Colletorichum acutatum é o agente causal da Podridão Floral dos Citros (PFC), doença que em determinadas condições ambientais constitui-se em fator limitante à produção citrícola em várias regiões produtoras do mundo. Além da PFC, esse fungo causa antracnose em outros hospedeiros, sendo um dos patógenos que mais acarreta danos em frutíferas tropicais, subtropicais e temperadas no mundo. O trabalho teve como objetivos estudar a especificidade patogênica e compatibilidade vegetativa entre isolados de C. acutatum dos citros e de outros hospedeiros como: goiaba, pimentão, morango e pêssego. Para os estudos de especificidade patogênica, foram realizadas inoculações cruzadas entre isolados de citros e dos outros hospedeiros visando verificar se os diferentes isolados são capazes de causar sintomas de PFC em flores de citros e antracnose em frutos. Foram também obtidos, a partir dos mesmos isolados, mutantes deficientes na absorção de nitrogênio (mutantes nit). Esses foram caracterizados fenotipicamente e pareados a fim de verificar por meio de estudos de compatibilidade vegetativa a capacidade de recombinação entre si, gerando heterocários com patogenicidade alterada. Para verificar a ocorrência de possíveis alterações na patogenicidade dos heterocários formados, foi feita a inoculação dos heterocários e dos isolados parentais nos seus respectivos hospedeiros de origem. Nos ensaios de inoculação cruzada, houve grande variação quanto à patogenicidade dos isolados inoculados. Isolados provenientes de citros e de goiaba causaram lesões em flores de citros, isso demonstra a ausência de especificidade entre isolados dos dois hospedeiros. Porém, isolados provenientes de pimentão, pêssego e morango não foram capazes de causar sintomas em flores de citros o que indica a existência de especificidade desses isolados. Os isolados provenientes dos citros e de outros hospedeiros foram capazes de causar antracnose em goiaba, morango e pêssego, mas apenas os isolados de pimentão causaram antracnose em pimentão. Alguns isolados de citros foram capazes de recombinar entre si e com isolados de goiaba, pimentão e morango. Dos heterocários formados, dois foram caracterizados quanto a sua patogenicidade, Het 3 e Het 5. Como resultado, o heterocário proveniente do isolado de citros com goiaba (Het 5) comportou-se de forma semelhante à um de seus parentais. O heterocário proveniente de citros com pimentão (Het 3), mostrou-se mais agressivo do que seus parentais quando inoculados em pimentão. Com esses estudos pode-se concluir que existe especificidade patogênica entre isolados de C. acutatum de diferentes hospedeiros, entretanto, isolados de diferentes hospedeiros podem recombinar entre si e gerar heterocários com características patogênicas alteradas. / Colletorichum acutatum is the causal agent of postbloom fruit drop (PFD).This disease is a limiting factor for citrus production under specifics environmental conditions in several regions of the world. In addition to the PFD, this fungus causes anthracnose on other hosts. It is one of the pathogens that cause more damage in tropical, subtropical and temperate fruit around the world. This work aimed to study the specificity pathogenic and vegetative compatibility among isolates of C. acutatum from citrus and other hosts: guava, pepper, strawberry and peach. For studies of pathogenic specificity, cross inoculations were performed among isolates from citrus and other hosts in order to verify whether different strains are capable of causing symptoms of PFD in citrus flowers and fruit anthracnose. Furthermore, it was obtained from the same isolates, nitrate-nonutilizing mutants (nit mutants). They were phenotypically characterized and paired to verify, by means of vegetative compatibility studies, the ability of recombination between them, generating heterokaryons with altered pathogenicity. In order to verify the occurrence of possible changes in the pathogenicity of the heterokaryons formed, parental isolates and heterokaryons were inoculated in their respective original hosts. In cross-inoculation tests, there was a great variation in the isolates pathogenicity. Isolates from citrus and guava caused lesions on citrus blossoms; this demonstrates the absence of pathogenic specificity between isolates of the two hosts. However, isolates from pepper, peach and strawberry were unable to induce symptoms on citrus flowers showing the existence of specificity of these isolates. The strains from citrus and other hosts were able to cause anthracnose on guava, strawberry and peach, but only isolates of pepper caused anthracnose on pepper. Some isolates from citrus were able to recombine among themselves and with isolates from guava, peppers and strawberries. From the heterokaryons obtained, two of them had their pathogenicity characterized: Het 3 and Het 5. As a result, the heterokaryon derived from citrus and guava (Het 5) behaved similarly to one of their parental isolates. The heterokaryon derived from citrus and pepper (Het 3) was more aggressive than their parental isolates when inoculated in pepper. With these results we can conclude that there is specificity between pathogenic strains of C. acutatum from different hosts. However, isolates from different hosts can recombine with each other and generate heterokaryons with altered pathogenic characteristics.

A espécie Araucaria angustifolia, pertencente ao fragilizado Bioma Mata Atlântica, foi, durante décadas, uma das maiores fontes de madeira no Brasil. Essa espécie é de grande importância sendo fonte de alimento e matéria prima para a produção de móveis, polpa de celulose e vernizes. Devido à grande importância econômica e ambiental da araucária, estudos voltados à preservação e manejo da espécie se tornaram necessários. Este trabalho teve como finalidade isolar actinobactérias, presentes na rizosfera de araucária, antagônicos aos fungos Fusarium sp .e Armillaria sp. Estes patógenos são responsáveis por danos às raízes e sementes causando podridão e perda de mudas. Além disso, verificou-se também o efeito das actinobactérias sobre a germinação de esporos de Gigaspora rosea. Após a seleção dos melhores inibidores, identificação morfológica e seqüenciamento do gene 16S rRNA, verificou-se o efeito destes sobre o crescimento de Pinus taeda, na presença e na ausência do fungo ectomicorrízico (Suillus brevipes). Os isolados ainda foram avaliados quanto à produção de enzimas como quitinase, lipase, fosfatase, celulase, amilase e protease. Para o isolamento foram coletadas raízes de 15 árvores adultas presentes na mata nativa. Dez gramas de raízes frescas com resíduos de solo aderidos firmemente foram agitados por 30 minutos em solução salina 0,85 % padronizando como solo rizosférico aquele que soltou das raízes. Neste isolamento foram utilizadas duas metodologias: por plaqueamento e por separação física pela utilização de membrana de 0,45 micrômetros. Foram obtidos 33 possíveis actinobactérias. Os isolados foram testados quanto à capacidade antagônica pelo método de contato direto, inoculando-os a 30 mm de distância do fungo fitopatogênico Fusarium sp., em placas de petri contendo meio ISP2. Os halos de inibição foram medidos após 3, 5, 7 e 10 dias. De todos os isolados testados 6 mantiveram a inibição por 10 dias com manutenção de halos de inibição de até 4 mm contra um Fusarium sp. isolado de sementes de milho e 2 foram eficientes na inibição de Fusarium sp, patógeno de Pinus sp. A análise de inibição do fungo Armillaria sp, foi feito em meio líquido medindo o crescimento em mg/dia após 30 dias na presença de extratos de actinobactérias e também pela contagem de rizomorfas em placa de petri após 20 dias de incubação em contato direto com as actinobactérias. Verificou-se que de 28 isolados testados 24 foram capazes de inibir a produção de rizomorfas, destacando-se o isolado A43 que foi capaz de inibir ambos os fungos, Fusarium e Armillaria. Os esporos de Gigaspora rosea tiveram a taxa de germinação avaliada na presença de actinobactérias a partir da técnica de dupla camada. Todos os seis isolados testados foram capazes de estimular a germinação dos esporos desse fungo micorrizico. Nenhum dos seis isolados (A43, A43b, PNA, A64, A75 e A93) foi capaz de produzir fosfatases e lipases. Porém os isolados A93, A75, A64 e PNA produziram protease, quitinase e amilase. Em casa de vegetação, foi testado o efeito de seis isolados, na presença e não ausência de ectomicorriza (Suillus brevipes), sobre plântulas de Pinus taeda. Analisou-se o diâmetro, a altura, a massa seca da raiz e da parte aérea e também o fósforo da parte aérea. Destaca-se o isolado A43 que, quando na ausência de ectomicorriza, estimulou o desenvolvimento da planta em relação ao controletambém sem ectomicorriza, provocando aumento de 100 % para massa seca da parte aérea e da raiz. Os resultados encontrados neste trabalho poderão levar ao desenvolvimento de novas tecnologias, visando à identificação de novos metabólitos e novas técnicas de manejo, voltados ao controle de doenças de plantas, especialmente as espécies arbóreas. / The tree Araucaria angustifolia, belonging to the endangered Atlantic Forest biome, for many decades was the source of Brazilian wood. This species is also very important in providing food and feed, as well as raw material for joinery, cellulose pulp and varnish. Due to the economic and environmental importance of A. angustifolia, research projects involving the preservation and management of this species are becoming more urgent and necessary. The aim of this work was to isolate Araucaria rhizosphere actinobacteria with antagonic effects against the plant pathogens Fusarium sp. and Armillaria sp. These fungi cause root rot and seed damage, with the consequent loss of seedlings. Moreover, the effect of these actinobacteria on Gigaspora rosea spore germination was studied. After the selection of the best pathogen inhibitors, we also tested the effect of these microorganisms on Pinus taeda growth, in the presence or absence of the ectomycorrhizal fungus Suillus brevipes. The production of protease, chitinase, lipase, phosphatase, cellulase and amylase of these bacteria in culture media was also investigated. For the isolation of rhizosphere bacteria, we collected roots of 15 adult trees in a native forest. Ten grams of fresh roots with soil residues adhered to the surface were shaken in 0,85 % salt solution for 30 minutes. Two techniques were used, the dilution plate method and the coverage of the medium, utilizing a 0,45 µm membrane to separate these filamentous bacteria. About 33 actinobacteria were isolated. After isolation the actinobacteria were tested against the plant pathogenic fungi Fusarium spp., utilizing dual culture techniques and ISP2 medium. The inhibition halo was measured after 3, 5, 7 and 10 days. Six of our isolates maintained an inhibition zone measuring at least 4 mm against Fusarium sp. isolated from corn seed and 2 mm against the Fusarium, which causes root root of Pine trees. For the inhibition test of Armillaria, in liquid medium with the addition of culture extracts of actinobacteria, the growth in mg/day was measured after thirty days growth, and the number of rizomorphs produced in culture dishes after twenty days in dual culture with the actinobacteria was counted. Six bacteria proved to be antagonistic (A43, A43b, A64, PNA, A93 e A75), and only one had no effect. Possibly the elevation of the pH value played also a role in this situation. About 24 of 28 isolates inhibited the rizomorph production, especially the isolate A43 that showed a double antagonism against Fusarium and Armillaria. The dual layer test was used to investigate the reaction of the arbuscular mycorrhizal fungus Gigaspora rosea spore germination to the presence of actinobacteria. All the six actinobacteria stimulated the germination, but the germ tube did not grow straight forward as in the control. This result may indicate a negative effect against this arbuscular mycorrhizal fungus. None of the six isolates tested (A43, A43b, PNA, A64, A75 and A93) produced phosphatases and lipases, but A93, A75, A64 and PNA produced protease, amylase and chitinase. Isolates A43 and A43b did not produce any of the enzymes tested. This fact suggests that there is production of an antibiotic acting against the pathogenic fungi. Pinus taeda seedlings were grown under green-house conditions. After three months the stem diameter, shoot height, root and shoot dry weight and shoot phosphorus content were evaluated. Plants with ectomycorrhiza presented a significant growth promotion in comparison with the nonmycorrhizal ones. Among the actinobacteria in the absence of mycorrhiza only the isolate A43 produced a 100% growth enhancement in comparison with the control plant without ectomycorrhiza. The results presented in this dissertation could lead to the development of new technologies and new management techniques, with regard to the control of plant diseases, especially in tree species.

Orientador: Michel Georges Albert Vincentz / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-21T07:49:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Matiolli_CleversonCarlos_D.pdf: 11712676 bytes, checksum: dd78e2f749da48afd1fc31207bc95b06 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A manutenção do balanço energético em plantas é de crucial importância para a otimização de seu crescimento e desenvolvimento em resposta às condições sempre flutuantes do meio. A energia obtida através da fotossíntese deve ser utilizada parcimoniosamente e dividida entre crescimento, desenvolvimento, armazenamento e respostas a estresses bióticos e abióticos. Entender como a energia é canalizada para cada um destes processos e como os diversos sinais ambientais e metabólicos são integrados é de vital importância para a compreensão dos mecanismos que permitem o sucesso reprodutivo das plantas mesmo frente a condições ambientais adversas. Os fatores reguladores de transcrição desempenham um papel importante como pontos de convergência de vias de sinalização distintas e regulam a expressão dos conjuntos de genes mais adequados para cada combinação de sinais, permitindo uma resposta equilibrada diante de desafios muitas vezes concomitantes. Neste trabalho, mostramos que o fator de transcrição de Arabidopsis thaliana AtbZIP63, o qual pertence a família bZIP e é um mediador das respostas a carência energética induzidas pela quinase KIN10, é reprimido a curto prazo (2h e 4h) pela hexose glicose e o hormônio ácido abscíssico (ABA). A repressão da expressão de AtbZIP63 por 2% de glicose é independente da atividade sensora de glicose da enzima Hexokinase 1 (HXK1) e não envolve mudanças nos níveis endógenos de ABA, um mediador das respostas a glicose. No entanto, o ABA é capaz de modular a amplitude da resposta de AtbZIP63 a glicose. ABA e glicose interagem de maneira sinérgica para repressão da expressão de AtbZIP63 e esta interação envolve mecanismos de regulação pós-transcricionais. Análises em escala genômica de diferenças de perfis transcricionais entre mutantes para AtbZIP63 e seus respectivos genótipos selvagens foram desenvolvidas para identificar os genes alvos de AtbZIP63 e definir a rede de regulação da qual AtbZIP63 participa. A classificação funcional dos 280 e 348 genes desregulados nos mutantes por inserção de T-DNA atbzip63-1 e atbzip63-2, respectivamente, sugere que AtbZIP63 está envolvido na regulação de genes relacionados as respostas à carência energética, síntese e resposta a hormônios, estresses abióticos e bióticos e ciclo circadiano, provavelmente modulando o uso equilibrado de energia em resposta aos desafios ambientais. Baseado na observação de que os mutantes para AtbZIP63 apresentam diversos genes relacionados a respostas contra estresses bióticos, avaliamos a resposta dos mutantes atbzip63-1 e atbzip63-2 a patógenos usando o patossistema Arabidopsis-Pseudomonas O mutante atbzip63-1 é mais resistente a infecção com o fitopatógeno Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, mostrando seu envolvimento nas respostas a estresse biótico. O mutante atbzip63-2 apresenta atraso de crescimento quando cultivado em condições limitantes de energia, sugerindo sua participação também no crescimento/desenvolvimento de Arabidopsis nestas condições. A busca de proteínas interatoras de AtbZIP63 utilizando o sistema de duplo híbrido em levedura (Y2H) revelou genes relacionados a degradação de proteínas sugerindo que controle da estabilidade da proteína de AtbZIP63. Em conjunto, os resultados apresentados neste trabalho sugerem que AtbZIP63 é um nó de integração entre diferentes vias de sinalização para modular o crescimento e desenvolvimento de Arabidopsis de acordo com diversos sinais ambientais / Abstract: The maintenance of energy balance in plants is crucial to optimize their growth and development in response to ever changing environment. The energy obtained through photosynthesis must be used sparingly and divided between growth, development, storage, and responses to biotic and abiotic stresses. Understand how energy is channeled to each of these processes and how the environmental and metabolic signals are integrated have a vital importance to understanding the mechanisms by which plants reach the reproductive success even in adverse environmental conditions. Transcription factors play an important role as convergence points of several signaling pathways and regulate the expression of sets of genes most appropriate for each signal combination. We show that the transcription factor AtbZIP63 from Arabidopsis thaliana, which belongs to the bZIP family and mediates partially the response to energy deprivation induced by kinase KIN10, is repressed in short-term treatments (2h and 4h) with glucose and hormone absicisic acid (ABA). The repression of AtbZIP63 by 2% glucose is independent of the glucose sensing activity of the enzyme Hexokinase 1 (HXK1) and does not involve changes in endogenous ABA levels, a mediator of glucose responses. However, ABA modulates the amplitude of AtbZIP63 responses to glucose. ABA and glucose interact synergistically to repress AtbZIP63 mRNA accumulation and that this interaction involves post-transcriptional mechanisms. Genomic scale transcriptional profile comparison between AtbZIP63 mutants and their respective wild-type genotypes have been developed to identify target genes and the regulatory context which AtbZIP63 is involved. The functional classification of 280 and 348 misregulated genes in T-DNA insertion mutants atbzip63-1 and atbzip63-2, respectively, suggests that AtbZIP63 regulates genes involved in responses to energy starvation, synthesis and hormone response, biotic and abiotic stress, and circadian clock, probably by modulating the energy usage in response to environmental challenges. Based on the observation that the AtbZIP63 mutants have several misregulated genes related to responses to biotic stress, we evaluated the response of atbzip63-1 and atbzip63-2 to pathogens using the Arabidopsis-Pseudomonas pathosystem. The atbzip63-1 mutant is more resistant to infection with the pathogen Pseudomonas syringae pv tomato DC3000, showing their involvement in responses to biotic stress. The atbzip63-2 mutant has arrested growth in energy-limiting conditions, also suggesting its participation in the growth / development of Arabidopsis under these conditions. A searching for interacting proteins of AtbZIP63 using Yeast Two-Hybrid (Y2H) system revealed proteins related to protein degradation and suggests stability control of AtbZIP63 protein. Together, the results presented here suggest that AtbZIP63 is an integration node of different signaling pathways and modulates growth and development of Arabidopsis under different environmental conditions / Doutorado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

The endophytic microorganisms in at least one phase of its life cycle inhabit the inner tissues of plants without causing apparent damage. Like other tropical species, Caesalpinia echinata Lam has shown several endophytes. Therefore this study aimed to isolate and characterize the endophytic fungi of Brazil wood, as well as assess the antimicrobial activity of extracts. The harvesting of stems has been done in a fragment of Atlantic Forest, and the leaves were harvested from trees growing in the campus of the Universidade Federal de Alagoas. There was a predominance of filamentous fungi compared to bacteria, in both, stems and leaves. By morphological and molecular analyses some endophytic fungi of C. echinata were identified, namely: Botryosphaeria rhodina, Xylaria multiplex and Pestalotiopsis sp. Among all the isolates ten fungi were selected for tests of antagonism against phytopathogenic fungi. The endophytic fungi Pestalotiopsis sp. Xylaria multiplex and Botryosphaeria rhodina were the most effective antagonists of Pythium debaryanum and Phytoththora palmivora. These results obtained in in vitro experiments support the possibility of the application of chemical extracts of the endophytic Botryosphaeria rhodina and Xylaria multiplex for the biological control of plant pathogens such as Rhizoctonia solani and Colletotrichum gloeosporioides. The mycelial growth of the pathogenic fungus Phomopsis sp. was not inhibited by endophytic Botryosphaeria rhodina, Pestalotiopsis sp and Xylaria multiplex. These same endophytes were also the most effective inhibiting the mycelial growth of phytopathogen Pestalotiopsis sp. Botryosphaeria rhodina, Xylaria multiplex, Pestalotiopsis sp. and C.e.A6.F4.c.b. have shown a higher amount of biomass when growing in BD medium incubated in the dark and without agitation. Extracts of the endophytic fungi of Caesalpinia echinata obtained from different solvents, have not shown antibacterial effect on Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, in the concentrations used. / Os microrganismos endofíticos, em pelo menos uma fase do seu ciclo de vida, habitam o interior de tecidos vegetais, sem causar-lhes danos aparentes. Assim como outras espécies tropicais, Caesalpinia echinata Lam. também abriga diversos endofíticos. Sendo assim o presente trabalho teve como objetivos isolar e caracterizar os fungos endofíticos do pau-brasil, assim como, avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos obtidos. As coletas de caules foram realizadas em um fragmento de Mata Atlântica, e as folhas foram coletadas de árvores plantadas, no Campus da Universidade Federal de Alagoas. Houve um predomínio de fungos filamentosos em relação a bactérias, tanto nos caules quanto nas folhas. Através de análises morfológica e molecular alguns fungos endofíticos de C. echinata foram identificados, sendo eles: Botryosphaeria rhodina, Xylaria multiplex e Pestalotiopsis sp. Dentre todos os isolados, dez deles foram selecionados para testes de antagonismo contra fungos fitopatógenos. Os fungos endofíticos Pestalotiopsis sp., Xylaria multiplex e Botryosphaeria rhodina foram os mais eficazes antagonistas de Pythium debaryanum e Phytoththora palmivora. Os resultados obtidos no antagonismo in vitro evidenciaram a possibilidade da aplicação dos seus respectivos extratos químicos no controle biológico dos fitopatógenos Rhizoctonia solani e Colletotrichum gloeosporioides. O crescimento micelial do fitopatógeno Phomopsis sp. só foi inibido pelos endofíticos Botryosphaeria rhodina, Pestalotiopsis sp. e Xylaria multiplex. Estes mesmos endofíticos também foram os mais eficazes na inibição do crescimento micelial do fitopatógeno Pestalotiopsis sp. Botryosphaeria rhodina, Xylaria multiplex, Pestalotiopsis sp. e C.e.A6.F4.c.b. apresentaram uma quantidade maior de biomassa ao crescerem no meio BD, incubados no escuro e sem agitação. Os extratos dos fungos endofíticos de Caesalpinia echianata, obtidos a partir de diferentes solventes, não exerceram efeito antibacteriano sobre Enterococcus faecalis, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus, nas concentrações utilizadas.

Thesis (MScAgric)--University of Stellenbosch, 2006. / ENGLISH ABSTRACT: Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata, Phomopsis, Phaeoacremonium, and Botryosphaeria spp. are important trunk disease pathogens that cause premature decline and dieback of grapevine. Previous research has focused primarily on wine grapes and the incidence and symptomatology of these pathogens on table grapes were largely unknown. A survey was therefore conducted to determine the status and distribution of these pathogens and associated symptoms in climatically diverse table grape growing regions. Fifteen farms were identified in the winter rainfall (De Doorns, Paarl and Trawal) and summer rainfall (Upington and Groblersdal) areas. Samples were taken in July and August 2004 from Dan-ben-Hannah vineyards that were 8 years and older. Distal ends of arms were removed from 20 randomly selected plants in each vineyard. These sections were dissected and isolations were made from each of the various symptom types observed: brown or black vascular streaking, brown internal necrosis, wedge-shaped necrosis, watery necrosis, esca-like brown and yellow soft wood rot, as well as asymptomatic wood. Fungal isolates were identified using molecular and morphological techniques. Pa. chlamydospora was most frequently isolated (46.0%), followed by Phaeoacremonium aleophilum (10.0%), Phomopsis viticola (3.0%), Botryosphaeria obtusa (3.0%), B. rhodina (2.2%), B. parva (2.0%), Fusicoccum vitifusiforme (0.6%), B. australis, B. dothidea and an undescribed Diplodia sp. (0.2% each), while E. lata was not found. Most of these pathogens were isolated from a variety of symptom types, indicating that disease diagnosis can not be based on symptomatology alone. Pa. chlamydospora was isolated from all areas sampled, although most frequently from the winter rainfall region. Pm. aleophilum was found predominantly in Paarl, while P. viticola only occurred in this area. Although B. obtusa was not isolated from samples taken in De Doorns and Groblersdal, it was the most commonly isolated Botryosphaeria sp., being isolated from Upington, Paarl and Trawal. B. rhodina occurred only in Groblersdal and B. parva in Paarl, Trawal and Groblersdal, while B. australis was isolated from Paarl only. The rest of the isolates (33%) consisted of sterile cultures, Exochalara, Cephalosporium, Wangiella, Scytalidium, Penicillium spp. and two unidentified basidiomycetes, which were isolated from five samples with yellow esca-like symptoms from the Paarl area. These findings clearly illustrate that grapevine trunk diseases are caused by a complex of fungal pathogens, which has serious implications for disease diagnosis and management. Protection of wounds against infection by any of these trunk disease pathogens is the most efficient and cost-effective means to prevent grapevine trunk diseases. However, previous research on the effectiveness of chemical pruning wound protectants has mostly focused on the control of Eutypa dieback only. Fungicide sensitivity studies have been conducted for Pa. chlamydospora, P. viticola and Eutypa lata, but no such studies have been conducted for the pathogenic Botryosphaeria species from grapevine in South Africa. Ten fungicides were therefore tested in vitro for their efficacy on mycelial inhibition of the four most common and/or pathogenic Botryosphaeria species in South Africa, B. australis, B. obtusa, B. parva and B. rhodina. Iprodione, pyrimethanil, copper ammonium acetate, kresoxim-methyl and boscalid were ineffective in inhibiting the mycelial growth at the highest concentration tested (5 μg/ml; 20 μg/ml for copper ammonium acetate). Benomyl, tebuconazole, prochloraz manganese chloride and flusilazole were the most effective fungicides with EC50 values for the different species ranging from 0.36-0.55, 0.07-0.17, 0.07-1.15 and 0.04-0.36 μg/ml, respectively. These fungicides, except prochloraz manganese chloride, are registered on grapes in South Africa and were also reported to be effective against Pa. chlamydospora, P. viticola and E. lata. Results from bioassays on 1-year-old Chenin Blanc grapevine shoots indicated that benomyl, tebuconazole and prochloraz manganese chloride were most effective in limiting lesion length in pruning wounds that were inoculated with the Botryosphaeria spp after fungicide treatment. The bioassay findings were, however, inconclusive due to low and varied re-isolation data of the inoculated lesions. Benomyl, tebuconazole, prochloraz manganese chloride and flusilazole can nonetheless be identified as fungicides to be evaluated as pruning wound protectants in additional bioassays and vineyard trials against Botryosphaeria spp. as well as the other grapevine trunk disease pathogens. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Phaeomoniella chlamydospora, Eutypa lata, Phomopsis, Phaeoacremonium, en Botryosphaeria spesies is die mees belangrikste stamsiekte patogene wat agteruitgang en vroeë terugsterwing van wingerd veroorsaak. Voorafgaande navorsing het hoofsaaklik gefokus op wyndruiwe en die voorkoms en simptomatologie van hierdie patogene op tafeldruiwe is dus grootliks onbekend. ‘n Opname is gevolglik gedoen in verskillende klimaaatsareas waar tafeldruiwe verbou word om die voorkoms en verspreiding, asook die simptome geassosieer met hierdie patogene, te bepaal. Vyftien plase is geïdentifiseer in die winter- (De Doorns, Paarl en Trawal) en somer-reënval (Upington en Groblersdal) streke. Wingerde (8 jaar en ouer) met die kultivar Dan-ben-Hannah is gekies vir opname en monsters is gedurende Julie en Augustus 2004 geneem. Die distale deel van ‘n arm is verwyder vanaf 20 lukraak gekose plante in elke wingerd. Hierdie dele is ontleed en isolasies is gemaak vanuit elke simptoomtipe wat beskryf is, naamlik bruin en swart vaskulêre verkleuring, bruin interne nekrose, wig-vormige nekrose, waterige nekrose, esca-geassosieerde bruin en geel sagte houtverrotting en asimptomatiese hout. Identifikasie van die swamagtige isolate is gedoen op grond van morfologiese eienskappe en molekulêre tegnieke. Pa. chlamydospora is die meeste geïsoleer (46.0%), gevolg deur Phaeoacremonium aleophilum (10.0%), Phomopsis viticola (3.0%), Botryosphaeria obtusa (3.0%), B. rhodina (2.2%), B. parva (2.0%), Fusicoccum vitifusiforme (0.6%), B. australis, B. dothidea en ‘n onbeskryfde Diplodia sp. (0.2% elk), terwyl E. lata nie geïsoleer is nie. Hierdie patogene is elk geïsoleer vanuit ‘n verskeidenheid simptoomtipes, wat daarop dui dat siektediagnose nie alleenlik op simptomatologie gebaseer kan word nie. Pa. chlamydospora is geïsoleer vanuit al die gebiede, alhoewel die patogeen opmerklik meer voorgekom het in die winter-reënval area. Pm. aleophilum het hoofsaaklik voorgekom in Paarl, terwyl P. viticola slegs in hierdie area voorgekom het. Alhoewel B. obtusa nie voorgekom het in die De Doorns en Groblersdal areas nie, was dit die mees algemeen geïsoleerde Botryosphaeria sp. en het in Upington, Paarl en Trawal voorgekom. B. rhodina het slegs in Groblersdal voorgekom, B. parva in Paarl, Groblersdal en Trawal en B. australis het slegs in Paarl voorgekom. Die res van die isolate (33%) het bestaan uit steriele kulture, Exochalara, Cephalosporium, Wangiella, Scytalidium, en Penicillium spesies asook twee onbekende basidiomycete isolate, geïsoleer vanuit vyf monsters met geel eska-geassosieerde simptome vanuit die Paarl area. Hierdie resultate illustreer dus die feit dat wingerdstamsiektes deur ‘n kompleks van swampatogene veroorsaak word, wat belangrike implikasies het vir die bestuur en diagnose van hierdie siektes. Wondbeskerming teen infeksie van enige van hierdie stamsiekte patogene is die mees doeltreffende en koste-effektiewe manier om wingerdstamsiektes te voorkom. Vorige navorsing aangaande die effektiwiteit van chemiese wondbeskermingsmiddels het egter slegs gefokus op die beheer van Eutypa terugsterwing. In vitro swamdoder sensitiwiteitstoetse is gedoen vir Pa. chlamydospora, P. viticola en Eutypa lata, maar geen studies is al gedoen ten opsigte van die patogeniese Botryosphaeria spesies op wingerd in Suid-Afrika nie. Tien swamdoders is dus getoets vir inhibisie van in vitro miseliumgroei van die vier mees algemene en/of patogeniese Botryosphaeria spesies wat in Suid-Afrika voorkom, naamlik B. australis, B. obtusa, B. parva en B. rhodina. Iprodione, pyrimethanil, koper ammonium asetaat, kresoxim-metiel en boscalid was oneffektief by die hoogste konsentrasies getoets (5 μg/ml; 20 μg/ml vir koper ammonium asetaat). Benomyl, tebuconasool, prochloraz mangaan chloried en flusilasool was die mees effektiewe swamdoders met EC50 waardes tussen 0.36-0.55, 0.07-0.17, 0.07-1.15 en 0.04-0.36 μg/ml, onderskeidelik vir die verskillende spesies. Hierdie fungisiedes, behalwe prochloraz mangaan chloried, is geregistreer op druiwe in Suid-Afrika en is ook effektief gevind teenoor Pa. chlamydospora, P. viticola en E. lata. Resultate van biotoetse op 1-jaar-oue Chenin Blanc wingerd lote het getoon dat benomyl, tebuconasool en prochloraz mangaan chloried die effektiefste was om die lengte van letsels in snoeiwonde, geinokuleer met Botryosphaeria spesies na die aanwending van swamdoder behandelings, te verminder. Die bevindinge was egter onbeslis as gevolg van die lae en variërende her-isolerings data. Benomyl, tebuconasool, prochloraz mangaan chloried en flusilasool kan egter geïdentifiseer word as swamdoders wat verder geevalueer kan word as snoeiwond beskermingsmiddels teen Botryosphaeria spesies asook ander wingerd stamsiekte patogene in verdere biotoetse en wingerdproewe.

O fungo basidiomiceto Crinipellis perniciosa é o agente causal da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), podendo causar sérios perdas na produção. Este fungo é capaz de colonizar, além do cacau, várias outras plantas hospedeiras, onde pode se adaptar às novas condições, contribuindo, dessa forma, para o aumento da variabilidade genética desse microrganismo. Assim sendo, o objetivo desse trabalho foi isolar e identificar C. perniciosa de tecidos sadios de cacaueiro e comparar a sua variabilidade genética e fisiológica com isolados patogênicos por meio de análises moleculares e fisiológicas. Após a desinfecção e retirada da casca dos ramos, colônias morfologicamente similares a C. perniciosa foram obtidas de tecidos sadios de cacaueiro, os quais foram considerados como endófitos. A identificação preliminar desses isolados foi baseada nas observações morfológicas, tais como coloração da colônia e presença de grampos de conexão. Posteriormente, os isolados de C. perniciosa foram caracterizados geneticamente por RAPD, e sequenciamento de regiões do rDNA (18S+5.8S+28S), resistência a fungicidas, produção de exoenzimas e patogenicidade ao cacaueiro. A análise por marcadores RAPD separou os 37 isolados em 8 grupos (G1 a G8), sendo o grupo G1 dividido em 2 subgrupos (G1-1 e G1-2). Por esta análise foi possível observar que linhagens com 100 % de similaridade foram isoladas de locais diferentes, enquanto que isolados obtidos de uma mesma planta podem ser geneticamente diferentes. A análise da seqüência do rDNA dos isolados de C. perniciosa mostrou a formação de 6 grupos distintos (R1 a R6). Isolados obtidos de uma mesma planta não se agruparam, reforçando a hipótese de que isolados geneticamente diferentes podem ocupar a mesma planta hospedeira. Quanto resistência a fungicidas (tebuconazole, mancozeb, benomil e óxido cuproso), foi observado que tebuconazole foi o mais eficiente na inibição do crescimento miceliar, enquanto benomil apresentar menor taxa de inibição. Isolados endofíticos e patogênicos apresentaram comportamento similar em relação aos fungicidas. Resultado semelhante foi observado quanto a produção de exoenzimas (amilase, lipase, pectinase, exo e endoglicanase). Foi observada a produção de todas as enzimas avaliadas, sendo possível detectar variações entre os isolados. Entretanto, esta variação não foi correlacionada ao hábito endofítico ou patogênico. A patogenicidade de 8 isolados de C. perniciosa foi avaliada em mudas de cacau Catongo. A porcentagem de plantas infectadas com sintomas variou de 55% a 100%. Isolados endofíticos apresentaram baixa virulência sobre o cacaueiro, tendo o isolado endofítico 31 induziu sintomas em 60% das plantas inoculadas, resultado este provavelmente devido à alta pressão de inóculo. Este trabalho mostra pela primeira vez C. perniciosa como endófito em tecidos não meristemático do cacaueiro. / The basidiomycete fungus Crinipellis perniciosa (Stahel) Singer is the causal agent of Witches' Broom Disease of Cacao (Theobroma cacao L.) which is the main factor limiting cocoa production in the Americas. Pod losses of up to 90% are experienced in affected areas as evidenced by the 50% drop in production in Bahia province, Brazil following the arrival of the C. perniciosa in the area in 1989. The disease has proven particularly difficult to control and many farmers in affected areas have given up cacao cultivation. Any useful control strategy for Witches' Broom disease must be effective against in range strains of the pathogen. It is already known that pathogenic variation exists among isolates of Crinipellis perniciosa obtained from different areas and host plants. However, any study was developed about the variability between endophytic and pathogenic population. In order to evaluate the genetic variability of 35 isolates of endophytic and pathogenic populations of Crinipellis perniciosa, the RAPD technique, ITS sequencing and fungicide susceptibility were performed. Genetic variability between 35 isolates of C. perniciosa was analysed by the random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique, which indicated that isolates from other host plants were more diverse than isolates obtained from cacao plants. Among cacao isolates was observed at least two groups, one formed mainly by endophytic isolates and other by pathogenic ones. Analysis by ITS sequence grouped isolates independently of endophytic or pathogenic status. Fungicide susceptibility showed that cupric oxide inhibits statistically more endophytic isolates than pathogenic ones, showing that could have physiological differences between these populations. The present study highlighted the possible genetic and physiological differences between endophytic and pathogenic population of C. perniciosa.

Devido à percepção dos consumidores sobre o impacto da utilização de pesticidas sobre o ambiente e saúde humana, além da aquisição de resistência por parte dos fitopatógenos, a sociedade tem exercido pressões que levaram ao estabelecimento de políticas governamentais que restringem a utilização de fungicidas levando agricultores e pesquisadores a considerar a aplicação de técnicas de controle biológico de fitopatógenos fúngicos. Guignardia citricarpa é o agente causal da pinta preta dos citros, que é de grande importância econômica, pois interfere na produção e causa depreciação estética dos frutos, acarretando em prejuízos principalmente na comercialização de frutos in natura para o mercado externo. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi a avaliação in vitro do potencial de linhagens de Saccharomyces cerevisiae, utilizadas em processos fermentativos, como agentes de biocontrole contra G. citricarpa. Através de ensaio em placa, foi evidenciado que entre as linhagens de S. cerevisiae testadas (BG-1, CR-1, CAT-1, KD-1, K-1 e PE-2), a CR-1 demonstrou a maior atividade antagônica contra o fitopatógeno, causando 73% de inibição do crescimento micelial. Também foi demonstrado que as linhagens são capazes de produzir voláteis de ação fungistática inibindo em até 83% o desenvolvimento do patógeno. O filtrado de cultura autoclavado e não autoclavado, bem como as células inativadas termicamente, obtidas a partir do crescimento da linhagem CR-1 por 24 h em meio YEPD, não causaram redução do crescimento vegetativo do fungo. A produção de enzimas hidrolíticas extracelulares (quitinases, β-1,3-glucanases e proteases) pela levedura não foi detectada em meio YEPD contendo glicose ou preparação de parede celular de G. citricarpa, nos tempos de cultivo avaliados. Baseado nas informações obtidas, foi possível constatar que as linhagens de S. cerevisiae, em especial a linhagem CR-1, são potenciais antagonistas para o controle de G. citricarpa. O possível mecanismo utilizado para inibição pela levedura é a produção de voláteis, no entanto, outros mecanismos não podem ser descartados. Desta forma, o presente trabalho mostra o potencial de S. cerevisiae no controle de G. citricarpa em frutos de laranja na pós-colheita. / Due to the consumers perception about the impact caused by pesticides utilization over the environment and human health, besides the acquisition of resistance for part of the phytopathogens, the society has exercised pressures that had led to the establishment of governmental politics that restrict the use of fungicides leading agriculturists and researchers to consider the application of techniques of biological control of plant pathogenic fungi. Guignardia citricarpa is the causal agent of citrus black spot that has a great economic importance, therefore interfering in production and causing aesthetic depreciation of the fruits that can interfere with commercialization of fresh-fruit in the external market. In this context, the aim of this work was to evaluate in vitro the potential of Saccharomyces cerevisiae strains, used in fermentative process, as biocontrol agents against G. citricarpa. Through plate assay it was evidenced that among the tested strains of S. cerevisiae (BG-1, CR-1, CAT-1, KD-1, K-1 and PE-2), the strain CR-1 was the one that demonstrated the greatest antagonic activity against the phytopathogen, causing 73% of micelial growth inhibition. It was also demonstrated that the strains were able to produce volatile compounds with fungistatic action inhibiting up to 83% the development of the pathogen. The autoclaved and not autoclaved culture filtrate, as well as the termical inactivated cell obtained from the growth of strain CR-1 in YEPD medium for 24 h, did not cause reduction in the fungal vegetative growth. The production of extracellular hydrolytic enzymes (chitinases, β-1,3-glucanases and proteases) by the yeast was not detected in YEPD medium with glucose or cell wall preparation of G. citricarpa at the evaluated times. Based upon the obtained information it was possible to evidence that the strains of S. cerevisiae, specially the strain CR-1, are potentials antagonists for the control of G. citricarpa. The possible mechanism used for inhibition by yeast is the volatile production, however other mechanisms cannot be discarded. Thus, the present work shows the potential of S. cerevisiae to control G. citricarpa in orange fruits in postharvest.

O mal-das-folhas, principal doença da seringueira, ainda restrita ao continente americano, tem frustrado todas as tentativas de cultivo da seringueira em regiões com distribuição de chuvas durante todo o ano, tais como a Amazônia tropical úmida. A utilização da técnica de enxertia de copa com clones resistentes é uma solução para contornar este problema, porém, o efeito depressivo das copas enxertadas, ocasionado pela perda da estabilidade do látex tem sido um dos principais obstáculos para a adoção dessa técnica. O papel da cianogênese na perda da estabilidade do látex foi sugerido pelos resultados do estudo da incompatibilidade de enxertia de clones de copa sobre o clone de painel IPA 1 em plantas jovens mantidas em jardim clonal. Verificou-se que a incompatibilidade ocorria devido ao transporte de glicosídeos cianogênicos (linamarina e lotaustralina) sintetizados nos folíolos jovens dos clones de copa enxertados, para o caule do IPA 1, cujos sintomas iniciavam com a perda da estabilidade do látex seguido de sua coagulação nos laticíferos. Tais sintomas evoluíram para necrose do floema, além de acúmulo de polifenóis e taninos, aumento do número de esclereídeo, inclusão de tilosóides nos vasos laticíferos e depósito intercelular de lignina amorfa de coloração marrom acinzentada, muito semelhante aos descritos para um dos tipos de secamento do painel, denominado Brown Bast, cuja causa ainda não está esclarecida. O passo inicial da biossíntese dos dois glicosídeos cianogênicos linamarina e lotaustralina é catalisado por citocromos multifuncionais, enzimas que se encontram ligadas à membrana e são denominadas, genericamente, de citocromos P-450. O aumento da atividade dessa enzima foi observado in vivo sob doses de nitrogênio (N), neste caso, acompanhado pelo aumento do conteúdo de glicosídeo cianogênico, e in vitro na presença de manganês (Mn). Essas evidências levaram à elaboração das seguintes hipóteses: i) clones de copa capazes de sintetizar grandes quantidades de glicosídeos cianogênicos (HCNp) podem translocá-los para o painel, elevando a concentração destes na casca do tronco, ii) altas concentrações de HCNp na casca do clone de painel, provenientes de copas enxertadas, reduzem a estabilidade do látex, produzindo o efeito depressivo sobre a produção, podendo evoluir para o secamento do painel de sangria do tipo Brown Bast. iii) a quantidade de glicosídeos cianogênicos produzidos nas folhas é influenciada pelo teor de N e Mn no tecido vegetal. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar critérios de seleção de clones de copa para a obtenção de combinações copa/painel mais produtivas, com base na avaliação das relações entre a cianogênese, estado nutricional, estabilidade do látex e incidência de secamento do painel de sangria com os seguintes estudos: a) levantamento do potencial cianogênico (HCNp) entre os clones de copa, b) evidências do transporte de glicosídeos cianogênicos da copa para o tronco, como fator de variação do HCNp da casca do painel de sangria, c) relação entre a cianogênese e a estabilidade do látex e o secamento do painel de sangria, d) efeito da adubação com N e Mn na formação de glicosídeos cianogênicos. Verificou-se que o potencial cianogênico (HCNp) apresenta ampla faixa de variação dentro das espécies estudadas como clones de copa, com os valores mais baixos obtidos com os clones de Hevea nítida e os mais altos com os de H. rigidifolia . No entanto, a ocorrência de indivíduos de H. nítida com valores médios de HCNp e H. rigidifolia com valores baixos indicam que essa característica ainda não se encontra bem definida dentro das espécies de Hevea. As copas enxertadas exercem influência sobre o potencial cianogênico (HCNp) da casca do tronco dos clones de painel. No entanto, a ausência de correspondência entre os HCNps das folhas dos clones de copa e o da casca do tronco invalida a utilização do HCNp da copa como critério de seleção destas. Futuras pesquisas são necessárias para identificar o mecanismo do efeito das copas enxertadas sobre o HCNp do painel. A atividade da enzima -glicosidase não foi influenciada pelas combinações copa/painel, estando a capacidade cianogênica (HCNc) diretamente relacionada ao HCNp das cascas das plantas. Os teores foliares de N, Mn e clorofila apresentam correlação com o HCNp das folhas novas e diagnóstico, podendo os mesmos serem utilizados em futuros processos de seleção. Em baixas concentrações de N (0,8% de uréia), o Mn influência a absorção de nitrogênio, potássio, fósforo, cálcio, enxofre, ferro e manganês pelas plantas de seringueira, na fase de viveiro. / The South American leaf blight (SALB), main disease of the rubber tree, which is still restricted to the American continent, has frustrated all the attempts of cultivation of the rubber tree in regions with rainfall distributed throughout the year, such as the humid tropical Amazon. The use of crown grafting with clones resistant to the disease is one possible solution to obviate this problem. However, the depressant effect of the grafted crowns caused by the loss of latex stability is one of the main obstacles to this technique. The role of cyanogenesis in the loss of latex stability was suggested in view of the findings of the study of incompatibility of crown clone grafting and the IPA 1 panel clone in young plants kept in the clonal nursery. This incompatibility occurred due to the transport of cyanogenic glycosides (linamarin and lotaustralin) synthesized in the young follicles of the grafted crown clones to the stem of IPA 1, which first symptoms were the loss of latex stability followed by coagulation within the lactiferous ducts. Such symptoms evolved to phloem necrosis, including the accumulation of polyphenols and tannins, increased number of sclereids, inclusion of tyloses in the lactiferous ducts and intracellular deposit of amorphous lignin of a greyish- brown color very similar to the one described in one of the types of panel dryness called Brown Bast, which cause has not yet been clarified. The first step of biosynthesis of the two cyanogenic glycosides linamarin and lotaustralin is catalyzed by multifunctional cytochromes, enzymes connected with the membrane generically called P-450 cytochromes. The increased activity of the referred enzyme was observed in vivo when nitrogen (N) rates were applied, in this case, followed by increased cyanogenic glycoside content, and in vitro in the presence of manganese (Mn). Such evidence led to the creation of the following hypotheses: i) crown clones capable of synthesizing large amounts of cyanogenic glycosides (HCNp) may transport them to the panel, thus increasing their concentration in the bark of the tree trunk, ii) high concentrations of HCNp in the bark of the panel clone, from the grafted crowns, reduce latex stability, producing a depressant effect on the production that may evolve to panel dryness similar to the Brown Bast disease. iii) the amount of cyanogenic glycosides produced in the leaves is influenced by the N and Mn concentrations in the vegetable tissue. In this context, the present study aimed to determining criteria for the selection of tree crown clones to obtain more productive crown/panel arrangements, based on the assessment of the relationships between cyanogenesis, nutritional status, latex stability and incidence of dryness in the panel, through the following studies: a) assessment of cyanogenic potential (HCNp) of the crown clones, b) evidence of transport of cyanogenic glycosides from the crown to the tree trunk as a determining factor in the variation of HCNp level in the panel bark c) relationship between cyanogenesis and latex stability and the dryness of the panel, d) N and Mn fertilization effects on cyanogenic glycosides formation. The cyanogenic potential (HCNp) was found to have a broad range of variation among the studied species as crown clones, with the lowest values obtained with Hevea nítida clones and the highest values obtained with H. rigidifolia. However, the occurrence of H. nítida individuals with average HCNp values and H. rigidifolia individuals with low values indicate that this characteristic is not well defined within Hevea species. The grafted crowns influence the cyanogenic potential (HCNp) of the bark of the tree trunk of the panel clones. Yet, the lack of correspondence between the HCNps of the trees of the crown clones and that of the bark of the trunk invalidate the use of the crown HCNp as a selection criterion. Further research is necessary to identify the mechanism of the effect of grafted crowns on the panel HCNp. The activity of the -glicosidase enzyme was not influenced by the crown/panel arrangements, with the cyanogenic capacity (HCNc) found to be directly related to the HCNp of the barks of the trees. In rubber tree, regardless the age and species of Hevea, the foliar chlorophyll, N and Mn concentrations have a positive relationship to the HCNp of the young leaves and diagnosis, so they can be used in future selection processes. Under low N contents (0.8% of urea), the Mn influences the nitrogen, potassium, phosphorus, calcium, sulphur, iron and manganese uptake by rubber tree plants at nursery stage.

O Brasil é líder absoluto no comércio internacional de suco de laranja concentrado congelado participando com 82% do volume comercializado no mundo. Guignardia citricarpa é um fungo Ascomiceto agente causal da Mancha Preta dos Citros (MPC), uma doença importante no contexto da Citricultura, causando lesões negras em frutos tornando-os impróprios para a exportação, já que não são aceitos na União Européia pois o patógeno é classificado como quarentenário. O presente trabalho teve como objetivo principal estabeler a metodologia de transformação genética de G. citricarpa para futuramente auxiliar no entendimento dos mecanismos de patogenicidade desta espécie, visando diminuir perdas na citricultura brasileira devido à MPC. Além disso, foi realizada uma análise do gene da enzima endopoligalacturonase, a qual está associada à capacidade de patógenos em colonizar plantas. Para elucidar esse fenômeno, foi realizada a busca de genes relacionados à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos previamente descritos e confirmados participarem no processo de doenças em diversas plantas. Considerando que esses genes possuem uma região conservada para esse fim, após o alinhamento dessas sequências foram construídos primers e o gene de endopoligalacturonase foi identificado no gênero Guignardia sp. Outra espécie pertencente a esse gênero é G. mangiferae, conhecida como endófito de citros, ou seja, coloniza os tecidos internos da planta hospedeira sem causar dano. Em análises enzimáticas foi observado que a quantidade de endopoligalacturonase produzida pela espécie patogênica é superior à da espécie endofítica, mostrando que essa enzima pode participar do processo de patogenicidade de G. citricarpa. Estudos para comprovar a participação de genes nos mecanismos de patogenicidade em diversas espécies utilizando reconhecimento de genes e genômica funcional, expressão e knockout de genes estão sendo realizados, permitindo uma visão geral da organização genômica do sistema patogênico. Pensando nisso, esse trabalho descreve pela primeira vez a metodologia de transformação genética de G. citricarpa via micélio e a obtenção de transformantes expressando a proteína verde fluorescente (GFP). Micélios do fungo foram transformados pelo sistema via Agrobacterium tumefaciens com o plasmídeo pFAT-gfp, contendo os genes de resistência à higromicina B (hgr) e da GFP. A otimização do protocolo de agrotransformação foi realizada a partir do teste de diferentes condições como: tipo de membrana, concentração de agente indutor e tempo de cocultivo. A melhor condição incluiu a utilização de membrana de éster de celulose; 200 PM de AS e 96 horas de co-cultivo. Os transformantes apresentaram alta estabilidade mitótica (82%) e tiveram a inserção do gene hgr confirmada por PCR e do gfp observada em microscopia óptica de epifluorescência. Além disso, foi acompanhado o desenvolvimento do fungo inoculado em frutos, mostrando a interação planta-patógeno. O estabelecimento do sistema de transformação por Agrobacterium para G. citricarpa possibilita o uso dessa ferramenta para estudos de mutagênese insercional e interrupção gênica visando a identificação de genes importantes, como os envolvidos com os mecanismos de patogenicidade utilizados por esse fungo. / Brazil is the world leader in the international trade of frozen orange juice concentrate, taking part with around 82% of the traded volume. Guignardia citricarpa (anamorph Phyllosticta citricarpa) is a fungal pathogen of citrus plants, being described as the causal agent of citrus black spot (CBS), one of the most important fungal diseases of citrus worldwide. Its symptoms are black lesions on fruit, making them unsuitable for the international fresh market, since they are included in the quarantine list of the European Plant Protection Organization (EPPO). Moreover, when the disease is severe it may cause extensive premature fruit drop that reduces yields of fruit for processing. Taking this into consideration, the current work aimed to improve the understanding on the pathogenic mechanisms of this fungus. Firstly, in an attempt to elucidate this phenomenon, it was performed a search for pathogenicity genes previously reported to some pathogenic fungi and confirmed to participate in the process of infection in many plants , especially endopolygalacturonase. Primers were designed using the conserved regions of the genes and allowed the identification of the Guignardia spp. endopolygalacturonase gene for the first time. This enzyme has been described as playing important role in the process of fungal diseases in plants. In the present work, enzymatic analysis showed that the pathogen G. citricarpa produced significantly greater amounts of endopolygalacturonase when compared to G. mangiferae, a closely related fungus described as a citrus endophyte. This result suggests that this enzyme may participate in the process of pathogenicity, characteristic of the pathogenic species. Genetic transformation methods have been used to prove the involvement of genes in pathogenic mechanisms, however, a suitable methodology for G. citricarpa has not been described yet. In this way, this study describes for the first time a methodology for genetic transformation of G. citricarpa via mycelia and the successful generation of transformants expressing the green fluorescent protein (GFP) and resistant to the hygromycin B antibiotic. Mycelia of the fungus were genetically transformed via Agrobacterium tumefaciens hosting the plasmid pFAT-gfp, which carries the genes for resistance to hygromycin B (hph) and for GFP (gfp). The protocol was optimized through different test conditions (type of membrane, concentration of the inducing agent acetosyringone and duration of the co-cultivation period). The higher transformation efficiencies were observed using cellulose ester membrane, 200 PM of acetosyringone and 96 hours of cocultivation. The transformants showed high mitotic stability (82%) and the insertion of the T-DNA was confirmed by PCR and GFP expression through epifluorescence microscopy observation. Moreover, it was observed the development of the fungus in inoculated oranges, showing the plant-pathogen interaction observed by epifluorescense microscopy. The establishment of the Agrobacterium-mediated transformation system for G. citricarpa represents an important step on the search for unveiling important genes of this fungus, such as those involved in the pathogenic mechanisms.

A podridão floral dos citros (PFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum responsável por causar grandes danos à produção de citros no Brasil. A doença surge apenas em botões florais com 8mm de comprimento ou maiores, levando a formação de lesões alaranjadas nas pétalas, lesões necróticas no estigma, promove a queda prematura dos frutos e a retenção do cálice e pedúnculo, sendo este último sintoma denominado estrelinha. Este trabalho tem por objetivo: observar o modo de penetração do fungo no hospedeiro Citrus sinensis Valência e os estágios posteriores da colonização, verificar se há fatores estruturais e químicos pré-formados que expliquem o porquê do fungo não conseguir infectar botões florais com menos de 8mm, caracterizar anatomicamente o sintoma estrelinha e estigmas lesionados, investigar ultraestruturalmente pétalas inoculadas, analisar se há o estabelecimento de uma infecção quiescente nos tecidos foliares, analisar grãos de pólen após a inoculação in vivo e in vitro com o fungo. Botões florais sadios, pétalas e estigmas com e sem lesões, foram submetidos às técnicas convencionais de microscopia de luz e eletrônica. Folhas e grãos de pólen foram inoculados e analisados. Foi desenvolvida uma nova técnica de coloração para tecidos vegetais infectados por fungos. A resistência dos botões florais menores que 8mm pode estar associada às barreiras químicas e estruturais pré-formadas. O ápice, nesses botões, apresenta papilas entremeadas, cristais de oxalato de cálcio no mesofilo e câmara subestomática e cavidades de óleo localizadas muito próximas umas das outras. Botões com 8mm e 12mm possuem, no ápice, papilas com arranjo frouxo, ausência de cristais e maior distanciamento entre as cavidades de óleo. No ápice da pétala, verificou-se que as células papilosas são osmóforos. No sintoma estrelinha, nota-se sob a região de abscisão do ovário a instalação de um meristema de cicatrização. A lignificação das paredes das células da medula do receptáculo e do pedúnculo floral está associada à retenção destas estruturas na planta. Nas pétalas infectadas, o C. acutatum pode penetrar intra, intercelularmente e via estômato. O fungo pode crescer de modo subcuticular e intramural e coloniza todos os tecidos da pétala. A nova técnica de coloração se mostrou muito útil nas análises histopatológicas. O fungo associa-se aos tecidos vasculares. Acérvulos ocorrem em ambas as faces das pétalas. A cutícula nos estágios mais avançados da lesão apresenta-se alterada, ou seja, ocorre a perda da ornamentação estriada e maior deposição de material lipofílico. A síntese de materiais lipofílicos envolve o retículo endoplasmático liso e rugoso e plastídios. Vesículas provenientes de dictiossomos e de corpos multivesiculares são observadas ao longo da parede celular e estão associadas ao depósito de material lipofílico na cutícula. No estigma lesionado há a formação de uma camada de proteção. O fungo apresenta quimiotropismo e cresce em direção aos grãos de pólen infectando-os 24 horas após a inoculação. Sugere-se que C. acutatum pode utilizar grãos de pólen para a sua dispersão. Após 48 horas da inoculação as folhas apresentam conídios germinados com apressórios. / The postbloom fruit drop (PFD) is a disease caused by Colletotrichum acutatum responsible for causing great damage to citrus crops in Brazil. The disease appears only in flower buds 8 mm in length or greater, leading to orange lesions in petals, necrotic lesions on the stigma, promoting the young fruit drop and the retention of the calyx and peduncle, which is called buttons. In this context, this study aimed to: observe the fungus penetration mode into the host Citrus sinensis \'Valência\' and the later stages of colonization; study the presence of preformed structural and chemical factors to explain why the fungus cannot infect floral buds with less than 8 mm in length; characterize anatomically the symptom \"buttons\" and injured stigmas; investigate the ultrastructural changes in tissues of inoculated petals; analyze whether there is the establishment of a quiescent infection in leaf tissues, analyze pollen grains after inoculation in vivo and in vitro with the fungus. Healthy buds, petals and stigmas with and without lesions, were processed and analyzed using conventional light and electron microscopy techniques. Leaves and pollen grains were also inoculated and analyzed with light microscopy. It was developed a new staining method for fungal-infected plant tissues. The resistance of flower buds smaller than 8mm may be associated with preformed structural and chemical barriers. These buttons display the apex with interspersed papillae, with crystals in mesophyll and substomatic chamber and oil cavities, which are located very close to each other on the abaxial surface. In 8mm and 12mm flower buds, the papilas in the apex become weakly interspaced, the crystals are not observed and there is the increase of the distance between the oil cavities. The papillose cells are osmophores. In the symptom \"button\", it is noted in the abscission of the ovary, an installation of wound meristem. There is also the lignification in the pith of receptacle and pedicel that can be associated with the retention of these structures in the plant. In infected petals, it was found that C. acutatum can penetrate intra and intercelullar or via stomata. The fungus may grow subcuticular and intramural and colonize all tissues of petal. The new staining technique developed has proved very useful for histopathological analysis. The fungus is closely associated with vascular tissues. The acervulli occur on both surfaces of petals. The cuticle in the later stages of the lesion is altered, i.e., there is loss of striated ornamentation and increased deposition of lipophilic material. The synthesis of lipophilic materials involves rough and smooth endoplasmic reticulum and plastids. Vesicles from dictyosomes and multivesicular bodies were observed throughout the cell wall and are associated with the deposit of lipophilic material in the cuticle. There is the formation of protective layer over the stigma damaged area. The fungus shows chemotropism and grows toward the pollen infecting it 24 hours after inoculation. It is suggested that C. acutatum can use pollen grains for dispersal. After 48 hours of inoculation, the leaves have germinated conidia with appressoria.