Orientadores: Anibal Eugenio Vercesi, Karina Gottardello Zecchin / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-15T13:27:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossato_FrancoAparecido_M.pdf: 961339 bytes, checksum: eb647604d3856b3e12d36a8143d26540 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Ácido graxo sintase (FASN - EC 2.3.1.85) é a enzima responsável pela síntese endógena de ácidos graxos de cadeia longa a partir dos precursores acetil-CoA e malonil-CoA. Diversos estudos mostram que a FASN é altamente expressa em vários tipos de neoplasias malignas humanas, tais como de próstata, mama, melanoma e, em alguns destes tumores, a alta expressão de FASN está associada a um pior prognóstico. O tratamento com inibidores específicos de FASN, como cerulenina, C75 e orlistat, diminui a capacidade de proliferação e induz apoptose em linhagens celulares derivadas de neoplasias malignas de próstata, mama e cólon, porém pouco se sabe sobre os efeitos desses inibidores em células não tumorais. Recentemente mostramos que a inibição de FASN com orlistat reduz a proliferação e induz apoptose em células B16-F10 de melanoma murino (Carvalho et al. 2008). Considerando que (1) pouco é conhecido sobre os efeitos de inibidores de FASN em células "normais", inclusive melanócitos e (2) dados iniciais mostram que o tratamento com orlistat ou cerulenina também induz elevados níveis de apoptose em células "normais", este estudo teve por objetivo principal verificar os mecanismos envolvidos na morte induzida pela inibição da FASN em linhagem celular não-tumorigênica derivada de melanoblastos de camundongos (melan-a). O tratamento in vitro de células melan-a com 5 µg/mL de cerulenina ou com 30 µM de orlistat induziu expressiva porcentagem de apoptose, mas não necrose. As células tratadas também apresentaram redução da proliferação, além de discretas ativação de caspase-3 e liberação de citocromo c. Como o silenciamento de FASN através de RNA de interferência (RNAi) não resultou em apoptose, investigamos o possível envolvimento mitocondrial na morte induzida pelos inibidores de FASN. De fato, o tratamento com cerulenina ou orlistat resultou em diminuição do ??m, além de mais de 50% de inibição da velocidade de respiração das melana no estado de repouso. Paralelamente também foi constatado que esses mesmos inibidores de FASN induzem apoptose e reduzem a proliferação de células derivadas de queratinócitos não tumorigênicos, HaCaT. O presente trabalho mostra, portanto, que os inibidores de FASN, cerulenina e orlistat, apresentam efeitos nocivos sobre células não tumorais, conseqüência da ação sobre a respiração mitocondrial. / Abstract: Fatty acid synthase (FASN - EC 2.3.1.85) is the enzyme responsible for endogenous synthesis of long chain fatty acid palmitate derivate from precursors acetyl-CoA and malonyl-CoA. Studies have shown that FASN is highly expressed in several types of human malignancies, such as prostate, breast, melanoma, and in some of these tumors, high expression of FASN is associated with a poor prognosis. FASN inhibitors, such as cerulenin, C75, and orlistat, decrease cell proliferation and induce apoptosis in prostate, breast, and colon tumor cells lines. Recently we demonstrated that inhibition of FASN with orlistat reduced proliferation and induced apoptosis in cells B16-F10 murine melanoma (Carvalho et al. 2008). Consider that (1) little is known about the effects of FASN inhibitors in normal cells, including melanocytes and (2) previous data show that treatment with orlistat or cerulenin also induces high levels of apoptosis in normal cells, the aim of this study was to analyze the mechanisms involved in FASN inhibitioninduced cell death in cell line derived from non-tumorigenic mice melanoblasts (melana). In vitro treatment of melan-a cells with 5 µg/mL cerulenin or 30 µM orlistat induced a significant percentage of apoptosis, but not necrosis. Treated cells also showed reduced proliferation, and moderate activation of caspase-3 and release of cytochrome c. As FASN silencing through RNA interference (RNAi) did not result in apoptosis, we investigated the possible involvement of mitochondria in FASN inhibition-induced cell death. Cerulenin or orlistat treatment of melan-a cells decreased ?? m and inhibited more than 50% the respiration rate in rest state. We also detected significant apoptosis and reduced proliferation in cells derived from non-tumorigenic keratinocyte, HaCaT, after incubation with the same FASN inhibitors. In conclusion, this study shows that FASN inhibitors, cerulenin and orlistat, have adverse effects on non-tumor cells, as a consequence of direct action on mitochondrial respiration. / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Orientadores: Reginaldo Palazzo Junior, Marcio de Castro Silva Filho / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Eletrica e de Computação / Made available in DSpace on 2018-08-15T16:43:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rocha_AndreaSantosLeiteda_D.pdf: 5117477 bytes, checksum: e8f0c742c67382cad01387d3e62f6705 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Um dos desafios em biologia matemática e mostrar a existência de qualquer forma de códigos corretores de erros na estrutura do DNA. Usando os conceitos da teoria de comunicação, propomos um modelo para o sistema de codificacao e decodificaçao do mecanismo de importaçao de proteínas mitocondriais similar a um sistema de comunicacoes digital. Este modelo consiste de um mapeador responsável por transformar os nucleotídeos (A, C, G, T) no alfabeto (0,1, 2, 3) usado pelo codigo sobre a estrutura de anel; um codificador (cádigo BCH); e um modulador (codigo genetico, tRNA e rRNA). O processo de decodificaçao baseia-se em uma analogia entre o processo de decodificacão do algoritmo Berlekamp-Massey para aneis e o complexo TOM (complexo ancorado na membrana externa da mitocondria responsavel por auxiliar na importacçãao das proteínas precursoras). Neste processo temos um demodulador (proteínas Tom 70 e Tom20), um decodificador (o complexo GIP - poro geral de inserção) e o receptor (subcompartimento mitocondrial). Neste trabalho mostramos que as sequencias de DNA (sequencias de direcionamento) são identificadas como palavras-codigo de um código G-linear sobre a extensão de um anel de Galois. Além disso, essas sequências de DNA e suas fitas complementares estão relacionadas matematicamente através dos polinómios primitivos e seus polinómios recíprocos, respectivamente. Um estudo filogenético sugere que a proteína malato desidrogenase da Arabidopsis thaliana encontrada no banco de dados NCBI e uma sequência derivada da proteína malato desidrogenase reproduzida pelo cídigo corretor de erros. Este modelo também reproduz com notível precisão os parâmetros cinéticos baseados em substituicões de aminoíacidos em oligopeptídeos sintéticos. Apresentamos, pela primeira vez, a existência de códigos corretores de erros associados com as sequências de DNA, os quais sugerem fortemente a existência de códigos concatenados no genoma. Os resultados apresentados neste trabalho contribuem para o desenvolvimento de um procedimento sistemático que podera ser empregado em analises de mutacães/polimorfismos com aplicações na engenharia geníetica. / Abstract: One of the puzzling problems in mathematical biology is to show the existence of any form of error-correcting code in the DNA structure. Using information theory considerations we propose a model for the biological coding system similar to that of a digital communication system. This model consists of a mapper (transformations from the set of nucleotides either to the set (0, 1, 2, 3) ring; an encoder (BCH code); and a modulator (genetic code, tRNA and rRNA). The decoding process is based on the Modified Berlekamp-Massey algothm in an analogy with the TOM complex (translocase of the mitochondrial outer membrane). In this process we have a demodulator (Tom 70 and Tom 20 proteins), a decoder (GIP complex) and the receiver (mitochondrion). In this work we show that DNA sequences (targeting sequences) are identified as codewords of a G-linear code over Galois ring extensions. In addition, these DNA sequences and their complementary strands are mathematically related to the primitive polynomials and their reciprocal polynomials, respectively. A phylogenetic study suggest that the MDH protein, Arabidopsis thaliana, found in the NCBI databank is a derived sequence of the MDH protein reproduced by the error correcting code. This model also reproduces with remarkable accuracy kinetic parameters based on amino acid substitutions on synthetic oligopeptides. We show, for the first time, the existence of error-correcting codes associated with DNA sequences, which strongly infer on the existence of nested codes within the genome. The results presented in this work contribute to the development of a systematic procedure which may be employed in the mutations/polymorphisms analysis with applications in genetic engineering. / Doutorado / Telecomunicações e Telemática / Doutor em Engenharia Elétrica

O fígado desempenha um papel central na disposição metabólica de vários agentes químicos endógenos e exógenos, incluindo quase todos os fármacos. Neste processo de biotransformação pode ocorrer a formação de metabólitos intermediários altamente reativos que se não forem convenientemente eliminados podem interagir com macromoléculas celulares lesando o órgão. A hepatotoxicidade idiossincrática associada ao uso de antiepilépticos aromáticos (AEA) é bem conhecida e tem sido atribuída ao acúmulo de intermediários tóxicos (areno-óxidos) formados durante a bioativação hepática. Embora a participação de processos imunológicos no mecanismo de ação tóxica dos AEA tenha sido demonstrada, existe a possibilidade de mecanismos adjuvantes envolvendo a toxicidade mitocondrial, evento ainda não explorado na literatura científica. Neste estudo avaliou-se, in vitro, o efeito dos AEA: carbamazepina, fenitoína e fenobarbital, bem como dos seus respectivos metabólitos na função mitocondrial e na indução do estresse oxidativo em mitocôndrias de fígado de rato, como possível mecanismo de ação hepatotóxica desses fármacos. Sistema microssomal hepático de rato foi utilizado para bioativação dos fármacos e produção dos respectivos metabólitos in vitro. Sem a bioativação, somente o fenobarbital (em concentrações elevadas) apresentou efeitos inibidores sobre o estado 3 da respiração, síntese de ATP e potencial de membrana, sem, contudo induzir o estresse oxidativo. Quando bioativados, todos os fármacos apresentaram efeitos sobre a função mitocondrial através de processo mediado por estresse oxidativo. Todos os fármacos bioativados afetaram a respiração mitocondrial, causando diminuição do consumo de oxigênio no estado 3, diminuição do RCR e aumento do consumo de oxigênio no estado 4. Foram também evidenciadas alterações na captação/liberação de cálcio, inibição da síntese de ATP, diminuição do potencial de membrana e inibição do intumescimento mitocondrial induzido pelo cálcio. A oxidação de proteínas e lipídeos mitocondriais foi demonstrada pela formação de proteínas carboniladas, diminuição de proteínas com grupamentos sulfidrila, aumento de malondialdeído (MDA) e pela oxidação da cardiolipina. O sistema de defesa antioxidante mitocondrial também foi afetado, como evidenciado pela diminuição da relação GSH/GSSG (glutationa reduzida/glutationa oxidada). Os resultados sugerem fortemente a participação do dano mitocondrial, mediado pelo estresse oxidativo causado pelos metabólitos dos AEA, no desenvolvimento da hepatotoxicidade idiossincrática induzida por esses fármacos. / The liver plays a central role in the metabolic disposition of various endogenous and exogenous chemicals, including almost all drugs. During the biotransformation process, highly reactive metabolites can be produced, and if they are not detoxified, they can interact with cellular macromolecules and cause organ injury. Idiosyncratic hepatotoxicity is a well-known complication associated with aromatic antiepileptic drugs (AAED), and it has been suggested to occur due to the accumulation of toxic arene oxide metabolites. Although the participation of an immune process in the toxic action mechanism of AAED has been demonstrated, adjuvant mechanisms involving mitochondrial toxicity is also possible and such event has not been studied yet. Therefore, we investigated, in vitro, the effects of carbamazepine (CB), phenytoin (PT), phenobarbital (PB) and their respective metabolites on the hepatic mitochondrial function as well as their ability to induce oxidative stress in rat liver mitochondria, as a possible hepatotoxic action mechanism. The murine hepatic microsomal system was used to bioactivate the drugs and to produce the anticonvulsant metabolites in vitro. As an unaltered drug, only phenobarbital (in high concentrations) presented inhibitory effects on state 3 respiration, ATP synthesis, and membrane potential; however, it did not induce oxidative stress. All the bioactivated drugs affected mitochondrial function through an oxidative stress-mediated process. All the bioactivated drugs affected mitochondrial function causing decrease in state 3 respiration, decrease in RCR and increase in state 4 respiration. They also caused impairment of Ca+2 uptake /release, decrease in ATP synthesis, decrease in membrane potential and inhibition of calcium-induced swelling. Oxidation of proteins and lipids was evidenced by carbonil proteins formation, decrease in thiol proteins, increase in malonaldehyde (MDA) and cardiolipin oxidation. The mitochondrial antioxidant defense system was also affected, as evidenced by the decreased GSH/GSSG ratio (reduced glutathione/oxidized glutathione). Results strongly suggest the involvement of mitochondrial damage, which is mediated by the oxidative stress caused by the AAED metabolites, in the development of AAED-induced idiosyncratic hepatotoxicity.

A criopreservação de sêmen humano tem sido amplamente utilizada como método de preservação da fertilidade. A fim de reduzir os danos causados pelo processo de congelamento, diversos estudos utilizaram substâncias antioxidantes e estimulantes, porém, sua eficácia, bem como seu papel no controle funcional dos espermatozoides, não está bem estabelecida na literatura. Assim, o objetivo do estudo foi avaliar o efeito da suplementação de melatonina e cafeína nas características estruturais e funcionais de espermatozoides pré-criopreservação e pós-descongelamento. Para isso, este estudo prospectivo utilizou 30 amostras seminais de pacientes entre 19 e 45 anos de idade da rotina do Laboratório Androscience entre maio de 2013 e maio de 2017. Todas as amostras foram classificadas como normozoospérmicas, segundo análise seminal inicial de acordo com os critérios da Organização Mundial da Saúde (OMS). Em seguida, as amostras foram criopreservadas com Human Tubal Fluid modificado sem suplemento ou com 2mM de melatonina. Após o descongelamento, as amostras foram analisadas ou suplementadas com 2 mM de cafeína, incubadas por 15 minutos. Ao final dos experimentos, obtivemos 4 grupos: Amostras pós-descongelamento sem suplementação (CONT), amostras suplementadas com cafeína (CAF), melatonina (MEL) e cafeína + melatonina (CM). Parâmetros seminais de contagem, motilidade e cinética, analisados pelos critérios da OMS e pelo software SCA®, a atividade mitocondrial, pela coloração por diaminobenzidina, avaliação da taxa de fragmentação de DNA, pelo método SCSA® e a dosagem dos níveis de radicais livres de oxigênio (ROS), pelo método de luminescência, foram realizados pré-criopreservação e pós-descongelamento com ou sem suplementação. Os dados foram analisados pelo teste T de Student pareado e pela análise de variâncias de uma via com medidas repetidas, seguida pelo pós-teste de Holm-Sidak, e adotado um alfa de 5%. Observamos redução significativa concentração espermática (p < 0,001), motilidade total (p < 0,001) e progressiva (p < 0,001), parâmetros cinéticos (p < 0,009) e atividade mitocondrial (p < 0,001) e aumento das taxas de fragmentação de DNA (p=0,046) e ROS (p=0,052) nas amostras CONT quando comparadas com as amostras a fresco. Quando suplementadas com cafeína e melatonina, observamos aumento da motilidade progressiva nos grupos CAF (p=0,005) e CM (p=0,048) e aumento da atividade mitocondrial no grupo CM (p < 0,05). Podemos concluir que a associação da suplementação com cafeína e melatonina nas amostras pré-criopreservação e pós-descongelamento demonstrou ser uma ferramenta importante para ser aplicada em amostras criopreservadas para atuarem como substâncias estimuladoras de motilidade espermática / Human semen cryopreservation has been widely used as a method of preserving fertility. In order to reduce the damages caused by the freezing process, several studies used antioxidant and stimulant substances, however, their efficiency as well as their role in the functional control of spermatozoa have not been well established in literature. Thus, the goal of this study was to investigate the effect of melatonin and caffeine supplementation on the structural and functional characteristics of pre-cryopreservation and post-thaw spermatozoa. For this, this prospective study used 30 seminal samples from patients aged from 19 to 45 years in the routine of the Androscience Laboratory between May 2013 and May 2017. All samples were classified as normozoospermic, according to the initial seminal analysis following criteria of the World Health Organization (WHO). Then, the samples were cryopreserved with modified Human Tubal Fluid without supplement or with 2 mM of melatonin. After thawing, the samples were analyzed or supplemented with 2 mM of caffeine, and incubated for 15 minutes. At the end of the experiments, we obtained 4 groups: Post-thaw samples without supplementation (CONT), samples supplemented with caffeine (CAF), melatonin (MEL) and caffeine + melatonin (CM). Seminal parameters for count, motility and kinetics, analyzed by WHO criteria and by the SCA® software, mitochondrial activity, by diaminobenzidine staining, evaluation of DNA fragmentation rate, by the SCSA® method, and dosage of radical oxygen species (ROS) levels, by the luminescence method, pre-cryopreservation and post-thaw were carried out with or without supplementation. The data were analyzed by the paired Student\'s t-test and by one-way analysis of variance with repeated measurements, followed by the Holm-Sidak post-test, adopting an alpha of 5%. We observed a significant reduction in sperm concentration (p < 0.001), total (p < 0.001) and progressive (p < 0.001) motility, kinetic parameters (p < 0.009) and mitochondrial activity (p < 0.001), and increased rates of DNA fragmentation (p=0.046) and ROS (p=0.052) production in the CONT samples when compared with fresh sample. When supplemented with caffeine and melatonin, we observed an increase in progressive motility in the CAF (p=0.005) and CM (p=0.048) groups, and an increase in mitochondrial activity in CM group (p < 0.05). We can conclude that that the combination of caffeine and melatonin supplementation in pre-cryopreservation and post-thaw samples proved to be an important tool to be applied in cryopreserved samples to act as substances that stimulate sperm motility

RESUMO A morte celular programada (PCD) é um processo vital que ocorre em todos os eucariotos. Em plantas, os mecanismos básicos que governam a PCD não estão esclarecidos. Sabe-se que a PCD em plantas é ativada pelo acúmulo de ácido salicílico e influxo de íons cálcio, bem como pela geração de ERO que ocorre nos cloroplastos e nas mitocôndrias. Além disso, as plantas possuem um grupo de proteases denominadas metacaspases, que assemelham-se estruturalmente com as caspases, proteínas que executam PCD em animais. Apesar destes conhecimentos, os mecanismos que governam a ativação da PCD são desconhecidos. Nesse contexto, o presente trabalho procurou investigar alguns fatores possivelmente envolvidos em PCD vegetal. Com esse objetivo, foram isoladas e caracterizadas mitocôndrias de cultura de células em suspensão de Rubus fruticosus. Foram avaliados os efeitos do Ca2+ e do AS sobre as funções mitocondriais, dentre elas a geração de ERO, diminuída pelo AS, porém aumentada por Ca2+. Um mecanismo foi proposto para explicar a diminuição de ERO pelo AS e as respostas observadas para AS e Ca2+ sobre as mitocôndrias são discutidas com base no possível envolvimento na PCD vegetal. A segunda parte do trabalho envolveu a expressão e caracterização de metacaspases (AtMCPs) em Arabidopsis thaliana. As proteases demonstraram autoprocessamento quando superexpressas in planta, assim como ocorre com as caspases em animais. A expressão de AtMCPs nesse modelo não produziu nenhum fenótipo de morte celular, sugerindo que o fenômeno ocorra por meio da integração de duas ou mais metacaspases. Foram estudadas também as propriedades biológicas de AtMCPs recombinantes em E. coli, demonstrando-se diferentes efeitos. Nossos estudos visam contribuir para a melhor compreensão de mecanismos básicos possivelmente envolvidos na PCD em plantas superiores. / ABSTRACT Programmed cell death (PCD) is a fundamental process that occurs in all eukaryotes. In plants, such phenomenon is not well understood. It is known that PCD in plants is activated through salicylic acid (SA) accumulation, Ca2+ ion fluxes, as well as reactive oxygen species (ROS) generation, which occurs mainly in chloroplasts and mitochondria. Besides, plants have a family of proteases, named metacaspases, which are proteases structurally similar to the caspases, members of proteins involved in animal PCD execution. In despite of this knowledge, the mechanism by which plant PCD is activated remains elusive. In this context, the aim of this work was to investigate some factors potentially involved in plant PCD. To this purpose, mitochondria from cell suspension cultures of Rubus fruticosus were isolated and characterized. It was investigated the effects of SA and Ca2+ on mitochondrial functions, as well. We have focused on ROS generation, which are important signals involved in plant PCD. It was shown that Ca2+ increased ROS generation, while SA decreases such production. A mechanism was proposed to explain the SA effects on isolated mitochondria, and the responses obtained from Ca2+ and SA addition on the organelle are discussed, based on the possible involvement of these effects in plant PCD. In the second part of this work, it was investigated the expression of metacaspases (AtMCPs) in the model plant Arabidopsis thaliana. The proteases have demonstrated self-processing when expressed in planta, similar to the animal caspases. Such expression did not cause any cell death phenotype, suggesting that PCD could be activated through the integration of two or more MCPs, if they are involved. It was investigated the effects of recombinant AtMCPs in E. coli, as well, demonstrating different responses. Our work contributes to a better understanding of factors potentially involved in plant PCD.

A atividade do complexo 1 da proteína alvo mecanístico da rapamicina (mTORC1), importante regulador da adiposidade e do metabolismo de lipídeos, está aumentada no tecido adiposo de camundongos obesos. A inibição completa de mTORC1 reduz a adiposidade, enquanto que sua inibição parcial potencializa a obesidade induzida por dieta. Assim, hipotetizamos que um nível ótimo de ativação de mTORC1 é necessário para promover aumento da adiposidade, de forma que sua superativação é tão inibitória para a deposição de gordura quanto sua inibição completa. Para testar esta hipótese, investigamos os efeitos da ativação constitutiva de mTORC1, induzida pela deleção de Tsc1, especificamente em adipócitos na adiposidade in vivo. A deleção de Tsc1 reduziu a massa do tecido adiposo visceral, mas não do subcutâneo, que foi associado ao aumento da lipólise e browning. Além disso, aumentou em ambos tecidos adiposos a massa e atividade oxidativa mitocondrial. Esses dados apoiam nossa hipótese de que é necessário um nível ótimo de ativação de mTORC1 para promover aumento da adiposidade. / The activity of mechanistic target of rapamycin complex 1 (mTORC1), an important regulator of adiposity and lipid metabolism, is increased in adipose tissue of obese mice. Complete mTORC1 inhibition reduces adiposity, whereas partial mTORC1 inhibition enhances diet-induced obesity. Therefore, we hypothesized that an optimal level of mTORC1 activity is required to increase adiposity, in such a manner that mTORC1 overactivation is as inhibitory to fat deposition as its complete inhibition. To test this hypothesis, we investigated the effects of constitutive mTORC1 activation, induced by Tsc1 deletion, specifically in adipocytes on adiposity in vivo. Tsc1 deletion reduced visceral, but not subcutaneous, fat mass, which was associated with increased lipolysis and browning. Moreover, it enhanced mitochondrial mass and oxidative activity in both visceral and subcutaneous fat. These data support our hypothesis that an optimal level of mTORC1 activation is necessary to increase adiposity.

Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-17T11:16:52Z No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-08-17T11:34:54Z (GMT) No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-17T11:34:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 lucianamariaribeiroantinarelli.pdf: 16756474 bytes, checksum: 2304892df326fd4997c78bc7f0870bae (MD5) Previous issue date: 2017-02-15 / As leishmanioses representam um grande problema de saúde pública mundial com sérias limitações na quimioterapia atual, como: número limitado de fármacos, baixa eficácia, custo elevado, crescente resistência parasitária e toxicidade. O objetivo do presente trabalho foi avaliar a atividade de uma série de dez derivados de 4- aminoquinolinas em espécies de Leishmania relacionadas a leishmaniose tegumentar. Avaliar os possíveis mecanismos de ação do composto com atividade antileishmanial promissora, identificando as organelas alvo e os processos de morte celular desencadeados no parasito, bem como a sua eficácia in vivo. Dentre os compostos avaliados, o derivado AMQ-j foi o mais ativo, com atividade expressiva em L. amazonensis e L. braziliensis (CI50 menor que 6.0 μg/mL e 2,5 μg/mL em promastigotas e amastigotas intracelulares, respectivamente) para ambas as espécies avaliadas. O composto AMQ-j apresentou baixa toxicidade para macrófagos murinos (CC50> 40.0 μg/mL), sendo mais tóxico para amastigotas intracelulares (Índice de Seletividade>12,0). Os resultados preliminares acerca do modo de ação apontam que o composto AMQ-j induziu drásticos efeitos na mitocôndria do parasito e caracterizado pelo colapso do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm), inchaço da organela, aumento na produção de Espécies Reativas do Oxigênio (EROS) e acúmulo de corpúsculos lipídicos (CLs) no citoplasma. O tratamento com AMQ-j induziu nas formas promastigotas uma série de alterações bioquímicas e celulares sugestivas de morte por apoptose-like como redução do volume celular, exposição de fosfatidilserina no folheto externo da membrana plasmática, manutenção da integridade da membrana plasmática e alterações drásticas no núcleo celular evidenciadas por meio da desorganização da cromatina e fragmentação do DNA. O efeito do composto em promastigotas está também associado à indução de morte por autofagia evidenciada pelo aumento de vacúolos autofágicos, presença de corpos multivesiculares dentro de vacúolos, vesículas citoplasmáticas e acúmulo de compartimentos acídicos no citoplasma dos promastigotas. O composto também induziu fragmentação do DNA dos amastigotas intracelulares de modo seletivo, sem induzir fragmentação da célula hospedeira. Estudos in silico sugerem que AMQ-j é um potencial inibidor da tripanotiona redutase (TryR), enzima fundamental na defesa antioxidante do parasito. Estudos in vivo em modelo murino de infecção com L. amazonensis demonstraram a eficácia do AMQ-j pela via intralesional na redução do tamanho da lesão e da carga parasitária, sem indução de toxicidade hepática, cardíaca e renal. Os estudos de predição in silico relacionados a propriedades farmacocinéticas (ADMET) e características físico-químicas (regra de Lipinsky) sugerem que AMQ-j pode ser utilizado pela via oral. O efeito leishmanicida do composto está associado a múltiplos alvos, desencadeando a morte do parasito por diferentes vias, como apoptose e autofagia. O efeito in vivo do composto aponta para a necessidade da continuidade dos estudos no intuito de melhor estabelecer o seu efeito leishmanicida. / Leishmaniasis represents a major global public health problem with serious limitations in current chemotherapy, such as limited number of drugs, low efficacy, high cost, increasing parasitic resistance and toxicity. The objective of the present study was to evaluate a series of ten 4-aminoquinolines derivatives (AMQs) on Leishmania species related to tegumentary leishmaniasis. It was also evaluated the possible mechanisms of action of a compound with promising leishmanicidal activity, identifying the target organelles and the type of death triggered in the parasite, as well as to its leishmanicidal effect in vivo. Among the evaluated compounds, the AMQ-j derivative was the most active, with expressive activity on L. amazonensis and L. braziliensis (IC50 less than 6.0 μg/mL and 2.5 μg/mL against intracellular promastigotes and amastigotes, respectively) for both evaluated species. Furthermore, AMQ-j showed low toxicity for murine macrophages (CC50> 40.0 μg/mL) being more destructive to the intracellular parasites (selectivity index > 12.0). Preliminary studies about the mode of action showed that AMQ-j compound induced marked effects on the parasite mitochondria, characterized by mitochondrial membrane potential collapse (ΔΨm), organelle swelling, increased of Reactive Oxygen Species (ROS) production and lipidic bodies accumulation in the cytoplasm. The treatment with AMQ-j induced in the promastigote forms a series of biochemical and cellular alterations which suggest apoptosis-like death, including reduction of cellular volume, phosphatidylserine exposure on the outer leaflet of the plasma membrane, maintenance of plasma membrane integrity and drastic changes in the cell nucleus evidenced by chromatin disorganization and DNA fragmentation. The effect of AMQ-j in promastigote forms is also associated with the induction of death by autophagy evidenced by the increase of autophagic vacuoles, presence of multivesicular bodies inside vacuoles, cytoplasmic vesicles and accumulation of acidic compartments in the promastigote cytoplasm. The compound also induced DNA fragmentation of intracellular amastigotes selectively, without inducing host cell fragmentation. In silico studies suggest that this compound is a potential inhibitor of key redox enzyme trypanothione reductase (TryR). In vivo studies in murine infection model of L. amazonensis demonstrated the efficacy of AMQ-j by the intralesional route, reducing lesion size and parasite load, without induction of hepatic, cardiac and renal toxicity. The in silico prediction studies on pharmacokinetic properties (ADMET) and physico-chemical characteristics (Lipinsky's rule) suggest that AMQ-j can be used orally. Taken together, the results suggest that the leishmanicidal effect of the compound is associated with multiple targets and triggers parasite death through different pathways, including apoptosis and autophagy. The in vivo effect indicates that studies with this compound should be continued in order to better establish its leishmanicidal effect.

Submitted by Geandra Rodrigues (geandrar@gmail.com) on 2018-04-10T18:23:45Z No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2018-04-11T15:17:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-11T15:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 stephanelimacalixto.pdf: 3753314 bytes, checksum: 81fe7e710d2a4f72d60b8c74e25040de (MD5) Previous issue date: 2018-02-22 / As leishmanioses são doenças infecciosas, porém não contagiosas, causadas por protozoários do gênero Leishmania. Os fármacos atualmente empregados para o tratamento das leishmanioses apresentam inúmeros problemas, como alta toxicidade, são dispendiosos, além de mostrarem baixa eficácia em áreas endêmicas devido à resistência observada de várias espécies do parasito. Visto derivados de quinolinas apresentarem como uma classe de moléculas promissoras para o tratamento das leishmanioses, este trabalho teve como objetivo analisar o efeito antileishmanial de novos derivados 4-amino-7-cloroquinolina e a toxicidade em macrófagos peritoneais de camundongos. Objetivou-se também avaliar o modo de ação do composto mais efetivo. Dentre os três compostos avaliados, genericamente denominados de derivados de quinolina (DQ), o composto mais promissor foi o DQ3 (CI50 de 43,25 e 39,19 μM para promastigotas de L. amazonensis e L. braziliensis, respectivamente; CC50 de 226,79 μM; e CI50 de 5,62 e 5,48 para amastigotas de L. amazonensis PH8 e GFP, respectivamente), sendo então o escolhido para os estudos dos possíveis mecanismos de morte celular. Promastigotas de L. amazonensis foram tratados com o composto DQ3 e posteriormente as células foram analisadas quanto a vários parâmetros morfológicos, ultraestruturais e bioquímicos. O tratamento dos promastigotas com o composto DQ3 induziu redução do potencial de membrana mitocondrial, observado pelas marcações com JC-1 e rodamina 123, inchaço mitocondrial observado pela MET e aumento da produção de ROS (marcação com H2DCDFA), sugerindo que o composto tem a mitocôndria como um alvo importante. Além disso, induziu externalização de fosfatidilserina (marcação com anexina V), aumento na população de células na fase sub G0/G1, indução de núcleo apoptótico e alterações morfológicas (corpos arredondados e redução do volume celular). Esses dados sugerem que o composto possa induzir apoptose-like em L. amazonensis. Descartou-se a hipótese de morte por necrose e autofagia, visto que a membrana plasmática se manteve íntegra e não foi observado, pela marcação com MDC, a formação de vacúolos autofágicos. O tratamento dos macrófagos infectados com L. amazonensis induziu aumento na produção de ROS, entretanto o mesmo não foi observado em macrófagos não infectados, sugerindo o estresse oxidativo como um modo de ação deste composto. Também, o tratamento induziu alterações morfológicas nos amastigotas intracelulares. Os resultados obtidos, in vitro, mostram que o composto DQ3 apresenta potencial para ser um agente antileishmanial, estimulando a continuidade da pesquisa no modelo in vivo. / Leishmaniasis is an infectious but non-contagious disease caused by protozoa of the genus Leishmania. The drugs currently used for the treatment of leishmaniasis present numerous problems, such as high toxicity, are expensive, and show low efficacy in endemic areas due to the observed resistance of several species of the parasite. Given quinolines derivatives as a class of promising molecules for the treatment of leishmaniasis, this work aimed to analyze the antileishmanial effect of new 4-amino-7-chloroquinoline derivatives and the toxicity in mouse peritoneal macrophages. The objective of this study was also to evaluate the mode of action of the most effective compound. Among the three evaluated compounds, generically denominated quinoline derivatives (DQ), the most promising compound was DQ3 (IC50 of 43.25 and 39.19 μM for L. amazonensis and L. braziliensis promastigotes, respectively, CC50 of 226.79 μM, and IC50 of 5.62 and 5.48 for amastigotes of L. amazonensis PH8 and GFP, respectively), being then chosen for the studies of the possible mechanisms of cell death. Promastigotes of L. amazonensis were treated with the compound DQ3 and later the cells were analyzed for several morphological, ultrastructural and biochemical parameters. Treatment of the promastigotes with the DQ3 compound induced reduction of the mitochondrial membrane potential observed by the JC-1 and rhodamine-123 markers, mitochondrial swelling observed by MET and increased ROS production (H2DCDFA labeling), suggesting that the compound has the mitochondria as an important target. In addition, it induced phosphatidylserine externalization (annexin V labeling), increase in cell population in the sub G0/G1 phase, induction of apoptotic nucleus and morphological changes (rounded bodies and reduction of cell volume). These data suggest that the compound may induce apoptosis-like in L. amazonensis. The hypothesis of death due to necrosis and autophagy was discarded, since the plasma membrane remained intact and the formation of autophagic vacuoles was not observed by MDC labeling. The treatment of macrophages infected with L. amazonensis induced an increase in the production of ROS, but the same was not observed in uninfected macrophages, suggesting oxidative stress as a mode of action of this compound. Also, the treatment induced morphological changes in intracellular amastigotes. The results obtained, in vitro, show that the compound DQ3 presents potential to be an antileishmanial agent, stimulating the continuity of the research in the in vivo model.

Orientadores: Anibal Eugênio Vercesi, Karina Gottardelo Zecchin / Texto em português e inglês / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T16:40:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rossato_FrancoAparecido_D.pdf: 7526681 bytes, checksum: 3768c017da7bde02ddd95e8e41881438 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Recentemente mostramos que os inibidores da enzima ácido graxo sintase (FASN - EC 2.3.1.85), cerulenina e orlistat, reduzem a proliferação e induzem apoptose em células B16-F10 de melanoma murino via mecanismos mitocondriais. Neste presente estudo investigamos os efeitos desses inibidores de FASN em linhagem celular não-tumorigênica derivada de melanoblastos de camundongos (melan-a). O tratamento in vitro de células melan-a com 5 µg/mL de cerulenina ou com 30 µM de orlistat inibiu a proliferação celular, com acúmulo da proteína supressora de tumor p21WAF1/Cip1, assim como induziu a via intrínseca da apoptose com liberação de citocromo c e ativação de caspases-3 e -9, sem ativação da caspase-8. Os inibidores de FASN não alteram o conteúdo de ácidos graxos livres nas células melan-a, verificados por espectrometria de massas, sugerindo que o tratamento com cerulenina ou orlistat induz apoptose independente da inibição desta enzima. Análise das funções da bioenergética mitocondrial das células melan-a mostraram inibição da respiração, seguido por aumento da produção de superóxido. A inibição da respiração, promovida pelo tratamento com cerulenina ou orlistat, foi restrita à oxidação de substratos ligados a NADH (39,9% DMSO x cerulenina; ou 60,8% EtOH x orlistat) e succinato (45,8% DMSO x cerulenina; ou 51,8% EtOH x orlistat), e não foi significativa quando as mitocôndrias estavam respirando com substrato do complexo IV, N,N,N',N'-tetrametil-p-fenilenodiamina. A proteção conferida pelo sequestrador de radicais livres N-acetil cisteína (NAC) sugere que a disfunção mitocondrial provocada por estes compostos está associada a estresse oxidativo e é provável que seja mediada pela ação de superóxido na cadeia respiratória nos níveis de complexos de I e II. Análise proteômica de mitocôndria dessas células também mostra alterações ligadas ao estresse oxidativo. Nossos dados em conjunto sugerem que cerulenina e orlistat induzem apoptose em células não tumorais como resultado de uma disfunção mitocondrial e de maneira independente de FASN / Abstract: We have previously reported that the fatty acid synthase (FASN) inhibitors, cerulenin or orlistat, induce apoptosis in B16-F10 mouse melanoma cells mediated by mitochondria. Here we investigate the effects of these inhibitors on the non-tumorigenic mouse cell line melan-a. Cerulenin or orlistat treatment decreased cells proliferation, accompanied by increased amounts of the tumor suppressor protein p21WAF1/Cip1, as well as induced apoptosis, but not necrosis, in melan-a cell line. Mitochondrial cytochrome c release and activation of caspases-9 and -3 were detected in melan-a-treated cells. siRNAi for FASN did not culminate in apoptosis, and FASN inhibitors treatment did not alter free fatty acids content in the non-tumorigenic cells, as verified by mass spectrometry, suggesting that cerulenin or orlistat induces apoptosis independent on FASN inhibition. Analysis of energy-linked functions of melan-a mitochondria showed inhibition of respiration followed by large stimulation of superoxide production. Respiratory inhibition after cerulenin or orlistat treatment, respectively, was restricted to the oxidation of NADH-linked substrates (39.9 or 60,8%) and succinate (45.8 or 51.8%) and was not significant when mitochondria were respiring on the complex IV substrate, N,N,N?,N?-tetramethyl-p-phenylendiamine. The protection conferred by the free radical scavenger NAC suggests that the mitochondrial dysfunction caused by these compounds is associated with oxidative stress and is mediated by the action of superoxide on the respiratory chain at the levels of complexes-I and II. Proteomic analysis of mitochondria melan-a cells also indicate major changes linked to oxidative stress. Taken together, the present results show that cerulenin or orlistat induces apoptosis in non-tumorigenic cells via mitochondrial dysfunction, independent on FASN inhibition / Doutorado / Fisiopatologia Médica / Doutor em Ciências

Orientador: Roger Frigério Castilho / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T17:18:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Michelini_LuizGuilhermeBueno_M.pdf: 1602537 bytes, checksum: f58032fd3eaf359e8f094658a3612c02 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A inibição parcial do Complexo I da cadeia respiratória mitocondrial em ratos tratados cronicamente com rotenona está associada com o desenvolvimento de características neuroquímicas, comportamentais e neuropatológicas da doença de Parkinson. Os objetivos deste trabalho foram (i) caracterizar os efeitos de uma inibição parcial do Complexo I por rotenona na produção de peróxido de hidrogênio (H2O2) por mitocôndrias de cérebro de ratos (MCR) em diferentes estados respiratórios e (ii) avaliar a suscetibilidade de MCR velhos (24 meses) à inibição do consumo de oxigênio (O2) e ao estímulo da produção de H2O2 por rotenona em comparação a MCR adultos (3-4 meses). A análise do potencial de membrana por citometria de fluxo em mitocôndrias isoladas indicou que a adição de rotenona promoveu uma inibição uniforme da respiração mitocondrial nestas organelas. Quando mitocôndrias foram incubadas na presença de uma baixa concentração de rotenona (10 nM) e de substratos geradores de NADH, o consumo de O2 foi reduzido de 45,9±1,0 para 26,4±2,6 nmol O2.mg-1.min-1 e de 7,8±0,3 para 6,3±0,3 nmol O2.mg-1.min-1 nos estados respiratórios 3 (respiração estimulada por ADP) e 4 (respiração de repouso), respectivamente. Nessas condições, a produção mitocondrial de H2O2 foi estimulada de 12,2±1,1 para 21,0±1,2 pmol H2O2.mg-1.min-1 e de 56,5±4,7 para 95,0±11,1 pmol H2O2.mg-1.min-1 nos estados respiratórios 3 e 4, respectivamente. Resultados similares foram observados ao comparar preparações mitocondriais enriquecidas com organelas sinápticas e não-sinápticas ou quando o íon 1-metil-4-fenilpiridina (MPP+) foi utilizado como inibidor de Complexo I mitocondrial. O estímulo da produção de H2O2 por rotenona nos estados respiratórios 3 e 4 foi associado a um aumento do estado reduzido de nucleotídeos de nicotinamida endógenos. Na respiração mitocondrial com succinato, onde a maior parte da produção de H2O2 se origina do fluxo reverso de elétrons do Complexo II para o I, baixas concentrações de rotenona inibiram a produção de H2O2. Rotenona não exerceu efeito sobre a eliminação mitocondrial de concentrações micromolares de H2O2. Em sinaptossomas intactos, observamos que rotenona 10 nM estimulou a liberação de H2O2 em 20,2±3,3% no estado respiratório basal. Ao compararmos MCR adultos e velhos, verificamos que o consumo de O2 no estado respiratório 3 e a atividade da citrato sintase foram 21,0±3,3% e 17,0±5,4% mais baixos em MCR velhos. Experimentos conduzidos na presença de diferentes concentrações de rotenona (5, 10 e 100 nM) demonstraram sensibilidade similar à inibição do consumo de O2 por rotenona no estado respiratório 3, com IC50 de 7,8±0,4 e 6,5±0,5 nM para MCR adultos e velhos, respectivamente. De acordo com esses resultados, o estímulo da produção de H2O2 observado foi similar em MCR adultos e velhos, tratadas com diferentes concentrações de rotenona. Concluímos que, uma inibição parcial do Complexo I pode resultar em uma crise energética e/ou estresse oxidativo mitocondrial, enquanto o primeiro evento predominaria numa situação de alta demanda de fosforilação oxidativa, o segundo ocorreria em condições de respiração de repouso. Em adição, os experimentos com ratos velhos indicaram que rotenona exerce efeitos similares no consumo de O2 e na produção de H2O2 em MCR adultos e velhos / Abstract: Partial inhibition of mitochondrial Complex I is associated with the development of neurochemical, behavioral, and neuropathological features of Parkinson's disease in rats chronically and systemically treated with rotenone. The aims of this work were (i) to characterize the effects of partial inhibition of respiratory Complex I by rotenone on H2O2 production by rat brain mitochondria in different respiratory states and (ii) to evaluate the susceptibility of brain mitochondria from old rats (24 month-old) to rotenone-induced inhibition of oxygen consumption and increased generation of H2O2 when compared with organelles from adult rats (3-4 month-old). Flow cytometric analysis of membrane potential in isolated mitochondria indicated that rotenone leads to uniform respiratory inhibition when added to a suspension of these organelles. When mitochondria were incubated in the presence of a low concentration of rotenone (10 nM) and NADH-linked substrates, oxygen consumption was reduced from 45.9±1.0 to 26.4±2.6 nmol O2.mg-1.min-1 and from 7.8±0.3 to 6.3±0.3 nmol O2.mg-1.min-1 in respiratory states 3 (ADP-stimulated respiration) and 4 (resting respiration), respectively. Under these conditions, mitochondrial H2O2 production was stimulated from 12.2±1.1 to 21.0±1.2 pmol H2O2.mg-1.min-1 and 56.5±4.7 to 95.0±11.1 pmol H2O2.mg-1.min-1 in respiratory states 3 and 4, respectively. Similar results were observed when comparing mitochondrial preparations enriched with synaptic or nonsynaptic organelles or when 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP+) ion was used as a respiratory Complex I inhibitor. Rotenone-stimulated H2O2 production in respiratory states 3 and 4 was associated with a high reduction state of endogenous nicotinamide nucleotides. In succinate-supported mitochondrial respiration, where most of the mitochondrial H2O2 production relies on electron backflow from Complex II to Complex I, low rotenone concentrations inhibited H2O2 production. Rotenone had no effect on mitochondrial elimination of micromolar concentrations of H2O2. In intact synaptosomes, we observed that 10 nM rotenone stimulated H2O2 release by 20.2 ± 3.3% under basal respiratory state. When comparing isolated brain mitochondria from adult and old rats we observed that oxygen consumption under respiratory state 3 and citrate synthase activity were 21.0±3.3% and 17.0±5.4% lower in mitochondria from old rats. Experiments conducted in the presence of different rotenone concentrations (5, 10 and 100 nM) showed that brain mitochondria from adult and old rats have similar sensitive to rotenone-induced inhibition of oxygen consumption in respiratory state 3, with IC50 of 7.8±0.4 and 6.5±0.5 nM for adult and old rats, respectively. In line with these results, similar stimulations in H2O2 production were observed in mitochondria from adult and old rats treated with different concentrations of rotenone. We conclude that partial Complex I inhibition may result in mitochondrial energy crisis and oxidative stress, the former being predominant under oxidative phosphorylation and the latter under resting respiration conditions. Rotenone exerts similar effects on oxygen consumption and H2O2 production by isolated brain mitochondria from adult and old rats / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Ciências