados evidenciam a participação dos macrófagos M1 e M2 durante a esporotricose, uma vez que os M1... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by the dimorphic fungus, Sporothrix schenckii, generally presenting skin lesions with spread via lymphatic vessels, especially in immunocompromised patients, what can lead to systemic disease. Macrophages play an important role in innate immune response against various pathogens and, depending on the eliciting signals, macrophage can be polarized in M1 and M2, which presents distinct proprieties, so macrophage activation can be either proinflammatory or antiinflammatory. Thereby, the aim of this study was to evaluate the role of macrophage populations M1 and M2, through the evaluation of IL-12, IL-23, IL-10 and TGF-β, NO production and activity of the enzyme arginase, along with phenotypic evaluation of these populations throughout the experimental period. The results showed that peritoneal exudate cells of infected mice groups, when challenged ex vivo with exoantigen and lipid extract, were able to lead to production of IL-12, IL- 10 and TGF-β throughout the experimental period. The production of IL-23 occurred in the 2nd and 4th week through the challenge with exoantigen and throughout the experimental period with the lipid extract. Phenotyping revealed the presence of both macrophages, M1 and M2, throughout the experimental period, with increased expression of the receptor CD206 (M2) in the late infection period, which could explain the production of proinflammatory (IL-12 and IL-23) and anti-inflammatory (IL-10 and TGF-β) mediators found throughout the kinetic, and the nitric oxide production and activity of the arginase enzyme. M1 macrophages are important during sporotrichosis, they have microbicidal activity and are responsible for releasing inflammatory mediators in an attempt to eliminate the fungus Sporothrix schenckii, while the M2 found during... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador : Iracilda Zeppone Carlos / Banca: Fernanda de Freitas Anibal / Banca: Angela Maria Victoriano de Campos Soares / Banca: Ana Marisa Fusco Almeida / Banca: Danielle Cardoso Geraldo Duharte / Resumo: A descoberta recente das células T "helper" 17 (Th17) e de inúmeros outros subtipos de células Th expandiu o paradigma Th1/Th2, que persistia desde sua introdução por Mosmann e colaboradores em 1986, mas que não fornecia explicação suficiente para uma série de condições homeostáticas e patológicas. Definidas caracteristicamente pela expressão do fator de transcrição "retinoic acid receptor-related orphan receptor" γt (RORγt) e pela produção de interleucina (IL)- 17, as células Th17 são potentes indutoras de inflamação tecidual, com reconhecido papel no combate a bactérias e fungos extracelulares e na manutenção da homeostasia em mucosas. Apesar disso, o interesse pelo seu estudo veio do papel central que desempenham no desenvolvimento de condições inflamatórias crônicas importantes como esclerose múltipla, artrite reumatóide e doença de Crohn, razão pela qual têm sido alvo de novas e promissoras terapias especificamente voltadas para o seu bloqueio. Nesse sentido, tem importância profilática a identificação de patógenos oportunistas cuja eliminação dependa da resposta Th17 e que possam representar risco a pacientes submetidos a terapias anti-Th17. Conforme mostramos aqui pela primeira vez, este é o caso do fungo Sporothrix schenckii, causador da esporotricose, e que até agora apresentava importância clínica quase que exclusivamente limitada a pacientes imunodeprimidos, quer seja como consequência do tratamento farmacológico da rejeição a transplantes ou contra o câncer, ou por imunodeficiências primárias ou adquiridas diversas. Diante disso, o objetivo desse estudo foi avaliar a participação da resposta Th17 na infecção por S. schenckii e qual o grau de importância desta para a capacidade do animal eliminar a infecção. Para isso, nós desenvolvemos um modelo de infecção sistêmica por S. schenckii em camundongos e avaliamos o desenvolvimento das células e a produção de ... / Abstract: The discovery of T helper 17 (Th17) cells, along with many other Th cell subsets in the recent years, has expanded the Th1/Th2 paradigm that had persisted since its proposition by Mosmann and colleagues in 1986. Defined by the characteristic expression of the transcription factor retinoic acid receptor-related orphan receptor γt (RORγt) and production of interleukin (IL)-17, Th17 cells are powerful inducers of tissue inflammation with a recognized role against extracellular bacteria and fungi and in the maintenance of mucosal homeostasis. Despite all this, the interest in their study came from the pivotal role they play in the development of major chronic inflammatory conditions such as multiple sclerosis, rheumatoid arthritis and Crohn's disease, reason why they have been the target of promising new therapies specifically aimed at their blockade. Accordingly, the identification of opportunistic pathogens whose clearance relies on the Th17 response is of huge prophylactic importance, for they could become a risk for patients subjected to anti-Th17 therapies. As shown here for the first time, this applies to Sporothrix schenckii, the agent of sporotrichosis, whose clinical importance was, until now, almost exclusively limited to immunodepressed individuals, either as a consequence of pharmacological treatment against transplant rejection or cancer, or due to various primary or acquired immunodeficiency disorders. In light of the above, the aim of this study was to assess the role of the Th17 response in the S. schenckii infection and its importance for the animal's ability to eliminate the infection. In order to do that, we developed a murine model of S. schenckii systemic infection and assessed the development and effector cytokines production from Th17 cells. Additionally, the Th17 response's importance for infection control was assessed by treating mice with an anti-IL-23p19 neutralizing monoclonal antibody, which was aimed at ... / Doutor

Orientador: Jose Vassallo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T10:59:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cotta_AnaCristinadaSilva_D.pdf: 741571 bytes, checksum: 3587b25cef0824942ecc681152c99878 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Micose fungóide (MF) é a forma mais comum de linfoma cutâneo de células T. Nos estágios iniciais, pode mimetizar dermatites crônicas. MF é, geralmente, CD3+ e CD4+. CD7 é expresso em cerca de 90% dos linfócitos T CD4+ e está, freqüentemente, ausente nas células T malignas. O objetivo deste estudo foi avaliar a utilidade da detecção imuno-histoquímica de CD3 e CD7 (clone CBC.37) no diagnóstico diferencial de MF e dermatites benignas. Todos os casos foram submetidos a um painel imuno-histoquímico constituído pelos anticorpos CD3, CD7, CD20, CD4, CD8 e CD30. Foram selecionados 42 pacientes. Correlação clínico-patológica havia estabelecido o diagnóstico de MF em 31 e, infiltrações linfocitárias cutâneas benignas, em 11. Foi realizada avaliação semi-quantitativa da porcentagem de células coradas às reações imuno-histoquímicas para todos os anticorpos avaliados, tanto em visão panorâmica de menor aumento, quanto em 10 campos consecutivos em maior aumento. Para análise estatística, foi utilizado o teste t de Student. As médias das porcentagens de células CD3 positivas foram similares em pacientes com MF e dermatites benignas, respectivamente, 86 (+/-9)% versus 79 (+/-26)% (p=0,807). Já a média das porcentagens de células CD7 positivas foi de 54 (+/-32)% nos pacientes com MF e de 74 (+/-22)% nas dermatites benignas (p=0,048). A avaliação semi-quantitativa revelou perda considerável do CD7 em relação ao CD3 nos pacientes com MF. A média de células coradas na MF foi de 86 (+/-9)% para CD3 e 54 (+/-32)% para CD7 (p<0,001), e, nas dermatites benignas, 79 (+/-26)% para CD3 e 74 (+/-22)% para CD7 (p=0,669). Concluímos que o estudo do CD7 pode ser ferramenta valiosa para a distinção entre inflamação e neoplasia, nas desordens linfoproliferativas da pele / Abstract: Mycosis fungoides (MF) is the most common form of primary cutaneous T-cell lymphoma. In early stage, it may mimic benign dermatoses both, on clinical and histological basis. MF usually expresses CD3 and CD4 (T-cell) markers. CD7 is expressed on about 90% of CD4+ T cells and is often deficient on malignant T cells. Thus, CD7 is of potential aid in the evaluation of the nature of dermal lymphoid infiltrates. The aim of this study was to evaluate the usefulness of immunohistochemical detection of T-cell markers on paraffin-embedded sections, CD3 and CD7 (clone CBC.37) in the differential diagnosis of MF and benign dermatoses. All cases were submitted to CD3, CD7, CD20, CD4, CD8, and CD30 panel of antibodies. Forty-two patients with diffuse dermal T-lymphocytic infiltrates were selected. Previous clinicopathologic correlation and follow-up had established the diagnosis of MF in 31 patients and benign dermatoses in 11. A semiquantitative evaluation for the percentage of stained cells on immunohistochemistry was performed for all antibodies in low power and 10 consecutive high power fields. Student t test was used for statistical analysis. The mean percentage of CD3 stained cells was similar in MF and benign dermatoses patients, respectively 86 (+/-9)% versus 79 (+/-26)% (p=0.807). On the other hand, the mean percentage of CD7 stained cells was 54 (+/-32)% in patients with MF, and 74 (+/-22)% in patients with benign dermatoses (p=0.048). A semiquantitative evaluation revealed a considerable loss of CD7 immunolabeling in comparison with CD3 in patients with MF. Mean value of stained cells in MF was 86 (+/-9)% for CD3 and 54 (+/-32)% for CD7 (p< 0.001) while in benign dermatoses it was 79 (+/-26)% for CD3 and 74 (+/-22)% for CD7 (p= 0.669). We concluded that CD7 study may represent a valuable tool in the distinction between inflammation and neoplasia in T lymphoproliferative skin disorders / Doutorado / Anatomia Patologica / Doutor em Ciências Médicas

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-10-19Bitstream added on 2014-06-13T19:40:41Z : No. of bitstreams: 1 scorzoni_l_dr_arafcf.pdf: 3179979 bytes, checksum: 1e778fd453c60b43b64a943d7b3e82a0 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / A incidência de infecções fúngicas oportunistas tem aumentado nas últimas décadas devido à crescente proporção de pacientes imunocomprometidos em nossa sociedade. Candida krusei é descrita como um dos agentes de infecções fúngicas em pacientes susceptíveis. Embora sua prevalência seja baixa entre as infecções fúngicas (2-7%), a resistência intrínseca ao fluconazol torna esta levedura importante no contexto relacionado à epidemiologia e na procura de novas alternativas terapêuticas. Modelos de organismos não mamíferos são alternativas viáveis para estudar a virulência de fungos e eficácia de drogas. Neste trabalho utilizou-se Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans como modelos para estudar a virulência e avaliar a eficácia antifúngica de anfotericina B e fluconazol durante a infecção por C. krusei, bem como cultura de macrófagos e testes de agrotransformação. No modelo de G. mellonella foi realizada a caracterização completa da interação de C. krusei por meio da determinação do índice de fagocitose, quantificação da densidade hemocitária, melanização, estudos de filamentação, carga fúngica e histopatologia. Além disso, foi realizado estudo de eficácia antifúngica entre G. mellonella e C. elegans mostrando resultados compatíveis entre os dois modelos. Além disso, utilizou-se cultura de macrófagos RAW 267.7 para verificar o efeito das duas drogas sobre a fagocitose e produção de citocinas quando as células foram infectadas com C. krusei. Não houve alterações quanto à fagocitose nesse modelo, entretanto a produção de TNF-α mostrou-se excessivamente aumentada com o tratamento com anfotericina sugerindo que além do efeito direto da droga existem também mecanismos de imunomodulação envolvidos nessa... / The incidence of opportunistic fungal infections has increased in the last decades due to the increasing proportion of immunocompromised patients. Candida krusei is described as one of the agents of fungal infections in susceptible patients. Although its prevalence is low among fungal infections (2-7%), the intrinsic resistance to fluconazole makes this yeast important in this context related to epidemiology and new therapies. Models of non-mammalian are viable alternatives to study virulence of fungi and drug efficacy. In this work we used Galleria mellonella and Caenorhabditis elegans as models for studying virulence and evaluate the efficacy of antifungal agent’s amphotericin B, fluconazole and caspofungin during infection by C. krusei, and C. albicans, as well as, macrophages and agrotransformation studies. The model of G. mellonella was done full characterization of the interaction with C. krusei by determining the phagocytosis index, measuring the density haemocytic, melanization, filamentation studies, fungal burden and histopathology. In addition, we conducted a study of antifungal efficacy between G. mellonella and C. elegans showing compatible results between the two models. Furthermore, we used macrophage culture RAW 267.7 to determine the effect of drugs amphotericin B and fluconazole on phagocytosis and production of cytokines when the cells were infected with C. krusei and C. albicans. There was no change on the phagocytosis in this model, however, the production of TNF-α was shown to be excessively increased with treatment with amphotericin suggesting that in addition to the direct effect of the drug, immunomodulation mechanisms are also involved in this response. The construction of transformants... (Complete abstract click electronic access below)

Orientador : Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Juliana Campos Junqueira / Banca: Fernando Rogério Pavan / Banca: Patricia Albuquerque de Andrade Nicola / Banca: Dulce Helena Siqueira Silva / Resumo: O aumento de micoses invasivas e o desenvolvimento de mecanismos de resistência de algumas espécies de fungos, frente aos fármacos utilizados na terapia, têm sido preocupante. O tratamento antifúngico, geralmente é agressivo e o surgimento da resistência antifúngica acrescenta dificuldades adicionais no tratamento dessas infecções. Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, e afetam principalmente pacientes imunodeprimidos. Nesse trabalho foi realizada a caracterização morfológica e da virulência de três isolados clínicos de C. neoformans e dois isolados ambientais de C. gattii em Galleria mellonella, além da análise do nível de expressão dos genes MDR1 e AFR1 envolvidos no funcionamento de bomba de efluxo, através da quantificação relativa por PCR (polimerase chain reaction) em tempo real. Uma vez esses genes quantificados, esses isolados foram usados na prospecção de moléculas sintéticas para verificação da atividade inibitória dos genes selecionados, após o contato com as mesmas. Os isolados foram classificados como sensível (26S), sensibilidade intermediária (27I) e resistente (30R) da espécie neoformans e da espécie C. gattii, um foi resistente (118R) e outro sensível (CL), in vitro, a fluconazol. As moléculas selecionadas para os testes foram o ácido gálico e seus derivados sintéticos, e os melhores resultados observados foram obtidos a partir dos galatos de alquila G11, G12, G14, G15, G16 e G17, apresentando ótima atividade antifúngica contra os isolados testados, em especial os galatos G14, G16 e G17, obtendo ótima atividade antifúngica. O galato de n-dodecila (G16), foi selecionado para os demais testes apresentando atividade aditiva no teste de sinergismo, quando utilizado em associação com fluconazol, reduzindo os valores de CIM para o mesmo, o que mostra a possível... / Abstract: The increase of invasive mycoses and the development of antifungal resistance by some fungi species have been worrying. The antifungal treatment is usually aggressive and inefficient, and the emergence of antifungal resistance increases the difficulties in treating these fungi infections.Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii are the main etiologic agents of cryptococcosis andespecially affect immunocompromised patients. In this work the Galleria mellonella, was used to perform the morphologic characterization as well as determine the virulence of three sequential clinical isolates of C. neoformansand twoisolates environmental of C. gattii. In addition, was held the analysis of genes expressions (MDR1, ERG11 and AFR1), that are involved in efflux pumps and ergosterol synthesis, by real time PCR (polimerase chain reaction) assay. After these characterizations the isolates were used in the prospecting of synthetic molecules to verify the inhibitory activity of selected genes. After incubation in vitro with fluconazole the C.neoformans isolates were classified as sensitive (26S), intermediate sensitivity (27I) and resistant (30R), and the C. gattiiisolates were resistant (118R) and the other sensitive (LC). The galic acid molecules and their synthetic derivatives were tests against C.neoformans and C. gattii isolates.The best results were obtained from alkyl gallates G11, G12, G14, G15, G16 and G17 which shows a great antifungal activity, especially G14, G16 e G17. The gallate n-dodecyl (G16), was select to others tests once presented additive activity in synergism test with fluconazole, decreasing the MIC values. The gene expression assay shows that both isolates expressed MDR1 and AFR1 (encoding efflux pumps), and the G16 was capable to inhibit these genes which makes this molecule promising for inhibiting efflux. With virulence assays using the G. mellonella was possible ... / Doutor

Resumo: Paracoccidioides brasiliensis é um importante patógeno humano que causa a paracoccidioidomicose (PCM), uma micose sistêmica com ampla distribuição na América Latina. A adesão e invasão de células são eventos cruciais envolvidos na infecção e disseminação do patógeno. Além disso, patógenos utilizam suas moléculas de superfície para se ligar aos componentes da matriz extracelular para estabelecer a infecção. Uma proteína antigênica de P. brasiliensis foi isolada de géis de eletroforese bidimensional do cell-free do fungo e caracterizada. Peptídeos foram obtidos da proteína de 54 kDa e pI 5,6 e mostraram homologia com enolase de Paracoccidioides brasiliensis e outros fungos. A proteína foi purificada através de eletroeluição e utilizada para a produção de anticorpo policlonal em coelho. Por microscopia de fluorescência não foi possível observar a localização exata desta proteína, apenas que se encontra aparentemente distribuídapor todo o fungo, foi possível verificar alterações no citoesqueleto de pneumócitos durante a infecção por P. brasiliensis. A localização foi confirmada por microscopia imunoeletrônica a presença de enolase foi detectada principalmente na parede celular de leveduras de P. brasiliensis e também no citoplasma, ela se demonstrou mais expressa quando este fungo foi cultivado em meio onde houve acréscimo de sangue de carneiro e durante a situação de infecção a pneumócitos. A enolase purificada foi capaz de se ligar a fibronectina, fibrinogênio, laminina, plasminogênio, colágenos tipo I e IV. Foi confirmado que a ligação desta proteína à pneumócitos é influenciada pela sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp contida provavelmente nos receptores da matriz extracelular presentes na célula do hospedeiro. Essas informações indicam que a enolase possivelmente contribui para a adesão do microrganismo aos tecidos do ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Paracoccidioides brasiliensis is an important human pathogen that causes paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis with a wide distribution in Latin America. The ability of P. brasiliensis to cause not only human diseases but also mycoses with a variety of clinical manifestations from localized forms to the disseminated disease progressing to lethality, probably depends on the relationship between the virulence of the fungus, its ability to interact with and to invade the surface structures of the host and the immune response of the host. The adhesion of the pathogen leads to the recognition of carbohydrate and protein ligands on the surface of the host cell or proteins of the extracellular matrix (ECM). The large number of tissue types that fungi can colonize and infect suggests that they use a variety of surface molecules for adhesion.Understanding the interactions between P. brasiliensis and the host tissue depends on the study of the different steps of the process of colonization, especially adhesion, in which the pathogen recognizes ligands on the surface of host cells. This study aimed to verify the role of enolase in the host cell-fungus interaction and the ability of enolase to bind to extracellular matrix components, to determine its subcellular localization. The data revealed that fibronectin is the major ligand of enolase. Evaluation of the location of enolase at an ultrastructural level revealed that it is distributed in various cellular compartments, but at a high level in the cell wall. This suggests that enolase performs additional functions related to the glycolytic pathway and also plays a role of adhesion in P. brasiliensis. Therefore, this study increases the knowledge about the characteristics of enolase and its influence on the binding process of P. brasiliensis / Orientador: Ana Marisa Fusco Almeida / Coorientador: Maria José Soares Mendes Giannini / Banca: Márcia Aparecida Silva Graminha / Banca: Eduardo Bagagli / Mestre

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:28Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-28. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:40Z : No. of bitstreams: 1 000851921.pdf: 11886045 bytes, checksum: 1cf15c01de888d44bc38aeeab19c7d88 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O aumento de micoses invasivas e o desenvolvimento de mecanismos de resistência de algumas espécies de fungos, frente aos fármacos utilizados na terapia, têm sido preocupante. O tratamento antifúngico, geralmente é agressivo e o surgimento da resistência antifúngica acrescenta dificuldades adicionais no tratamento dessas infecções. Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii são os principais agentes etiológicos da criptococose, e afetam principalmente pacientes imunodeprimidos. Nesse trabalho foi realizada a caracterização morfológica e da virulência de três isolados clínicos de C. neoformans e dois isolados ambientais de C. gattii em Galleria mellonella, além da análise do nível de expressão dos genes MDR1 e AFR1 envolvidos no funcionamento de bomba de efluxo, através da quantificação relativa por PCR (polimerase chain reaction) em tempo real. Uma vez esses genes quantificados, esses isolados foram usados na prospecção de moléculas sintéticas para verificação da atividade inibitória dos genes selecionados, após o contato com as mesmas. Os isolados foram classificados como sensível (26S), sensibilidade intermediária (27I) e resistente (30R) da espécie neoformans e da espécie C. gattii, um foi resistente (118R) e outro sensível (CL), in vitro, a fluconazol. As moléculas selecionadas para os testes foram o ácido gálico e seus derivados sintéticos, e os melhores resultados observados foram obtidos a partir dos galatos de alquila G11, G12, G14, G15, G16 e G17, apresentando ótima atividade antifúngica contra os isolados testados, em especial os galatos G14, G16 e G17, obtendo ótima atividade antifúngica. O galato de n-dodecila (G16), foi selecionado para os demais testes apresentando atividade aditiva no teste de sinergismo, quando utilizado em associação com fluconazol, reduzindo os valores de CIM para o mesmo, o que mostra a possível... / The increase of invasive mycoses and the development of antifungal resistance by some fungi species have been worrying. The antifungal treatment is usually aggressive and inefficient, and the emergence of antifungal resistance increases the difficulties in treating these fungi infections.Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii are the main etiologic agents of cryptococcosis andespecially affect immunocompromised patients. In this work the Galleria mellonella, was used to perform the morphologic characterization as well as determine the virulence of three sequential clinical isolates of C. neoformansand twoisolates environmental of C. gattii. In addition, was held the analysis of genes expressions (MDR1, ERG11 and AFR1), that are involved in efflux pumps and ergosterol synthesis, by real time PCR (polimerase chain reaction) assay. After these characterizations the isolates were used in the prospecting of synthetic molecules to verify the inhibitory activity of selected genes. After incubation in vitro with fluconazole the C.neoformans isolates were classified as sensitive (26S), intermediate sensitivity (27I) and resistant (30R), and the C. gattiiisolates were resistant (118R) and the other sensitive (LC). The galic acid molecules and their synthetic derivatives were tests against C.neoformans and C. gattii isolates.The best results were obtained from alkyl gallates G11, G12, G14, G15, G16 and G17 which shows a great antifungal activity, especially G14, G16 e G17. The gallate n-dodecyl (G16), was select to others tests once presented additive activity in synergism test with fluconazole, decreasing the MIC values. The gene expression assay shows that both isolates expressed MDR1 and AFR1 (encoding efflux pumps), and the G16 was capable to inhibit these genes which makes this molecule promising for inhibiting efflux. With virulence assays using the G. mellonella was possible ...

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:26:42Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-18Bitstream added on 2014-06-13T20:15:32Z : No. of bitstreams: 1 goncalves_ac_me_arafcf.pdf: 721947 bytes, checksum: 2ac1a94e8c25ed57ddda5d2effa6d4d6 (MD5) / A esporotricose é uma doença micótica causada pelo fungo termodimórfico Sporothrix schenckii. A resposta imune inata permite o reconhecimento de um amplo espectro de agentes patogênicos através dos PRRs, como os NLRs. Esses receptores, moléculas adaptadoras ASC e proteases caspase-1 formam os inflamassomas, complexo multiprotéico responsável pela maturação da IL-1β e IL-18. Evidências experimentais mostram que o inflamassoma tem importante papel na defesa antifúngica do hospedeiro, entretanto não há informações disponíveis sobre seu envolvimento em infecções causadas pelo S. schenckii. A indução da imunidade celular depende da interação entre antígenos, macrófagos e linfócitos, pois quando ativadas essas populações celulares liberam mediadores imunológicos, estabelecendo uma ligação entre as respostas imunológicas inata e a adaptativa. O objetivo deste trabalho foi avaliar o envolvimento do inflamassoma, por meio da determinação de caspase-1, e citocinas na resposta imunológica induzida pelo fungo S. schenckii em modelo experimental de esporotricose sistêmica utilizando camundongos Balb/c infectados e não infectados durante oito semanas. Os resultados encontrados mostraram que entre a 4ª e 6ª semanas de infecção ocorre imunossupressão do hospedeiro, com consequente agravamento da doença, pois a produção de NO permaneceu elevada neste período, assim como houve diminuição da liberação da IL-1β, IL-17, IL-23, citocinas pró-inflamatórias que agem protegendo o hospedeiro. Neste mesmo período, a diminuição do percentual de caspase-1 ativa, seguido pela menor liberação de IL-1β e IL-18, demonstrou que o inflamassoma estava com sua ativação inibida, colaborando para uma maior disseminação do patógeno, já que estão diretamente relacionada... / Sporotrichosis is a fungal disease caused by the thermo-dimorphic fungus Sporothrix schenckii. The innate immune response enables the recognition of a broad spectrum of pathogens through PRRs, such as NLRs. These receptor, ASC and caspase-1 form inflammasomes, complex multiprotein responsible for maturation of IL-1β and IL-18. Experimental evidence shows that inflammassome plays an important role in antifungal host defense, however there is no information available about his involvement in infections caused by S. schenckii. The induction of cellular immunity depends on the interactions between antigens, macrophages and lymphocytes because when activated, these cell populations release immune mediators to establishing a link between the innate and adaptive immune responses. The aim of this study was to evaluate the involvement of inflamassoma, through the determination of caspase-1, and cytokines in the immune response induced by the fungus S. schenckii in an experimental model of systemic sporotrichosis using Balb/c mice infected and uninfected for eight weeks. The results showed that between the fourth and sixth weeks of infection occurs immunosuppression of the host, with consequent worsening of the disease, because NO production encontrouse high during this period, as well as decreased release of IL-1β, IL-17, IL-23, pro-inflammatory cytokines that act to protect the host. In this same period, the decrease in the percentage of active caspase-1, followed by lower release of IL-1β and IL-18, showed that inflammasome was inhibited its activation, contributing to further spread of the pathogen, since it is directly related with the innate response and optimization of an adaptive response. The production of IFN-γ remained increased during all weeks... (Complete abstract click electronic access below)