Die Entwicklung von Autoimmunerkrankungen wird durch eine Vielzahl verschiedener Faktoren verursacht, darunter gewisse Umwelteinflüsse, genetische Veranlagungen oder Virusinfektionen. So vielfältig die Ursprünge von Autoimmunerkrankungen sind, so divers sind die daraus resultierenden Erkrankungen, wodurch die Entwicklung zuverlässiger Therapien erschwert wird. Obwohl verschiedene Behandlungsmöglichkeiten existieren, welche die Symptome bei Autoimmunerkrankungen wie neuroinflammatorischer Multipler Sklerose (MS) mildern können, z.B. mit monoklonalen Antikörpern (mAk), wirken die meisten Medikamente breit und unspezifisch. Dies beeinträchtigt die Funktionalität des Immunsystems, was wiederum zu einem höheren Risiko für bakterielle und virale Infektionen, maligne Erkrankungen oder sekundäre Autoimmunität führen kann. Andere Therapieansätze untersuchen daher Möglichkeiten einer Antigen-abhängigen Immuntoleranz-Induktion. Allerdings befinden sich diese noch in den frühen Entwicklungsphasen und deren klinische Wirksamkeit muss noch bewiesen werden. Alternativ hat es sich in der onkologischen Immuntherapie als erfolgreich erwiesen, entweder natürliche oder gentechnisch veränderte Immunzellen zu aktivieren. Bisher wurden humane T-Zellen, welche mit Hilfe chimärer Antigenrezeptoren (CAR) mit ausgewählter Spezifität ausgestattet sind, sehr erfolgreich in der Klinik gegen Tumorerkrankungen genutzt. Basierend auf diesen klinischen Erfolgen stellt sich die Frage, ob CAR T-Zellen auch zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen eingesetzt werden können. Herkömmlichen CAR T-Zellen mangelt es jedoch sowohl an Flexibilität als auch an Kontrollierbarkeit, da sie mit einem CAR gegen ein einzelnes Antigen ausgestattet sind und in Gegenwart des Zielantigens dauerhaft aktiviert und nicht kontrollierbar sind. Um Limitationen konventioneller CARs zu überwinden, wurden universelle Adapter-CARs (UniCARs, RevCARs) in der Gruppe von Prof. Bachmann entwickelt. Die modulare UniCAR-Plattform besteht aus universell einsetzbaren UniCAR T-Zellen und anpassbaren antigenspezifischen Zielmodulen (TMs). Die Bindungseinheit des UniCAR basiert auf einem mAk mit Spezifität gegen ein Peptidepitop, das Teil des TMs ist und welches spezifisch an Zielantigene auf Tumorzellen bindet. Das TM fungiert als Adaptermolekül, das eine Vernetzung der UniCAR T-Zelle mit der Zielzelle herstellt. Nach der Vernetzung mit der Zielzelle über das TM wird die UniCAR T-Zelle aktiviert, so dass die Zielzelle eliminiert wird. Eine vor Kurzem vorgenommene Modifikation der extrazellulären UniCAR-Domäne führte zu der Reverse CAR (RevCAR)-Plattform, welche die Spezifität und Sicherheit noch weiter erhöhen sowie tonische Signale konventioneller CARs reduzieren soll. Dabei wurde die extrazelluläre mAk-basierte UniCAR-Domäne mit dem Peptidepitop des TM ausgetauscht. Eines der am besten untersuchten Autoantigene bei neuroinflammatorischen Erkrankungen ist das Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG). Dieses Protein befindet sich ausschließlich im zentralen Nervensystem an der abaxonalen Membran der nervenschützenden Myelinscheide. Obwohl neuroinflammatorische Erkrankungen wie MS hauptsächlich durch T-Zellen verursacht werden, wurden bei MS-Patienten auch Autoantikörper gegen MOG nachgewiesen, was auf die Beteiligung autoreaktiver B-Zellen an der Verschlimmerung der Krankheit hinweist. Diese Ergebnisse werden durch die wirksame Behandlung von MS-Patienten mit anti-CD20-mAks belegt. In dieser Arbeit wurde MOG als erstes Modell-Zielantigen für das Retargeting von CAR-modifizierten T-Zellen gegen anti-MOG-Ak-exprimierende humane Zellen verwendet. Ziel dieser Arbeit war neue TMs basierend auf der extrazellulären Domäne des MOG Antigens zu entwickeln, die dazu dienen, UniCAR oder RevCAR T-Zellen zur Eliminierung von anti-MOG Ak-exprimierenden Zielzellen zu aktivieren. Zur Bestimmung des optimalen MOG-Antigen TM-Formats wurden für die UniCAR-Plattform ein monovalentes (25 kDa) und ein bivalentes MOG-Antigen TM (50 kDa) entwickelt. Die Wirksamkeit des UniCAR-Systems wurde in vitro demonstriert. Es konnte dabei gezeigt werden, dass beide TMs bereits nach einer kurzen Inkubationszeit von 8 Stunden eine TM-spezifische Lyse Anti-MOG scFv-exprimierender menschlicher Zelllinien durch UniCAR-T-Zellen vermitteln. Darüber hinaus war es möglich, das zytotoxische Potential der UniCAR-T-Zellen durch die Dosierung der TMs zu kontrollieren. Um zu überprüfen, ob der Effekt basierend auf der UniCAR-Platform gegen anti-MOG scFv-exprimierende Zielzellen noch gesteigert werden kann, wurde ein monovalentes MOG-Antigen RevTM für die RevCAR-Plattform entwickelt. In Kombination mit RevCAR-T-Zellen übertraf die Anwendung des RevTM beide UniCAR TMs hinsichtlich Bindungsaffinität und dosisabhängiger Zytotoxizität gegen zwei anti-MOG scFv-exprimierende Zelllinien in vitro. Außerdem war die Freisetzung proinflammatorischer und T-Zellwachstum-fördernder Zytokine im Vergleich zu UniCAR T-Zellen höher und ausgeprägter. Weiterhin wurde die Funktionalität des RevCAR-Systems gegen anti-MOG-scFv-exprimierende Zielzellen in vivo bewiesen. Zusammenfassend kann geschlussfolgert werden, dass die modularen Adapter-CAR T-Zell-Plattformen neben der Krebsimmuntherapie auch bemerkenswertes Potential für die Behandlung von MOG-assoziierten Autoimmunerkrankungen hat. Damit konnte ein erster Grundstein dafür gelegt werden, CAR T-Zellen auf die Anwendung in Autoimmunerkrankungen zu übertragen, um zukünftig gezielt fehlerhafte Immunzellen zu beseitigen, die nachweislich zur Verschlimmerung von Autoimmunerkrankungen beitragen.:Table of contents I List of abbreviations VI 1 Introduction 1 1.1 The human immune system 2 1.2 B cells and antibodies 3 1.2.1 Antibody structure 3 1.2.2 Tolerance induction 4 1.2.3 B cell activation 5 1.2.4 B cell functions in autoimmune diseases 6 1.3 Multiple sclerosis – an example for neuroinflammatory demyelination diseases 8 1.3.1.1 Disease phenotypes 9 1.3.1.2 Immunopathogenesis 9 1.3.2 Autoantigen myelin oligodendrocyte glycoprotein 11 1.4 Immunotherapy 14 1.4.1 Monoclonal antibody therapy 14 1.4.2 Chimeric antigen receptor therapy 16 1.4.2.1 UniCAR and RevCAR T cell system 18 1.4.2.2 CAR T cells in autoimmune diseases 22 1.5 Objectives 23 2 Materials and Methods 25 2.1 Materials 25 2.1.1 Consumables 25 2.1.2 Devices and software 27 2.1.3 Chemicals and reagents 32 2.1.4 Buffers and solutions 36 2.1.5 Enzymes and enzyme buffers 38 2.1.6 Kit systems 39 2.1.7 Plasmid vectors 39 2.1.8 Oligonucleotides 41 2.1.9 Antibodies 41 2.1.10 Basic media, additives, and recombinant proteins 43 2.1.11 Composition of culture media 44 2.1.12 Bacterial strain 46 2.1.13 Cell lines 46 2.1.14 Mouse strain 47 2.2 Methods 47 2.2.1 Molecular biological and microbiology methods 47 2.2.1.1 DNA digestion with restriction enzymes 47 2.2.1.2 Dephosphorylation of vectors 48 2.2.1.3 Agarose gel electrophoresis 48 2.2.1.4 Isolation and purification of DNA fragments from agarose gels 48 2.2.1.5 Ligation of DNA fragments 49 2.2.1.6 Heat-shock transformation of competent E. colis 49 2.2.1.7 Plasmid mini preparation 49 2.2.1.8 Plasmid midi preparation 50 2.2.1.9 Determination of DNA concentration 50 2.2.1.10 DNA sequencing 50 2.2.2 Cell biology methods 50 2.2.2.1 Cultivation of eukaryotic cells 50 2.2.2.2 Freezing and thawing cultured cells 51 2.2.2.3 Determination of cell number 52 2.2.2.4 Lentiviral transduction of eukaryotic cells 52 2.2.2.5 Immunofluorescence labeling 54 2.2.2.6 Flow cytometry and analysis of flow cytometry data 55 2.2.2.7 Isolation of human peripheral blood mononuclear cells 57 2.2.2.8 Isolation of T cells from PBMCs with magnetic-activated cell sorting 58 2.2.2.9 Stimulation of isolated human T cells 58 2.2.2.10 Engraftment of T cells with chimeric antigen receptors 59 2.2.3 Methods of protein biochemistry 59 2.2.3.1 Isolation of target module constructs 59 2.2.3.2 Dialysis of purified target module constructs 60 2.2.3.3 Discontinuous Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis 60 2.2.3.4 Determination of concentration and immunochemical detection of target module constructs 62 2.2.3.5 Determination of binding affinities of target modules using enzyme-linked immunosorbent assay 63 2.2.4 In vitro functional studies 64 2.2.4.1 T cell activation and exhaustion assay 65 2.2.4.2 Luciferase assay (cytotoxicity assay) 65 2.2.4.3 Determination of cytokine concentration 65 2.2.5 In vivo functionality studies 66 2.2.5.1 Evaluation of tumor killing in vivo 66 2.2.5.2 Optical imaging of luciferase-expressing tumors in vivo 67 2.2.6 Statistical evaluation 67 3 Results 68 3.1 Design and generation of novel MOG target modules 68 3.1.1 MOG target module constructs 68 3.1.2 Expression of target modules 69 3.2 Establishment of scFv MOG-presenting cell models 72 3.3 Binding properties of MOG target modules 74 3.3.1 Determination of binding affinity between anti-MOG antibody and MOG target modules with enzyme-linked immunosorbent assay 74 3.3.2 Determination of binding affinity between anti-MOG receptor-expressing cell lines and MOG target modules with flow cytometry 75 3.4 Generation of human CAR-expressing T cells and binding of MOG target modules 80 3.4.1.1 Genetic modification of human T cells for UniCAR expression 81 3.4.1.2 Genetic modification of human T cells for RevCAR expression 83 3.5 Redirection of UniCAR T cells in vitro 85 3.5.1 Activation of redirected UniCAR T cells 85 3.5.2 Cytokine profile of redirected UniCAR T cells 87 3.5.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells by UniCAR T cells 89 3.5.3.2 Efficacy of UniCAR target modules 91 3.6 Redirection of RevCAR T cells in vitro 92 3.6.1 Activation of redirected RevCAR T cells 92 3.6.2 Cytokine profile of redirected RevCAR T cells 95 3.6.3 Elimination of scFv MOG-positive target cells by RevCAR T cells 99 3.6.3.1 Time-dependent retargeting of scFv MOG-positive target cells using RevCAR T cells 99 3.6.3.2 Efficacy of RevCAR target module 101 3.7 Investigation of RevCAR T cell-mediated cytotoxicity in vivo 103 4 Discussion 105 4.1 Structure and purification of MOG target modules 106 4.2 Expression and purification of target modules 107 4.3 Binding properties of MOG target modules 107 4.4 In vitro cytotoxic potential of UniCAR and RevCAR T cells redirected by MOG target modules 110 4.4.1 Target module-specific redirection of UniCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 110 4.4.2 Target module-specific redirection of RevCAR T cells to scFv MOG-expressing target cells 112 4.5 Future prospective 116 5 Summary 119 6 Zusammenfassung 121 7 References 124 List of figures 145 List of tables 147 Acknowledgement 148

Pat. mit Multipler Sklerose haben ein erhöhtes Risiko, einen schweren Verlauf einer SARS- CoV-2 Infektion zu entwickeln. Durch das fehlregulierte Immunsystem und durch die mit dem Krankheitsbild verbundenen vielen körperlichen Einschränkungen treten bei MS Pat. häufiger schwere Infektionen auf. Eine Anti-CD20-Antikörpertherapie depletiert vor allem B-Zellen, zu einem geringen Teil auch T-Zellen. Mit dieser immunsupprimierenden Therapie haben Pat. ein nochmals erhöhtes Infektionsrisiko. Zur B-Zell depletierenden Therapie (BZDT) werden aktuell Ocrelizumab, Ofatumumab und Rituximab verwendet. Durch eine Impfung könnten die MS Pat. mit BZDT vor einer SARS-CoV-2 Infektion geschützt werden bzw. ein schwerer Verlauf durch sie verhindert werden. Die Beurteilung der Effektivität einer Impfung kann durch die Analyse der B-Zell spezifischen und T-Zell spezifischen Impfantwort untersucht werden. Ziel der Studie ist es, herauszufinden, ob Pat. trotz der MS-Erkrankung und einer Anti-CD20 Antikörpertherapie eine Impfantwort entwickeln und ob die Pat. dadurch von einer SARS- CoV2-Impfung profitieren.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Multiple Sklerose 1.1.1 Epidemiologie 1.1.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.1.3 Pathophysiologie 1.1.4 Symptome 1.1.5 Verlaufsformen 1.1.6 Diagnostik 1.1.7 Prognosefaktoren 1.1.8 Therapie 1.2 SARS-CoV-2 1.2.1 Epidemiologie 1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.2.3 Infektion und ihre Immunantwort 1.2.4 Impfung 2. Fragestellung und Zielsetzung 3. Material und Methode 3.1 Einschlusskriterien 3.2 Methode 3.2.1 B-Zell Antwort 3.2.2 T-Zell Antwort 3.3 Statistik 3.4 Pat.kollektiv 4. Ergebnisse 4.1 Ergebnisse nach der Grundimmunisierung 4.1.1 B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.1.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.2 Ergebnisse nach der Booster Impfung 4.2.1 B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.2.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.3 SARS-CoV-2 spezifische B- und T-Zell Antwort im Verlauf 4.4 Bedeutung des zeitlichen Beginns einer BZDT auf die SARS-CoV-2 spezifische Impfantwort 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung 10. Anhang (einschließlich Originalpublikationen) / Patients with multiple sclerosis generally face an elevated risk of experiencing a severe course of SARS-CoV-2 infection. This heightened susceptibility results from the dysregulated immune system and various physical limitations associated with the disease. Anti-CD20 therapy primarily leads to B-cell depletion and, to a lesser extent, T-cell depletion. Consequently, patients undergoing BCDT, which includes ocrelizumab, ofatumumab, and rituximab, are at an even greater risk of infection due to this immunosuppressive therapy. Vaccination emerges crucial of protecting MS patients undergoing BCDT from SARS-CoV-2 infection or mitigating the severity of the disease. The effectiveness of a vaccination can be assessed by analyzing the B-cell specific and T-cell specific vaccination response. The study aims to ascertain whether patients with MS, despite the disease and anti-CD20 antibody therapy, develop a vaccination response and whether they indeed benefit from a SARS-CoV-2 vaccination.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1. Einleitung 1.1 Multiple Sklerose 1.1.1 Epidemiologie 1.1.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.1.3 Pathophysiologie 1.1.4 Symptome 1.1.5 Verlaufsformen 1.1.6 Diagnostik 1.1.7 Prognosefaktoren 1.1.8 Therapie 1.2 SARS-CoV-2 1.2.1 Epidemiologie 1.2.2 Ätiologie und Risikofaktoren 1.2.3 Infektion und ihre Immunantwort 1.2.4 Impfung 2. Fragestellung und Zielsetzung 3. Material und Methode 3.1 Einschlusskriterien 3.2 Methode 3.2.1 B-Zell Antwort 3.2.2 T-Zell Antwort 3.3 Statistik 3.4 Pat.kollektiv 4. Ergebnisse 4.1 Ergebnisse nach der Grundimmunisierung 4.1.1 B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.1.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Grundimmunisierung 4.2 Ergebnisse nach der Booster Impfung 4.2.1 B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.2.2 Einfluss einer SARS-CoV-2-Infektion auf die B- und T-Zell Antwort nach der Booster Impfung 4.3 SARS-CoV-2 spezifische B- und T-Zell Antwort im Verlauf 4.4 Bedeutung des zeitlichen Beginns einer BZDT auf die SARS-CoV-2 spezifische Impfantwort 5. Diskussion 6. Zusammenfassung 7. Summary 8. Literaturverzeichnis 9. Danksagung 10. Anhang (einschließlich Originalpublikationen)

Die Infiltration von T Zellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) ist ein Charakteristikum neuroinflammatorischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS) und ihrem Tiermodell der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), und führt zur Aktivierung intrinsischer Hirnmakrophagen, den Mikrogliazellen, zu axonaler Schädigung sowie zum Zusammenbruch der Blut-Hirnschranke. Die T Zellen, welche als erste im Gehirn erscheinen, sind vom Subtyp Th1, spezifisch für Bestandteile der Myelinscheide, wie das myelinbasische Protein (MBP), produzieren inflammatorische Zytokine und rekrutieren andere unspezifische T Zellen und Makrophagen. Da sich diese Zellen des Immunsystems gegen körpereigene Bestandteile richten, spricht man von autoreaktiven T Zellen und einer autoimmunen Erkrankung. Im ersten Teil meiner Dissertation habe ich den Einfluss dieser autoreaktiven T Zellen auf den Aktivierungszustand von Mikrogliazellen mit Hilfe muriner Schnittkulturpräparate von Hippocampus und entorhinalem Kortex untersucht, welche den myelinisierten Fasertrakt Tractus perforans mit seinen Ursprungsneuronen und Zielzellen enthielten. Gering aktivierte MBP-spezifische T Zellen induzierten die Expression der Aktivitätsmarker MHC-II und ICAM-1 auf den Mikroglia und die damit verbundene axonale Schädigung (Phagozytose) im gleichen Maße wie hochaktivierte unspezifische T Zellen. Nur Th1 Zellen konnten Mikroglia aktivieren. MBP-spezifische Th2 Zellen hingegen reduzieren die Th1 induzierte Mikrogliaaktivierung (ICAM-1) auf Kontrollniveau. MBP-spezifische Th1 Zellen konnten die Expression von B7 auf Mikrogliazellen modulieren, während die MBP-spezifischen Th2 Zellen diese Eigenschaft nicht besaßen. Durch diese Befunde kann die prominente Rolle von autoreaktiven Th1 Zellen beim Auslösen neuroinflammatorischer Prozesse auf ihre einmalige Fähigkeit, Mikrogliazellen zu aktivieren und deren kostimulatorische Moleküle zu modulieren, zurückgeführt werden. Gleichzeitig bieten die Daten eine mögliche Erklärung für die protektive Rolle von Th2 Zellen bei MS und EAE. Es ist bekannt, dass autoreaktive T Zellen, wie die MBP-spezifischen Th1 Zellen, auch im gesunden Zustand im humanen und murinen T-Zell-Repertoire vorhanden sind. Die physiologische Funktion dieser Zellen ist unklar. Untersuchungen am Nervus opticus sowie im Rückenmark in vivo belegen, dass autoreaktive T Zellen und Makrophagen die Reorganisationsprozesse im ZNS nach traumatischer Schädigung positiv beeinflussen. Diese bei neuroinflammatorischen Erkrankungen so destruktiv wirkenden autoreaktiven T Zellen verhindern nach einem experimentell gesetzten Primärschaden im ZNS das Fortschreiten der Schädigung und es kommt zu einer fast vollständigen Regeneration des Gewebes. Im zweiten Teil meiner Promotionsarbeit habe ich versucht, die Mechanismen, welche hinter dieser Protektion stecken aufzuspüren. Dazu habe ich ebenfalls das in vitro Hirnschnittmodell benutzt. Für diese Fragestellungen wurden Akutschnitte verwendet, die ein Modell für primäre Schädigung im ZNS darstellen. MBP-spezifische Th2 Zellen hatten ein größeres protektives Potential als MBP-spezifische Th1 Zellen. Die nicht ZNS-spezifischen Th1 und Th2 Zellen benötigten ihr Antigen (OVA-Peptid), um signifikant protektiv zu wirken. Durch eine Superstimulation der OVA- und MBP-spezifischen T Zellen wurde eine Neuroprotektion auf gleichem Niveau erreicht. Die Neuroprotektion nach primärer Schädigung von ZNS Gewebe ist somit antigen- und stimulationsabhängig und wird hauptsächlich von Th2 Zellen unterstützt. / The invasion of T cells into the central nervous system (CNS) is a hallmark of neuro inflammatory diseases like multiple sclerosis (MS) and its rodent model, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), leading to activation of intrinsic macrophages, the microglia, axonal damage and break down of the blood brain barrier. The initial invading T cells are of the Th1 subtype and specific for parts of the myelin sheet like myelin basic protein (MBP). They produce inflammatory cytokines and recruit peripheral non-specific T cells and macrophages. Because these T cells are directed against a self antigen, they are called auto reactive T cells and the phenomenon an autoimmune disease. In the first part of my study I investigated the influence of auto reactive T cells on microglial cells' utilizing an organotypic slice culture system of hippocampus and entorhinal cortex. The slice culture contains a myelinated fibre tract - the tractus perforans - with its original and target neurons. Low activated MBP-specific T cells induced the expression of the activation markers ICAM-1 and MHC-II on microglia as well as microglial phagocytosis in the same manner as highly activated non-specific T cells. Only Th1 cells were able to activate microglia, while Th2 cells reduced the Th1 induced activation (ICAM-1 expression). MBP-specific Th1 cells could modulate the expression of co-stimulatory molecules B7-1 and B7-2, whereas MBP-specific Th2 cells could not. These findings could show why Th1 cells are responsible for EAE induction while Th2 cells can be protective. Auto reactive T cells like MBP-specific T cells have been found in the normal human and murine T cell repertoire. The physiological function of these cells is still unclear. Studies using the models of optic nerve crush or spinal cord crush have shown that macrophages and auto reactive T cells are involved in reorganisation and regeneration after CNS trauma. These auto reactive T cells, which are usually known to be destructive, could prevent CNS tissue from secondary degeneration. In the second part of my study I tried to identify the mechanisms involved in this phenomenon. I also used the organotypic slice culture system. Immediately after preparation causing the primary injury the slices were cultivated with T cells. Th2 cells were found to be more potent to prevent form secondary damage than Th1 cells. The non-CNS specific OVA Th1 and Th2 cells required their antigen to be fully protective. When over stimulated, MBP- and OVA-specific Th1 and Th2 cells proved to be protective to the same extend. Neuroprotection after primary injury depends on the T cell s state of activation and their antigen specificity. Among the cells examined I found Th2 cells were most effective in preventing CNS tissue from secondary injury.

Multiple Sklerose (MS) ist eine chronische neuro-degenerative Erkrankung des zentralen Nervensystems, die durch auto-immun-bedingte Prozesse charakterisiert ist. T Zellen wurden als wesentliche pro-inflammatorische Mediatoren mit der Pathogenese der MS assoziiert. In gesunden Individuen passen Immunzellen ihren Metabolismus, wie die mitochondriale Atmung und Glykolyse, ihrer jeweiligen Funktion und ihrem inflammatorischen Phänotyp an. Im Krankheitsverlauf der MS ist die Bedeutung der metabolischen Anpassung und der damit verbundenen pro-inflammatorischen Mechanismen von T Zell-Subpopulationen noch nicht eindringlich erforscht. Um dieser Fragestellung nachzugehen wurden Relapsing Remitting MS (schubförmig, RRMS) Patienten und sorgfältig aufeinander abgestimmte gesunde Kontrollprobanden als Teil der Studie Depression und Immunfuktion bei MS rekrutiert (n=62). Den Patienten und gesunden Kontrollprobanden wurde Nüchternblut entnommen, woraus periphäre mononukleäre Blutzellen (PBMC) aufgearbeitet wurden, um anschließend CD4+ und CD8+ T Zellen zu isolieren. Die erzielten Ergebnisse zeigten CD4+ T Zell-spezifische Verringerungen der mitochondrialen Atmung und glykolytischen Aktivität in der MS Patienten Kohorte im Vergleich zur Kohorte der gesunden Kontrollprobanden. Darüberhinaus wurden, zusätzlich zu den umfangreichen phänotypischen Charakterisierungen der PBMCs via Durchflußzytometrie, erhöhte Werte des mitochondrialen Membranproteins CPT1a in CD4+ T Zell-Subpopulationen in der MS Patienten Kohorte detektiert. Die Analyse der CD4+ CD25- CD127+ konventionellen T Zell- Subpopulation ergab leicht erniedrigte Werte von IL7-Rα in MS Patienten. Genexpressionsanalysen, die mit pro-inflammatorischen und metabolischen Genen assoziiert sind, ergaben keine Veränderungen in den T Zell-Subpopulationen der MS Patienten. Die in dieser Studie erzielten Ergebnisse weisen auf Funktionsstörungen bei der metabolischen Anpassung in T-Zell-Subpopulationen bei MS Patienten hin und helfen, den Beitrag des Immunmetabolismus bei der Pathogenese der MS Erkrankung besser zu verstehen. / Multiple Sclerosis (MS) is a chronic neurodegenerative disease of the central nervous system characterized by autoimmune-mediated mechanisms. T cells have been associated as central pro-inflammatory mediators in MS pathogenesis. In healthy individuals, immune cells adapt metabolic programs like mitochondrial respiration and glycolysis based on their function and inflammatory phenotype. However, the relevance of metabolic reprogramming and associated pro-inflammatory mechanisms in T cell subpopulations in MS disease is not well understood yet. To address this question, Relapsing Remitting MS (RRMS) patients and meticulously matched healthy control (HC) participants were recruited as part of the clinical study Depression and Immune Function in MS (n=62). Blood samples, after a period of fasting, were collected and CD4+ and CD8+ T cells isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC). The results obtained demonstrated decreased mitochondrial and glycolytic activity specific to CD4+ T cells in the MS patient cohort compared to the HC participant cohort. Furthermore, increased CPT1a mitochondrial membrane protein levels were detected in CD4+ T cell subpopulations in the MS patient cohort as assessed in comprehensive flow cytometry PBMC phenotype investigations. The analysis of the CD4+ CD25- CD127+ conventional T cell subpopulation moreover revealed a trend of decreased IL7-Rα expression levels in MS patients. Gene expression measurements of pro-inflammatory and metabolic genes did not reveal alterations in MS patients’ T cell subpopulations. The results obtained in this study allude to dysfunctions in metabolic reprogramming in T cell subpopulations in MS patients and help to better understand the contribution of immunometabolism in the pathogenesis of MS disease.

Die genaue Implikation natürlicher Killer(NK)-zellen und Neutrophile in Autoimmunerkrankungen des zentralen Nervensystems (ZNS) ist nach wie vor ungeklärt und wurde daher im Mausmodell der multiplen Sklerose (MS), der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis (EAE), sowie bei MS und Neuromyelitis optica (NMO) Patienten untersucht. Bei MS Patienten konnte eine mit der Krankheitsaktivität korrelierende, reduzierte Zahl zirkulierender CX3CR1+NK Zellen festgestellt werden. Daher wurden die NK Zell-Dynamiken und der Einfluss von CX3CR1 auf diese im EAE Mausmodell untersucht. Hierbei konnte in Wildtyp(WT) sowie auch CX3CR1-defizienten EAE Mäusen eine Rekrutierung peripherer NK Zellen in das ZNS beobachtet werden. Anders als bei WT EAE Mäusen wiesen die NK Zellen bei CX3CR1-defizienten Mäusen einen primär unreifen Phänotyp auf, der möglicherweise als ursächlich für die erhöhte Krankheitsaktivität dieser Tiere gemutmaßt werden kann. Der Transfer reifer NK Zellen vor Immunisierung CX3CR1-defizienter Tiere zeigte folglich protektive Effekte und lässt schlussfolgern, dass die CX3CR1-vermittelte Rekrutierung reifer NK Zellen die EAE Neuroinflammation limitiert. Die Diskriminierung der MS von der klinisch ähnlichen NMO stellt nach wie vor eine Herausforderung dar. Neutrophile in ZNS-Läsionen und der Cerebrospinalflüssigkeit(CSF) können bei NMO, nicht aber MS Patienten nachgewiesen werden, weshalb Neutrophile aus dem Blut von NMO und MS Patienten hier vergleichend untersucht wurden. Die Neutrophile beider Patientengruppen wiesen einen aktivierten Phänotyp im Vergleich zu gesunden Kontrollen auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich eine von Medikation und neurologischen Defiziten der Patienten unabhängige, kompromittierte Funktionalität der NMO verglichen mit MS Neutrophilen im Hinblick auf Migration, oxidativen Burst und Degranulierung. Die Neutrophilenfunktionalität könnte entsprechend potentiell als diagnostisches Diskriminierungskriterium zwischen der MS und der NMO dienen. / The implication of natural killer (NK) cells and neutrophils in autoimmune disorders of the central nervous system (CNS) remains elusive, and therefore was investigated in a mouse model for multiple sclerosis (MS), experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), and in patients with MS and neuromyelitis optica (NMO), respectively. In MS, a decreased frequency of circulating CX3CR1+NK cells correlating with the patient disease activity has been reported. Therefore, the pattern of NK cell mobilization and the contribution of CX3CR1 to NK cell dynamics in response to neuroinflammatory insult were investigated in the EAE model. Here, NK cells similarly mobilized from the periphery and accumulated in the CNS in both wild-type (WT) and CX3CR1-deficient mice during EAE. However, in mice lacking CX3CR1 the infiltrated NK cells displayed an immature phenotype contrasting with the mature infiltrates in the WT counterparts, apparently contributing to EAE exacerbation in those animals since transfer of mature WT NK cells prior to immunization of CX3CR1-deficient mice exerted a protective effect. Together, these data suggest that the CX3CR1-mediated recruitment of mature CX3CR1+NK cells limits EAE neuroinflammation. Due to clinical similarities, the discrimination between MS and NMO is still challenging. In contrast to MS, neutrophil accumulations were found in CNS lesions and the cerebrospinal fluid (CSF) of NMO patients wherefore a comparative analysis of peripheral blood neutrophils in NMO and MS patients was performed. The results revealed an activated neutrophil phenotype in NMO and MS when compared to healthy individuals. In contrast, analysis of neutrophil migration, oxidative burst activity and degranulation showed a compromised neutrophil functionality in NMO compared to MS, which was not influenced by the treatment regime and clinical parameters of the patients. Thus, neutrophil functionality may represent a new diagnostic tool to discriminate between NMO and MS.

In einer repräsentativen Querschnittsuntersuchung wurden 1219 Multiple Sklerose Betroffene in Deutschland zu den Auswirkungen der Multiple Sklerose auf deren Lebenssituation und ihrer Einschätzung der medizinischen Versorgung befragt. Schwerpunkte der Untersuchung, die auf einem integrativen Konzept der Patientenorientierung beruht, waren: Soziale Auswirkungen, Krankheitswahrnehmung, Alltagsbewältigung, Lebensqualität, Patienteninformation, Arzt-Patient-Beziehung, Therapieentscheidung und das ACT Programm in der medizinischen Versorgung. Negative Auswirkungen der Multiple Sklerose auf die untersuchten Lebensbereiche sind nachweisbar, aber die Einschätzung differiert in Abhängigkeit von der konkreten Lebenssituation und der Persönlichkeit. Der Schweregrad der körperlichen Einschränkungen steht nur bedingt in Beziehung zur subjektiven Einschätzung der Auswirkungen. Es bestätigt sich außerdem die besondere Bedeutung des nahen persönlichen Umfeldes als wichtigste Quelle der Unterstützung Multiple Sklerose Betroffener. Professionelle Unterstützung wird nur in geringem Maß in Anspruch genommen. Die Anforderungen der Befragten an die medizinische Versorgung sind sehr hoch. Negative Bewertungen der medizinischen Betreuung zeigen sich sowohl bei kritischeren Befragten und als auch bei ausgeprägten Autonomiebedürfnis. Die befragten Multiple Sklerose Betroffenen nutzen überwiegend objektive Informationsquellen als allgemeine Informationsbasis und zur Therapieentscheidung. Subjektives Erfahrungswissen wird meist nur ergänzend herangezogen. Veränderungsbedarf besteht in der medizinischen Versorgung im Bezug auf die Integration kritischerer, informierterer, selbstbewussterer Multiple Sklerose Betroffene und in Bezug auf den Zugang zu den vorhandenen Informations-, Unterstützungs- und Beratungsangeboten. / In a representative study 1219 people with multiple sclerosis in Germany were asked about the impacts of multiple sclerosis on their living situation and their estimation of the medical supply. Main topics were: social impacts, perception of the disease, coping with everyday life, quality of life, patient information, doctor-patient-relationship, shared decision making and the ACT programme as tool in the medical supply. Negative impacts on all analysed areas of the living situation could be proved, but the estimation differs in dependence on the specific living situation and the personality. Unlike the physical disability isn''t a predictor of the individual estimation of the impact. People with multiple sclerosis get their main support by relatives and friends. Professional services are rarely used in relation to the aid by the individual social environment. People with multiple sclerosis have very high expectations on the medical supply. The estimation of the situation is relatively negative if the people are more critical as well as if they have a great need for autonomy. The interrogated people with multiple sclerosis use basically and for their therapy decision mostly objective, medical information. Most of them use subjective knowledge based on experiences only additionally. Medical supply should be optimised by better integrating people with multiple sclerosis who are more critical or self confident as well as better informed. Usability and access of the existing offers to inform, support and counsel people with multiple sclerosis have to be improved.

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Background Growing evidence emphasizes the relevance of sphingolipids for metabolism and immunity of antigen-presenting cells (APC). APCs are key players in balancing tolerogenic and encephalitogenic responses in immunology. In contrast to the well-known prominent effects of sphingosine-1-phosphate (S1P) on lymphocyte trafficking, modulatory effects on APCs have not been fully characterized. Methods Frequencies and activation profiles of dendritic cell (DC) subtypes, monocytes, and T cell subsets in 35 multiple sclerosis (MS) patients were evaluated prior and after undergoing fingolimod treatment for up to 24 months. Impact of fingolimod and S1P on maturation and activation profile, pro-inflammatory cytokine release, and phagocytotic capacity was assessed in vitro and ex vivo. Modulation of DC-dependent programming of naïve CD4+ T cells, as well as CD4+ and CD8+ T cell proliferation, was also investigated in vitro and ex vivo. Results Fingolimod increased peripheral slanDC count—CD1+ DC, and monocyte frequencies remained stable. While CD4+ T cell count decreased, ratio of Treg/Th17 significantly increased in fingolimod-treated patients over time. CD83, CD150, and HLADR were all inhibited, but CD86 was upregulated in DCs after incubation in the presence of fingolimod. Fingolimod but not S1P was associated with reduced release of pro-inflammatory cytokines from DCs and monocytes in vitro and ex vivo. Fingolimod also inhibited phagocytic capacity of slanDCs and monocytes. After fingolimod, slanDCs demonstrated reduced potential to induce interferon–gamma-expressing Th1 or IL-17-expressing Th17 cells and DC-dependent T cell proliferation in vitro and in fingolimod-treated patients. Conclusions We present the first evidence that S1P-directed therapies can act additionally as immunomodulators that decrease the pro-inflammatory capabilities of APCs, which is a crucial element in DC-dependent T cell activation and programming.

Background Growing evidence emphasizes the relevance of sphingolipids for metabolism and immunity of antigen-presenting cells (APC). APCs are key players in balancing tolerogenic and encephalitogenic responses in immunology. In contrast to the well-known prominent effects of sphingosine-1-phosphate (S1P) on lymphocyte trafficking, modulatory effects on APCs have not been fully characterized. Methods Frequencies and activation profiles of dendritic cell (DC) subtypes, monocytes, and T cell subsets in 35 multiple sclerosis (MS) patients were evaluated prior and after undergoing fingolimod treatment for up to 24 months. Impact of fingolimod and S1P on maturation and activation profile, pro-inflammatory cytokine release, and phagocytotic capacity was assessed in vitro and ex vivo. Modulation of DC-dependent programming of naïve CD4+ T cells, as well as CD4+ and CD8+ T cell proliferation, was also investigated in vitro and ex vivo. Results Fingolimod increased peripheral slanDC count—CD1+ DC, and monocyte frequencies remained stable. While CD4+ T cell count decreased, ratio of Treg/Th17 significantly increased in fingolimod-treated patients over time. CD83, CD150, and HLADR were all inhibited, but CD86 was upregulated in DCs after incubation in the presence of fingolimod. Fingolimod but not S1P was associated with reduced release of pro-inflammatory cytokines from DCs and monocytes in vitro and ex vivo. Fingolimod also inhibited phagocytic capacity of slanDCs and monocytes. After fingolimod, slanDCs demonstrated reduced potential to induce interferon–gamma-expressing Th1 or IL-17-expressing Th17 cells and DC-dependent T cell proliferation in vitro and in fingolimod-treated patients. Conclusions We present the first evidence that S1P-directed therapies can act additionally as immunomodulators that decrease the pro-inflammatory capabilities of APCs, which is a crucial element in DC-dependent T cell activation and programming.

Background: Sphingosine 1-phosphat receptor modulators (S1PRMs) have been linked to attenuated immune response to SARS-CoV-2 vaccines. Objective: To characterize differences in the immune response to SARS-CoV-2 vaccines in patients on selective versus unselective S1PRMs. Methods: Monocentric, longitudinal study on people with multiple sclerosis (pwMS) on fingolimod (FTY), siponimod (SIP), ozanimod (OZA), or without disease-modifying therapy (DMT) following primary and booster SARS-CoV-2 vaccination. Anti-SARS-CoV-2 antibodies and T-cell response was measured with electro-chemiluminescent immunoassay and interferon-γ release assay. Results: Primary vaccination induced a significant antibody response in pwMS without DMT while S1PRM patients exhibited reduced antibody titers. The lowest antibodies were found in patients on FTY, whereas patients on OZA and SIP presented significantly higher levels. Booster vaccinations induced increased antibody levels in untreated patients and comparable titers in patients on OZA and SIP, but no increase in FTY-treated patients. While untreated pwMS developed a T-cell response, patients on S1PRMs presented a diminished/absent response. Patients undergoing SARS-CoV-2 vaccination before onset of S1PRMs presented a preserved, although attenuated humoral response, while T-cellular response was blunted. Conclusion: Our data confirm differential effects of selective versus unselective S1PRMs on T- and B-cell response to SARS-CoV-2 vaccination and suggest association with S1PRM selectivity rather than lymphocyte redistribution.