A abundância e diversidade dos microrganismos do solo podem ser influenciadas por grande número de fatores, associados, principalmente, ao tipo de solo, sua cobertura e uso. A microbiota do solo apresenta grande importância pelos processos desempenhados pelos seus organismos, essenciais para todos os ecossistemas terrestres. Apesar da grande complexidade associada a esses estudos, os fatores que influenciam as comunidades microbianas podem ser melhor elucidados pela pesquisa com grupos específicos. Nesse sentido, o filo bacteriano Verrucomicrobia, grupo ubíquo em solos, apresenta elevada abundância em diferentes ambientes, o que sugere sua grande importância ecológica. Mas, pela dificuldade de isolamento de seus organismos, ainda pouco se sabe a respeito da ecologia do filo. O presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de analisar os efeitos do uso do solo e da rizosfera de cana-de-açúcar nas comunidades de Bacteria e do filo Verrucomicrobia. Com essa finalidade, amostras de solo foram coletadas em áreas sob diferentes usos em uma usina sucroalcooleira na cidade de Piracicaba (SP). As amostras foram utilizadas em dois estudos distintos. No primeiro, foram analisadas as comunidades microbianas presentes nas amostras de solo obtidas na coleta das áreas de estudo e, no segundo, retiradas de um experimento controlado conduzido em estufa para analisar o efeito do uso do solo e, principalmente, da rizosfera nas mesmas. As comunidades foram avaliadas quanto a sua abundância, pela técnica de qPCR, e estrutura, pela técnica de T-RFLP. No primeiro estudo, a diversidade do filo também foi acessada pelo desenvolvimento de bibliotecas do seu gene 16S rRNA. Os resultados dos estudos indicam que a comunidade bacteriana e, principalmente, do filo foram afetadas pelo uso do solo e pelo manejo adotado em cada área, o que evidencia a importância de sistemas conservacionistas. A análise das bibliotecas demonstrou que o filo Verrucomicrobia apresentou maior diversidade na mata nativa do que nos canaviais. Adicionalmente, a incidência e a abundância das subdivisões do grupo foram alteradas de acordo com o uso do solo. As comunidades também foram influenciadas pela rizosfera em sua estrutura e abundância, resultados de grande interesse para o estudo do filo, pois poucos trabalhos analisaram o efeito rizosférico em seus organismos. Além disso, a sua elevada abundância encontrada no estudo, que tem sido comumente subestimada, ressalta a importância de trabalhos com foco específico em grupos de interesse / The abundance and diversity of soil microbial communities can be influenced by many factors, mainly associated with soil type, its coverage and use. The soil microbiota has great importance due to the processes performed by its organisms, essential for all terrestrial ecosystems. Despite the great complexity associated with these studies, the factors that affect the microbial communities can be better explained through the research of specific groups. In this sense, the bacterial phylum Verrucomicrobia, a ubiquitous soil group, presents high abundance in different environments, which suggests its great ecological importance. But due to the difficulty of isolating its organisms, little is known about the ecology of the phylum. The present work was developed with the objective of analyzing the effect of land use changes and sugarcane rhizosphere on the structure and abundance of Bacteria and Verrucomicrobia communities. For this purpose, soil samples were collected in areas under different land uses in a sugarcane mill in Piracicaba (SP). The samples were used in two separate studies. In the first, the microbial communities present in soil samples obtained in the sampling areas were analyzed and, in the second, taken from a controlled experiment conducted in a greenhouse to analyze the effect of land use and, especially, the rhizosphere on the communities. The communities were evaluated for their abundance, by the qPCR technique, and structure, by T-RFLP. In the first study, the phylum diversity was also accessed with the development of 16S rRNA gene libraries. The results from the studies indicate that bacterial and, especially, the phylum community were affected by land use and the management adopted in each area, which evidences the importance of conservationist systems. The analysis of the clone library demonstrated that the phylum Verrucomicrobia presented greater diversity in native vegetation than in the sugarcane fields. Additionally, the incidence and abundance of the group subdivisions have been changed in accordance with land use. The structure and abundance of the communities were also influenced by the rhizosphere, results of great interest to the reserach of the phylum, since few studies have analyzed the rhizosphere effect on its organisms. Furthermore, the high abundance of the phylum found in the study, which has been commonly underestimated, emphasizes the importance of research with specific focus on groups of interest

Submitted by Jorge Silva (jorgelmsilva@ufrrj.br) on 2018-09-21T19:29:33Z No. of bitstreams: 1 2016 - Caroline Barra Sales Khayat da Costa.pdf: 5220401 bytes, checksum: 553248261c960b6b5fb62cadb1b26ebf (MD5) / Made available in DSpace on 2018-09-21T19:29:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016 - Caroline Barra Sales Khayat da Costa.pdf: 5220401 bytes, checksum: 553248261c960b6b5fb62cadb1b26ebf (MD5) Previous issue date: 2016-07-26 / CAPES / One of the most known and important process in nature is the biological nitrogen fixation (FBN). Few classes of microorganisms perform this process; named diazotrophics that associated with plants is an important alternative to enhance nitrogen nutrition in agricultural systems. Diazotrophic bacterial population in association with sugarcane improves the yield due to its ability to colonize the inner roots of the host plant and do not provoke any pathogenicity signal. Quantitative analyzes have indicated that selection of combinations of endophytic diazotrophic strains when associated with sugarcane varieties can improve the yield and therefore varieties of sugarcane may be better exploited in order to benefit this association for agricultural purposes. Thus, this work proposes to monitor the establishment of diazotrophic bacteria present in the inoculant of Embrapa, during the initial development of sugarcane plants. Micro-propagated sets of the sugarcane variety RB867515 were inoculated individually and with a mixture of five nitrogen fixing bacteria strains that compose the sugarcane inoculant: Nitrospirillum amazonense (CBAmC) Paraburkholderia tropica (Ppe8) Gluconacetobacter diazotrophicus (Pal5) Herbaspirillum seropedicae (HRC54) and Herbaspirillum rubrisubalbicans (HCC103). Plants were grown in a greenhouse and harvested 30 days after planting. Fresh root material was separated for evaluation of the establishment of the strains by bacterial counting using the technique of Most Probable Number (MPN), absolute quantification by Real Time PCR (qPCR), besides the identification of the inoculated strains through analysis of the rDNA profile of the pellicle formed in the respective semisolid media using the BOX-PCR technique. The results of bacterial count diazotrophic present in the roots by NMP showed that the treatments inoculated in the control (native population) showed higher population of bacterial cells around 105 cells by fresh root mass, but not statistically significant. The methodology qPCR permitted quantitation of the number of 16S rDNA copies in the order of 105 bacterial cells g - 1 fresh weight root, showing that there were differences in the population of endophytic species that colonize the roots of sugarcane. The profiles of BOX -PCR of the respective pellicles formed in semisolid media did not show high similarity (> 80 %) with the profile of the species inoculated for most of the treatments. The results obtained indicate that the qPCR technique showed the establishment of some of the inoculated strains in sugar cane buds while the NMP technique showed no significant difference between treatments inoculated and non-inoculated possibly due to the lower sensitivity of the method. / Um dos processos mais conhecidos e importantes na natureza ? a fixa??o biol?gica de nitrog?nio atmosf?rico (FBN). Este processo ? realizado por algumas classes de microrganismos, denominados diazotr?ficos, que associados com esp?cies vegetais s?o uma alternativa importante para aprimorar a nutri??o nitrogenada nos sistemas agr?colas. As popula??es de bact?rias fixadoras de nitrog?nio atmosf?rico quando associadas ? cultura da cana-de-a??car melhoram a produ??o e, ao colonizarem o interior das ra?zes promovem benef?cios ?s plantas hospedeiras. An?lises quantitativas t?m indicado que a sele??o das combina??es de estirpes de bact?rias diazotr?ficas endof?ticas e variedades de cana-de-a??car podem ser melhor exploradas com o objetivo de aperfei?oar a associa??o para finalidades agr?colas. Assim, o presente trabalho prop?e monitorar o estabelecimento das bact?rias diazotr?ficas presentes no inoculante para cana-de- a??car da Embrapa, durante o desenvolvimento inicial planta. Toletes propagados da variedade RB867515 de cana-de-a??car foram inoculados individualmente e com a mistura das cinco estirpes de bact?rias diazotr?ficas: Nitrospirillum amazonense (CBAmC), Paraburkholderia tropica (PPe8), Gluconacetobacter diazotrophicus (Pal5), Herbaspirillum seropedicae (HRC54) e Herbaspirillum rubrisubalbicans (HCC103). As plantas foram crescidas em casa de vegeta??o e coletadas 30 dias ap?s o plantio, sendo separado o material vegetal para avalia??o do estabelecimento das estirpes pela t?cnica do N?mero Mais Prov?vel (NMP) e quantifica??o absoluta por PCR em Tempo Real (qPCR). Adicionalmente foi feita a identifica??o das estirpes inoculadas atrav?s da an?lise do perfil de rDNA das pel?culas bacterianas formadas nos respectivos meios semiss?lidos pela t?cnica de BOX-PCR. Os resultados obtidos da contagem de bact?rias diazotr?ficas presente nas ra?zes por NMP mostrou que os tratamentos inoculados em rela??o ao controle (popula??o nativa), apresentaram uma maior popula??o de c?lulas bacterianas em torno de 105 c?lulas por massa fresca de raiz, por?m n?o significativa. A metodologia de qPCR permitiu a quantifica??o do n?mero de c?pias do 16S rDNA, da ordem de 105 c?lulas bacterianas g-1 massa fresca de raiz, mostrando que houve diferen?a na popula??o das esp?cies diazotr?ficas endof?ticas que colonizam as ra?zes de cana-de-a??car. Os perfis obtidos por BOX-PCR das pel?culas formadas nos respectivos meios semiss?lidos n?o mostraram alta similaridade (>80%) com o perfil das esp?cies inoculadas para a maioria dos tratamentos inoculados. Os resultados obtidos indicam que a t?cnica de qPCR permitiu mostrar o estabelecimento de algumas estirpe do inoculante nos toletes de cana-de a??car enquanto que a t?cnica de NMP n?o mostrou diferen?a significativas entre os tratamentos inoculados e n?o inoculados possivelmente pela menor sensibilidade da metodologia.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:14Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-07-24Bitstream added on 2014-06-13T20:43:03Z : No. of bitstreams: 1 colombo_j_dr_sjrp.pdf: 949474 bytes, checksum: 856a4b47ea1a9aa6adebae3e2e97b6a0 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os tumores de cabeça e pescoço ocupam, mundialmente, a quinta posição na lista das neoplasias mais freqüentes. O tipo histológico predominante é o carcinoma de células escamosas, que acomete a cavidade oral, a orofaringe, a hipofaringe e a laringe. O tumor de laringe é um dos tipos mais comuns, correspondendo a 25% dos casos, com alto índice de mortalidade e prognóstico reservado. O principal fator etiológico para o seu desenvolvimento é o consumo combinado de álcool e fumo. O desenvolvimento do câncer de cabeça e pescoço é um processo multipasso acompanhado por mudanças genéticas e epigenéticas. Recentemente, estudos envolvendo a tecnologia microarray têm identificado genes específicos, cuja expressão está alterada em câncer de cabeça e pescoço quando comparado ao tecido normal. No entanto, a maioria dos estudos são realizados usando tumores de diferentes sítios. Neste estudo, foi analisado somente amostras de carcinoma de laringe para minimizar as diferenças genéticas. Dessa forma, os objetivos do presente projeto foram identificar e validar possíveis biomarcadores moleculares envolvidos na carcinogênese de laringe. Para tanto, foi construído um cDNA microarray com 340 genes previamente identificados pelo Head and Neck Annotation Consortium. A expressão desses genes foi analisada em 8 amostras de tecido tumoral e em 4 amostras de tecido histologicamente normal de laringe pela técnica de microarray. Foram identificados 35 genes diferencialmente expressos (SNR ½1.0½, p-value 0.001), os quais estão envolvidos em diversos processos celulares como adesão celular, apoptose, ciclo celular, inibição de proteases, metabolismo, proteólise, reparo de DNA, regulação da transcrição e transdução de sinal. A robustez da assinatura dos 35 genes diferencialmente expressos foi confirmada em um conjunto adicional de 5 amostras tumorais e 6 amostras... / Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the fifth most common cancer world-wide. More than 90% of this cancer type has a squamous origin and common sites include oral cavity, oropharynx, hypopharynx and larynx Laryngeal squamous cell carcinoma is very common in head and neck cancer, corresponding to 25% of cases, with high mortality rates and poor prognosis. Tobacco use and/or alcohol consumption are the two principal risk factors involved in development of HNSCC. The development of head and neck cancer is a multistep process accompanied by genetic and epigenetic changes. In recent years, studies involving microarrays have identified specific genes whose expression has changed in head and neck cancer compared with normal tissue. However, most microarray studies are performed using tumors from different sites in head and neck. In our study, we analyzed only larynx carcinoma samples to minimize the genetic differences. Thus, the purpose of this work was to identify and to validater molecular biomarkers involved in larynx carcinogenesis. Therefore, we constructed a cDNA microarray containing 340 genes previously identified by Head and Neck Annotation Consortium. Expression analysis was applied to 8 larynx tumor samples and 4 larynx normal samples. We identified 35 differentially expressed genes between tumor and non-tumor adjacent tissue of larynx (SNR ½1.0½, p-value 0.001). Genes detected were involved in processes as apoptosis, cell adhesion, cell cycle, DNA repair, metabolism, protease inhibition, proteolysis, signal transduction and transcription regulation. The robustness of the 35-gene signature was confirmed using data from an additional set of 5 larynx tumor samples and 6 adjacent non-tumor larynx tissues. For real time RT-PCR validation we selected fourteen genes, of which 10 (ADCY6, AES, AL2SCR3, CRR9, CSTB, DUSP1, MAP3K5, PLAT, UBL1 and ZNF706) were validated... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-02-26Bitstream added on 2014-06-13T19:57:05Z : No. of bitstreams: 1 okino_ch_me_jabo.pdf: 1181305 bytes, checksum: cf91a5205aface873e536d06ccd0eb78 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / A bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é uma doença infecciosa que está amplamente disseminada entre as criações avícolas brasileiras e é uma das enfermidades virais que mais têm causado perdas econômicas na atualidade. Portanto, a rápida detecção e identificação do agente causal são imprescindíveis para que medidas eficazes de controle sejam prontamente tomadas. Para tanto, é necessário que os métodos de diagnóstico empregados sejam sensíveis, específicos, rápidos e também de baixo custo. Nesse contexto, a técnica de RTPCR em tempo real abordada no presente estudo permitiu a amplificação de duas regiões de hipervariabilidade do gene S1 de 17 estirpes diferentes do vírus da BIG (VBI), que foram testadas, mas não foi capaz de amplificar nenhum dos RNAvírus heterólogos analisados (vírus da doença de Newcastle, pneumovírus aviário e vírus da doença de Gumboro). Com essa mesma técnica foi possível fazer a diferenciação em grupos geneticamente distintos, de estirpes do VBI através de análises das curvas de dissociação de fragmentos amplificados a partir das regiões de hipervariabilidade gênica I e II do gene S1. A RT-PCR em tempo real desenvolvida apresentou maior sensibilidade na detecção do VBI em amostras teciduais, quando comparada à técnica padrão de Isolamento Viral em ovos embrionados de galinha... / The avian infectious bronchitis virus (IBV) is an infectious disease widely spread in Brazilian commercial poultries where causes significant economical losses. Rapid and accurate diagnosis of the IBV strain involved in a field outbreak is necessary to establish an effective control of this disease. The real-time RT-PCR performed in this study to amplify two hypervariable regions of S1 gene, was able to detect 17 IBV strains, e.g., nine reference strains (including Massachussets, Connecticut, JMK, SE 17 and Iowa serotypes) and eight Brazilian field isolates, whilst non-related avian viral pathogens such as Newcastle disease virus, Avian Pneumovirus and Gumboro disease virus were not detected. The differentiation between IBV strains was accomplished using the melting curve analysis of the amplified fragments corresponding to the hypervariable regions I and II of S1 gene. The real-time RT-PCR developed here showed a higher rate of IBV detection in tissue samples of experimentally infected chickens, when compared to the goldstandard technique of Viral Isolation in embryonated chicken eggs, and the same rate of detection was found for the conventional RT-PCR... (Complete abstract, click electronic access below)

Vibrio cholerae é uma bactéria autóctone em ecossistemas aquáticos, os fatores responsáveis pela virulência podem contribuir com a patogenicidade, influenciados por fatores genéticos e ambientais. Considerando a importância de conhecer e monitorar o V. cholerae, o estudo pretende caracterizar isolados da especie e padronizar uma metodologia para detecção em amostras de água. Os isolados foram avaliados por metodologias clássicas e moleculares, para confirmar espécie. Também, foi avaliada a presença de genes de virulência, susceptibilidade aos antibióticos e resposta em modelo invertebrado. Tres marcadores moleculares foram avaliados por PCR quantitativa. Observou-se que setenta dos isolados pertenciam a espécie V. cholerae e mostraram variação na prevalência dos genes de virulência e ao perfil de suscetibilidade ao antibióticos. Mostrou uma influencia da temperatura e concentração do inoculo no modelo invertebrado. Os marcadores moleculares selecionados mostraram a viabilidade da metodologia proposta neste estudo pela alta especificidade e sensibilidade. / Vibrio cholerae is an autochthonous bacterium in aquatic ecosystems, factors responsible for virulence may contribute to pathogenicity, influenced by genetic and environmental factors. Considering the importance of knowing and monitoring V. cholerae, the study pretend to characterize selected isolates and to standardize a methodology for detection in water samples. The isolates were evaluated by classical and molecular methodologies to confirm species. Also, the presence of factors associated with virulence, antibiotics susceptibility and response in invertebrate model were evaluated. Three molecular markers were evaluated by quantitative PCR. It was observed that seventy of the isolates belonged to the V. cholerae species and showed a variation in the prevalence of the virulence genes and the antibiotic susceptibility profile. Also, showed an influence of the inoculum temperature and concentration on the invertebrate model. The selected molecular markers showed the viability of the methodology proposed in this study for the high specificity and sensitivity.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A tese à composta por dois capÃtulos. O primeiro capÃtulo inclui o trabalho cujo objetivo foi investigar o potencial uso de pares de transcritos correlativos baseados em microarranjos como marcadores de fertilidade masculina usando a displasia da bainha fibrosa (DFS) como modelo afetado. Atualmente à bastante reconhecido que a tecnologia de microarranjos pode ser limitada pelos custos e que a qualidade dos transcritos permanece relativamente desconhecida. Para responder essas questÃes, nÃs analizamos pares de transcritos estÃveis por qPCR com um processo sistemÃtico de desenho de primers sistemÃtico. Nesse estudo experimental, nÃs utilizamos amostras de homens com fertilidade comprovada e de homens com diagnÃtico de DFS. Nossa abordagem foi baseada nas sequÃncias de primers dos seis genes de interesse, os quais foram desenhados utilizando os programas Oligo7 e Primer3Plus. A especificidade do primer foi inicialmente analisada in silico atravÃs de pesquisas nos bancos de dados ENSEMBL, University of California Santa Cruz (UCSC), e National Center for Biotechnology Information (NCBI) para uso de sequÃncias especÃficas aos genes alvos. A habilidade dos pares de transcritos em classificar as amostras de homens de fertilidade comprovada das amostras de DFS foi avaliada. Nossos resultados mostraram que em conjunÃÃo com a identificaÃÃo de quatro novos pares estÃveis, a comparaÃÃo dos coeficientes de correlaÃÃo dos valores de C(t) dos DSF revelou a interrupÃÃo de quatro pares estÃveis identificados nas amostras de homens normais. Esta seleÃÃo de pares estÃveis resolve a questÃo sobre a DSF. Em conclusÃo, os resultados mostram efetivamente que o desenho de primers e qPCR podem fornecer um ensaio molecular de baixo custo para avaliar a fertilidade masculina. O segundo capÃtulo divide-se em dois estudos e avalia em carneiros os efeitos de uma dieta suplementada com farelo de castanha de caju. No estudo 1, nosso objetivo foi detectar a presenÃa de transcritos para Heat Shock Protein (HSP70), clusterina (CLU), proteÃna semelhante à subunidade alfa do complexo T (TCP1) e proteÃna do complexo T subunidade 8 (CCT8) no espermatozÃide de ovinos, seguindo a mesma metodologia para qPCR utilizada no capitulo 1. As sequÃncias de primers foram desenhadas utilizando os programas Primer3Plus e Oligo Analyzer. Gene para protamina 2 (PRM2) foi usado como controle interno de reaÃÃo. O sÃmen foi coletado de machos pÃberes Morada Nova utlizando eletroejaculador. As amostras selecionadas para extraÃÃo de RNA espermÃtico seguiram as recomendaÃÃes do ColÃgio Brasileiro de ReproduÃÃo Animal quanto aos parÃmetros de motilidade, vigor e concentraÃÃo. Nossos resultados mostraram a presenÃa de mRNA para a HSP70 nos espermatozÃides de ovinos. Maiores estudos sÃo necessÃrios a fim de confirmar ou refutar a presenÃa das chaperonas TCP1 e CCT8 no espermatozÃide ovino. A presenÃa do transcrito da HSP70 no espermatozÃide de ovinos abre perspectivas para estudos futuros sobre os efeitos do mRNA HSP70 no desenvolvimento embrionÃrio, de modo a avaliar se essa expressÃo ocorre de modo espontÃneo, programado e seqÃencial, e se esses mecanismos se refletem na fertilidade e no desenvolvimento embrionÃrio. O segundo estudo tem como principal objetivo avaliar os efeitos de uma dieta contendo farelo de castanha de caju (FCC) na expressÃo de genes relacionados ao metabolismo dos lipÃdios no mÃsculo Longissimus dorsi de carneiros Morada Nova. Vinte carneiros maduros sexualmente foram divididos em dois grupos baseando-se no peso vivo. Os animais foram mantidos em baias individuais. Durante trÃs meses, o grupo castanha (GCA) foi alimentado com raÃÃo contendo FCC, enquanto o grupo controle (GCO) recebeu raÃÃo à base de milho e soja. As duas dietas eram isocalÃricas e isoprotÃicas, adicionadas de suplemento mineral. Os carneiros tambÃm receberam feno de Tifton e Ãgua à vontade. A quantidade de alimento ofertado (raÃÃo e feno) foi ajustada diariamente para sobra de 10%. Sete genes codificantes de proteÃnas envolvidas direta ou indiretamente foram selecionados como alvos, incluindo: GH, ACACA, CAST, CAPN3, LPL, SCD e FASN. Para normalizaÃÃo, foram selecionados cinco genes candidatos: ACTB, GAPDH, RPL4, RPS18 e TBP. Dentre os sete genes alvos selecionados anteriormente, os alvos GH, ACACA e CAST foram removidos. Os dois primeiros foram removidos devido amplificaÃÃo de alinhamento mÃltiplo (baixa especificidade do primers), enquanto CAST apresentou baixa eficiÃncia de amplificaÃÃo. Da lista de gene alvo final, a expressÃo de somente dois genes foi afetada pela dieta, SCD (p<0.01) e FASN (p<0.05), enquanto LPL (p=0,1022) e CAPN3 (p=0,0939) nÃo apresentaram diferenÃa significativa (p<0.05). Os genes SCD e FASN foram reprimidos no GCA comparada ao GCO. Este à o primeiro relato de que uma raÃÃo contendo FCC afetou a expressÃo gÃnica de proteÃnas envolvidas na deposiÃÃo de lipÃdios no mÃsculo em ovinos. Considerando que uma dieta contendo FCC altera a expressÃo de genes lipogÃnicos sem afetar o ganho de peso nem a eficiÃncia reprodutiva de ovinos, faz da castanha de caju uma importante alternativa para o sistema de produÃÃo de ovinos criados em regiÃes tropicais. / This thesis presents two chapters. In the first chapter, its objective was to investigate the potential use of correlative microarray-based transcript pairs as candidate markers for male fertility using dysplasia of the fibrous sheath (DFS) as an affected model. It is widely recognized that microarray technology may be limited by cost and that the quality of the transcript remains relatively unknown. To address these issues, we analyzed the stable transcript pairs by qPCR with a systematic primer design process. On this experimental study, we used men with proven fertility and men with a diagnosis of DFS. Our approach was based on primer sequences for six genes of interest were designed using Oligo7 and Primer3Plus. Primer specificity was initially assessed in silico by searching the ENSEMBL, University of California Santa Cruz, and National Center for Biotechnology Information databases for nontarget complementary sequences throughout the genome. The ability of transcript pairs to classify samples from males of proven fertility away from DFS was assessed. Our results showed that in conjunction with identifying four new stable transcript pairs, comparison of the DFS qPCR C(t) correlation coefficients revealed the disruption of four stable fertile sample transcript pairs. This suite of transcript pairs resolves DFS. In conclusion, the results show that with effectively designed primers, qPCR may provide an affordable molecular assay to assess male fertility status. Second chapter includes two studies regarding evaluations of ram feeded with supplemented diet with cashew nut. On the frist study, our goal was detect transcripts for Heat Shock Protein (HSP70), Clusterin (CLU), Ovis aries T-complex protein 1 alfa subunit-like protein (TCP1) e Ovis aries chaperonin containing TCP1, subunit 8 (theta) (CCT8) on ram sperm by. For primer designing we used published ESTs from NCBI and manually annotated by us using Primer3Plus and OligoAnalizer. PRM2 was used as internal qPCR control. Semen samples from mature Morada Nova ram were collected by eletroejaculator, washed in PBS and prepared for further RNA extraction. Selected samples followed quality recommendatios from ColÃgio Brasileiro de ReproduÃÃo Animal regarding motility, vigor and concentration. Our results showed presence of mRNA HSP70 on ram sperm and they can possible be envolved in early embryo development, oocyte activation and post fertilization events. Further analyses will be necessary to confirm presence of TCP1 and CCT8 on ram sperm. Our findings indicate new perpectives about the effects of these chaperones during embryo development mesuring if its expression reflects male fertility on the early embryo development. On the second study the the main goal is to evaluate the effects of a lipid-enriched diet containing cashew nut brain on the expression of genes related to lipid metabolism in the longissimus dorsi muscle of Morada Nova rams. Twenty sexually mature and reproductively sound rams were divided in two groups based on ram live weight, and each ram was kept on individual pens. During three months, group 1 (G1) rams were fed with a lipid-rich diet, containing cashew nut bran (CNB), while group 2 (G2) was fed with a meal based on corn and soy. Both diets were isocaloric and isoproteic, and had a mineral mix added-in. The rams also were offered Tifton grass hay and had free access to water. The amount of diet offered (ration plus hay) was adjusted everyday to a maximum waste of 10%. Seven genes coding for proteins directly or indirectly involved in lipid metabolism were initially selected as targets, incluiding GH, ACACA, CAST, CAPN3, LPL, SCD, and FASN. Also, five genes were selected as reference genes, ACTB, GAPDH, RPL4, RPS18 and TBP. From the seven genes originally selected as targets, GH, ACACA and CAST were removed, leaving the final list with four targets. The first two genes were removed due to alternative pairing of the primers (low specificity), while CAST showed low amplification efficiency during PCR reaction. From the final target list, the expression of only two genes was affected by diet, SCD (p<0.01) and FASN (p<0.05), while LPL (p=0,1022) and CAPN3 (p=0,0939) were not different at the p<0.05 level. Both SCD and FASN genes were down-regulated in G1 (lipid-rich diet containing CNB) compared to G2. These genes are involved in lipogenic pathways, related to tissue lipid deposition; therefore, these results were expected. This is the first time that a fat-rich diet based on CNB was shown to affect gene expression of proteins involved in fat deposition in carcass muscles of rams. Longissimus dorsi is one of the finest meat cuts. Considering that human diets rich in poli-unsaturated fatty acids (PUFA) can decrease the risk of heart and other chronic diseases, a change in the fatty acid profile of this muscle could contribute to a healthier diet, aggregating value to the end-product of the lamb meat market. The effects of CNB-based diet on the gene expression of SCD and FASN support the notion that such diet, as previously shown for other sources of lipid in ruminants, can potentially change the fatty acid composition of L. dorsi, but this hypothesis needs to be experimentally verified by profiling fatty acids in animals fed CNB versus carbohydrate-based diets. CNB use as an ingredient in animal feeding is environmentally-friendly, since it contributes to by-product recycling from the agroindustrial plants in Northeast Brazil. Also, considering that CNB-based diet changes lipogenic gene expression without affecting weight gain or reproductive status of the rams, as shown in another work from our team, makes CNB a very important alternative food in ram production systems in tropical regions.

O bocavirus humano (HBoV) é um parvovirus recentemente identificado em associação com a presença de sintomas de infecção do trato respiratório. Esse vírus possui um genoma de aproximadamente 5217 nucleotídeos que contém 3 open reading frames que codificam 4 proteínas (NS1, NP-1, VP-1 e VP-2). HBoV tem sido detectado em amostras respiratórias de diversas partes do mundo, incluindo Austrália, América do Norte, Europa, Ásia e África, o que sugere uma distribuição global desse vírus. Entretanto, nenhum estudo longitudinal de HBoV em amostras respiratórias foi realizado na América Latina. Dessa forma, nós realizamos um estudo prospectivo de HBoV em lavados nasofaríngeos (LFNs) coletados de pacientes com sintomas de infecção do trato respiratório (IRA) atendidos em um hospital universitário de Ribeirão Preto, SP e em um hospital universitário de Salvador, BA no período entre 2005 a 2007. 1288 LFNs de 1217 pacientes foram encaminhados ao laboratório de virologia e foram testados por PCR para HBoV. Desses pacientes, 962 eram menores de 5 anos e 177 eram maiores de 5 anos. Além disso, também foram analisados 50 LFNs de crianças menores de 5 anos que não tinham sintomas respiratórios. Todas as amostras positivas para HBoV foram testadas para todos os outros vírus respiratórios, incluindo o vírus sincicial respiratório (HRSV), rinovirus humano (HRV), influenza humano (HFLU), metapneumovirus humano (HMPV), parainfluenza humano (HPIV), coronavirus humano (HCoV) e adenovirus humano (HAdV). A carga viral de HBoV foi determinada por PCR em tempo real em todas as amostras positivas e o genoma completo de 19 amostras de HBoV foi seqüenciado. Com intuito, de fazer um levantamento sorológico e determinar sítios replicativos de HBoV, nós ainda clonamos e expressamos em S. cerevisae (Y258) o gene de VP2, que codifica uma das proteínas do capsídeo viral. A prevalência desse vírus foi de 4,8% em crianças menores de cinco anos e de 1% em pacientes maiores de cinco anos. HBoV não foi detectado em crianças sem sintomas. Dos 259 pacientes analisados em 2005, 25 (10%) foram positivos para HBoV. Esse vírus circulou mais frequentemente em abril, mês de maior incidência do HRSV. Em 2006, HBoV foi detectado em apenas 10 LFNs de 334 (3%) amostras testadas, sem qualquer pico de freqüência. Em 2007 HBoV foi detectado em 13 de 552 (2%) amostras, com uma freqüência de detecção um pouco maior em junho e julho. Os sintomas mais comumente observados foram rinorréia, tosse, febre e chiado, que foram observados geralmente em mais de 50% dos casos positivos para HBoV. Não houve uma diferença significativa na prevalência desses sintomas entre as crianças positivas e negativas para HBoV. Entretanto, foi observada uma maior freqüência de diarréia entre as crianças com esse vírus. Nesse estudo também foi documentado uma alta freqüência de co-infecções virais entre os pacientes com HBoV. Os vírus mais frequentemente associados com o bocavirus humano foram: HRSV, HRV e HAdV. Além disso, foi detectado uma maior carga viral media e uma maior freqüência de diarréia nos 15 pacientes com infecção exclusiva por HBoV do que nos pacientes com co-infecção. Esses resultados mostraram que HBoV pode alcançar títulos enormes (tão grandes como1014/mL) em LFNs de pacientes com sintomas respiratórios e que isso é associado a de diarréia. O seqüenciamento do genoma inteiro de HBoV realizado nesse estudo indica que a divergência genômica entre as amostras desse vírus é muito pequena. Como conclusão, nós demonstramos que HBoV circula e é detectado em associação com sintomas de infecção respiratória e diarréia no Brasil. Novos estudos, com um longo acompanhamento em diferentes populações serão necessários para determinar a sazonalidade e o real impacto clínico de HBoV em nosso país. / Human bocavirus (HBoV) is a parvovirus recently identified in association with respiratory tract infections. HBoV 5217 nt genome contains 3 open reading frames encoding four proteins (NS1, NP-1, VP-1 and VP-2). HBoV has been reported in respiratory samples from children in several parts of the world (including Australia, North America, Europe, Asia, and Africa), suggesting that the virus circulates worldwide. However, no longitudinal studies of HBoV in respiratory samples have been reported in Latin America. We report a prospective study of HBoV in nasopharyngeal aspirates (NPAs) collected from patients seen for acute respiratory tract infections (ARI) at the University of Sao Paulo Hospital in Ribeirao Preto, southeast Brazil and at the University Hospital in Salvador, Brazil. 1288 NPAs from 1217 patients was submitted to the virology lab for respiratory virus detection from 2005 to 2007 and were screened for HBoV by polymerase chain reaction (PCR), whom 962 were under 5 years of age and 177 were older than 5 years. In addition, NPAs from 50 children under 12 years without IRA was also tested to HBoV for PCR. All samples positive of HBoV was tested for others respiratory virus, including the human respiratory syncitial virus (HRSV), human rhinovirus (HRV), human influenza (HFLU), human metapneumovirus (HMPV), human parainfluenza virus (HPIV), human coronavirus (HCoV) and human adenovirus (HAdV). These samples had their HBoV viral load determined by real time PCR and the viral entire genome of nineteen HBoV sample was sequenced. We also cloned and expressed in S. cerevisae (Y258) the gene of VP2, one protein of viral capside. The prevalence of this virus was of 4,8% in children under 5 years and 1% in adults, both with IRA. HBoV was not found on the patients without symptoms. In 2005, of the 259 patients tested, 25 (10%) were positive for HBoV. Interestingly, the virus circulated more frequently in April, the month of peak activity of respiratory HRSV. In 2006 HBoV was detected in only 10 NPAs out of 334 samples (3%) tested, without any notable peak of frequency. In 2007 HBoV was detected in 13 out of 552 (2%) tested samples with little higher frequency of detection in June an July. Rhinorrhea, cough, and wheezing were observed in more than 50% of the HBoV-positive children, and no obvious respiratory clinical differences were noted between HBoV-positive and negative children. However, was noted a higher frequency of diarrhea on HBoV-positive patients. In this study was also observed a larger frequency (71%) of viral coinfections between the HBoV-positive patients. The respiratory viruses more frequently associated with human bocavirus were: HRSV, HRV and HAdV. Interestingly, on the 15 HBoV-alone patients was observed a higher viral load and a higher prevalence of diarrhea than HBoV-coinfection patients. These results showed that this virus can reach enormous titles (like 1014) in NPAs from patients with respiratory infection symptoms and this is associated with diahhrea. The entire genome sequencing of HBoV of our study indicates that the genetic divergence between the HBoV lineages is small. In conclusion, we demonstrated that HBoV circulates and is detected in association with respiratory symptoms and diarrhea in Brazil. Long term surveillance will be needed to determine whether or not an HBoV season occurs and what is the real clinical impact of this virus in our country.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_vanessa_silva_da_silva.pdf: 492130 bytes, checksum: 6301288f1de4d9363b332a15a2ad0a6e (MD5) Previous issue date: 2011-11-28 / Listeria monocytogenes is an infectious microorganism causing listeriosis, a foodborne illness affecting immunocompromised, pregnant, elderly and childrens. Pathogenic to men and animals is found naturally in the environment and has the ability to multiply on adverse conditions such as high salinity and chilling temperatures. However, their detection in food is difficult because it is laborious, time consuming and expensive. Therefore comes to searching for methods to detect simple and fast. Immunological methods are very promising in this regard, but the conditions under which the organism is grown should be ideal for maximizing the expression and subsequent detection of the target antigen. Internalin A protein (InlA) of L. monocytogenes is an excellent target for detection of this pathogen in immunological tests, but the ideal conditions to enhance its expression had not yet been described. Therefore thus study analyzed the expression of InlA in two strains of L. monocytogenes serotype 4b, a clínical and other non-clínical, in non selective enrichment broths Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI), Tryptic Soy Broth (TSB) and selective broths Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB), Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), to incubation at 29 and 37 °C, through the ELISA and real time RT-PCR. All data were statistically analyzed considering a significance level of 5% (p <0.05). In the ELISA it was found that expression of InlA is strain-specific, in other words, was influenced by the origin of the strain, because the strain non-clínical of L. monocytogenes showed higher InlA expression levels than the clínical strain, and the medium used directly interfere with the expression of this antigen, and the most appropriate medium of enrichment for use in detection methods, regardless of the origin of the strain,was FRA, TSB and LEB. It was also observed that there was no significant difference in the expression of InlA when strains were grown at 29 and 37 °C. The real-time RT-PCR data showed inconclusive, since there was no statistically significant difference between the conditions analyzed, requiring thus more study. In conclusion, it was found that InlA gene expression on influenced by origin of the strain and culture media. Regardless of the origin of the strain, the preferred media for use in InlA protein detection methods are FRA, TSB and LEB / Listeria monocytogenes é um microrganismo infeccioso causador de listeriose, uma doença de origem alimentar que acomete principalmente imunocomprometidos, gestantes, idosos e crianças. Considerado patogênico tanto para homens quanto para animais, está distribuído naturalmente no ambiente e possui a capacidade de multiplicar-se sobre condições adversas, como alta salinidade e temperaturas de refrigeração. Todavia, sua detecção em alimentos é dificultada por ser trabalhosa, demorada e dispendiosa. Por isso, vem-se buscando métodos de detecção mais simples e rápidos. Os métodos imunológicos são muito promissores neste sentido, mas as condições em que o microrganismo é cultivado devem ser ideais para maximizar a expressão e consequente detecção do antígeno alvo. A proteína internalina A (InlA) de L. monocytogenes é um excelente alvo para detecção desse patógeno em testes imunológicos, porém as condições ideais para potencializar sua expressão ainda não foram descritas. Portanto, nesse trabalho analisou-se a expressão de InlA em duas cepas de L.monocytogenes sorotipo 4b, uma de origem clínica e outra não-clínica, nos caldos de enriquecimento não seletivos Luria-Bertani (LB), Brain Heart Infusion (BHI) e Tryptic Soy Broth (TSB), assim como nos caldos seletivos Fraser Broth (FRA), Listeria Enrichment Broth (LEB) e Listeria Enrichment Broth - University of Vermont Medium (UVM), a 29 e 37 °C, utilizando ELISA indireto e RT-PCR em tempo real. Todos os dados obtidos foram submetidos a análises estatísticas considerando um nível de significância de 5% (p<0,05). Através do ELISA indireto verificou-se que a expressão da InlA é cepa-especifica, ou seja, foi influenciada pela origem da cepa, pois a L. monocytogenes não-clínica apresentou maiores níveis de expressão de InlA do que a cepa clínica, e que os meios utilizados interferem diretamente na expressão desse antígeno, sendo os meios de enriquecimento mais indicados para uso em métodos de detecção, independentemente da origem da cepa, o FRA, TSB e LEB. Observou-se também que não ocorreu diferença significativa na expressão de InlA quando as cepas foram cultivadas a 29 e 37°C. O RT-PCR em tempo real apresentou dados inconclusivos, visto que não houve diferença estatística significativa entre as condições analisadas, necessitando, dessa forma, de maiores estudos.

A síndrome de ardência bucal (SAB) é uma condição caracterizada pelo sintoma de ardência na mucosa oral, na ausência de qualquer sinal clínico. Sua etiologia é desconhecida e, até o momento, não dispõe de tratamento efetivo. Há entretanto características de doença neuropática que justificam investigações nesse sentido. O objetivo desse estudo foi mensurar a expressão gênica dos receptores de canais de sódio, Nav 1.7, Nav 1.8 e Nav 1.9, nos pacientes portadores de SAB. A casuística foi composta por dois grupos sendo o grupo de estudo composto por 12 pacientes portadores de SAB, selecionados através do critério estabelecido pela International Headache Society, em 2013 e o grupo controle composto por 4 pacientes não portadores de SAB. As amostras analisadas foram coletadas do dorso lingual, por meio de biópsia realizada com punch de 3 mm e profundidade de 3 mm, estas foram submetidas ao método de análise RT-PCR em tempo real. A expressividade dos genes de canais de sódio foi avaliada nos indivíduos portadores de SAB em relação aos do grupo controle, sendo esta calculada a partir da normalização dos dados da quantificação destes com os da expressão do gene constitutivo (GAPDH), pelo método de Cicle Threshold comparativo e analisados estatisticamente por meio do teste estatístico Mann-Whitnney. Observou-se o aumento da expressão gênica do Nav 1.7 (fold-change = 38.70) e diminuição da expressão gênica do Nav 1.9 (fold-change = 0.89), porém sem diferenças estatisticamente significativas entre os grupos analisados. O gene Nav 1.8 não foi expresso em nenhuma das amostras analisadas. O Nav 1.7 expressa-se tanto em neurônios nociceptivos quanto no sistema nervoso autônomo e mutações no Nav 1.9 tem sido associada a perda de percepção dolorosa. Os resultados obtidos embora não estatisticamente significativos são compatíveis com as características da doença, justificando a extensão dos estudos na linha expressão de genes codificadores dos canais de sódio em pacientes com SAB. / Burning mouth syndrome (BMS) is a condition characterized by symptoms of burning in the oral mucosa, in the absence of any clinical signs. Its etiology is unknown and so far, it has no effective treatment. It is important to mention that BMS exhibits some traits of a neuropathic disease, what justifies a thorough investigation of this subject.The objective of this study was to measure the gene expression of the sodium channel receptors, Nav 1.7, Nav 1.8 and Nav 1.9, in patients with BMS.The sample was composed of two groups, being the study group formed by 12 patients with SAB, selected according to the criteria established by the International Headache Society in 2013, while the compound control group had 4 patients without SAB. The analyzed samples were collected from the tongue, by the biopsy technique with a 3 mm punch and 3mm depth. These samples were processed in real time, following the guidelines set forth by the RT-PCR method. The expressiveness of the sodium channels was evaluated in the individuals with BMS in relation to control group, which was calculated from the normalization of these data with the quantification of the expression of a constitutive gene (GAPDH) by the Cycle Threshold comparative methods and statistically compared by Man-Whitnney test. We observed an increased gene expression of Nav 1.7 (fold-change = 38.70) and a decreased gene expression of Nav 1.9 (fold-change = 0.89), but no statistically significant differences between the groups. Nav 1.8 gene was not expressed in any of the samples. Nav 1.7 is expressed in both nociceptive neurons as the autonomic nervous system and changes in Nav 1.9 has been associated with loss of pain perception. The results although not statistically significant are consistent with the disease characteristics, justifying the extension line of the studies on the expression of genes encoding the sodium channel in patients with SAB.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-04T15:47:31Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Carneiro Naziasene Lima - 2014.pdf: 3242345 bytes, checksum: d0ace95b026350f2bf41251459258252 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-03-05T10:40:24Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laís Carneiro Naziasene Lima - 2014.pdf: 3242345 bytes, checksum: d0ace95b026350f2bf41251459258252 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-05T10:40:24Z (GMT). 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The genetic material was extracted by phenolchloroform extraction of the sample C. tropicalis, ATCC 28367 (C. albicans) and ATCC 22019 (C. parapsilosis) for use in a species-specific multiplex qPCR assay with analysis of differences in the curve fusion. Microdilution plate test and reduction of the tetrazolium salt for 21 isolates were performed for the susceptibility of sessile and free cells, respectively. The evaluation of the ultrastructure of the biofilm was performed on strips of polyurethane with visualization by scanning electron microscopy. The amplified products from C. albicans obtained three melting peaks with values of 75,2 °C, 76,8 °C and 79,8 °C, while C. tropicalis and C. parapsilosis showed one peak with values 73,5 °C and 78,5 °C, respectively. The identification test showed to be reliable for the identification of the most common species in the study. All of Candida yeasts were able to form biofilm with own organization of each specie. The in vitro susceptibility test of planktonic cells demonstrated that amphotericin B and caspofungin showed better activity compared to fluconazole and voriconazole who obtained 19% of resistant strains, all C. albicans. In assessing of the CIMs50% and CIMs80% of sessile cells, we observed an increase of at least 60 times the values of planktonic cells. It was observed a high percentage of BF that demonstrates the need for diagnosis and combat against this biomass formed by Candida species. The BF is a virulence factor determinant for decrease of susceptibility to antifungal agents thus compromising antifungal therapy. / O aumento no número de infecções fúngicas por espécies de Candida, como resultado do expressivo aumento de pacientes imunocomprometidos destaca a importância de estudos relacionados a esse gênero. A resistência destas leveduras aos fármacos antifúngicos é observada em isolados específicos, assim como em infecções associadas com a formação de biofilme (FB). O objetivo deste estudo foi comparar o perfil de suscetibilidade in vitro de células sésseis e planctônicas de diferentes isolados de Candida, diferenciando as espécies por qPCR multiplex e microscopia eletrônica de varredura. A amostra foi composta de 10 C. albicans, 10 C. parapsilosis e 1 C. tropicalis. O material genético foi extraído pelo método de extração fenol-clorofórmio da amostra de C. tropicalis, ATCC 28367 (C. albicans) e ATCC 22019 (C. parapsilosis) para utilização no ensaio espécie-específico qPCR multiplex com avaliação das diferenças na curva de fusão. Foram realizados teste de microdiluição em placa e redução do sal tetrazólio para 21 isolados a fim de determinar a suscetibilidade de células livres e sésseis, respectivamente. A avaliação da ultraestrutura do biofilme foi realizada em tiras de poliuretano com visualização por microscopia eletrônica de varredura. Os produtos amplificados de C. albicans, obtiveram três picos de fusão com valores de 75,2°C, 76,8°C e 79,8°C, enquanto C. parapsilosis e C. tropicalis mostraram um pico de valores 73,5°C e 78,5°C, respectivamente. O teste de identificação apresentou-se confiável para a identificação das espécies mais comuns no estudo. Todas as leveduras de Candida foram capazes de formar biofilme com organização própria de cada espécie. O teste de suscetibilidade in vitro das células planctônicas demonstrou que anfotericina B e caspofungina apresentaram melhor atividade em comparação com o fluconazol e voriconazol que obtiveram 19% das amostras resistentes, sendo todas C. albicans. Na avaliação da CIMs50% e CIMs80% das células sésseis, observou-se um aumento de pelo menos 60 vezes dos valores das células planctônicas. Foi observada porcentagem elevada de FB que demonstra a necessidade do diagnóstico e combate à essa biomassa formada pelas espécies de Candida, pois é um fator de virulência determinante para a diminuição da suscetibilidade aos antifúngicos comprometendo assim a terapêutica antifúngica.