As doenças pós-colheita em goiabas podem representar danos entre 20 e 40%, em função de condições ambientais e manejo integrado de doenças tanto antes quanto após a colheita. A adequação dos produtores às normas do Programa Integrado de Frutas (PIF) garante a obtenção de frutos com qualidade, produzidos de forma sustentável. Porém, exige o uso racional de agroquímicos durante as fases de produção da fruta. Neste contexto, utilizando a variedade Kumagai de polpa branca, os objetivos deste trabalho foram: (i) determinar as condições ambientais favoráveis à colonização natural de Guignardia psidii em goiabas; (ii) quantificar a incidência das doenças pós-colheita em goiabas nos dois principais mercados atacadistas do Estado de São Paulo; (iii) detectar e quantificar as doenças quiescentes desde a flor até em frutos no ponto de colheita; (iv) verificar o efeito da atmosfera controlada utilizando altas concentrações de O2 no controle das principais doenças pós-colheita da goiaba. Experimentos em condições controladas foram conduzidos para determinar o efeito de condições ambientais na colonização de G. psidii em goiabas. Na CEASA e na CEAGESP foram realizados levantamentos para quantificar as doenças pós-colheita em goiabas. Em duas áreas de produção de goiabas quantificaram-se as doenças quiescentes da goiaba em duas áreas de produção pelo método de detecção precoce de infecções quiescentes. Armadilhas caça-esporos foram colocadas em plantas para quantificar esporos carregados pela chuva. Talhões com e sem restos de cultura ao redor das plantas foram avaliados. Experimentos in vitro e in vivo foram realizados com diferentes tratamentos de atmosfera controlada para o controle de antracnose e pinta preta da goiaba. A temperatura ótima para a colonização de G. psidii foi de 30 ºC, atingindo incidência de 100% com 24 horas de molhamento, 10 dias após incubação. As principais doenças observadas nos mercados atacadistas e nas duas áreas de produção de goiabas foram antracnose, pinta preta e podridão de Fusicocum, com incidências máximas de 56,6%, 46,1% e 41,9%, respectivamente nos mercados atacadistas e máximas de 86,4%, 62,0% e 44,0%, respectivamente, nas áreas de produção de goiabas, 10 dias após incubação a 25 ºC. A antracnose foi a única doença observada desde a flor até em frutos maduros. Houve correlação direta entre a temperatura máxima combinada ou não com a precipitação acumulada e a incidência de antracnose nos frutos. Todos os isolados de Colletotrichum obtidos de frutos doentes foram identificados como C. gloeosporioides. Não houve diferença significativa nas incidências das principais doenças quiescentes da goiaba para as áreas com e sem restos culturais. A ocorrência de chuva no florescimento e nos estádios iniciais de desenvolvimento do fruto associada a temperaturas elevadas resultaram em incidências elevadas das principais doenças quiescentes da goiaba \'Kumagai\' em pós-colheita. O tratamento 30% CO2 + 70% O2 proporcionou maiores reduções no crescimento micelial dos fungos avaliados e na incidência de frutos doentes, após 4 dias sob atmosfera controlada. Frutos armazenados em atmosferas contendo 60% N2O + 20% O2 + 20% N2 e 30% CO2 + 70% O2 apresentaram menores severidade da antracnose e pinta preta, respectivamente em goiabas. / Post-harvest diseases in guavas may represent damages from 20 to 40%. Environmental conditions and disease management, before or after harvesting, are among their major causes. Standards proposed by the Integrated Production Fruit (IPF) ensure fruit quality and sustainable production with rational use of agrochemicals. Using the white-fleshed variety Kumagai, the objectives were: (i) to determine the environmental conditions favorable to the natural colonization of Guignardia psidii in guava (ii) to quantify the incidence of major post-harvest diseases of guava at the main wholesale markets of São Paulo state, (iii) to detect and quantify the quiescent diseases from flower to fruit in the harvest point (iv) to evaluate the effect of controlled atmosphere using high concentrations of O2 to control the main post-harvest diseases of guava. Experiments were conducted under controlled conditions to determine the effect of environmental conditions on the colonization of G. psidii on guavas. Surveys were carried out to quantify the postharvest diseases in guavas in CEASA and CEAGESP. The quiescent diseases of guava were quantified in two production areas by the method of early detection of quiescent infection. Inverted-bottle samplers were placed on plants to quantify spores carried by rain. Plots with and without crop residues around the plants were evaluated. Experiments in vitro and in vivo experiments were performed with different controlled atmosphere treatments for control of anthracnose and black spot of guava. The optimum temperature for G. psidii colonization was 30 °C, reaching 100% incidence with 24 hours of wetness, 10 days after incubation. The main diseases observed in the wholesale markets and in the two production areas were guava anthracnose, black spot and Fusicocum rot. The highest incidences were 56.6%, 46.1% and 41.9%, for anthracnose, black spot and Fusicocum rot, respectively, stored at 25 °C. In the field, fruits presented maximum incidences of 86.4% for anthracnose, 62.0% for black spot and 44.0% for Fusicocum rot. Anthracnose was the only post-harvest quiescent disease that was observed from the flower to the mature fruit. There was direct correlation between the maximum temperature and the incidence of anthracnose regardless of rainfall. Colletotrichum sp. strains obtained from diseased fruit were identified as C. gloeosporioides. There was no significant difference in the incidence of major diseases of guava quiescent in areas with and without crop residues around the plants. The occurrence of rain during flowering and early stages of fruit development associated with high temperatures resulted in high diseases incidences of major diseases quiescent guava \'Kumagai\' in post-harvest. The treatment 30% CO2 + 70% provided greater reductions in mycelial growth of fungi and incidence of diseased fruits, after 4 days under controlled atmosphere. Fruit stored with 60% N2O + 20% O2 + 20% N2 and 30% CO2 + 70% O2 showed lower severity of anthracnose and black spot, respectively.

O Brasil é o maior produtor de laranja do mundo e, embora o cultivo ocorra em todos os estados brasileiros, o Estado de São Paulo é o maior produtor, responsável por 80% da produção nacional. Dentre as doenças que podem limitar a produção dos citros encontra-se a podridão floral do citros (PFC), causada pelo fungo Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds. Os sintomas desta doença são caracterizados pela presença de lesões necróticas marrons ou alaranjadas nas pétalas e queda dos frutos recém formados, os cálices e os pedúnculos permanecem retidos nos ramos. Em citros, C. acutatum pode sobreviver aderido à superfície das folhas, na forma de apressório quiescente, por pelo menos um mês. As plantas daninhas podem atuar como hospedeiras alternativas de diversos patógenos, servindo como fontes de inóculo e desempenhando um importante papel na epidemiologia das doenças. O objetivo deste trabalho foi verificar se plantas daninhas, comuns em pomares de citros no Estado de São Paulo, podem servir como fonte de inóculo de C. acutatum para esta cultura. Sete espécies de plantas daninhas foram inoculadas com uma suspensão de conídios de C. acutatum, calibrada a 105 conídios/mL. Após a inoculação, estas foram mantidas em câmara úmida por 36 horas e, em seguida, amostras de todas as plantas foram coletadas e observadas em microscópio óptico para verificar a germinação dos conídios. Trinta, sessenta e noventa dias após as inoculações realizou-se o isolamento de C. acutatum das folhas inoculadas. Para isso, amostras de folhas de cada espécie de planta daninha foram coletadas, desinfestadas superficialmente e transferidas para placas de Petri, onde receberam 70 L de extrato floral de citros sobre o local da inoculação, para estimular a germinação dos apressórios ali presentes. As folhas permaneceram incubadas por 24 horas a 23°C, com fotoperíodo de 12 h. Após esse período, as áreas inoculadas das folhas foram cortadas e transferidas para placas de poliestireno contendo meio de Martin. Após o surgimento das primeiras colônias de C. acutatum, discos de quatro milímetros de diâmetro foram transferidos para meio BDA, para a obtenção de colônias puras. Em seguida foi realizado um teste de patogenicidade em flores de laranja doce de três anos de idade. Os dados de porcentagem de isolamento foram analisados análise de variância e testes não paramétricos. Foram observadas a germinação e a formação de apressórios de C. acutatum na superfície de todas as folhas inoculadas, após 36 horas de câmara úmida. Não houve diferença estatística na sobrevivência de C. acutatum ao longo dos 30, 60 e 90 dias e não foi observado nenhum tipo de sintoma nas folhas inoculadas. C. acutatum foi isolado de todas as plantas daninhas analisadas, embora o tempo de sobrevivência tenha variado em função da espécie de daninha. Todos os isolados obtidos das plantas daninhas apresentaram sintomas típicos de PFC em todas as flores inoculadas. Os resultados obtidos demonstraram que as plantas daninhas avaliadas podem servir como hospedeiras alternativas de C. acutatum, resultando em fonte de inóculo primário e secundário deste patógeno para a cultura do citros. / Brazil is the major orange producer in the world, and although the cropping occurs all over the Brazilian States, the São Paulo State is the major producer, responsible for 80% of the national production. Postbloom fruit drop (PFD), caused by the fungus Colletotrichum acutatum J. H. Simmonds is an important disease that can cause yield reduction. The symptoms of this disease are characterized by the presence of brown or orange necrotic lesions in the petals and the drop of young fruits; the calyces and peduncles remain in the branches after fruit drop. In citrus, C. acutatum can adhered to the surface of the leaves, in the form of quiescent appressoria, for at least one month. The weeds can act as alternative hosts of diverse pathogens, serving as inoculum sources and playing an important role in the disease epidemiology. The purpose of this research was to verify if weeds, commons in citrus orchards in São Paulo State, may serve as inoculum source of C. acutatum for this crop. Seven weed species were inoculated with a conidial suspension of C. acutatum, calibrated with 105 conidia/mL. After the inoculation, the weeds were kept in humidity chamber for 36 hours. Samples of all weeds were collected and observed in optical microscope to verify the conidia germination. Thirty, sixty and ninety days after inoculation, C. acutatum was isolated from the inoculated leaves. For this purpose, leaves of each weed species were collected, superficially disinfested and transferred to Petri dishes. The leaves received 70 L of citrus flower extract over the inoculation area to stimulate the appressoria germination. The leaves were incubated for 24 hours at 23°C, with 12 hours of photoperiod. After this period, the inoculated areas were cut and transferred to polystyrene dishes with Martin medium. After the appearance of the first colonies of C. acutatum, discs of four millimeters of diameter were transferred to PDA medium to obtain pure colonies. A pathogenicity test was carried out in three years old sweet orange flowers. The percentage of pathogen isolation was analyzed by variance analysis or non-parametric analysis. Conidia germination and appressoria formation of C. acutatum in all inoculated leaves were observed, after 36 hours of humidity chamber. There was no statistical difference in the C. acutatum survival during 30, 60 e 90 days and no type of symptom was observed in the inoculated leaves. C. acutatum was isolated from every weed analyzed, although the survival period varied among the weed species. Every isolated obtained from the weeds presented typical PFD symptoms in every inoculated flowers. The results showed that weeds can serve as alternative hosts of C. acutatum, contributing in primary and secondary inoculum source of this pathogen to the citrus crop.

O fungo basidiomiceto Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), podendo causar sérios perdas na produção. Este fungo é capaz de colonizar, além do cacau, várias outras plantas hospedeiras, onde pode se adaptar às novas condições, contribuindo, dessa forma, para o aumento da variabilidade genética desse microrganismo. Assim sendo, o objetivo desse trabalho foi isolar e identificar C. perniciosa de tecidos sadios de cacaueiro e comparar a sua variabilidade genética e fisiológica com isolados patogênicos por meio de análises moleculares e fisiológicas. Após a desinfecção e retirada da casca dos ramos, colônias morfologicamente similares a C. perniciosa foram obtidas de tecidos sadios de cacaueiro, os quais foram considerados como endófitos. A identificação preliminar desses isolados foi baseada nas observações morfológicas, tais como coloração da colônia e presença de grampos de conexão. Posteriormente, os isolados de C. perniciosa foram caracterizados geneticamente por RAPD, e sequenciamento de regiões do rDNA (18S+5.8S+28S), resistência a fungicidas, produção de exoenzimas e patogenicidade ao cacaueiro. A análise por marcadores RAPD separou os 37 isolados em 8 grupos (G1 a G8), sendo o grupo G1 dividido em 2 subgrupos (G1-1 e G1-2). Por esta análise foi possível observar que linhagens com 100 % de similaridade foram isoladas de locais diferentes, enquanto que isolados obtidos de uma mesma planta podem ser geneticamente diferentes. A análise da seqüência do rDNA dos isolados de C. perniciosa mostrou a formação de 6 grupos distintos (R1 a R6). Isolados obtidos de uma mesma planta não se agruparam, reforçando a hipótese de que isolados geneticamente diferentes podem ocupar a mesma planta hospedeira. Quanto resistência a fungicidas (tebuconazole, mancozeb, benomil e óxido cuproso), foi observado que tebuconazole foi o mais eficiente na inibição do crescimento miceliar, enquanto benomil apresentar menor taxa de inibição. Isolados endofíticos e patogênicos apresentaram comportamento similar em relação aos fungicidas. Resultado semelhante foi observado quanto a produção de exoenzimas (amilase, lipase, pectinase, exo e endoglicanase). Foi observada a produção de todas as enzimas avaliadas, sendo possível detectar variações entre os isolados. Entretanto, esta variação não foi correlacionada ao hábito endofítico ou patogênico. A patogenicidade de 8 isolados de C. perniciosa foi avaliada em mudas de cacau Catongo. A porcentagem de plantas infectadas com sintomas variou de 55% a 100%. Isolados endofíticos apresentaram baixa virulência sobre o cacaueiro, tendo o isolado endofítico 31 induziu sintomas em 60% das plantas inoculadas, resultado este provavelmente devido à alta pressão de inóculo. Este trabalho mostra pela primeira vez C. perniciosa como endófito em tecidos não meristemático do cacaueiro. / The basidiomycete fungus Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer is the causal agent of Witches' Broom Disease of Cacao (Theobroma cacao L.) which is the main factor limiting cocoa production in the Americas. Pod losses of up to 90% are experienced in affected areas as evidenced by the 50% drop in production in Bahia province, Brazil following the arrival of the C. perniciosa in the area in 1989. The disease has proven particularly difficult to control and many farmers in affected areas have given up cacao cultivation. Any useful control strategy for Witches' Broom disease must be effective against in range strains of the pathogen. It is already known that pathogenic variation exists among isolates of Crinipellis perniciosa obtained from different areas and host plants. However, any study was developed about the variability between endophytic and pathogenic population. In order to evaluate the genetic variability of 35 isolates of endophytic and pathogenic populations of Crinipellis perniciosa, the RAPD technique, ITS sequencing and fungicide susceptibility were performed. Genetic variability between 35 isolates of C. perniciosa was analysed by the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique, which indicated that isolates from other host plants were more diverse than isolates obtained from cacao plants. Among cacao isolates was observed at least two groups, one formed mainly by endophytic isolates and other by pathogenic ones. Analysis by ITS sequence grouped isolates independently of endophytic or pathogenic status. Fungicide susceptibility showed that cupric oxide inhibits statistically more endophytic isolates than pathogenic ones, showing that could have physiological differences between these populations. The present study highlighted the possible genetic and physiological differences between endophytic and pathogenic population of C. perniciosa.

O estudo de fungos endofíticos tem sido intensificado nos últimos anos e abrange principalmente a descrição de novas espécies, o potencial de utilização no controle biológico de fitopatógenos e a produção de metabólitos secundários com atividades biológicas diversas. No entanto, a interação e a possível função destes organismos em plantas de clima tropical são pobremente estudadas e pouco compreendidas. A cana-de-açúcar é uma das principais culturas do Brasil e nos últimos anos está recebendo especial atenção devido à produção de etanol para uso como biocombustível. Um grande avanço no conhecimento das comunidades microbianas endofíticas desta planta tem sido alcançado, abrindo a possibilidade de estudo sobre as funções destes organismos na interação endofítica, bem como de seu potencial biotecnológico. Uma espécie que coloniza consistentemente os tecidos de cana-de-açúcar é o fungo Epicoccum nigrum. Este fungo é conhecido por sua atividade de biocontrole de fitopatógenos e por apresentar metabolismo secundário altamente desenvolvido e diverso. Nesse contexto, este trabalho teve por objetivos: 1) estudar a diversidade genética de isolados endofíticos de Epicoccum de cana-de-açúcar e de outros hospedeiros; 2) desenvolver um sistema de transferência de genes repórteres, visando à análise da interação in vitro e in vivo com cana-deaçúcar; 3) avaliar a atividade antimicrobiana in vitro de isolados endofíticos de Epicoccum contra diferentes fitopatógenos e patógenos humanos; 4) obter mutantes insercionais com atividade antimicrobiana ausente, visando à identificação de genes envolvidos no metabolismo secundário. O trabalho foi iniciado com o isolamento de Epicoccum de cana-de-açúcar. A análise por meio de abordagem polifásica resultou na separação dos isolados em dois taxa distintos (Grupo 1, E. nigrum; Grupo 2, Epicoccum sp.), demonstrando que a classificação de E. nigrum como uma única espécie variável deve ser reavaliada. A seguir, transformantes resistentes a higromicina B e expressando GFP foram obtidos por meio de transferência gênica mediada por A. tumefaciens. Ensaios de colonização de cana-de-açúcar in vitro e in vivo com a linhagem selvagem e transformada demonstraram a natureza não patogênica das linhagens e que E. nigrum é capaz de colonizar endofiticamente e persistir nas folhas desta planta. A análise da atividade antimicrobiana revelou extensa variação fisiológica, a qual foi correlacionada com a variabilidade genética dos isolados. Uma biblioteca de agrotransformantes de E. nigrum e Epicoccum sp. foi caracterizada quanto à perda da atividade antimicrobiana. A análise das seqüências flanqueadoras do T-DNA obtidas por TAIL-PCR a partir dos mutantes revelou que a inserção ocorreu em diferentes locais do genoma, muitos com elevada similaridade com proteínas hipotéticas de fungos, algumas sem função conhecida, e outras contendo domínios conservados envolvidos em diferentes funções celulares, como regulação da expressão gênica, transporte, obtenção de energia e outras funções enzimáticas. A análise do extrato orgânico por meio de bioautografia revelou a perda da atividade antimicrobiana de alguns mutantes insercionais, em comparação ao extrato da linhagem selvagem. O grande número de mutantes obtidos e caracterizados constitui uma ferramenta importante para o estudo molecular do metabolismo secundário deste fungo endofítico, auxiliando o entendimento da biossíntese de diversos compostos com estruturas complexas produzidos por esta espécie. / The study of endophytic fungi has increased in last few years and includes mainly the description of new species, biological control and production of compounds with biological activity. However, due the fact that few studies have been done, the role of these microorganisms inside the host plant from tropical areas is poorly understood. Sugarcane is one of the most important crop in Brazil, mainly due the biofuel production. Therefore, studies have been done to better understanding the role of endophytic microbial diversity inside the sugarcane plants, allowing the possibility to use this interaction in sugarcane production and also find endophytic isolates with biotechnological potential. Previous studies have shown that an important sugarcane endophytic fungus is Epicoccum nigrum, which species has been associated to biological control of many phytopathogens and also production of different secondary metabolites. In this way, the aims of the present study were to 1) study the genetic diversity of sugarcane endophytic Epicoccum; 2) develop a genetic transformation system for Epicoccum spp., allowing the in vitro and in vivo study of the interaction with sugarcane; 3) evaluate the in vitro antimicrobial activity of Epicoccum; 4) obtain mutants defective to antimicrobial activity and identification of genes associated to this activity. The polyphasic approach indicated that the evaluated Epicoccum population present two different genotypes (Group 1: E. nigrum and Group 2: Epicoccum sp.), suggesting that the classification of E. nigrum in only one species should be revised. Mutants resistant to hygromicin B and expressing GFP gene were obtained by transformation with Agrobacterium tumefaciens. In vitro and in vivo sugarcane colonization showed that the Epicoccum isolates and mutants were able to settling endophytically inside sugarcane without induce disease symptoms, and live up to leaves. The results shown that the antimicrobial activity was related to genetic variability, and this activity was better characterized by analysis of a obtained mutant library of E. nigrum and Epicoccum sp. The TAIL-PCR analysis revealed that the T-DNA introduced into the mutants was inserted in different regions of the fungi genome, truncating different genes those coding fungi hypothetical proteins, conserved domain associated to cellular function, such as genetic regulation, energy obtaining and others enzymatic activity. The analysis by bioautography indicated that some mutants lose the antimicrobial activity, allowing the correlation between the truncated genes and antimicrobial compound production. The evaluation of this mutant library showed that different genes are associated to antimicrobial compound production and may be an important tools to study the secondary metabolism in this endophytic fungus, allowing the understanding of biochemical pathway associated to biosynthesis of complex molecules produced by this fungus.

A citricultura é uma atividade rural extremamente importante no contexto sócio-econômico brasileiro. A laranja representa 49% de toda a produção brasileira de frutas. Entretanto, anualmente milhares de toneladas de frutos são perdidas devido à ação de fitopatógenos. A Mancha Preta dos Citros (MPC) tem sido responsável por grandes prejuízos em várias regiões produtoras de citros no mundo, sendo designada como barreira fitossanitária, principalmente no mercado Europeu. Para o consumo in natura, a aparência dos frutos é fator essencial, onde a MPC compromete a comercialização de frutas frescas. O controle químico de patógenos de plantas é geralmente o mais utilizado para minimizar os danos causados pela MPC, apesar do uso de tais produtos implicar em altos custos, tanto para os agricultores com para o meio ambiente, causando contaminação do solo e da água e aumentando a pressão de seleção sobre a população do patógeno. Dessa forma, o controle biológico torna-se uma alternativa atrativa, como uma estratégia que permite um menor impacto ambiental aliado à proteção da planta contra o patógeno. No entanto, para sua aplicação, são necessários estudos relacionados à utilização de técnicas de biocontrole, como por exemplo, a utilização de microrganismos produtores de enzimas hidrolíticas. Tais enzimas, como as quitinases, endoglicanases e β- glicosidases têm a capacidade de digerir a parede celular de fungos e bactérias. Neste trabalho, 24 isolados de G. citricarpa foram avaliados quanto à sensibilidade aos fungicidas usados em campo para controle da doença: piraclostrobina e carbendazim, nas dosagens de 0,5; 1 e 2 mg i.a./mL, a fim de verificar o efeito da pressão de seleção causada pelo uso contínuo destes compostos. Dois dos isolados apresentaram resistência ao carbendazim em todas as dosagens testadas, indicando que o uso desse agroquímico pode selecionar mutantes resistentes, resultando na não eficiência deste produto no controle da MPC. Uma alternativa para minimizar este tipo de efeito seria a utilização deste composto em combinação com outros princípios ativos. As atividades celulolíticas e quitinolíticas de 96 isolados de fungos filogeneticamente distintos foram avaliadas para a seleção de potenciais agentes de controle biológico. Os quatro isolados que apresentaram maior atividade de cada uma destas enzimas, além de duas linhagens de Trichoderma, foram testados como potencial de biocontrole de G. citricarpa em um experimento com folhas laranja ‘Valência’, comparando a ação destes com a de fungicidas comerciais. Apesar de o melhor controle do patógeno ter sido observado em folhas tratadas com piraclostrobina, dois isolados fúngicos mostraram eficiência similar ao fungicida, inibindo o desenvolvimento de G. citricarpa, o que sugere a possibilidade de futura utilização de métodos de controle biológico para a Mancha Preta dos Citros. / Citriculture is an extreme important rural activity in social and economical national context in Brazil. Orange is 49% of total brazilian fruit production. However, thousands of tons are lost due to the action of phytopathogens annually. The Black Spot of Citrus (BSC) is responsible for great lost in various citrus producers regions all around the world, being already designed as a phytosanitary barrier, mainly in European market. For in natura fruit consuming, the fruit esthetic is a limiting factor, where BSC compromises the market of fresh affected fruits. Chemical control of plant pathogens is the most commonly way used to minimize damages in citriculture by BSC, although the application of such products implies in high costs, not only for farmers but also for environment, causing soil and water contamination and increasing the selection pressure on pathogen population. On this way, the biocontrol became an attractive way, as a strategy that permits a minor environmental impact besides the plant protection against phytopathogens. For this application, are necessary researches based on utilization of biocontrol techniques, as for example, the using of microorganism producers of hydrolytic enzymes. Such enzymes, like quitinases, endoglicanases and β-glicosydases are able to digest the fungal and bacterial cell wall. In this work, 24 strains of G. citricarpa were evaluated about the sensibility to fungicides used in field for BSC control: piraclostrobin and carbendazin, in dosages of 0,5, 1,0 and 2,0 mg a.i./mL, aiming to verify the effect of selection pressure caused by continuous use of this compounds. Two of these strains presented resistance to carbendazim in all evaluated dosages, showing that the use of this agrochemical may select resistant individuals, resulting a non-efficiency of this compound for BSC control. An alternative to minimize this kind of effect must be the application of this compound in combination to others active principles. The celullolitic and chitinollitic activities of 96 fungi strains widely spread phylogenetically were evaluated for selection of potential biological control agents. Four strains that presented major activity of each enzyme, besides two Trichoderma lineages, were tested as potential biological control of G. citricarpa in an experiment with ‘Valência’ orange leaves, comparing the action of these biocontrolers with commercial fungicides. Although a better pathogen control was achieved in leaves treated with piraclostrobin, two fungi strains revealed to have the similar efficiency to fungicide, inhibiting the development of G. citricarpa, suggesting the possible future utilization of biocontrol methods to Black Spot of Citrus.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

Microrganismos endofíticos são definidos como organismos que habitam em pelo menos durante um período de seu ciclo vital, o interior de um vegetal, sem causar aparentemente nenhum dano a este. Na busca de novos organismos e novos metabólitos secundários, um estudo foi conduzido visando avaliar a diversidade química de bactérias endofíticas por meio do isolamento e identificação de metabólitos secundários produzido por bactérias endofíticas de etnovariedades de mandioca, mantidas por tribos indígenas da Amazônia brasileira. Sessenta e sete bactérias endofíticas de mandioca foram selecionadas e submetidas à uma seleção através de testes de antagonismo in vitro. A bactéria endofítica, Bacillus pumilus foi a que apresentou forte ação inibitória contra os fitopatógenos Rhizoctonia solani, Pythium e Sclerotium rolfsii. Essa bactéria foi identificada através do sequenciamento de um fragmento do gene de 16S rRNA e por meio da análise de ácidos graxos (FAME). A obtenção dos metabólitos da bactéria selecionada foi realizada através da extração dos meios de cultura com os solventes hexano, acetato de etila e diclorometano. Após a concentração dos extratos, seus constituintes químicos foram realizados através de cromatografia em camada delgada, cromatografia em coluna, cromatografia gasosa acoplada ao espectrômetro de massas CG-EM) e cromatografia líquida acoplada ao espectrômetro de massas (CL-EM). Os extratos obtidos por meio de diclorometano e acetato de etila continham diferentes componentes químicos que mostraram atividade inibitória contra os três fitopatógenos testados. O método cromatográfico CL-EM permitiu a identificação de uma substância antifúngica produzida pela bactéria endofítica, Bacillus pumilus, conhecida como pumilacidina. / Endophytic microorganisms are defined as organisms that inhabit the interior of a vegetable at least during a period of the vital cycle, without causing any apparent damage. In the search for new organisms and new secondary metabolites, a study was conducted to evaluate the chemical diversity of endophytic bacteria through the isolation and identification of secondary metabolites produced by endophytic bacteria of cassava cultivated by Brazilian Amazon Indian tribes. Sixty seven endophytic bacteria isolated from cassava were screened using in vitro antagonisms tests. An endophytic bacterium, the Bacillus pumilus, which showed a strong inhibitory activity against Rhizoctonia solani, Pythium aphanidermatum and Sclerotium rolfsii was selected. This bacterium was identified by sequencing of 16S rRNA genes and by FAME. The bacterial endophytic localization was confirmed by cassava cell tissue examination using scanning electron microscopy. The bacterial metabolites were extracted from the culture media using the solvents hexan, ethyl acetate and dichloromethane. After concentrate the extracts their chemical constituents were analyzed using thin layer chromatography (TLC), chromatography column, gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS) and liquid chromatography coupled with mass spectrometry (LC/MS). The extracts obtained with dichloromethane and ethyl acetate contained different chemical compounds that showed inhibitory activity against the three plant-pathogenic fungi tested. The LC/MS method allowed the identification of an antifungal compound produced by the B. pumilus, which is known as pumilacidin.

Orientadores: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Odalys Garcia Cabrera / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:42:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ambrosio_AlinneBatista_D.pdf: 4013772 bytes, checksum: 30fca05155be94194f624c02d6697d87 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O cacaueiro (Theobroma cacao L., Sterculiaceae), planta nativa da região amazônica, é aprincipal espécie dentre as 22 do gênero que é comercialmente explorada para aprodução de sementes, as quais tem grande importância econômica principalmente porser usado na produção de chocolate.Por conta disso, a produção das sementes sempre foiuma grande preocupação para as regiões produtoras, e o fator que causa o maior declínioda produção de cacau é o aparecimento de doenças. No Brasil, o cacaueiro apresentacomo principais doenças causadoras de perdas na produção a vassoura-de-bruxa e o maldo-facão. A vassoura-de-bruxa é causa pelo fungo Moniliophthora perniciosa e tem comosintomas característicos a hiperplasia e hipertrofia das células que dão lugar a tecidosanômalos chamados de vassoura. O mal-do-facão, causado pelo fungo Ceratocystiscacaofunesta, é uma doença assintomática, sendo detectada somente com a morte daplanta. As duas doenças foram estudadas neste trabalho atravez de ferramentas dagenômica na tentativa de identificação de mecanismos de interação patógenohospedeiro.Em Ceratocystis cacaofunesta foi feita uma análise global da mitocôndriaintegrando dados de genômica, transcritômica e proteômica. Foi gerado o primeiroinventário de proteinas mitocondriais de um fitopatógeno, sendo preditas um total de1.124 proteinas, das quais 304 foram identificadas experimentalmente. Dentre asproteinas listadas no inventário, 117 tem função desconhecida e 7 parecem ser específicasdeste fungo.Análises dos dados do genoma de M. perniciosa sugerem que o fungo poderiaestar produzindo giberelina, o que explica muito dos eventos que acontecem durante ainteração M. perniciosa-cacaueiro durante a fase biotrófica do fungo. Este trabalho demonstrou a importância desse hormônio na progressão da doença, assim como aalteração do metabolismo de giberelina na planta durante a interação. Os dados obtidosneste trabalho geraram conhecimento para desenvolvimento de estrátégias de controledas duas doenças, além de direcionar estudos com outros fitopatógenos / Abstract: Cacao tree (Theobroma cacao L., Sterculeaceae) is a native plant from Amazon region andthe main species commercially exploited for seed production among the 22 of the genus.This plant has a great economic importance because of its use in the production ofchocolate. Due to this, producing regions always has been concern to seed production,and diseases are the most important factors of decline in cocoa production. In Brazil,cacao witches' broom and ceratocystis wilt are major diseases causing production losses.The witches' broom is caused by the fungus Moniliophthora perniciosa and thecharacteristic hyperplasia and hypertrophy symptoms of cells gives rise to anomaloustissue called broom. Meanwhile, the ceratocystis wilt caused by Ceratocystis cacaofunestais an asymptomatic disease; it is detected only with the death of the plant. Both diseaseswere studied using genomic tools in an attempt to identify mechanisms of host-pathogeninteraction. In Ceratocystis cacaofunesta, a mitochondrial global analysis integrating datafrom genomics, transcriptomics and proteomics was made. This work generated the firstinventory of mitochondrial proteins of a plant pathogenic fungus, in which 1,124 proteinswere predicted and 304 were identified experimentally. Among the proteins listed in theinventory, 117 have unknown function and 7 appear to be specific to this fungus. Dataanalysis of the genome of M. perniciosa suggests that the fungus could be producinggibberellin, it may explain much of the events that happen during the interaction M.perniciosa-cacao in biotrophic phase of the fungus. Therefore, this work showed theimportance of this hormone in disease progression, as well as altered metabolism ofgibberellin in the plant during the interaction. The data obtained in this work generatedknowledge to develop strategies to control these two diseases, and can drive studies withother pathogens / Doutorado / Genetica de Microorganismos / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientadores: Telma Teixeira Franco, Carlos Raimundo Ferreira Grosso / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-07T12:03:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 OliveiraJunior_EnioNazarede_D.pdf: 5260922 bytes, checksum: 838753bbbf60bb35edf5aeb62dbbc33e (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: Na primeira etapa deste trabalho foi feita uma revisão de literatura referente à atividade antifúngica de quitina, quitosana e seus derivados contra diferentes tipos de microrganismos, como bactérias, fungos e leveduras. Nesta revisão são descritos importantes desenvolvimentos relativos a aplicação de quitosana e seus derivados como substância antimicrobiana contra bactérias, fungos e leveduras, hipóteses envolvidas na suas atividades antimicrobianas e efeitos na qualidade e armazenagem de vegetais frescos tratados com quitosana e seus derivados. A segunda etapa deste trabalho se refere a produção e caracterização de quitosanas com diferentes graus de polimerização (DP) obtidas por tratamento térmico e quitosanas com diferentes graus de acetilação (FA) obtidas por desacetilação alcalina. A terceira etapa deste trabalho refere-se à avaliação dos efeitos da atividade antifúngica de quinze amostras de quitosana com diferentes graus de polimerização e diferentes graus de acetilação contra quatro fungos fitopatogênicos (Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Penicillium expansum e Rhizopus stolonifer). Os crescimentos fúngicos foram avaliados em micro placas de 96 reservatórios e medidos em leitor de microplacas. A atividade antifúngica de quitosana aumentou com o decréscimo do FA. O efeito da combinação de quitosana com menor FA e maior DP teve a mais alta atividade fungistática contra os fungos A. alternata e B. cinerea. Os resultados tendem a indicar que os grupamentos amino protonados (NH3 +) foram um importante fator envolvido no efeito antifúngico. Os fungos mais resistentes foram Penicillium expansum e Botrytis cinerea e os mais sensíveis foram Alternaria alternata e Rhizopus stolonifer. Na quarta etapa deste trabalho foi investigado o efeito de quitoligômeros no crescimento dos mesmos fungos analisados na terceira etapa. Verificou-se que misturas de quitoligômeros de DP 5 a 8, DP 2 a 12 e de DP 2 a 11, apresentaram baixo ou nenhum efeito no crescimento fúngico na concentração máxima de 1,000 µg × mL-1. A última etapa deste trabalho refere-se às mudanças morfológicas nas hifas dos fungos tratados com quitosana. As micrografias obtidas por microscopia eletrônica de varredura com emissão de campo mostraram que os micélios fúngicos tratados com quitosana estavam agregados, excessivamente ramificados, inchados e de comprimentos reduzidos / Abstract: In the first step of this work, a literature review concerning antimicrobial activity of chitin, chitosan and their derivatives against different groups of microorganisms, such as bacteria, yeast and fungi was made. Important developments related to applications of chitosan and their derivatives, as an antimicrobial substance against bacteria, fungi and yeasts, hypotheses involved in the antimicrobial activities and effects on storability and quality of fresh vegetables treated with chitosan and its derivatives are described in this present review. The second step of this work, concerns the production of chitosans with different degrees of polymerization (DP) by thermal treatment and chitosans with different degrees of acetylation (FA) by alkaline deacetylation. The third step of this work, concerns the evaluation of antifungal effects of fifteen chitosans with different degrees of polymerization and different degrees of acetylation against four phytopathogenic fungi (Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Penicillium expansum and Rhyzopus stolonifer) by using the 96-well microtiter plate and a microplate reader. Antifungal activity of chitosans increased with FA decreasing. Combination effect of chitosan with low FA and high DP showed the highest fungistatic activity against A. alternata and B. cinerea. The results indicated that free amino groups protonated (NH3 +) were an important factor for antifungal effect. The most resistant fungi were Penicillium expansum and Botrytis cinerea and the most sensitive fungi were Alternaria alternata and Rhizopus stolonifer. In the fourth step of this work, it was investigated the effect of chitooligomers in the fungal growth of the same target fungi analyzed in the third step. The results suggested that chitooligomer mixtures of DP 5 to 8, DP 2 to 12 and DP 2 to 11 showed low or no effect on the fungal growth at concentration of 1,000 µg × mL-1. The last step of this work, concerns the morphological changes on hyphae of fungi treated with chitosan. Mycelial aggregation and morphological structural changes as excessive branching, swelling of the cell wall and hyphae size reduction were observed in the micrographs obtained by scanning electron microscopy field emission / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Químicos / Doutor em Engenharia Química

Neem cake is a product of the cold pressing from the neem kernels to obtain neem oil. Bio-active substances from neem cake extracted solutions were evaluated for their potential to control the root knot nematodes and other pests of plants. In this study different concentrations of the solution extracted from neem cake was tested against the second stage juveniles of the plant parasitic nematode Meloidogyne spp. and four phytopathogenic fungi: Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Collectotrichum spp. and Phytopthora capsici. Toxicity of neem cake extractions is represented by the EC50 value for the second-stage juvenile (J2) of Meloidogyne spp. and the four phytopathogenic fungi via Probit analysis. A 5% dilution of the solvent extracting from neem cake already caused 100% larval mortality after 24 hours exposure. Undiluted neem cake extraction effectively inhibited the growth of the four phytopathogenic fungi. The EC50 value of neem cake on J2-larvae of Meloidogyne nematode and on the fungi Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Collectotrichum spp. and Phytophthora capsici was 0.51, 0.74, 0.30, 0.51 and 4.33%, respectively. / Bánh dầu neem là sản phẩm của quá trình ép nhân hạt neem để lấy dầu. Các hoạt chất sinh học từ dịch chiết bánh dầu neem đã được đánh giá có tiềm năng lớn trong phòng trừ tuyến trùng nốt sưng và các loài dịch hại khác của nhiều loại cây trồng. Trong nghiên cứu này các nồng độ dịch chiết khác nhau của bánh dầu neem đã được thử nghiệm khả năng diệt tuyến trùng (ấu trùng tuổi 2 thuộc giống Meloidogyne spp.) và ức chế 4 loài nấm bệnh như: Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Collectotrichum spp. và Phytopthora capsici. Độc tính của dịch chiết bánh dầu neem được biểu diễn bởi giá trị EC50 đối với ấu trùng tuổi 2 của tuyến trùng Meloidogyne spp. và các loài nấm bệnh thông qua phân tích Probit. Dịch chiết bánh dầu neem ở nồng độ 5% đã làm chết 100% cá thể IJ2 của Meloidogyne spp sau 24 giờ phơi nhiễm. Dịch nguyên chất bánh dầu neem ức chế cả 4 loài nấm bệnh. Giá trị EC50 của bánh dầu neem lên ấu trùng tuổi 2 của Meloidogyne spp và các loài nấm bệnh Rhizoctonia solani, Sclerotium rolfsii, Collectotrichum spp. and Phytophthora capsici tương ứng là 0.51, 0.74, 0.30, 0.51 và 4.33%.