Made available in DSpace on 2015-03-26T13:42:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 576313 bytes, checksum: bb8b9f40095493e36b1db27e56b578a5 (MD5) Previous issue date: 2008-07-28 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / During a regular estrous cycle, a network of hormonal events, which consist of hormones and growth factors, interact to regulate ovarian follicular growth through autocrine and paracrine mechanisms. These events are marked by a high dynamism of gene expression and level of transcripts in the ovary tissue. Therefore, the objective of the present study was to characterize the expression of genes IGF-I, IGFBP (1, 2, 3 e 5), EGF and genes related to follicular atresia (caspase 3 and p53) in follicle cells and ovary tissue in sows during 0, 6, 12 e 18 days of estrous cycle through real-time quantitative PCR (qPCR) technique. The total RNA was extracted from follicle cells and ovary tissue for each animal, and used to synthesize the first strand cDNA. The GAPDH gene was used as endogenous control. The results of gene expression were analyzed using linear regression with gene expression as dependent variable and days of estrous cycle as independent variables. The expression of each gene was detected on follicle cells and ovary tissue, IGFBP2 gene increased sequentially during the estrous cycle (P<0,02) and IGFBP3 gene shows a quadratic expression pattern (P<0,02). For others genes the level of expression did not change during estrous cycle. The qPCR showed to be efficient for detection of low levels of transcripts and leads to a better understanding of follicle development dynamics. Studies should be done to examine the expression of other related genes as well genes of other metabolic pathways in order to broaden our understanding about the follicular stages of folliculogenesis in the pig. / Durante o ciclo estral, uma rede de eventos hormonais e de fatores de crescimento celular atua de maneira autócrina e parácrina para regular o desenvolvimento folicular. Esses eventos são caracterizados por grande dinamismo na expressão gênica e no acúmulo de transcritos gerados. No presente estudo, avaliou-se a expressão dos genes IGF-I, EGF, IGFBP (1, 2, 3 e 5) e dos genes da cascata de apoptose celular (caspase 3 e p53) em células foliculares e no tecido ovariano de fêmeas suínas nos dias 0, 6, 12 e 18 do ciclo estral por meio da técnica de PCR quantitativo em tempo real (qPCR). O RNA total das células foliculares e do tecido ovariano foi extraído para cada animal e utilizado como molde para a síntese da primeira fita de cDNA. O gene GAPDH foi utilizado como controle endógeno. Os resultados da expressão gênica foram analisados por regressão linear, considerando os dados de expressão gênica variável dependente e os dias do ciclo estral variáveis independentes (0, 6, 12 e 18 dias). Todos os genes analisados apresentaram expressão, sendo que o gene IGFBP2 apresentou perfil de expressão linear aumentando durante o ciclo estral (P<0,02), e o gene IGFBP3 apresentou perfil de expressão quadrático (P<0,01). Para os demais genes estudados, não foi verificado efeito da expressão gênica em função dos dias do ciclo estral. A técnica de qPCR mostrou-se eficiente na detecção de transcritos de baixa abundância e no maior entendimento da dinâmica folicular ovariana. Estudos devem ser ampliados para outros genes relacionados e de outras vias metabólicas para melhor entendimento dos estádios fisiológicos envolvidos na foliculogênese em suínos.

Made available in DSpace on 2015-04-01T12:09:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1738258 bytes, checksum: 9ea7722b27270b8d6f33deb6238bb982 (MD5) Previous issue date: 2010-12-21 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Streptococcus mutans is the main etiologic agent of dental caries, especially due to its ability to adhesion to the tooth surface. This bacterium produces glycosyltransferases that synthesize polymers of soluble and insoluble glucan from sucrose, which increases the colonization of cariogenic bacteria and promote the formation of biofilm on the surface of the teeth. Chlorhexidine is the most frequent topical antibiotic used in dentistry and is considered standard in the various dental specialties, but there are few studies on this drug at the molecular level. The aim of the present study was to investigate the antibacterial activity of chlorhexidine gluconate against in vitro planktonic and biofilm Streptococcus mutans cells in a dose- and timedependent manner. The minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of chlorhexidine in planktonic cells and MBC in biofilms were determined by microdilution method. Total S. mutans RNA from either planktonic cells or biofilms exposed or non-exposed (controls) to chlorhexidine were extracted, purified and reversely transcribed to cDNA. Real-time reverse transcription- PCR was used to quantify the relative levels of 16S rRNA, gtfB, gtfC and gtfD transcription of S. mutans in the presence of CHX. The activity of CHX in the initial biofilm structure for 2 and 4 h and morphological alterations in planktonic cells, under a range of CHX concentrations, was examined by Scanning Electron Microscopy (SEM). CLX MIC and MBC for planktonic cells were 2.2 mg/L and 18 mg/L, respectively, while MBC for biofilm was 800 mg/L. Planktonic cells exposed to CLX 4.5 mg/L and 9 mg/L were reduced almost by 6- and 20-fold, whereas biofilm counts were reduced (2.5-fold or more) in concentrations above 500 mg/L. In planktonic cells, exposition to CHX 4.5 mg/L increased gtfC and gtfD expression by 11-fold and 4-fold (p<0.01), respectively. In biofilm, expression of gtfB, gtfC and gtfD were reduced (<1.6-fold p<0.01) at concentrations above 500mg/L. Cell surfaces did not show any change when planktonic cells were exposed to CHX at 4.5 mg/L for 2 or 4h, but after 6 h, several wilted S. mutans cells with lost intracellular material could be observed. A decrease in the cells chain length and matrix was found when the initial biofilm was exposed from 1.1 mg/L to 4.5 mg/L of CHX, while 1200 mg/L and 2000 mg/L caused extensive precipitation of unknown material on the slide. Thus, we conclude that the CHX effects against bacteria depend on the kind of growth organization and the concentration/time of exposure to the drug. CHX may affect cell walls and intervene with mechanisms of the biofilm formation, and at sub-lethal concentrations, affect the expression of gtfs, which may exert an anticariogenic effect. / Streptococcus mutans é o principal agente etiológico da cárie dentária, especialmente devido à sua habilidade de adesão à superfície dentária. Esta bactéria produz glicosiltransferases, que sintetizam polímeros de glicano solúveis e insolúveis a partir da sacarose, que aumentam a colonização de bactérias cariogênicas e promovem a formação de biofilme dental na superfície dos dentes. A clorexidina é o antimicrobiano tópico mais utilizado na Odontologia, sendo considerado padrão nas diversas especialidades odontológicas, porém existem poucos estudos com esta droga em nível molecular. O objetivo do presente estudo foi investigar a atividade do gluconato de clorexidina em Streptococcus mutans UA159, plantônicos e organizados em biofilme, em diferentes concentrações e períodos de crescimento. A Concentração Inibitória Mínima (MIC) e a Concentração Bactericida Mínima (MBC) da clorexidina nas células plantônicas e MBC em biofilmes, foram determinadas pelo método da microdiluição. O RNA total das S. mutans plantônicos e organizados em biofilme, expostos ou não (controles) à clorexidina foram extraídos, purificados e reversamente transcritos a Cdna. O PCR quantitativo em tempo real foi utilizado para quantificar os níveis relativos de transcrição dos genes 16S rRNA, gtfB, gtfC e gtfD de S. mutans na presença ou ausência de clorexidina. A atividade da clorexidina na estrutura do biofilme inicial de 2 e 4h, e as alterações morfológicas nas células plantônicas, sobre concentrações variadas, foi examinada por Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV). A MIC e a MBC para células plantônicas foram 2,2 mg/L e 18 mg/L, respectivamente, e a MBC para os biofilmes foi de 800 mg/. A exposição à clorexidina, nas concentrações de 4,5 mg/L e 9 mg/L, reduziu a contagem das células plantônicas por 6 e 20 vezes, respectivamente, enquanto a contagem das células do biofilme foram reduzidas (2,5 vezes ou mais) em concentrações acima de 500 mg/L. Nas células plantônicas, a exposição a 4.5 mg/L de CHX, aumentou a expressão das gtfC e gtfD por 11 e 4 vezes (p<0.01), respectivamente. Em biofilme, a expressão das gtfB, gtfC e gtfD foram reduzidas (<1,6 x, p<0.01) em concentrações acima de 500 mg/L. As superficies celulares aparentemente não mostraram modificação quando as células plantônicas foram expostas às concentrações de 4,5 mg/L por 2 ou 4h, mas depois de 6h, várias células murchas de S. mutans com material intracelular extravasado, foram observadas. Um decréscimo no comprimento das cadeias das células e também da matriz foram encontradas quando os biofilmes iniciais foram expostos a 1,1 mg/L e 4,5 mg/L de clorexidina, enquanto as concentrações de 1200 mg/L e 2000 mg/L causaram extensa precipitação de material desconhecido nas lamínulas. Assim, concluiu-se que os efeitos da clorexidina contra S. mutans dependem do tipo de organização celular, período de crescimento e concentração utilizada da droga. A clorexidina pode afetar a parece celular e interferir com mecanismos de formação do biofilme e, em concentrações subletais, reduz a expressão de algumas gtfs, o que pode exercer um efeito anticariogênico.

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA12MA039.pdf: 1003613 bytes, checksum: 404c897431edca3b3b58de72b6b39864 (MD5) Previous issue date: 2012-05-25 / Swine Eperitrozoonosis, (ES) caused by Mycoplasma suis, is an infectious disease of the red blood cells and causing a variety of reproductive disorders, since, as the birth of weak piglets and stillborn, and productive as the occurrence of clinical disease, performance degradation, increase in feed conversion and immunosuppression. Some cases may even lead to death from anemia. In the farms, the disease can be asymptomatic or cause fever, anemia, jaundice and poor appetite. The ES control is accomplished with the use of tetracyclines, which are now restricted in use in accordance with European legislation. Currently, the diagnosis of ES is made by clinical suspicion and or by using blood smears that are less sensitive and less specific. The aim of this study was to evaluate de Mycoplasma suis presence through the use of a PCR with internal control (CIA) and a quantitative Real Time PCR in farms with reproductive disorders. The place of performance was Embrapa Swine and Poultry in Concordia, SC. The sample consisted of 80 sows and 230 fetal necropsies performed on 27 farms with reproductive disorders in the states of Santa Catarina and Paraná. Were collected from each sow blood and tissues of two piglets and they were aborted, stillborn, mummified or unfeasible. After necropsy tissues were stored in sterile plate at -70&#61616;C for future DNA extraction. Had no detectable DNA of the infectious agent in the blood of neither the sows nor the fetal tissues analyzed by PCR. The CIA developed was amplified in all reactions. Real-time PCR has detected M. suis in 17% of the sows and 40, 74% of farms had at least one positive sow / A Eperitrozoonose Suína (ES), causada pelo Mycoplasma suis, é uma doença infecciosa das hemácias e que causa uma série de transtornos, desde reprodutivos, como o nascimento de leitões fracos e natimortos, e produtivos, como a ocorrência de doença clínica, queda de desempenho, aumento na conversão alimentar e imunossupressão. Alguns casos ainda podem levar à morte por anemia. Nas granjas a enfermidade pode ser assintomática ou ainda causar febre, anemia, icterícia e inapetência. O controle da ES é realizado com as tetraciclinas, as quais hoje se encontram em uso restrito de acordo com a legislação européia. Atualmente o diagnóstico da ES é realizado pela suspeita clínica eou pela utilização de esfregaços sanguíneos que são pouco sensíveis e pouco específicos. O objetivo do presente trabalho foi realizar estudo da ocorrência da ES em granjas com transtornos reprodutivos com o uso das técnicas de PCR com controle interno (CIA) e de PCR quantitativo em Tempo Real. O local de execução foi a Embrapa Suínos e Aves de Concórdia, SC. Foram avaliadas 80 porcas e 230 fetos de necropsias realizadas em 27 granjas com problemas reprodutivos no estado de SC e PR. De cada porca foram coletados sangue e tecidos de dois leitões abortados, natimortos, inviáveis ou mumificados. Após a necropsia os tecidos foram armazenados em placa estéril a -70 &#61616;C para futura extração de DNA. Não foram detectados DNA do agente infeccioso no sangue das porcas, tampouco dos tecidos fetais analisados no PCR . O CIA desenvolvido foi amplificado em todas as reações. No PCR em Tempo Real houve 17% de porcas positivas e 40,74% das granjas tiveram ao menos uma porca reagente

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-25T23:51:26Z No. of bitstreams: 1 RenatoFerreiraDeAlmeidaJunior_DISSERT.pdf: 1495100 bytes, checksum: f007a8b773603ddf1cf491e66172e839 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-04-28T20:17:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 RenatoFerreiraDeAlmeidaJunior_DISSERT.pdf: 1495100 bytes, checksum: f007a8b773603ddf1cf491e66172e839 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:17:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 RenatoFerreiraDeAlmeidaJunior_DISSERT.pdf: 1495100 bytes, checksum: f007a8b773603ddf1cf491e66172e839 (MD5) Previous issue date: 2015-03-16 / Os v?rus dengue pertence ? fam?lia Flaviviridae e ao g?nero Flavivirus, sendo composto por 4 sorotipos antigenicamente distintos, s?o considerados os arbov?rus mais importantes no mundo por causar altas taxas de morbidade e mortalidade em regi?es tropicais e subtropicais do planeta, colocando em risco at? 3,6 bilh?es de pessoas em mais de 100 pa?ses. Por ser uma doen?a com amplo espectro cl?nico e por n?o possuir vacina ou tratamento eficaz, o estudo de poss?veis antivirais que visam diminuir a viremia do paciente ? de suma import?ncia, j? que este ? um dos fatores que pode levar a febre hemorr?gica da dengue e a s?ndrome do choque da dengue que s?o as formas grave da doen?a. No presente estudo foi avaliado o potencial antiviral do extrato da folhada planta Caesalpinia echinata contra o v?rus dengue-2 (DENV-2) em cultura de c?lulas C6/36 e Vero e a a??o antiviral da Rifampicina em c?lulas Vero. A escolha da Caesalpinia echinata se deve ao fato de que j? foi observada sua a??o antiinflamat?ria e antimal?rica, al?m de n?o ter sido encontrado nenhum trabalho que tenha avaliado seu potencial de a??o frente a v?rus. A Rifampicina foi escolhida por demonstrado a??o antiviral, principalmente contra os poxvirus, por?m poucos s?os os relatos da utiliza??o deste f?rmaco contra v?rus de RNA. O resultado foi obtido atrav?s da quantifica??o da carga viral pela t?cnica da qRT-PCR em Tempo Real. As c?lulas infectadas por DENV-2 foram submetidas ao tratamento pelo per?odo de 7 dias em diferentes concentra??es do extrato da planta Caesalpinia echinataque variou entre 0,68 a 0,0068mg/mL. N?o foi poss?vel observar neste estudo, evid?ncias de inibi??o significativa da replica??o do v?rus DENV-2 em ambas as culturas celulares. ARifampicina foi utilizada em diferentes condi??es de tratamento, no qual foi avaliado ao longo de 72 horas a carga viral produzida nas c?lulas Vero.Nas condi??es de tratamento p?s-infec??o e no ensaio virucida o f?rmaco apresentou atividade antiviral, reduzindo a taxa de replica??o em 100 vezes em rela??o ao controle. De acordo com os nossos resultados conclui-se que a Rifampicina mostrou-se eficaz no combate a infec??o do DENV-2 em cultura de c?lulas Vero. / The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and the Flavivirus genus, consisting of four serotypes antigenically distinct, are considered the most important arbovirus in the world to cause high rates of morbidity and mortality in tropical and subtropical regions of the world, threatening to 3, 6 billion people in over 100 countries. Because it is a disease with a wide clinical spectrum and has no vaccine or effective treatment, the study of possible antiviral drugs aimed at reducing viremia of patients is of paramount importance, since this is one of the factors which can lead to dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome that are severe forms of the disease. In the present study we evaluated the antiviral potential of the leaf extract of the plant Caesalpinia echinata against dengue-2 virus (DENV-2) in cultured C6/36 and Vero cells and the antiviral action of Rifampicin on Vero cells. The choice of Caesalpinia echinata is due to the fact that has been observed its action anti-inflammatory and antimalarial , and not have been found no study evaluated its antiviral effect. Rifampin was chosen was chosen for demonstrated antiviral action, especially against poxviruses, but few sane reports usage of this drug against RNA viruses. The result was obtained by quantifying the viral load bythe technique of Real-time qRT-PCR. Cells infected with DENV-2 were subjected to treatment for 7 days in different concentrations of plant extract Caesalpinia echinata (0.68 - 0,0068mg / ml). As a result, we could not observe a inhibition significant of virus replication in both cell cultures. The Rifampicin was used for different treatment condition,which were evaluated over 72 hours the amount of viral load produced in Vero cells, In the conditions treatment and the test virucidal theantiviral activity, which is capable of reducing the rate of 100X replication as compared to control. According to our results we can conclude that Rifampicin was effective in action against to infection DENV-2 in Vero cell culture.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2016-04-25T23:51:26Z No. of bitstreams: 1 TabataLoiseCunhaLima_DISSERT.pdf: 1403767 bytes, checksum: 7424c70f286f04743b45ac7531e6829b (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2016-04-28T20:23:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TabataLoiseCunhaLima_DISSERT.pdf: 1403767 bytes, checksum: 7424c70f286f04743b45ac7531e6829b (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-28T20:23:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TabataLoiseCunhaLima_DISSERT.pdf: 1403767 bytes, checksum: 7424c70f286f04743b45ac7531e6829b (MD5) Previous issue date: 2015-03-13 / A dengue ? uma doen?a de notifica??o compuls?ria e cerca de 50 a 100 milh?es de casos s?o registrados anualmente. Possui amplo espectro cl?nico e ? transmitida ao homem atrav?s da picada dos mosquitos do g?nero Aedes, tendo como principal vetor a esp?cie Aedes aegypti. O agente etiol?gico da doen?a ? o v?rus dengue (DENV) pertencente ao g?nero Flavivirus, fam?lia Flaviviridae e s?o conhecidos quatro sorotipos antigenicamente distintos (DENV-1, DENV-2, DENV-3 e DENV-4). Atualmente o tratamento da dengue ? apenas de suporte, feito atrav?s de intensa hidrata??o. Ainda n?o existe uma vacina comprovadamente eficaz ou tratamento espec?fico, o estudo de poss?veis antivirais que possam diminuir a viremia no paciente ? de alt?ssima relev?ncia, uma vez que a carga viral ? um dos fatores associado ao aparecimento das formas graves da doen?a (febre hemorr?gica da dengue e s?ndrome do choque da dengue). No presente estudo n?s avaliamos o potencial antiviral de extratos brutos obtidos a partir das folhas das plantas do Nordeste brasileiro Annona muricata (graviola) e Spondias mombin (caj?) contra o DENV-2 em cultura de c?lulas C6/36 e Vero. A avalia??o da a??o dos extratos brutos foi feita por meio da quantifica??o da carga viral atrav?s da PCR em Tempo Real (qRT-PCR) e pela t?cnica de contagem de unidades formadoras de placa (PFU). As concentra??es dos extratos de ambas as plantas utilizadas foram: 0,01, 0,1 e 1mg/mL. As culturas de c?lulas infectadas foram submetidas ao tratamento com os extratos durante os per?odos de 24-168h horas (7 dias). C?lulas Vero tratadas com o extrato da S. mombin n?o apresentaram redu??o na carga viral. Em contrapartida, quando estas c?lulas foram tratadas com o extrato da A. muricata, uma hora ap?s infec??o, observou-se uma redu??o significativa na carga viral nas primeiras horas (24h), quando comparadas com as c?lulas n?o tratadas utilizadas como controle positivo. Ao serem tratadas em intervalos de 24 horas apresentaram uma redu??o na carga viral nos dias subsequentes (at? o s?timo dia). N?o foi observada redu??o na carga viral em c?lulas C6/36 tratadas com ambos os extratos. De acordo com os nossos resultados, o extrato da planta A. muricata possui potencial antiviral promissor contra a infec??o pelo DENV-2 em cultura de c?lulas Vero. / Dengue is a reportable disease and about 50 to 100 million cases are reported annually. It has a wide clinical spectrum and is transmitted to humans through the bite of Aedes mosquitos, the main vector the Aedes aegypti species. The causative agent of disease is dengue virus (DENV) belonging to the genus Flavivirus, family Flaviviridae and are known four antigenically distinct serotypes (DENV-1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4). Currently the treatment of dengue is supportive, made by intense hydration. Although there is no proven effective vaccine or specific treatment, the study of potential antiviral drugs that can reduce viremia in patients is very high importance, since the viral load is one of the factors associated with the development of severe forms of the disease (hemorrhagic fever dengue and dengue shock syndrome). In the present study we evaluated the antiviral potential of crude extracts obtained from the leaves of plants in Northeastern Brazil Annona muricata (soursop) and Spondias mombin (caja) against DENV-2 in cultured C6/36 and Vero. The evaluation of the activity of the crude extracts was performed by the quantification of viral load by RT-PCR (qRT-PCR) and counting technique of plaque forming units (PFU). The concentrations of extracts of both plants used were 0.01, 0.1 and 1 mg/mL. The infected cell cultures were subjected to treatment with the extracts during periods of 24-168h hours (7 days). Vero cells treated with the S. mombin extract showed no reduction in viral load. In contrast, when these cells were treated with the extract of A. muricata, one hour after infection, significant reductions in viral load in the first hour was observed (24 h) when compared to untreated cells used as positive control. When they are treated at 24 hour intervals showed a reduction in viral load in subsequent days (until day). There was no reduction in viral load in C6/36 cells treated with both extracts. According to our results, the plant extract has antiviral A. muricata promising potential against infection by DENV-2 in Vero cell culture.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O Cryptosporidium é um parasito coccídeo reconhecido por causar diarréia em humanos e animais em todo o mundo. O gênero compreende pelo menos 20 espécies confirmadas, sendo o C. hominis e C. parvum as principais espécies causadoras de criptosporidiose em humanos. Ferramentas moleculares têm sido desenvolvidas para detectar e diferenciar espécies/genótipos e subgenótipos de Cryptosporidium. O objetivo do trabalho foi avaliar a heterogeidade molecular de Cryptosporidium sp. obtidos de amostras clínicas provenientes dos municípios do Rio de Janeiro e de Salvador, através da PCR em tempo real e seqüenciamento automático. Foram analisadas 85 amostras, distribuídas em 3 grupos distintos, sendo 45 delas do município do Rio de Janeiro e 40 amostras provenientes de Salvador, Bahia. Todas as amostras foram positivas para Cryptosporidium sp. pelo método de coloração de Kinyoun a frio. O ensaio da PCR em tempo real combinou uma reação multiplex para a detecção do gênero Cryptosporidium e da espécie C. parvum e uma reação simples para a detecção de C. hominis. Na detecção do gênero Cryptosporidium foram utilizados par de primers e uma sonda TaqMan desenhados a partir do alinhamento de seqüências conservadas do gene 18S rRNA de várias espécies de Cryptosporidium disponíveis no GenBank. Para a detecção das espécies C. parvum e C. hominis foram utilizados primers e sondas específicos obtidos a partir de seqüências de cada espécie disponíveis no GenBank. A detecção do gênero Cryptosporidium através da sonda 18S rRNA, na reação duplex, foi visualizada em 63 de 85 amostras totais. Destas, a sonda TaqMan específica para C. parvum detectou 6 amostras e a sonda TaqMan específica para C. hominis detectou 42 amostras. Quinze amostras não puderam ser detectadas pelas sondas C. hominis ou C. parvum. Nos ensaios da PCR para o gene 18S, 31 amostras foram positivas e 27 delas sequenciadas. As análises filogenéticas confirmaram a presença de C. hominis, C. parvum e C. felis nas amostras estudadas. Na análise da topologia da árvore filogenética obtida por Neighbor Joining, observou-se-se que as sequências obtidas neste estudo se agruparam com espécies do gênero Cryptosporidium já descritas, com 99% ou 100% de similaridade. Conclui-se que os dois métodos utilizados são importantes ferramentas para o diagnóstico da criptosporidiose e diferenciação de C. hominis e C. parvum em investigações epidemiológicas, assim como avaliação da heterogeneidade molecular de Cryptosporidium sp / Cryptosporidium is a coccidia parasite known to cause diarrhea in humans and animals worldwide. The genus comprises at least 20 confirmed species, with C. hominis and C.parvum major species that cause cryptosporidiosis in humans. Molecular tools have been developed to detect and differentiate Cryptosporidium at the species/genotypes and subtype levels. The objective of this study was to evaluate the molecular heterogeneity of Cryptosporidium sp. clinical samples obtained from Rio de Janeiro and Salvador (Bahia), through real-time PCR and automatic sequencing. We analyzed 85 samples, distributed in three distinct groups, 45 of them in the city of Rio de Janeiro and 40 samples from Salvador. All samples were positive for Cryptosporidium sp. by modified Kinyoun acid-fast staining technique. The real-time PCR procedure combined a duplex reaction for the detection of Cryptosporidium species and C. parvum and a simple reaction for the detection of C. hominis. The detection of the genus Cryptosporidium have been used a pair of primers and TaqMan probe designed from the alignment of conserved sequences of the 18S rRNA gene of several species of Cryptosporidium available in GenBank. For the detection of species C. parvum and C. hominis were used specific primers and probes derived from sequences of each species available in the GenBank. Detection of Cryptosporidium sp. by 18S rRNA probe, in the duplex reaction, was visualized in 63 of 85 total samples. Of these, the C. parvum TaqMan probe detected 6 samples and the C. hominis TaqMan probe detected 42 samples. Fifteen samples could not be detected by C. hominis or C. parvum probes. In the 18S PCR assays, 31 samples were positive and 27 of them sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the presence of C. hominis, C. parvum and C. felis. The analysis of the phylogenetic tree obtained by Neighbor Joining showed that the sequences obtained in this study were grouped with Cryptosporidium species described in the GenBank, with 99% or 100% similarity. Both methods are important tools for the diagnosis of cryptosporidiosis and differentiation of C. hominis and C. parvum in epidemiological investigations, as well as evaluation of Cryptosporidium sp. molecular heterogeneity

O recente crescimento da produção de organismos geneticamente modificados (OGM) no mundo tem demandado novas políticas de controle de plantio e comercialização de produtos alimentícios produzidos com ingredientes GM. Vários aspectos influenciam a análise de detecção e quantificação de OGM em alimentos, e em última instância, o monitoramento e atendimento à legislação e rotulagem. Este estudo se propôs a avaliar três destes aspectos, através da metodologia de análise de PCR em tempo real: a degradação de DNA e a presença adventícia de culturas GM e não-GM, ambas decorrentes da produção e processamento dos grãos em matérias-primas e produtos para consumo, bem como os planos de amostragem existentes para coleta de material alimentício destinado às análises de OGMs. Resultados demonstraram que os processos de fabricação degradam o material genético em diferentes graus em algumas matrizes de alimentos, viabilizando ou não, a análise por PCR em tempo real. Na cadeia de manufatura de subprodutos de soja, milho, arroz e trigo, 45% das amostras apresentaram detecção para uma cultura diferente da principal, sendo 44% deste total, GM. A adoção de metodologias de análise que se restringem à detecção de poucos genes-alvo, ou aplicadas somente a amostras compostas de soja ou milho, já não são mais suficientes para o rastreamento e quantificação dos alimentos contendo matérias-primas geneticamente modificadas. O plano de amostragem proposto foi representativo e delineado sob medida para avaliação de bebida à base de soja produzida em escala industrial, porém mais matrizes necessitam ser testadas para uma avaliação global das estratégias de amostragem. / The recent increase in genetically modified organisms (GMO) production is requiring new control policies for cultivation and commercialization of food products containing GM ingredients. There are many factors that can influence detection and quantification of GMO ingredients in food products, and these can ultimately influence the monitoring, labeling and legislation observance. In this work, we intended to evaluate three of these factors, using real-time PCR analysis method: DNA degradation; adventitious presence of GM and non-GM cultures, both caused by grain production and raw materials and finished products processing; and the available sampling plans for the collection of food material for GM analysis. Results in some food matrices showed that the manufacturing processes can degrade the genetic material in different degrees, allowing or not, the real-time PCR analysis. Regarding the soya beans, maize, rice and wheat manufacturing chains, 45% of the samples presented positive detection for a secondary crop, of which 44% were GM. The adoption of analysis methodologies restricted to a few target-genes, or applied solely to samples composed by soya or maize is simply not enough for tracking and quantification of food containing GM raw material. The sampling plan was representative and fit-for-purpose for one tested soya-based beverage and produced in industrial scale, however, more lots and matrices need to be analyzed for a global evaluation of the sampling strategies.

A mandioca (Manihot esculenta Crantz), apesar de ser muito cultivada e consumida no país, é uma planta da qual se conhece pouco sobre características intrínsecas do vegetal e as transformações bioquímicas que ocorrem em suas raízes tuberosas. Os traços fenotípicos das raízes foram usados para classificações empíricas, mas o emprego de técnicas de biologia molecular ainda é pouco utilizado para mostrar novos marcadores moleculares que poderiam identificar, além de traços agronômicos, fatores nutricionais, sensoriais e de qualidade que afetam essas raízes comestíveis. A participação de enzimas endógenas, como a &#945;-amilase, pode estar relacionada com o processo de deterioração pós-colheita, no caso, fornecendo energia para o desenvolvimento microbiano. Os objetivos do presente trabalho foram avaliar a diversidade genética entre cultivares de mandioca, as expressões gênicas de &#945;-amilase e da amido-sintase ligada ao grânulo, e a atividade amilolítica total. Amostras de variedades de mandioca, consideradas doce, foram coletadas nas reservas indígenas de Juruti e Caxiuanã, PA, e mantidas na Embrapa Agrobiologia (Seropédica, RJ). Para as análises de diversidade genética, foi extraído o DNA de folhas de 30 amostras e utilizado como molde em PCR-RAPD, a partir de 20 oligonucleotídeos do conjunto Operon W. Os amplicons foram submetidos à eletroforese em gel de agarose e fotodocumentados. Os padrões obtidos por PCR-RAPD foram agrupados através de coeficiente de Pearson e expressos sob dendograma. As análises por RAPD, utilizando o oligonucleotídeo OPW-12, permitiram a distinção das variedades e demonstraram alto grau de similaridade genética entre as amostras de mandioca avaliadas, permitindo a identificação de três grupos. Nestes grupos, estão distribuídas 28 das 30 amostras analisadas, com 75% de similaridade genética entre elas. Paralelamente, amostras de raízes das 30 variedades de mandioca foram empregadas em ensaios de determinação da atividade amilásica, sendo observada ampla variação entre as variedades. Igualmente, para os estudos de expressão gênica da &#945;-amilase e GBSSI, o RNA total foi extraído a partir das raízes de 30 amostras de mandioca, e utilizado como molde na obtenção de c-DNA e posterior amplificação por RT-PCR em tempo real. A análise da expressão relativa demonstrou discreta variação entre as amostras analisadas. Entretanto, somente a amostra 19 (variedade Açaí-Tinga) apresentou variação expressiva na quantificação relativa (3,18) para MEAMY, e as amostras 19 (variedade Açaí-Tinga) e 29 (Jabuti) apresentaram variação expressiva na quantificação relativa de GBSSI (4,13 e 2,58 respectivamente). / Cassava (Manihot esculenta Crantz) is a worldwide important crop, but some intrinsic feature of this plant remained unclear. Phenotypic characteristics of the roots of cassava are still used to classified them in spite of molecular biology technics to identify agronomic traits, nutritional factors, quality and sensorial parameters of the eatable parts of this plant. Endogenous enzymes, like &#945;-amylase, may be involved on the deteriorative process after harvest by the release of sugars to the microbial proliferation into the roots. The objectives of this study were to use a RAPD assay to identify some DNA variations within and between cassava varieties, expression of &#945;-amylase and granule-bound starch synthase gene, as well as amylolitic activity in the roots. Several cassava accessions were collected from indigenous community Caxiuanã and Juruti, state of Pará. The cultivars were grown in EMBRAPA Agrobiologia, state of Rio de Janeiro. Thirty cassava accessions were sampled to prepare DNA templates from cassava leaf. RAPD was performed using twenty commercial primers OPW, and the amplified DNAs for each sample were run in agarose gel. RAPD patterns were grouped following Pearson\'s coefficient, used to construct a dendogram. RAPD-PCR with primer OPW-12 showed that most varieties of this work showed a very similar fingerprint pattern, indicating that they were likely related. Twenty eight from 30 cassava cultivars analyzed presented more closely genotype, and were distributed into three groups by dendogram. These groups showed similarity coefficient of 75%. Amylolytic activity was determined by quantification of the amount of reducing sugars released during enzymatic reaction with aqueous extract from cassava roots, and variations were observed among cultivars. The evaluation of gene expression showed &#945;-amylase and granule-bound starch synthase genes have been shown to be differentially expressed in some cultivars, with higher expression of MEAMY gene on sample 19, Açaí-Tinga variety, and the same sample 19 and 29, Jabuty variety, for GGSSI gene.

Por representar a mais importante arbovirose em nível mundial, as infecções causadas pelos vírus da dengue são de grande importância em nosso país, apresentando uma ampla variedade de sintomas clínicos que vão desde infecção assintomática até formas mais graves da doença. O título de anticorpos neutralizantes produzidos frente à infecção por dengue parece ser determinante na forma de apresentação da doença no paciente. Atualmente, a forma com que o teste de neutralização é realizado demanda tempo para sua realização. O objetivo deste trabalho foi padronizar um ensaio de neutralização viral por RT-PCR em tempo real em cepas virais dos quatro sorotipos dengue para, posteriormente, ser empregada na detecção rápida e em grande escala de anticorpos em soro de pacientes e de candidatos vacinais. Para isso, foram construídas curvas padrão, para cada sorotipo viral, por meio da transcrição in vitro do RNA viral. O ensaio de neutralização padronizado nesse estudo reduziu o número de dias de detecção da neutralização em 48 horas quando comparada com a técnica de neutralização tradicional (PRNT), além de utilizar técnicas moleculares sensíveis e específicas para detecção como a RT-PCR em tempo real que garantem maior aplicabilidade do teste. / Because Dengue virus is the most important arboviral disease worldwide, infections caused by this pathogen are of great importance in Brazil, producing a wide variety of clinical symptoms ranging from asymptomatic infection to more serious forms of the disease. The title of neutralizing antibodies produced against the dengue infection appears to be determinant in the outcome of the disease. Currently, neutralization tests that have been performed take time for its execution. The aim of this study was to standardize a viral neutralization assay by real-time RT-PCR of viral strains of the four Dengue serotypes to subsequently be used for rapid detection and large-scale using antibodies of patients and for vaccine candidates. For this matter, standard curves were constructed for each Dengue serotype, by in vitro transcription of viral RNA. The neutralization assay in this study reduced the period of neutralization to 48 hours, compared to traditional neutralization test (PRNT), and it uses a more sensitive and specific molecular technique for detection of neutralizing antibodies, such as real time RT-PCR, to ensure greater applicability of the test

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Modifications of the “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” method (CTAB) to extract DNA of G. citricarpafrom symptomatic tissues with validation of chemical purity, structural integrity, and absence of DNA inhibiting substances, for further use in diagnosis by PCR were tested. There was no difference in the average of DNA extracted for hygienized and non-hygienized tissues (328.62 ng µL -1 and 322.79 ng µL -1 , respectively), with low concentration of proteinsin the DNA solution. The extractor of DNA in amount (>300 ng µL -1 ) and quality (structural integrity) was sufficient to perform the conventional and real-time PCR analyses. The absence of inhibitors was demonstrated by real-time PCR, adding 0.1 % genetically modified standard corn DNA (event MON 810 standard ERM®-BF413b), with the amplification of the specific region of this event in all test samples. The modified CTAB method sowed repeatability and partial reproducibility among the limits acceptablein the methodology with coefficient of variability lower than 30 %. To comply with the ISO/TEC 17025:2005 norm, the method for the diagnosis of the fungus G. citricarpaby PCR conventional and real time PCR was validated with the specific evaluation of the limitof detection. Conventional and real time PCR methods were specificity and adequacy to detect G. citricarpa. Conventional PCR presented detecting limit of 10 ng µL -1 of the fungus DNA, with repeatability. Real time PCR presented higher sensitivity, having the detecting limit determined for the technique with repeatability, at the concentration of 10 fg of DNA of the fungus. In two farms 24 external asymptomatic leaves from orange trees variety Pera Rio were collected; eight from each third (lower, medium and upper); totaling twent plants. The modified CTAB method for DNA extraction was used. The presence of the fungus in very low concentrations was detected in the asymptomatic leaves, which made it impossible when we used the conventional PCR technique. In those conditions, the real-time PCR proved to be feasible, reproducible and highly sensitive for G. citricarpa detection, amplifying between 232 and 232 x 10 2 DNA copies of the fungus from asymptomatic leaf samples; being an excellent option for the diagnosis of thispathogen in asymptomatic orchards. / A pinta preta dos citros (PPC), causada pelo fungo Guignardia citricarpa, é considerada uma doença quarentenária, que impõe restrições ao transporte de frutas frescas para países da União Europeia. Em Goiás, apesar dos sistemáticos levantamentos fitossanitários, ainda não se conhece a real distribuição da ocorrência da PPC em função da tecnologia disponível para o diagnóstico. A ocorrência de infecção latente, a presença de uma espécie endofítica muito semelhante morfologicamente à G. citricarpae o tempo para o diagnóstico por métodos convencionais levam à necessidade de validar métodos moleculares rápidos, eficientes, reprodutíveis, seguros e sensíveis de diagnóstico, que garantem confiabilidade dos diagnósticos e dos levantamentos de detecção e delimitação da distribuição dessa doença. Foram testadas modificações do método “Cationic hexadecyl trimethyl ammonium bromide” (CTAB) para extração de DNA de G. citricarpaem tecidos de frutos cítricos sintomáticos, com a avaliação dapureza química, integridade estrutural e ausência de substâncias inibidoras na solução de DNA, para posterior uso em diagnóstico por reação em cadeia da polimerase (PCR). Não houve diferença significativa na quantidade média de DNA extraído para tecidos higienizados e não higienizados (328,62 ng µL -1 e 322,79 ng µL -1 , respectivamente), com baixa concentração de proteínas na suspensão de DNA. A obtenção de DNA em quantidade (>300 ng µL -1 ) e qualidade (integridade estrutural) foi suficiente para realização das análises de PCR convencional e PCR em tempo real. A ausência de compostos inibidores foi demostrada por PCR em tempo real pela adição de DNA padrão de milho, geneticamente modificado 0,1 % (evento MON 810 padrão ERM®-BF413b), com a amplificação da região específica desse evento em todas as amostras teste. O método CTAB modificado apresentou repetitividade e reprodutibilidade parcial dentro dos limites aceitáveis para a metodologia, apresentando coeficientes de variação inferiores a 30 %. Em atendimento à norma ISO/IEC 17025:2005, foi validado o método para diagnóstico do fungo G. citricarpa por PCR convencional e PCR em tempo real com a avaliação da especificidadee do limite de detecção. Os métodos de PCR convencional e PCR em tempo real demonstraram serem específicos e adequados para a detecção de G. citricarpa. A PCR convencional apresentou o limite de detecção de 10 ng µL -1 de DNA do fungo, com repetitividade. A PCR em tempo real apresentou maior sensibilidade, sendo o limite de detecção determinado para a técnica, com repetitividade, na concentração 10 fg de DNA do fungo. Em duas propriedades foram coletadas 24 folhas externas assintomáticas de laranja-pera rio, sendo oito em cada terço (inferior, médio e superior) da planta, em um total de vinte plantas. Para a extração do DNA, foi utilizado o método CTAB modificado. Em folhas assintomáticas, apresença do fungo foi detectada em baixíssimas concentrações, o que inviabiliza a utilização da técnica PCR convencional. Nessas condições, a PCR em tempo real demonstrou ser viável, reprodutível e altamente sensível para a detecção de G. citricarpa, sendo detectado na concentração de 232 a 232 x 10² números de cópia do DNA do fungo em amostras de folhas assintomáticas, constituindo uma excelente opção para o diagnóstico desse patógeno em pomares assintomáticos.