Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-03-23T15:49:46Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoUsoNanoparticulas.pdf: 1640772 bytes, checksum: a5aed1934809db6b93411a3f1d5c38eb (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-03-27T13:02:11Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoUsoNanoparticulas.pdf: 1640772 bytes, checksum: a5aed1934809db6b93411a3f1d5c38eb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-27T13:02:11Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoUsoNanoparticulas.pdf: 1640772 bytes, checksum: a5aed1934809db6b93411a3f1d5c38eb (MD5) Previous issue date: 2014-12-19 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Sistema de nanopartículas à base de lipídios têm sido usados como veículos experimentais para agentes quimioterápicos no tratamento do câncer. Recentemente essas preparações de nanopartículas foram testadas também em modelos animais de doenças inflamatórias cardiovasculares crônicas, doenças reumáticas entre outras. Acredita-se que esses sistemas suspostamente atenuem os graves efeitos tóxicos de agentes quimioterápicos antineoplásicos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da associação do paclitaxel a um sistema de nanopartículas à base de lipídios no tratamento crônico em primatas não-humanos, da espécie Cebus apella, por meio de extensas documentações e métodos detalhados da análise toxicológica através de bioquímica sérica, parâmetros hematológicos e histopatológicos. As nanopartículas a base de lipídios (LDE) eram constituída por ésteres de colesterol esterificado e colesterol, lectina e treolin, com adição de paclitaxel. Foram estudados dezoito Cebus apella; sendo que três animais foram tratados apenas com solução salina, administrada por via intravenosa, a cada três semanas, durante seis ciclos de tratamento; seis animais foram tratados com o paclitaxel associado a LDE no mesmo regime de administração, com três animais recebendo a dose mais baixa do fármaco (175 mg/m²) e três com a dose mais elevada (250mg/m2); seis animais foram tratados com o paclitaxel na forma comercial, sendo que três receberam as doses mais baixas (175 mg/m²) e outros três com doses mais elevadas (250mg/m2). Três semanas após o último ciclo de tratamento foram submetidos a eutanásia por dosagem letal de anestésico, e os fragmentos de tecidos foram recolhidos para a análise histopatológica. Em três animais não-tratados, a cinética plasmática da LDE foi determinada após a injeção intravenosa do colesterol radioativo (3H), seguido de coleta de sangue ao longo de 24 horas. O projeto foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa com animais de experimentação da UFPA (CEPAE/BIO008-11). No grupo LDE-paclitaxel, nenhuma toxicidade clínica foi observada, o peso, assim como o consumo de alimentos foram semelhantes aos animais pertencentes ao grupo controle. O tratamento foi interrompido após o segundo ciclo em quatro animais de grupo que recebeu o paclitaxel na forma comercial, devido a elevada toxicidade clínica, entretanto dois animais completaram os 6 ciclos de tratamento. Esses dois animais apresentaram perda de peso, náuseas e vômitos, diarréia, lesão inflamatória descamativa, perda de 70% do pelo corpóreo e diminuição da atividade física. A dose de paclitaxel 175 mg/m2 é usado em quimioterapia contra o câncer com uma toxicidade considerável, enquanto que a dose a 250 mg/m2 é intolerável e mostra toxicidade considerável nos pacientes. O uso de LDE como transportador de fármaco, em ambos as doses neutralizou consideravelmente a toxicidade do fármaco em primatas não humanos da espécie Cebus apella, intimamente relacionadas a sujeitos humanos. Isso foi observado não só devido as manifestações clínicas, bioquímicas e hematológicas, mas também pela análise histopatológica do estômago, intestino delgado e grosso, esôfago, pâncreas, traqueia e da vesícula biliar. Os resultados suportam a hipótese de que os sistemas de nanopartículas à base de lipídios utilizado como transportadores de droga pode oferecer ferramentas valiosas na diminuição da toxicidade e aumentar a segurança dos agentes quimioterápicos, assim como, amplia a sua utilização em outras doenças crônicas que não o câncer. / Lipid-based nanoparticle systems have been used as vehicles for chemotherapeutic agents in experimental cancer treatments. More recently, those preparations have also been assayed in animal models of cardiovascular, rheumatic and other chronic inflammatory diseases. In general those systems reportedly attenuate the severe toxicities of chemotherapeutic agents. This study was aimed to investigate the effects of associating paclitaxel to a lipid-based nanoparticle system upon the organism of a non-human primate, Cebus apella, by extensively documenting the toxicity by serum biochemistry, hematological and detailed histopathological methods. The lipid nanoparticles (LDE) were constituted of cholesterol esters and esterified cholesterol, lecithin and triolin, with addition of paclitaxel. Eighteen Cebus apella were studied; three animals were treated with LDE only, without paclitaxel, as ministered intravenously every three weeks, during six treatment cycles; six animals were treated with paclitaxel associated to LDE at the same administration scheme, three with the lower (175mg/m2) and three with higher (250mg/m2) paclitaxel doses; six animals were treated with commercial paclitaxel, three with the lower and three with the higher doses levels. Three weeks after the treatment cycle the animals were euthanized by lethal anesthetic dose, and tissues fragments were collected for histopathological analysis. In three non-treated animals, the plasma kinetics of LDE’s labeled with radioactive cholesterol was determined after intravenous injection and blood sampling over 24 hours. The ethics committee in research with experimental animals UFPA (BIO008-11) approved the project. In the LDE-paclitaxel group, no clinical toxicity appeared, and the weight food consumption curve were similar to controls. Treatment was interrupted after the second cycle in four animals of commercial paclitaxel group for very high clinical toxicity but the remaining two complete the 6-cycle-treatment. Those two animals presented weight loss, nausea and vomiting, diarrhea, escame decamation, 70% fur loss and loss of physical activity. The 175mg/m2 paclitaxel dose is used in cancer chemoterapie with considerable toxicity, while the 250 mg/m2 dose shows intorable toxicity to the patients. The use of LDE as carrier in both those levels was almost complete neutralized the toxicity of the drug in this species more closed related to human subjects. This was observed not only by clinical, biochemical and hematological profiles but also by the histopathological analysis of stomach, small and large intestine, esophagus, pancreas, trachea and gallbladder. The current results support the assumption that lipid-based nanoparticles systems used was drug carriers can offer valuable tools decrease the toxicity and increase the safety of the chemotherapeutic agents, while extending the use to chronic diseases other than cancer.

Atualmente, os profissionais da saúde não vêm sendo preparados para lidar com as dificuldades inerentes à morte e o morrer, no entanto, observa-se que, dentre eles, é o médico que vivencia mais negativamente essa realidade, em detrimento das intervenções psicossociais. A literatura aponta que, crenças e práticas religiosas são importantes na vida de muitos pacientes que procuram assistência, entretanto, muitos médicos e demais profissionais da equipe ainda estão incertos sobre a melhor maneira para abordar questões espirituais e religiosas. Esta pesquisa teve a intenção de compreender a vivência de religiosidade de médicos oncologistas no cuidado com o paciente oncológico. Optou-se pela modalidade de pesquisa qualitativa, na perspectiva da Fenomenologia Ontológica- Hermenêutica de Martin Heidegger, para a compreensão das situações vivenciadas. Foram realizadas entrevistas com oito médicos oncologistas, após a assinatura do consentimento livre e informado. As entrevistas foram gravadas e transcritas na íntegra, seguida de uma leitura ampla. Posteriormente, verificadas as convergências e divergências dos relatos, emergiram as categorias de análise. A análise interpretativa desvelou que os médicos têm uma abertura para a compreensão da dimensão religiosa do paciente, no entanto, a fazem com muita dificuldade e ambigüidade quanto às condutas a serem tomadas. Mostram-se sensíveis a uma nova postura médica que precisa de bases seguras para se solidificar, porém encontra-se em momento inicial, na construção de um novo paradigma, que transita entre o cuidar autêntico e o inautêntico. Revelaram a compreensão da importância de Deus, como facilitador ao enfrentamento da facticidade introduzida pelo adoecer e, paralelamente, relataram que, também buscam e confortam-se em sua relação com a espiritualidade e o transcendente. Diante do desamparo sentido pela angústia, na proximidade da fronteira vida-morte, emergem os modos de existir destes cuidadores, na medida em que deparam-se com a finitude humana. Alguns continuam agregados aos rituais religiosos, como missas, velórios e práticas de rezas como forma de elaboração do luto que vivenciam cotidianamente, assim, conservam a dimensão pública do evento morte. Outros mostram-se em uma postura mais contemplativa diante de um Deus interno, cultivando a religiosidade em seu mundo próprio, sem freqüentarem rituais. Acolheram a necessidade do paciente ser-com-o-divino, nos diversos momentos, ao longo do tratamento. Embora, alguns médicos não se sintam confortáveis, ponderando o valor científico das práticas, não há oposição. Tendo em vista que o cuidado permeia toda e qualquer ação humana, segundo a ontologia de Heidegger, podemos vislumbrar, a partir dos resultados desta pesquisa, filosofias educacionais que envolvam os modos de ser-com e suas implicações para o cuidado e o existir autêntico na relação do médico com a religiosidade. (CAPES). / Nowadays, the health professionals have not been prepared to deal with the difficulties inherent to death and dying, however, it is noticeable that, among them, it is the physician who experiences more negatively this reality, for he is the focus of the patients and their relatives. Literature points out that beliefs and religious practices are important the lives of many patients who look for assistance, however, many doctors and other professionals of the staff are still wrong about the best way of approaching spiritual and religious issues. This research had the aim of comprehending the experience of religiosity of oncologist physicians in the caring of the oncologic patient. We opted for the qualitative research, through the perspective of Martin Heideggers Ontological-Hermeneutic Phenomenology, to understand the situations experienced. We interviewed eight oncologist physicians, after the signature of the informed and free consent. The interviews were recorded and transcribed entirely, followed by a broad reading. After the convergences and divergences of the reports were verified, the categories of analysis emerged. The interpretative analysis unveiled that the physicians have an opening for the comprehension of the patients religious dimension, however, they do it with much difficulty and ambiguity in relation to the actions to be taken. It is a new medical posture that needs safe foundations to solidify, but it is in an initial moment, in the construction of a new paradigm that oscillates between the authentic and non-authentic treating. The Physicians revealed the importance of God as a facilitator to the coping with the adversity of sickening and alongside they reported that they also search for and comfort themselves with their relation with spirituality and the transcendental. In the situation of helplessness caused by anguish, in the proximity to death, these care takers existing forms emerge: some continue attached to religious rituals, such as masses, funerals and praying practices as a way of elaborating the grief that they experience daily, so as to keep the public dimension of the death event. Others show themselves in a more contemplative posture before an inner God, cultivating the religiosity in their own world, without attending rituals. The physicians incorporated the patients necessity of being-with-the-divine, in the various moments along the treatment. Although some physicians do not feel comfortable, considering the scientific value of the practices, there is no opposition. Seen that the care permeates all and every human action, according to Heideggers ontology, we can discern educational philosophies that involve the results of this research and the being-with ways and their implications for the caring and the authentic existing in the relationships between physicians and religiosity (CAPES).

O Papilomavírus bovino (BPV) gera prejuízos à pecuária. O trabalho buscou isolar vírions de BPV de papilomas cutâneos previamente diagnosticados e avaliar o potencial clastogênico do vírus através do ensaio cometa (EC). O DNA tecidual foi extraído e submetido a PCR. As bandas foram purificadas e sequenciadas. As sequências foram analisadas através de bioinformática. A tipagem mostrou a prevalência de BPV-2. A análise histopatológica revelou acantose, coilocitose e hiperqueratose. Foi possível detectar a presença de fibroblastos transformados, sugerindo uma via de infecção através do sangue. A imuno-detecção das proteínas L1 e E7 no estroma sugere atividade transformadora do BPV em fibroblastos. O EC mostrou a ação clastogênica estatisticamente igual entre os tipos virais BPV-2, 5 e 9. O isolamento viral foi realizado através de ultracentrifugação em densidade única de cloreto de césio, empregando uma nova metodologia, que se mostrou menos laboriosa do que as já descritas, permitindo o isolamento de vírions de BPV-2, iniciando o banco de vírus proposto. / The Bovine papillomavirus (BPV) generates losses to livestock. The study sought to isolate BPV virions from cutaneous papillomas previously diagnosed and evaluate the clastogenic potential of the virus through the comet assay (EC). The tissue DNA was extracted and subjected to PCR. The bands were purified and sequenced. Sequences were analyzed using bioinformatics. The typing showed the prevalence of BPV-2. Histopathology showed acanthosis, hyperkeratosis and koilocytosis. It was possible to detect the presence of transformed fibroblasts, suggesting a route of infection through the blood. Immunohistochemical detection of L1 and E7 proteins in the stroma suggests transforming activity of BPV in fibroblasts. The EC clastogenic action showed statistically equal among the virus types BPV-2, 5 and 9. Viral isolation was performed by ultracentrifugation in a single cesium chloride density, using a new method that was less laborious than those already described, allowing the isolation of BPV-2 virions, starting the proposed stock virus.

Dissertação de mestrado em Nutrição Clínica apresentada à Faculdade de Ciências de Nutrição e Alimentação da Universidade do Porto / Resumo da dissertação:Sabendo que o arquipélago dos Açores é o local do país com maior número de óbitos por tumores malignos e que são escassos os dados sobre este tema, é de extrema importância debruçarmo-nos sobre ele. A avaliação nutricional deverá estender-se a todos os doentes oncológicos e ser uma das primeiras medidas tomadas. A Avaliação Global Subjectiva Gerada pelo Doente (AGS-GD) é uma ferramenta capaz de avaliar objectivamente os efeitos do suporte nutricional em doentes oncológicos. OBJECTIVOS: Testar a facilidade de aplicação da AGS-GD como ferramenta de avaliação nutricional nos doentes oncológicos, determinar a evolução dos doentes no que respeita ao aconselhamento nutricional, demonstrar o auxílio da intervenção nutricional na redução da morbilidade relacionada com os cuidados prestados e saber se a intervenção nutricional precoce teve ou não influência na melhoria do estado geral. MATERIAL E MÉTODOS: Foram seleccionados consecutivamente 29 doentes com o diagnóstico de doença oncológica de novo para iniciar quimioterapia em ambulatório, aos quais foi aplicada a versão portuguesa da AGS-GD em três momentos distintos do tratamento (início dos 1º, 2º e 3º ciclos de quimioterapia). A amostra foi dividida em dois grupos distintos: um com intervenção nutricional (números ímpares de inclusão no estudo) e outro sem intervenção nutricional (números pares de inclusão no estudo). A intervenção nutricional foi feita de acordo com as recomendações preconizadas pelo questionário. Os participantes foram orientados com aconselhamento alimentar individualizado.(...) / Dissertation abstract:Knowing that the Azores is the Portuguese region with the greatest death rate due to malignant tumors and that information on this subject is scarce, it is extremely important to look further into this topic. Nutritional screening should be offered to all cancer patients and should be one of the first steps to be taken. Patient-Generated Subjective Global Assessment (PG-SGA) is a tool capable of evaluating objectively the nutritional support effects in cancer patients. OBJECTIVES: To test the ease of the application of PG-SGA as a nutritional screening tool in cancer patients, to determine patients development in what concerns nutritional counseling, to demonstrate the nutritional intervention aid in reducing the morbidity related to the health care, to know if early nutritional intervention influences the enhancement of the global status. MATERIAL AND METHODS: Twenty-nine (29) consecutive cancer patients newly diagnosed were selected as they were starting ambulatory chemotherapy, to whom the Portuguese version of PG-SGA was applied in three different moments of treatment (beginning of 1st, 2nd and 3rd chemotherapy courses). The sample was divided in two distinct groups: one receiving nutritional intervention (odd numbers received at the inclusion moment) and other without any nutritional intervention (even numbers received at the inclusion moment). This intervention was made according to the nutritional guidelines recommended by the questionnaire. Patients were oriented with individualized nutritional counseling.(...)

Dissertação de Mestrado em Nutrição Clínica apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa / Resumo da tese: Introdução: A malnutrição em doentes oncológicos é multifactorial e frequente e está relacionada com o aumento da morbilidade e da toxicidade do tratamento, com a redução da resposta ao tratamento e com a diminuição da Qualidade de Vida, piorando o prognóstico e aumentando os custos de saúde. Assim, a Nutrição em oncologia é uma terapêutica e, como tal, deve ser integrada de forma protocolada no tratamento global do doente. Objectivos: A presente monografia tem como objectivo principal a proposta de um protocolo de intervenção nutricional em oncologia, tendo por base o projecto "Nutrição e Oncologia: relevância e linhas de orientação paraa prática clínica", a decorrer na Unidade de Nutrição e Metabolismo, do Instituto de Medicina Molecular da Faculdade de Medicina da Universidade de Lisboa. Pretende-se também, pôr em prática o protocolo proposto. Metodologia: Para a elaboração da proposta de protocolo de intervenção nutricional, foram analisados protocolos internacionais e feita uma revisão bibliográfica com especial ênfase no projecto já mencionado. Quanto à aplicabilidade do protocolo proposta, ocorreu no Serviço de Radioterapia do Hospital dos SAMS, em Lisboa, tendo sido avaliados, na fase pré-tratamento, doentes com tumores de diversas localizações e em diferentes estadios, os quais seriam reavaliados a cada 2 semanas após o início do tratamento, no fim do tratamento e 3 meses após o fim do tratamento. Nas consultas, foi avaliado o estado nutricional, através da Patient-Generated Subjective Global Assessment (PG_SGA), aplicadas escalas de sintomas e os doentes eram inquiridos acerca da ingestão alimentar nas 24h anteriores. Caso a avaliação do estado nutricional assim o indicasse, era efectuada a devida intervenção nutricional individualizada.(...) / Thesis abstract: Introduction: Malnutrition in cancer patients is frequent and multifactorial and is associated with increased morbidity and toxicity of treatment, with reduced response to treatment and with decreased quality of life, worse prognosis and increased health costs. Thus, the nutrition in oncology is a therapy and as such must be integrated in treating the patient. Objectives: This monograph is primarily intended to draft a protocol of nutritional intervention in oncology, based on the project "Nutrition and Cancer: relevance and guidelines for clinical practice", to be held at the Unidade de Nutrição e Metabolismo, Instituo de Medicina Molecular Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa. The aim is also to implement the proposed protocol. Methodology: In developing the proposed protocol for nutritional intervention, were analyzed international protocols and performed a literature review with special emphasis on the project mentioned above. The applicability of the proposed protocol, occurred in the Serviço de Radioterapia of the Hospital SAMS, Lisbon, and patients with tumors of different locations and at different stages were evaluated in the pre-treatment phase and every 2 weeks after the initiation of treatment, at the end of treatment and 3 months after the end of treatment. In the visits, we evaluated the nutritional status, through the Patient-Generated Subjective Global Assessment (PG-SGA), applied scales of symptoms and patients were asked about food intake in the past 24 hours. If the assessment of nutritional status indicated so, patients received individualized nutrition intervention. (...)

Las células tumorales presentan alteraciones metabólicas. Una de las diferencias con las células no transformadas es que los tumores usan más glucosa incluso en condiciones de normoxia, lo que se utiliza actualmente para visualizar tumores mediante la técnica de PET. Ultimamente se están desarrollando terapias basadas en estas particularidades metabólicas de las células tumorales, que las hacen más sensibles a inhibición del metabolismo glicolítico. Aquí estudiamos la muerte producida por la falta de glucosa en sarcomas y otros tipos tumorales. La privación de glucosa induce apoptosis o necrosis dependiendo de la línea celular. Mostramos cómo la privación de glucosa induce actividad caspasa en células deficientes de Bax/Bak, mientras que en las líneas de rabdomiosarcoma induce necrosis. Además la caspasa-8 está implicada en la muerte por ausencia de glucosa en estas células deficientes en Bax/Bak y también en células humanas HeLa. Investigamos el uso de 2-deoxiglucosa como inductor de muerte celular frente a líneas de rabdomiosarcoma alveolar y embrional. La 2-deoxiglucosa promueve muerte celular en líneas de rabdomiosarcoma alveolar. También induce diferenciación acompañada por una bajada de PAX3/FOXO1a, una proteína surgida de la translocación cromosómica en las células de rabdomiosarcoma alveolar y crítica en el desarrollo oncogénico de las mismas. Caracterizamos la muerte celular apoptótica inducida por 2-deoxiglucosa en líneas de sarcoma, in vitro. Estudiamos las moléculas de las rutas de apoptosis que determinan la sensibilidad de estas células a la 2-deoxiglucosa, con especial interés en las proteínas de la familia del oncogén Bcl-2. La muerte celular inducida por el tratamiento está asociada a la activación de Bax y Bak. Observamos que la sobre-expresión de proteínas anti-apoptóticas de la familia Bcl-2 como Bcl-xL y de Mcl-1 previene la apoptosis, indicando que la muerte sucede a través de la ruta mitocondrial. Enseñamos que la bajada de Mcl-1 y la subida de Noxa son críticos en la muerte por 2-DG. Además, la 2-DG promueve estrés reticular acompañado de la inducción de ATF4 y chaperonas. Al bajar los niveles de ATF4, protegemos a las células de la muerte inducida por 2-DG y prevenimos la pérdida de Mcl-1. Incubamos células en presencia de manosa, que revierte el estrés inducido por la 2-DG y previnimos la muerte sin subir los niveles de ATP. Así, el estrés energético causado por la 2-DG no es la principal causa de muerte celular. También la 2-DG promueve la fosforilación de eIF2α, un inductor de ATF4, y la inactivación de mTOR. Nuestros resultados sugieren que el uso de inhibidores glicolíticos como la 2-DG pueden ser efectivos en el tratamiento de los rabdomiosarcoma alveolares y que Noxa podría ser un marcador pronóstico de la eficiencia de estas drogas. Por otro lado, caracterizamos las respuestas a la falta de glucosa y 2-DG, en particular la respuesta autofágica que puede determinar que las células mueran o no en respuesta a la falta de nutrientes. Observamos que las células están sensibilizadas al tratamiento con 2-DG tras el uso de cloroquina. Sin embargo, la presencia de cloroquina no afecta a la privación de glucosa. Intentamos clarificar si la falta de glucosa está induciendo macroautofagia. El flujo de LC3 por western blot nos indica que no hay más macroautofagia ni en células DKO ni en las Rh4 en ausencia de glucosa. Por microscopía confocal y analizando células HeLa y Rh4, tampoco vemos mayores acúmulos de GFP-LC3 tras la retirada de glucosa comparando con tratamientos clásicos de inducción de autofagía como la retirada de aminoácidos o con rapamicina. Estos datos sugieren que la combinación de 2-DG con inhibidores de la autofagia podría ser útil en el tratamiento contra rabdomiosarcomas y que la falta de glucosa no induce autofagia. / Characterization of cell death induced by inhibition of glucose metabolism Rhabdomyosarcoma (RMS) is the most common soft-tissue tumor of childhood characterized by high malignancy, local invasiveness and a marked predisposition to metastasize. Recently, a number of therapies targeting tumor cell metabolism are being developed, since oncogenic changes make tumors more sensitive to inhibition of glycolytic metabolism. We observed that the glycolytic inhibitor 2-deoxyglucose (2-DG) can efficiently promote cell death in p53-deficient alveolar rhabdomyosarcoma (the rhabdomyosarcoma subtype with poorer prognosis), but not in embryonal rhabdomyosarcoma. Differential expression of HIF-1 could not explain the different sensitivity of tumor subtypes. 2-deoxyglucose induced nuclear chromatin condensation, cleavage of caspase substrates and DNA degradation which was inhibited by caspase inhibitors. Cell death triggered by 2-DG was associated with its ability to activate Bax and Bak and was prevented by overexpression of the anti-apoptotic Bcl-2 homologs Bcl-xL and Mcl-1. Conversely, siRNA against Bcl-xL or Mcl-1 accelerated death. 2-DG promoted downregulation of the anti-apoptotic protein Mcl-1 and accumulation of two BH3-only proteins, Noxa and Bim. siRNA against these proteins indicated that Noxa mediates 2-DG-induced cell death. Addition of different carbon/energy sources indicated that apoptosis is not associated with loss of ATP but rather with endoplasmic reticulum stress and the eIF2-alpha-ATF4 pathway. 2-DG promoted Mcl-1 loss, probably due to general inhibition of translation, since both eIF2-alpha phosphorylation and inactivation of the mTOR pathway were observed. All these events (ER stress, energetic stress and inhibition of the mTOR pathway) are known to induce autophagy. Indeed, 2-DG induces autophagy, and inhibition of autophagy at different levels sensitizes cells to 2-DG. Together, our findings suggest that glycolysis inhibitors such as 2-DG may be effective in treating alveolar rhabdomyosarcoma.

INTRODUCCIÓ: Les neoplàsies limfoides agrupen un conjunt de malalties que, tot i compartir certes característiques comunes, presenten una gran heterogeneïtat en la seva biologia i manifestacions clíniques. En la present tesi s´han estudiat els mecanismes moleculars implicats en el desenvolupament i progressió de diferents entitats que s´inclouen dins del grup dels Limfomes No-Hodgkin de cèl·lula B (NHL, de l´anglès Non-Hodgkin Lymphoma), especialment el limfoma de cèl·lules del mantell (MCL, de l´anglès Mantle Cell Lymphoma) i la leucèmia limfàtica crònica (CLL, de l´anglès Chronic Lymphocytic Leukemia), els quals són limfomes de cèl·lula B petita. MATERIAL I MÈTODES: En aquest treball s´han emprat una gran diversitat de tècniques experimentals, de les que destaquen la hibridació genòmica comparada (CGH, de l´anglès Comparative Genomic Hybridization) per estudiar les alteracions cromosòmiques dels tumors, la reacció en cadena de la polimerasa (PCR, de l´anglès Polymerase Chain Reaction) i la cromatografia líquida desnaturalitzant (DHPLC, de l´anglès Denaturing High Perfomance Liquid Chromatography) per determinar l´adquisició d´alteracions en el material genètic a nivell de DNA; així com la PCR quantitativa a temps real (qPCR) i la realització de microarrays d´oligonucleòtids d´alta densitat per analitzar l´expressió gènica a nivell de mRNA.RESULTATS I CONCLUSIONS: L´estudi de gens implicats en la proliferació de MCL ha permès la construcció d´un model predictor de la supervivència dels pacients basat en l´expressió dels cinc gens RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 i SLC29A2. Aquest model es pot aplicar tant en material congelat com en teixits biològics fixats amb formol i inclosos en parafina (FFPE, de l´anglès Formalin-Fixed and Paraffin-Embedded tissue), podent ésser útil en la presa de decisions terapèutiques1. També s´ha estudiat el gen MDM2, implicat en les vies de resposta al dany del DNA. S´ha observat que, a part de les alteracions del gen p53, l´augment de l´expressió gènica de MDM2 es correlaciona directament amb una disminució de la supervivència en MCL. En alguns casos aquest augment de l´expressió pot donar-se per guany del locus genòmic del gen, mentre que la presència del SNP309 al seu promotor no es relaciona amb els canvis d´expressió (2).La desregulació dels mecanismes implicats en la mort cel·lular programada o apoptosi també juga un paper clau en els processos de tumorogènesi. S´ha observat que els receptors de mort TNFRSF10A i TNFRSF10B es troben poc mutats en neoplàsies limfoides, indicant que la seva alteració no és rellevant per explicar la resistència a l´apoptosi observada en aquests tipus de limfomes. Tot i això, la presència del polimorfisme A1322G al domini de mort de TNFRSF10A s´associa amb un augment de risc a patir MCL i CLL; mentre que la presència del polimorfisme C626G al domini d´unió a lligand de TNFRSF10A sembla jugar un paper protector en MCL; suggerint un possible paper de dits polimorfismes en la resistència a la mort mediada per TRAIL (3).Finalment, l´estudi global de les alteracions que participen en els fenòmens de progressió clínica primerenca de la CLL ha permès determinar la modulació de l´expressió d´un petit grup de gens (58) que participen en diferents vies cel·lulars. Destaca un subconjunt de gens que actuen en la inhibició de l´adhesió i motilitats cel·lulars, els quals presenten una disminució de la seva expressió. També s´ha observat que la progressió clínica de les CLL s´associa, en alguns casos, amb la inactivació de certs gens supressors de tumors. Per altra banda, l´evolució primerenca d´aquest tips de leucèmia sembla implicar poca inestabilitat cromosòmica (4).ARTICLES GENERATS PER LA PRESENT TESI:(1). Hartmann E, Fernandez V, Moreno V, Valls J, Hernandez L, Bosch F, Müller-Hermelink HK, Ott G, Rosenwald A, Campo E. A five-gene model to predict survival in mantle cell lymphoma and its application to formalin-fixed paraffin-embedded tissue. J Clin Oncol, under revision (Journal impact factor 2006: 13.598).(2). Hartmann E, Fernandez V, Stoecklein H, Hernández L, Campo E, Rosenwald A. Increased MDM2 expression is associated with inferior survival in mantle cell lymphoma, but not related to the MDM2 SNP309, Haematologica, 92:574-575 (Journal impact factor 2006: 5.032).(3). Fernandez V, Jares P, Bea S, Salaverria I, Guino E, de Sanjose S, Colomer D, Ott G, Montserrat E, Campo E. Frequent polymorphic changes but not mutations of TRAIL receptors DR4 and DR5 in mantle cell lymphoma and other B-cell lymphoid neoplasms. Haematologica. 2004 Nov;89(11):1322-31 (Journal impact factor 2006: 5.032).(4). Fernandez V, Jares P, Salaverria I, Giné E, Beà S, Aymerich M, Colomer D, Villamor N, Bosch F, Montserrat E, Campo E. Gene expression profile and genomic changes in disease progression of early-stage chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, accepted (Journal impact factor 2006: 5.032). / "ANALYSIS OF THE MOLECULAR MECHANISMS IMPLIED IN THE DEVELOPMENT AND PROGRESSION OF SMALL B CELL LYMPHOMAS" INTRODUCTION:Different molecular mechanisms implied in the development and progression of distinct subtypes of small B cell lymphomas that belong to Non-Hodgkin´s Lymphomas (NHL) have been studied in the present work, specially focusing on Mantle Cell Lymphoma (MCL) and Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL).MATERIALS AND METHODS:Comparative genomic hybridization (CGH) has been aplied to study the chromosomal alterations of the tumors. Polymerase chain reaction (PCR) and denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC) techniques have been performed to detect nucleotide alterations in certain genes; whereas real time quantitative PCR (qPCR) and high density oligonucleotide microarrays have been used to analyse gene expression.RESULTS AND DISCUSSION:The gene expression model composed of the five genes RAN, MYC, TNFRSF10B, POLE2 and SLC29A2 allows the survival prediction of MCL patients with widely disparate clinical outcome and is superior to the immunohistochemical marker Ki-67. The predictor is applicable to fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tumor samples. On the other side, the study of the MDM2 gene has shown that increased gene expression correlates with inferior survival in MCL. MDM2 overexpression is associated with copy number gains of the MDM2 locus in single tumors, but not with the recently reported MDM2 promoter SNP309.The study of the death receptors TNFRSF10A and TNFRSF10B has shown that mutations in these genes are uncommon in lymphoid neoplasms, but the presence of certain TNFRSF10A polymorphisms (A1322G in the death domain and C626G in the extracellular binding domain) can contribute to the pathogenesis of these malignancies. The study of early clinical progression in CLL has allowed the identification of a significant modulation of the gene expression of 58 genes, with a particular downregulation of genes that are inhibitors of cell adhesion and motility. On the other side, our results indicate that clinical progression of early stage CLL is associated with karyotype evolution and inactivation of certain tumor suppressor genes.

El càncer de pròstata és un tipus de càncer de creixement lent, estructura heterogènia, etiologia desconeguda diagnosticat generalment en homes d'edat avançada (>50 anys). Excloent el càncer de pell no melanocític, és el tumor més freqüent (19,6%) en els homes a Catalunya. De manera natural evoluciona cap a la independència hormonal, tot i que es creu que aquesta transició és accelerada pel tractament amb antiandrògens. La interacció entre estroma i epiteli és d'una gran importància per a l'evolució del tumor.El concepte de cèl·lula mare cancerosa fa referència a una suposada població cel·lular tumoral, amb característiques anàlogues a les de les cèl·lules mare normals, responsable de la generació i manteniment tumorals. La side population (SP), és un conjunt de cèl·lules discriminat per citometria de flux amb capacitat per bombejar certes drogues, xenobiòtics, hormones i altres compostos, que s'ha vist que està enriquida en cèl·lules mare en alguns sistemes.En aquest treball es va proposar de trobar cèl·lules mare canceroses bàsicament en dos models de càncer de pròstata diferents: les línies cel·lulars LNCaP i PC-3 i el model animal PAC-120 (xenotrasplantament d'adenocarcinoma hormonodependent que recapitula de manera fiable el càncer de pròstata). Per tal d'assolir el primer objectiu d'identificar-les, es va proposar l'assaig de side population, per tal i com s'ha demostrat la seva validesa per aïllar poblacions enriquides en cèl·lules mare i és un assaig que dóna informació funcional sobre les cèl·lules i en manté la seva viabilitat. A més, aquesta tècnica permetia també assolir el segon objectiu i parcialment el tercer, és a dir aïllarles i caracteritzar-les.Partint de la hipòtesi nul·la que hi ha cèl·lules amb característiques de cèl·lules mare al càncer de pròstata, els objectius d'aquesta tesi per punts han estat:1. Identificar i aïllar cèl·lules de la side population tant als tumors del PAC-120 com a les línies cel·lulars LNCaP i PC-3.2. Caracteritzar els perfils gènics de les cèl·lules de la side population aïllades.3. Comprovar la seva naturalesa progenitora mitjançant assaigs de diferenciació in Vitro o de tumorigènesi in vivo.4. Analitzar l'existència de cèl·lules tumorals disseminades al moll d'os del model PAC-120 i estudiar la seva possible naturalesa progenitora.Els resultats d'aquest treball demostren que el tumor del model PAC-120, format per una barreja d'epiteli humà i estroma murí, conté cèl·lules de la side population i que els cultius del tumor PAC-120 també contenen cèl·lules de la side population. La separació i anàlisi clonal de les cèl·lules de la side population dels cultius revelen que aquestes tenen una capacitat variable de donar lloc a cèl·lules de la side population. A més, l'estudi dels perfils gènics d'aquestes cèl·lules, la seva expressió proteica (immunofenotip Cd45- Sca-1+ Cd81+), la seva adherència al plàstic, la seva morfologia fibroblastoide, la seva gran capacitat proliferativa i la seva capacitat de diferenciació revelen que són cèl·lules multipotents estromals. Per tant, el tumor PAC-120 conté cèl·lules multipotents estromals que poden ser aïllades mitjançant l'assaig de la side population. Així mateix, el fenotip SP d'aquestes cèl·lules està associat amb el seu estat de diferenciació, ja que la seva diferenciació en comporta la pèrdua.D'altra banda, s'ha demostrat que les cèl·lules multipotents estromals aïllades secreten TGF-beta de manera autocrina i tenen la via del TGF-beta activa. El TGF-beta manté la proliferació i inhibeix la diferenciació de les cèl·lules multipotents estromals obtingudes del tumor.Quant a les línies, en aquest treball s'ha demostrat que tant LNCaP i PC-3 contenen cèl·lules de la side population, i presenten RNA i proteïna del transportador ABCG2. El promotor d'ABCG2 està parcialment desmetilat a la línia cel·lular LNCaP i molt metilat a PC-3. L'addició del composta bloquejador de la metilació de novo 5-aza afavoreix la desmetilació del promotor d'ABCG2, la transcripció del gen, la traducció de la proteïna i l'augment de la side population. A més, el sèrum i l'estradiol regulen a l'alça la transcripció d'ABCG2 i, en el cas del sèrum, també de la side population a la línia cel·lular LNCaP. / Cancer Stem Cells are a distinct cellular population that is believed to be responsible for tumor initiation and maintenance. Recent data suggest that solid tumors also contain another type of stem cells, the mesenchymal stem cells or multipotent mesenchymal stromal cells (MSC), which contribute to the formation of tumor-associated stroma.The Hoechst 33342 efflux assay has proved useful to identify a rare cellular fraction, named Side Population (SP), enriched in cells with stem-like properties. Using this assay, we identified SP in a prostate cancer xenograft containing human prostate cancer cells and mouse stromal cells. The SP isolation, subculture and sequential sorting allowed the generation of single-cell-derived clones of murine origin that were recognized as MSC by their morphology, plastic adherence, proliferative potential, adipogenic and osteogenic differentiation ability and immunophenotype (CD45-, CD81+ and Sca-1+). We also demonstrated that SP clonal cells secrete transforming growth factor β1 (TGF-β1) and that their inhibition reduces proliferation and accelerates differentiation.These results reveal the existence of SP in the stroma of a cancer xenograft, and provide evidence supporting their MSC nature and the role of TGF-β1 in maintaining their proliferation and undifferentiated status. Our data also reveal the usefulness of the SP assay to identify and isolate MSC cells from carcinomas.Concerning to cell lines, previous studies reported the presence of SP in prostate cancer tissues but not in the most widely used prostate cancer cell lines LNCaP and PC3. Using the SP flow cytometric assay, we demonstrate that SP cells are present in LNCaP and PC3 cells and that their abundance change with the serum concentration and steroid ablation. In addition, RT-PCR analysis evidences that ABCG2 is expressed in both cell lines and that its expression significantly increases when LNCaP cells are treated with estradiol (E2) and the demethylation agent 5-aza-2'-deoxycytidine (5-aza-dC). Finally, our results also show that the ABCG2 gene expression relates negatively with the number of methylated CpG islands in its promoter and positively with the abundance of SP in LNCaP cells. In conclusion, these results demonstrate that prostate cancer cell lines LNCaP and PC3 do contain SP cells and express the ABCG2 transporter, and suggest that the changes in the SP abundance in these cell lines most likely reflect the modulation of the transporter activity by the environment than an enrichment in cancer stem cells.

En la present tesi doctoral es presenta, des d'una perspectiva narrativa i socioconstruccionista, una aproximació a l'estudi de l'experiència de malaltia en càncer a partir del treball amb relats narrats. Es realitza una anàlisi narrativa de la construcció de les històries de malaltia a partir dels relats escrits per les persones "malaltes" i /o els seus familiars. Es cerquen elements per a la reflexió de: a) el paper de la narració en la comprensió de l'experiència de malaltia oncològica i la construcció narrativa d'identitat; b) l'ús del mètode d'anàlisi narrativa dins el camp de la salut/malaltia; i c) implicacions i aplicacions en la pràctica terapèutica. Seguint una orientació metodològica qualitativa, s'analitza la construcció de narratives de malaltia i del self, la construcció i relació amb els personatges de la història, la construcció de la malaltia (càncer), així com les potencialitats i limitacions de l'aproximació narrativa en l'estudi. Finalment, es presenten elements narratius per a la reflexió del seu ús en l'atenció psicològica i la pràctica del professional de la salut en càncer. / In this doctoral thesis it is presented, from a narrative and socio constructionist perspective, an approach to the study of the cancer disease experience, based on working with narrated tales. A narrative analysis of disease stories construction is done from the tales written by ill people or their relatives. Elements for reflection are searched about: a) the narration role in the oncological disease experience understanding and the narrative construction of identity; b) the use of the narrative analysis method in the health/disease context; and c) implications and applications in the therapeutic practice. Following a qualitative methodological orientation, the disease and self narratives, the construction and relation between the story characters, and the disease construction (cancer) are analysed, as well as the potentials and limitations of the study narrative approach. Finally, narrative elements are presented for the reflection about its use in the psychological attention and cancer health professional practice.

Els linfomes no hodgkinianos són un grup heterogeni de neoplasies del sistema linforreticular. Sota el terme genèric de linfoma s'engloben neoplasies de ràpid creixement i elevada agressivitat, vaig agafar com altre bé tolerat durant mesos o anys. L'heterogeneïtat dels processos inclosos dintre dels linfomes es tradueix en una àmplia variabilitat en la presentació clínica, història natural i pronòstic de la malaltia. La caracterització dels linfomes s'ha fonamentat fonamentalment en la valoració histopatològica de biòpsies de mostres d'origen ganglionar o extraganglionar. Donada la diversitat del comportament dels linfomes, s'ha intentat estratificar als malalts afectes de linfoma en grups amb distint pronòstic segons la classificació histològica, de l'extensió de la malaltia, de la biologia tumoral, etc.. / Los linfomas no hodgkinianos son un grupo heterogéneo de neoplasias del sistema linforreticular. Bajo el término genérico de linfoma se engloban neoplasias de rápido crecimiento y elevada agresividad, así como otras bien toleradas durante meses o años. La heterogeneidad de los procesos incluidos dentro de los linfomas se traduce en una amplia variabilidad en la presentación clínica, historia natural y pronóstico de la enfermedad. La caracterización de los linfomas se ha basado fundamentalmente en la valoración histopatológica de biopsias de muestras de origen ganglionar o extraganglionar. Dada la diversidad del comportamiento de los linfomas, se ha intentado estratificar a los enfermos afectos de linfoma en grupos con distinto pronóstico en función de la clasificación histológica, de la extensión de la enfermedad, de la biología tumoral, etc..