OLIVEIRA, Hermógenes David de. Toxinas protéicas de sementes de soja [Glycine Max (L.) Merr.]: aspectos moleculares e funcionais. 2009. 179 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-20T13:47:53Z No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:35:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_tese_hdoliveira.pdf: 22424370 bytes, checksum: c91e302e7e8a350dc5032a3db4a9415d (MD5) Previous issue date: 2009 / Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42 ± 3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ºC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16 ± 0.08 µg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11µg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. EST’s encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens / A soja (Glycine max) é uma espécie de grande valor econômico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grãos na alimentação animal e na indústria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grãos, as perdas na produtividade em campo ainda são consideráveis, principalmente àquelas causadas por nematóides do gênero Meloidogyne e por fungos fitopatogênicos. Mesmo com a existência de alternativas químicas para o controle dessas espécies, bem como com a existência de genótipos resistentes, as perdas agrícolas ainda são consideráveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistência ambientalmente seguros são práticas necessárias para o controle de pragas e patógenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquímica e funcionalmente duas toxinas protéicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papéis na defesa contra patógenos de importância agronômica para essa espécie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) é uma proteína ácida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pI’s 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A análise por dicroísmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro típico de proteínas que apresentam α-hélice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante àquela já descrita para a SBTX. Esses padrões são gradualmente perdidos quando a proteína é aquecida de 25 a 95 ºC. Os espectros de emissão em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, máximo) mostraram padrões típicos de resíduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciária. SYTX-2 é uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrócitos de coelho em presença de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. Além disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleásica, cuja atividade específica (1821,42 ± 3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante àquela descrita para a ribonuclease de raízes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 está presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilédones, além de se distribuir também em raízes, caules e folhas. As raízes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62 ± 10,10 µg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressão triplicada em tecidos adultos (195,12 ± 35,54 µg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteína é exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudação mostrado 18 h após o contato com o tampão (6,16 ± 0,08 µgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteínas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h após a injúria mecânica de folhas (de 6,7 para 10,46 µg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h após a lesão. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita Raça 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h após incubação com a proteína, e de 100% após 24 h. Essa toxina também foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora não tenha sido efetiva em inibir a germinação de esporos de fungos fitopatogênicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho também descreve o isolamento, a clonagem e a caracterização do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraído de sementes 15, 25 e 35 dias após a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteína (27 e 17 kDa). Evidências experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteína são codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotídeos, codificante para uma proteína com 219 resíduos de aminoácidos. A sequência do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por EST’s para essa proteína, mostrou que além de ser expressa em todo o vegetal, níveis elevados de transcritos são observados após a infecção contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogênicos. A sequência deduzida de aminoácidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptídeo sinal de 26 resíduos de aminoácidos, clivado para a produção da proteína madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteína básica. Na sequência de aminoácidos da subunidade de 27 kDa também foram identificados: um resíduo de cisteína, envolvido na formação de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sítios de fosforilação em Ser, Thr ou Tyr, 8 sítios de glicosilação para GlcNAc e um sítio para adição de oligossacarídeos tipo mucina (GalNAc). A toxina também apresenta sítios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausência de toxicidade observada em camundongos após administração oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas através de uma caracterização estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informações obtidas permitiram definir que essas proteínas são parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogênicos e nematóides. Além de inéditos e de extrema relevância, todos esses dados darão subsídios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protéica e isolamento gênico e, para SBTX, realização de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgênicas com uma maior resistência a fungos

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:44Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-07-18Bitstream added on 2014-06-13T20:19:58Z : No. of bitstreams: 1 souza_ec_me_ilha.pdf: 505202 bytes, checksum: b2e8a6c8e22a5805a00f3381be5d40df (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O mal-do-fio (ou queima-do-fio) é uma doença causada pelo fungo Basidiomiceto Ceratobasidium sp., que afeta diversas plantas frutíferas nativas ou cultivadas. A doença ocorre com mais freqüência em zonas de alta precipitação e temperaturas elevadas, típicas de regiões de florestas tropicais como a Amazônia e a Mata Atlântica. Em São Paulo, recentemente detectou-se a ocorrência do mal-do-fio, em caquizeiro na região de Mogi das Cruzes. Essa doença pode- se tornar importante com a expansão do cultivo de fruteiras no Estado. A maioria das pesquisas sobre o patossistema focalizou a epidemiologia e o controle do fungo. Entretanto a etiologia do patógeno ainda não está totalmente definida, especialmente para populações do fungo infectando caqui e chá no Estado de São Paulo. Há também pouca informação sobre a divergência genética entre populações do patógeno de hospedeiros distintos como caqui e chá. O primeiro objetivo deste trabalho foi determinar o posicionamento filogenético global de populações de Ceratobasidium sp. do caqui e do chá, em relação a espécies de Ceratobasidium sp. descritas no mundo. Foram analisadas seqüências de DNA da região ITS-5.8S do rDNA, inferindo-se a história dos alelos ou haplótipos deste lócus, por meio de métodos filogenéticos, cladísticos e coalescentes. Observou-se que uso de C. noxium é apropriado para denominar espécies associadas ao mal-do- fio em caqui e chá, apesar de C. noxium do caqui e do chá constituírem populações filogeneticamente independentes, as quais denominamos de Grupo Diospyrus e Grupo Camellia. Este estudo trouxe uma contribuição importante para a compreensão das relações filogenéticas e biologia de populações de C. noxium em caqui e chá. Uma vez esclarecidas as questões filogenéticas, o segundo objetivo deste trabalho foi testar a patogenicidade cruzada de... / The white-thread blight is a disease caused by the Basidiomycete fungus Ceratobasidium sp. that affects several native or cropped tree fruits. This disease frequently occurs in zones of high precipitation and high temperatures typical of the tropical forest regions such as the Amazon and the Atlantic Forest. In São Paulo, the occurrence of the white-thread blight was detected only recently on kaki orchards closer to Mogi das Cruzes. That disease can become important with the expansion of the fruit trees cropping areas in the State. Most of the researches about the pathosystem has focused on the epidemiology and control of fungus. However the etiology of the pathogen is not totally defined yet, especially for the fungus populations infecting kaki and tea in São Paulo State. There is also little information available about the biological and genetic divergence between pathogen populations from distinct hosts, such as kaki and tea. The first objective of this research was to determine the global phylogenetic placement of populations of Ceratobasidium from kaki and tea, considering the species of Ceratobasidium described throughout the world. Sequences of the ITS-5.8S region of the rDNA were analyzed, inferring the alleles or haplotypes history for this locus, by phylogenetics, cladistisc and coalescent methods. We observed that the use of C. noxium is appropriate to denominate the fungus species associate with the white-thread blight on kaki and tea, despite the fact that C. noxium from kaki and tea constitutes phylogenetically independent populations, which we denominate Diospyrus and Camellia groups. This study brought an important contribution for the understanding of the phylogenetics and population biology of C. noxium infecting kaki and tea. Once the phylogenetics subjects have been cleared, the second objective of this work was to test the cross-pathogenicity... (Complete abstract, access electronic address below)

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CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A cultura da mamoneira (Ricinus communis L.) à de grande importÃncia socioeconÃmica devido Ãs suas sementes, que sÃo utilizadas, principalmente, na produÃÃo do Ãleo que pode ser empregado para diversos fins industriais. A extraÃÃo do Ãleo gera um subproduto de alto valor nutricional, conhecido como torta da mamona. PorÃm, a presenÃa de compostos tÃxicos e alergÃnicos dificulta utilizaÃÃo desse resÃduo como fonte de alimentaÃÃo animal. Outra forma de agregar valor à torta da mamona seria buscar molÃculas bioativas que pudessem ter aplicaÃÃes na agricultura e saÃde humana. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar um inibidor de tripsina da torta da mamona, bem como, testar a atividade deste in vitro contra fungos fitopatogÃnicos de importÃncia agrÃcola e proteases do intestino mÃdio de Aedes aegypti. O inibidor de tripsina da torta da mamona, nomeado RcTI, foi purificado atravÃs de tratamento tÃrmico, coluna de afinidade em matriz de anidrotripsina-Sepharose 4B e cromatografia de troca iÃnica em ResourceTM Q. Essa proteÃna apresentou massa molecular aparente de 14,0 kDa na ausÃncia ou presenÃa de agente redutor, pI 5,2 e nÃo à uma glicoproteÃna. A sequÃncia NH2-terminal do RcTI purificado mostrou similaridade de 83% com uma proteÃna de armazenamento rica em enxofre (albumina 2S) de R. communis e de 48% com uma napin-like (albumina 2S) de R. communis. O RcTI mostrou-se estÃvel apÃs tratamento tÃrmico a 98 ÂC durante duas horas. Da mesma forma, permaneceu com atividade inibitÃria estÃvel na faixa de pHs Ãcidos. No entanto, houve uma perda de, aproximadamente, 20% na capacidade inibitÃria em pHs alcalinos (pH 8-11). O RcTI (13 Âg) nÃo foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos dos fungos Fusarium oxysporum, Fusarium solani e Rhizoctonia solani. No entanto, foi capaz de inibir a germinaÃÃo de esporos de Colletotrichum gloeosporioides. O RcTI nÃo foi efetivo na inibiÃÃo de crescimento vegetativo dos fungos mencionados acima. Esse inibidor foi efetivo contra as proteases intestinais de Aedes aegypti com 91% de inibiÃÃo. A partir dos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que o RcTI tem potencial biotecnolÃgico, podendo ser utilizado como uma alternativa para o combate do importante fungo fitopatogÃnico C. gloeosporioides e larvas de A. aegypti. / The castor bean (Ricinus communis L.) culture is of great socioeconomic importance because of its seeds, which are used mainly for production of oil that can be used for various industrial purposes. The oil extraction generates a by-product of high nutritional value known as the castor cake. However, the presence of toxic and allergenic compounds hinders the use of this residue to feeding source. Another way to add value to the castor cake would be to seek bioactive molecules that could have applications in agriculture and human health. This study aimed to purify and characterize a trypsin inhibitor of castor cake and, to test this in vitro activity against phytopathogenic fungi of agricultural importance and proteases from the midgut of Aedes aegypti. The trypsin inhibitor of castor cake, named RcTI, was purified by heat treatment, affinity column in anhydrotrypsin-Sepharose 4B and ion-exchange chromatography ResourceTM Q. RcTI has a apparent molecular mass of 14 kDa in the absence or presence of a reducing agent, pI 5.2 and isnât a glycoprotein. The NH2-terminal sequence of purified RcTI showed 83% similarity with sulfur-rich storage protein (2S albumin) R. communis and 48% with napin-like (2S albumin) R. communis. The RcTI was stable after heat treatment at 98 ÂC for two hours. The inhibition on trypsin was stable in the acid pH range. However, there was a loss of approximately 20% inhibitory effect on alkaline pH (pH 8-11). The RcTI (13 Âg) was unable to inhibit the germination of spores of the fungus Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani and Fusarium solani. However, it was able to inhibit the germination of spores of Colletotrichum gloeosporioides. RcTI 100 Âg was not effective in the inhibition of vegetative growth of the fungi mentioned above. This inhibitor was effective against proteases from the midgut of Aedes aegypti with 91% inhibition. The results of the present study indicate that RcTI has biotechnological potential, can be used as an alternative to combat the important plant pathogenic fungus C. gloeosporioides and larvae of A. aegypti.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina, purificada de sementes de Moringa oleifera, com amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos. No presente trabalho, novas propriedades estruturais da Mo-CBP3 sÃo descritas, revelando correlaÃÃo entre sua estabilidade estrutural e atividade antifÃngica. Em adiÃÃo, para melhor compreensÃo dos mecanismos pelos quais essa proteÃna exerce aÃÃo antifÃngica, sua habilidade de induzir a produÃÃo endÃgena de espÃcies reativas de oxigÃnio e de causar alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais foi analisada, usando Fusarium solani como modelo. F. solani à uma espÃcie de fÃcil manuseio e desenvolvimento rÃpido, ideal para ensaios in vitro, e de relevÃncia, por se tratar de um fungo que ataca culturas economicamente importantes. Com foco na utilizaÃÃo segura da Mo-CBP3 como agente quÃmico contra fungos, seus efeitos citotÃxicos sobre cÃlulas eucariÃticas tambÃm foram investigados. Mo-CBP3 à uma proteÃna ligante à quitina de 18,0 kDa, de acordo com PAGE-SDS. Todavia, anÃlise por espectrometria de massas revelou que essa proteÃna consiste de mÃltiplas isoformas com massas moleculares variando entre 12,2 e 12,3 kDa. Mo-CBP3 à composta por duas cadeias polipeptÃdicas de 5,0 e 9,0 kDa, denominadas de cadeia A e cadeia B, respectivamente. A cadeia B contÃm a sequÃncia NH2-terminal representada por CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ, enquanto que a cadeia A tem o resÃduo NH2-terminal bloqueado. cDNA codificador da cadeia B foi obtido com iniciadores sintetizados a partir de sua sequÃncia NH2-terminal. AnÃlises in silico das sequÃncias de nucleotÃdeos e de aminoÃcidos deduzida confirmaram a presenÃa de isoformas e massa molecular da Mo-CBP3 e identificaram sÃtios potenciais de O-glicosilaÃÃo e fosforilaÃÃo. AlÃm disso, similaridades entre Mo-CBP3 e outras proteÃnas de M. oleifera, bem como com albuminas 2S, foram detectadas. A estrutura secundaria da Mo-CBP3 à composta por 30,3% α-hÃlices, 16,3% folhas β, 22,3% voltas e 30,4% estruturas ao acaso. Na espectroscopia de fluorescÃncia, excitaÃÃes de uma soluÃÃo da Mo-CBP3 a 280 nm e 295 nm produziram emissÃo mÃxima a 303 e 309 nm, respectivamente. A estrutura da Mo-CBP3 à altamente estÃvel, se apresentando indiferente Ãs mudanÃas de temperatura e pH. Mo-CBP3 (0,05-0,1 mg/mL) se mostrou capaz de inibir a germinaÃÃo de conÃdios de vÃrios fungos fitopatogÃnicos, incluindo F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae e C. gloeosporioides. Similarmente, Mo-CBP3 (0,05 mg/mL) foi capaz de inibir o crescimento micelial de F. solani e apresentou tanto efeito fungistÃtico como fungicida, dependendo da concentraÃÃo usada. LigaÃÃo da Mo-CBP3 à superfÃcie de cÃlulas fÃngicas ocorre, pelo menos em parte, via interaÃÃo eletrostÃtica, jà que NaCl 0,15 M aboliu seu efeito inibitÃrio. Mo-CBP3 induziu a produÃÃo de espÃcies reativas de oxigÃnio e causou perda de assimetria e deformaÃÃes em cÃlulas de F. solani. DesorganizaÃÃo do sistema de endomembranas, condensaÃÃo do citosol e aumento de vacuolizaÃÃo tambÃm foram observados. Mo-CBP3 nÃo mostrou atividade hemolÃtica e nem foi capaz de alterar a viabilidade das cÃlulas MCF-7 e Caco-2, sugerindo que essa proteÃna nÃo à tÃxica para cÃlulas humanas. Com base na alta estabilidade e no amplo espectro de aÃÃo contra fungos fitopatogÃnicos em baixas concentraÃÃes e, tambÃm, na ausÃncia de citotoxicidade para cÃlulas humanas testadas, Mo-CBP3 tem grande potencial para desenvolvimento de novas drogas antifÃngicas ou na produÃÃo de plantas transgÃnicas mais resistentes a fungos. / Mo-CBP3 is a chitin-binding protein purified from Moringa oleifera seeds that displays broad inhibitory activity against phytopathogenic fungi. In this work, we report new structural features of Mo-CBP3 that reveal a correlation between its structural stability and antifungal activity. In addition, to gain better insights into the mechanisms by which this protein acts as an antifungal agent, its ability to induce the endogenous production of reactive oxygen species and to trigger morphologic and ultrastructural alterations were analysed using Fusarium solani as a model. F. solani is an easy-to-handle and fast-developing species, making it ideal for in vitro assays, and it holds relevance as a phytopathogenic fungus that attacks economically important crop plants. To fully explore the biosafety of Mo-CBP3 as a chemical agent against fungi, its cytotoxic effects on eukaryotic cells were also investigated. Mo-CBP3 is a chitin-binding protein of 18.0 kDa, according to SDS-PAGE. However, by mass spectrometry analysis, it was observed that this protein consists of multiple isoforms with molecular masses ranging between 12.2 and 12.3 kDa. Mo-CBP3 is composed by two polypeptide chains of 5.0 and 9.0 kDa, named A and B chain, respectively. The B chain contains the following NH2-terminal sequence CPAIQRCCQQLRNIQPPCRCCQ while the A chain has a blocked NH2-terminal residue. cDNA encoding the B chain was obtained with primers of its NH2-terminal sequence. In silico analyses of nucleotide and deduced amino acid sequences confirmed the presence of isoforms and molecular mass of Mo-CBP3 and identified potential sites of O-glicosylation and phosphorilation. Moreover, similarities between Mo-CBP3 and other M. oleifera proteins as well as 2S albumins were detected. The secondary structure of Mo-CBP3 showed 30.3% α-helices, 16.3% β-sheets, 22.3% turns and 30.4% unordered forms. In the fluorescence spectroscopy, excitation of Mo-CBP3 solution at 280 nm and 295 nm gave emission maxima at 303 and 309 nm, respectively. The Mo-CBP3 structure is highly stable and retains its antifungal activity regardless of temperature and pH. Mo-CBP3 (0.05-0.1 mg/mL) was able to inhibit the conidia germination of several phytopathogenic fungi, including F. solani, F. oxysporum, Colletotrichum musae and C. gloeosporioides. Similarly, Mo-CBP3 was inhibitory to the mycelial mass development of F. solani at 0.05 mg/mL and has both fungistatic and fungicidal effects, depending on the concentration used. Binding of Mo-CBP3 to the fungal cell surface is achieved, at least in part, via electrostatic interactions, as 150 mM NaCl abolished its inhibitory effect. Mo-CBP3 induced the production of reactive oxygen species and caused in F. solani cells a marked loss of asymmetry, deformations and deep wrinkles in comparison to control cells. Disorganisation of the endomembrane system and condensation and shrinkage of cytosol with increased vacuolation and the loss of normal structure and content were also observed. Mo-CBP3 did not show haemolytic activity and it was not capable to alter de viability of both MCF-7 and Caco-2 cells, suggesting that this protein is not toxic for human cells. Based on its high stability and broad-spectrum efficacy against important phytopathogenic fungi at low inhibitory concentrations and absence of cytotoxicity to human cells, Mo-CBP3 has great potential in the development of new antifungal drugs or in transgenic crops with enhanced resistance to fungi.

O mal-das-folhas, principal doença da seringueira, ainda restrita ao continente americano, tem frustrado todas as tentativas de cultivo da seringueira em regiões com distribuição de chuvas durante todo o ano, tais como a Amazônia tropical úmida. A utilização da técnica de enxertia de copa com clones resistentes é uma solução para contornar este problema, porém, o efeito depressivo das copas enxertadas, ocasionado pela perda da estabilidade do látex tem sido um dos principais obstáculos para a adoção dessa técnica. O papel da cianogênese na perda da estabilidade do látex foi sugerido pelos resultados do estudo da incompatibilidade de enxertia de clones de copa sobre o clone de painel IPA 1 em plantas jovens mantidas em jardim clonal. Verificou-se que a incompatibilidade ocorria devido ao transporte de glicosídeos cianogênicos (linamarina e lotaustralina) sintetizados nos folíolos jovens dos clones de copa enxertados, para o caule do IPA 1, cujos sintomas iniciavam com a perda da estabilidade do látex seguido de sua coagulação nos laticíferos. Tais sintomas evoluíram para necrose do floema, além de acúmulo de polifenóis e taninos, aumento do número de esclereídeo, inclusão de tilosóides nos vasos laticíferos e depósito intercelular de lignina amorfa de coloração marrom acinzentada, muito semelhante aos descritos para um dos tipos de secamento do painel, denominado Brown Bast, cuja causa ainda não está esclarecida. O passo inicial da biossíntese dos dois glicosídeos cianogênicos linamarina e lotaustralina é catalisado por citocromos multifuncionais, enzimas que se encontram ligadas à membrana e são denominadas, genericamente, de citocromos P-450. O aumento da atividade dessa enzima foi observado in vivo sob doses de nitrogênio (N), neste caso, acompanhado pelo aumento do conteúdo de glicosídeo cianogênico, e in vitro na presença de manganês (Mn). Essas evidências levaram à elaboração das seguintes hipóteses: i) clones de copa capazes de sintetizar grandes quantidades de glicosídeos cianogênicos (HCNp) podem translocá-los para o painel, elevando a concentração destes na casca do tronco, ii) altas concentrações de HCNp na casca do clone de painel, provenientes de copas enxertadas, reduzem a estabilidade do látex, produzindo o efeito depressivo sobre a produção, podendo evoluir para o secamento do painel de sangria do tipo Brown Bast. iii) a quantidade de glicosídeos cianogênicos produzidos nas folhas é influenciada pelo teor de N e Mn no tecido vegetal. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi determinar critérios de seleção de clones de copa para a obtenção de combinações copa/painel mais produtivas, com base na avaliação das relações entre a cianogênese, estado nutricional, estabilidade do látex e incidência de secamento do painel de sangria com os seguintes estudos: a) levantamento do potencial cianogênico (HCNp) entre os clones de copa, b) evidências do transporte de glicosídeos cianogênicos da copa para o tronco, como fator de variação do HCNp da casca do painel de sangria, c) relação entre a cianogênese e a estabilidade do látex e o secamento do painel de sangria, d) efeito da adubação com N e Mn na formação de glicosídeos cianogênicos. Verificou-se que o potencial cianogênico (HCNp) apresenta ampla faixa de variação dentro das espécies estudadas como clones de copa, com os valores mais baixos obtidos com os clones de Hevea nítida e os mais altos com os de H. rigidifolia . No entanto, a ocorrência de indivíduos de H. nítida com valores médios de HCNp e H. rigidifolia com valores baixos indicam que essa característica ainda não se encontra bem definida dentro das espécies de Hevea. As copas enxertadas exercem influência sobre o potencial cianogênico (HCNp) da casca do tronco dos clones de painel. No entanto, a ausência de correspondência entre os HCNps das folhas dos clones de copa e o da casca do tronco invalida a utilização do HCNp da copa como critério de seleção destas. Futuras pesquisas são necessárias para identificar o mecanismo do efeito das copas enxertadas sobre o HCNp do painel. A atividade da enzima -glicosidase não foi influenciada pelas combinações copa/painel, estando a capacidade cianogênica (HCNc) diretamente relacionada ao HCNp das cascas das plantas. Os teores foliares de N, Mn e clorofila apresentam correlação com o HCNp das folhas novas e diagnóstico, podendo os mesmos serem utilizados em futuros processos de seleção. Em baixas concentrações de N (0,8% de uréia), o Mn influência a absorção de nitrogênio, potássio, fósforo, cálcio, enxofre, ferro e manganês pelas plantas de seringueira, na fase de viveiro. / The South American leaf blight (SALB), main disease of the rubber tree, which is still restricted to the American continent, has frustrated all the attempts of cultivation of the rubber tree in regions with rainfall distributed throughout the year, such as the humid tropical Amazon. The use of crown grafting with clones resistant to the disease is one possible solution to obviate this problem. However, the depressant effect of the grafted crowns caused by the loss of latex stability is one of the main obstacles to this technique. The role of cyanogenesis in the loss of latex stability was suggested in view of the findings of the study of incompatibility of crown clone grafting and the IPA 1 panel clone in young plants kept in the clonal nursery. This incompatibility occurred due to the transport of cyanogenic glycosides (linamarin and lotaustralin) synthesized in the young follicles of the grafted crown clones to the stem of IPA 1, which first symptoms were the loss of latex stability followed by coagulation within the lactiferous ducts. Such symptoms evolved to phloem necrosis, including the accumulation of polyphenols and tannins, increased number of sclereids, inclusion of tyloses in the lactiferous ducts and intracellular deposit of amorphous lignin of a greyish- brown color very similar to the one described in one of the types of panel dryness called Brown Bast, which cause has not yet been clarified. The first step of biosynthesis of the two cyanogenic glycosides linamarin and lotaustralin is catalyzed by multifunctional cytochromes, enzymes connected with the membrane generically called P-450 cytochromes. The increased activity of the referred enzyme was observed in vivo when nitrogen (N) rates were applied, in this case, followed by increased cyanogenic glycoside content, and in vitro in the presence of manganese (Mn). Such evidence led to the creation of the following hypotheses: i) crown clones capable of synthesizing large amounts of cyanogenic glycosides (HCNp) may transport them to the panel, thus increasing their concentration in the bark of the tree trunk, ii) high concentrations of HCNp in the bark of the panel clone, from the grafted crowns, reduce latex stability, producing a depressant effect on the production that may evolve to panel dryness similar to the Brown Bast disease. iii) the amount of cyanogenic glycosides produced in the leaves is influenced by the N and Mn concentrations in the vegetable tissue. In this context, the present study aimed to determining criteria for the selection of tree crown clones to obtain more productive crown/panel arrangements, based on the assessment of the relationships between cyanogenesis, nutritional status, latex stability and incidence of dryness in the panel, through the following studies: a) assessment of cyanogenic potential (HCNp) of the crown clones, b) evidence of transport of cyanogenic glycosides from the crown to the tree trunk as a determining factor in the variation of HCNp level in the panel bark c) relationship between cyanogenesis and latex stability and the dryness of the panel, d) N and Mn fertilization effects on cyanogenic glycosides formation. The cyanogenic potential (HCNp) was found to have a broad range of variation among the studied species as crown clones, with the lowest values obtained with Hevea nítida clones and the highest values obtained with H. rigidifolia. However, the occurrence of H. nítida individuals with average HCNp values and H. rigidifolia individuals with low values indicate that this characteristic is not well defined within Hevea species. The grafted crowns influence the cyanogenic potential (HCNp) of the bark of the tree trunk of the panel clones. Yet, the lack of correspondence between the HCNps of the trees of the crown clones and that of the bark of the trunk invalidate the use of the crown HCNp as a selection criterion. Further research is necessary to identify the mechanism of the effect of grafted crowns on the panel HCNp. The activity of the -glicosidase enzyme was not influenced by the crown/panel arrangements, with the cyanogenic capacity (HCNc) found to be directly related to the HCNp of the barks of the trees. In rubber tree, regardless the age and species of Hevea, the foliar chlorophyll, N and Mn concentrations have a positive relationship to the HCNp of the young leaves and diagnosis, so they can be used in future selection processes. Under low N contents (0.8% of urea), the Mn influences the nitrogen, potassium, phosphorus, calcium, sulphur, iron and manganese uptake by rubber tree plants at nursery stage.

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Devido à alta perecibilidade da matéria-prima e às falhas ocorridas nas diferentes fases da cadeia pós-colheita, grande parte dos vegetais produzidos no Brasil são desperdiçados. Dentre os diversos fatores envolvidos as doenças ocasionadas por fungos fitopatógenos se destacam. O controle de doenças fúngicas pós-colheita é comumente realizado através da aplicação de fungicidas, de elevado custo de produção e apresentados como ameaça à saúde pública e ao meio ambiente. Tendo em vista a problemática apresentada, no presente estudo foi avaliada a eficácia de revestimentos elaborados com quitosana (QUI) e óleos essenciais de Mentha piperita L. (MPOE) ou Mentha x villosa Huds (MVOE) como alternativa para o controle de infecções causadas pelos fungos Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Penicillium expansum e Rhizopus stolonifer em tomates cereja e uvas de mesa durante o armazenamento em temperatura ambiente e em baixas temperaturas. A quitosana foi obtida da carapaça do camarão Litopenaus vannamei, em meio alcalino. Os óleos essenciais foram obtidos por arraste de vapor. Para o preparo do revestimento, o polímero de quitosana foi diluído em ácido acético sob agitação por 6 horas, seguido da adição do óleo e agitação por mais 18 horas em presença de glicerol como agente dispersante. As Concentrações Inibitórias Mínima da quitosana e de cada óleo foram determinadas por meio da macrodiluição em caldo. Os efeitos dos revestimentos sobre as características fúngicas (crescimento micelial radial e germinação espórica), físico-químicas (perda de peso, firmeza, cor, acidez e sólidos solúveis) e sensoriais (aceitação e intenção de compra) dos frutos durante a armazenagem também foram avaliados. A concentração inibitória mínima (CIM) de QUI contra todos os fungos-teste foi de 8 mg / mL, ao passo que a CIM para ambos MPOE e MVOE foi de 5 μL / mL. Combinações de QUI (8 e 4 mg/mL) e MPOE (QUI-MPOE) ou (QUI-MVOE) (5, 2,5 e 1,25 μL/mL) inibiu fortemente a germinação de esporos e o crescimento micelial dos fungos estudados. Os revestimentos compostos de QUI-MPOE ou QUI-MVOE retardaram o crescimento dos fungos causadores de mofos ensaiados em frutos artificialmente infectados durante a armazenagem em temperatura ambiente (12 dias) ou em baixa temperatura (24 dias). Os revestimentos ensaiados também preservaram a qualidade de frutos de tomate cereja e uvas de mesa durante a armazenagem, em termos de características físico-químicas e sensoriais. Nas uvas de mesa, houve uma melhoria nos valores de firmeza, cor L* e cor h* indicando frutos mais brilhosos e um possível retardo no desenvolvimento do "browning" das uvas revestidas com QUI-MPOE ou QUI-MVOE em relação aos frutos controle. Estes resultados indicam que os revestimentos que compreendem CHI-MPOE ou CHI-MVOE, apresentam-se como alternativa promissora para inibir a infecção de fungos pós-colheita em tomate cereja e uvas de mesa durante o armazenamento sem afetar a qualidade desses frutos. / Fruits are rich in vitamins, minerals, fiber and other compounds that provide health benefits. Knowledge of these benefits has provided an increase in vegetable consumption in recent years because in addition to the interest in phytochemicals that benefit the health and nutritional value, consumers have sought high quality products and safe for consumption. Due to the high perishability of the raw material and the failures occurred in different stages of post-harvest chain, most of the vegetables produced in Brazil are wasted. Among the many factors involved diseases caused by fungi pathogens in fruits stand out, they result in significant economic losses. Control of post-harvest fungal diseases commonly is achieved through the application of fungicides, increase the cost of production and presented to public health and the environment. In view of the problems presented, in the present study we evaluated the efficacy comprising shrimp chitosan (CHI) and Mentha piperita L. (MPEO) or Mentha x villosa Huds (MVEO) essential oils as an alternative for the control mold infections caused by Aspergillus niger, Botrytis cinerea, Penicillium expansum and Rhizopus stolonifer of cherry tomatoes and table grapes during storage at room temperature and low temperatures. Chitosan was obtained from the shell of the shrimp Litopenaeus vannamei in alkaline medium. The essential oils were obtained by vapor dragging. To prepare the coating, the polymer chitosan was diluted acetic acid with stirring for 6 hours, followed by addition of the oil and shaken for 18 more hours in the presence of glycerol as a dispersing agent. The Minimum Inhibitory Concentrations in chitosan and each oil were determined by the broth macrodilution. The effects of the coatings on the fungal characteristics (radial mycelial growth and esporic germination), physico-chemical (weight loss, firmness, color, acidity and soluble solids) and sensory (acceptance and purchase intention) of the fruit during storage were also evaluated. The minimum inhibitory concentration (MIC) of CHI against all the test fungi were 8 mg / mL, whereas the MIC for both MPOE and MVOE was 5 uL / mL. Combinations CHI (8 and 4 mg / mL) and MPOE (CHI-MPOE) or (CHI-MVOE) (5, 2.5 and 1.25 uL / mL) strongly inhibited spore germination and mycelial growth of of target fungi. The coatings comprising CHI-MPEO or CHI-MVEO delayed the growth of mold-causing fungi in artificially infected fruits during storage at either room (12 days) or low temperatures (24 days). The assayed coatings preserved the quality of cherry tomato fruits and table grapes during storage, in terms of physical, physicochemical and sensory attributes. In table grapes, there was an improvement in the firmness values, color L * and h * color indicating more glossy fruit and a possible delay in the development of "browning" of grapes coated with CHI-CHI-MPOE or MVOE compared to control fruits. These results indicate that coatings comprising CHI-MPEO or CHI-MVEO represent promising post-harvest treatments to inhibit common postharvest mold infections in cherry tomato fruits and in table grapes during storage without affecting the quality of these fruits.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A soja (Glycine max) à uma espÃcie de grande valor econÃmico para o Brasil dada a multiplicidade de uso de seus grÃos na alimentaÃÃo animal e na indÃstria. Embora o Brasil seja o segundo maior produtor mundial dos grÃos, as perdas na produtividade em campo ainda sÃo considerÃveis, principalmente Ãquelas causadas por nematÃides do gÃnero Meloidogyne e por fungos fitopatogÃnicos. Mesmo com a existÃncia de alternativas quÃmicas para o controle dessas espÃcies, bem como com a existÃncia de genÃtipos resistentes, as perdas agrÃcolas ainda sÃo considerÃveis, mostrando que a busca por mecanismos naturais de resistÃncia ambientalmente seguros sÃo prÃticas necessÃrias para o controle de pragas e patÃgenos e para a melhoria na produtividade. Este trabalho objetivou caracterizar bioquÃmica e funcionalmente duas toxinas protÃicas isoladas de sementes de soja, bem como avaliar os seus papÃis na defesa contra patÃgenos de importÃncia agronÃmica para essa espÃcie. Foi mostrado experimentalmente que SYTX-2 (28 kDa) à uma proteÃna Ãcida encontrada em duas isoformas (27,3 e 27,2 kDa) de pIâs 5,11 e 5,24, as quais apresentam a mesma extremidade NH2-Terminal (KTISSEDSPFFNCREK). A anÃlise por dicroÃsmo circular mostrou que a SYTX-2 apresenta um espectro tÃpico de proteÃnas que apresentam α-hÃlice e folhas-β, sendo essa estrutura semelhante Ãquela jà descrita para a SBTX. Esses padrÃes sÃo gradualmente perdidos quando a proteÃna à aquecida de 25 a 95 ÂC. Os espectros de emissÃo em 280 e 295 nm (323 e 313 nm, mÃximo) mostraram padrÃes tÃpicos de resÃduos de triptofano presentes no interior da estrutura terciÃria. SYTX-2 à uma hemilectina capaz de aglutinar indiretamente eritrÃcitos de coelho em presenÃa de anticorpos policlonais anti-SYTX-2, sendo essa atividade inibida por D-manose. AlÃm disso, in vitro, SYTX-2 apresentou atividade ribonucleÃsica, cuja atividade especÃfica (1821,42  3,34 UA. h-1 mgP) foi semelhante Ãquela descrita para a ribonuclease de raÃzes de V. unguiculata. Foi observado que SYTX-2 està presente na casca das sementes em teores menores do que os observados para os cotilÃdones, alÃm de se distribuir tambÃm em raÃzes, caules e folhas. As raÃzes jovens apresentam os maiores teores de SYTX-2 (62,62  10,10 Âg de SYTX-2/g de tecido) sendo essa expressÃo triplicada em tecidos adultos (195,12  35,54 Âg/g de tecido). Em pH 5,0 essa proteÃna à exsudada das sementes ao longo de 24 h, sendo o pico de exsudaÃÃo mostrado 18 h apÃs o contato com o tampÃo (6,16  0,08 ÂgP de SYTX-2/semente ). Tal como descrito para muitas proteÃnas de defesa, SYTX-2 foi induzida 6 h apÃs a injÃria mecÃnica de folhas (de 6,7 para 10,46 Âg de SYTX-2/ g de tecido), retornando aos valores normais 24 h apÃs a lesÃo. In vitro SYTX-2 apresentou uma potente atividade nematicida contra M. incognita RaÃa 4, induzindo a mortalidade de 85% dos J2 6h apÃs incubaÃÃo com a proteÃna, e de 100% apÃs 24 h. Essa toxina tambÃm foi capaz de inibir (20%) o crescimento de C. albicans, embora nÃo tenha sido efetiva em inibir a germinaÃÃo de esporos de fungos fitopatogÃnicos (R. solani, Phomopsis sp. e F. solani f.sp glycines). Este trabalho tambÃm descreve o isolamento, a clonagem e a caracterizaÃÃo do cDNA da subunidade de 27 kDa da SBTX (44 kDa). O cDNA foi isolado a partir de um pool de RNA extraÃdo de sementes 15, 25 e 35 dias apÃs a antese, utilizando iniciadores desenhados a partir do NH2-terminal das duas subunidades da proteÃna (27 e 17 kDa). EvidÃncias experimentais sugerem fortemente que as duas subunidades da proteÃna sÃo codificadas por genes diferentes. A subunidade de 27 kDa da SBTX apresenta um cDNA de 815 pb, composto por uma ORF de 660 nucleotÃdeos, codificante para uma proteÃna com 219 resÃduos de aminoÃcidos. A sequÃncia do cDNA da SBTX foi detectada em dois cromossomos (04 e 06) e a busca por ESTâs para essa proteÃna, mostrou que alÃm de ser expressa em todo o vegetal, nÃveis elevados de transcritos sÃo observados apÃs a infecÃÃo contra P. sojae e F. solani f. sp. glycines, evidenciando seu importante papel na defesa contra fungos fitopatogÃnicos. A sequÃncia deduzida de aminoÃcidos da subunidade de 27 kDa apresenta um peptÃdeo sinal de 26 resÃduos de aminoÃcidos, clivado para a produÃÃo da proteÃna madura, que apresenta, portanto, massa molecular de 21,7 kDa e pI 9,3, sendo uma proteÃna bÃsica. Na sequÃncia de aminoÃcidos da subunidade de 27 kDa tambÃm foram identificados: um resÃduo de cisteÃna, envolvido na formaÃÃo de uma ponte dissulfeto com a subunidade de 17 kDa, 11 sÃtios de fosforilaÃÃo em Ser, Thr ou Tyr, 8 sÃtios de glicosilaÃÃo para GlcNAc e um sÃtio para adiÃÃo de oligossacarÃdeos tipo mucina (GalNAc). A toxina tambÃm apresenta sÃtios de clivagem para pepsina, tripsina e quimiotripsina que podem justificar a ausÃncia de toxicidade observada em camundongos apÃs administraÃÃo oral. SYTX-2 e SBTX foram mostradas atravÃs de uma caracterizaÃÃo estrutural ainda mais completa que as descritas por Sousa (2006) e Siebra (2004) e as informaÃÃes obtidas permitiram definir que essas proteÃnas sÃo parte importante da defesa da soja contra fungos fitopatogÃnicos e nematÃides. AlÃm de inÃditos e de extrema relevÃncia, todos esses dados darÃo subsÃdios para estudos posteriores que objetivem, para SYTX-2, determinar sua microestrutura protÃica e isolamento gÃnico e, para SBTX, realizaÃÃo de projetos futuros, visando o desenvolvimento de plantas transgÃnicas com uma maior resistÃncia a fungos / Soybean provides significant sources of fatty acids and proteins for human and animal nutrition and also has non-food uses. Conditions in almost all cultivated land are sub-optimal for plant growth as a result of the increasing incidence of diseases, even in developed agricultural systems. To meet these challenges, genes and proteins that control their resistance to a wide range of pathogens need to be identified and characterized to facilitate improvements in crop productivity. The main focus in this thesis has been to characterize (providing basic information about biochemical characteristics) and study the functional role of SYTX-2 (28 kDa) and SBTX (44 kDa), two toxic proteins isolated from soybean seeds, in plant defense against pathogens. The SYTX-2 was purified by a combination of ammonium sulphate fractionation and two chromatographic steps. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (27.3 e 27.2 kDa), with isoeletric points values corresponding to 5.11 and 5.24, respectively, exhibiting the same N-terminal sequence (KTISSEDSPFFNCREK). SYTX-2 has also ribonuclease activity (1821.42  3.34 UA. h-1 mgP), similar to that described in Vigna unguiculata leaves. The CD spectrum of SYTX-2 presents an alpha-beta profile spectrum, similar to the structure described to SBTX. Regarding to the temperature exposure, monitored by CD, it was observed that the structure of SYTX-2 is vulnerable to the temperatures above 40 ÂC. The fluorescence spectra of Soyatoxin-2 marked a maximum emission of fluorescence at 323-333 nm and confirmed that the tertiary structure of this protein was correctly folded. SYTX-2 behaves as a hemilectin: it does not directly promote agglutination of red blood cells, but toxin-treated erythrocytes are readily agglutinated in the presence of anti-SYTX-2 antibodies. ELISA assays showed that SYTX-2 was exuded during seed imbibition, the maximum level of exuded toxin (6.16  0.08 Âg/seed) detected being at 18 h after the start of imbibition. The expression profiles of SYTX-2 in various soybean tissues were investigated with ELISA assay or Dot Blot analysis. The expression analysis suggested that SYTX-2 was clearly detected in seed coat, leaves, roots and also in stems. However, expression of SYTX-2 in roots is higher than that in leaves and stems. A strong induction of SYTX-2 expression was also observed in wounded leaves 6 h after treatment and it decreased thereafter. In vitro, antifungal activity of SYTX-2 was not detected against R. solani, Phomopsis sp. and F. solani f.sp glycines, but this protein inhibits C. albicans growth. Nematicidal effects of SYTX-2 were studied in vitro against Meloidogyne incognita nematode and the toxin (11Âg/nematode) showed a high nematicidal activity, with the mortality of 85%, after six hours contact and of 100%, after 24 h of incubation. This work also describes the isolation, sequencing and functional analysis of cDNA (815 pb) encoding 27 kDa subunit of soybean toxin (SBTX). CDNA was amplified using a forward primer designed based on the N-terminal sequence of the toxin in combination of primer AP. The genomic location of the 27 kDa SBTX subunit SBTX was preliminarily determined with the mapped soybean ESTs database (www.phytozome.net) at Gm04 and Gm06 chromosome of soybean and thus may have two copies per genome. The deduced protein sequence of 219 amino acids (MW of mature protein 21.7 kDa, pI 9.3) included an N-terminal signal peptide. ESTâs encoding 27 kDa subunit SBTX were present in cotyledons, leaves, and seedlings and the expression of 27 kDa subunit SBTX was also induced in tissues by P. sojae and F. solani f. sp. glycines infection and by abiotic stress. In addition to these blocks, the 27 kDa deduced protein sequence contains a putative Ser/Tyr/Thr phosphorylation and also contains eight potential N-linked glycosylation sites and a threonine/serine-rich region which is a potential site for attachment of O-linked carbohydrate. Potential sites for pepsin, trypsin and chymotrypsin hydrolysis were also detected. The results add a new dimension to toxins SBTX and SYTX functionalities and support the concept that these proteins act protecting soybean against pathogens

A diversidade genética de Crinipellis perniciosa foi avaliada quanto à capacidade adaptativa de diferentes genótipos à dispersão geográfica e à associação preferencial ou diferencial com hospedeiros. Isolados polispóricos de C. perniciosa provenientes de diferentes Estados brasileiros (AM, RO, MG, BA, SP, MT e PA) e diferentes hospedeiros (Theobroma cacao L., Solanum cernuum, Solanum paniculatum, Solanum grandiflorum L., Solanum e lianas), foram analisados pelas técnicas de compatibilidade somática (SCG - Somatic Compatibility Group), através de reações de compatibilidade e/ou incompatibilidade, o uso de gel de eletroforese de proteínas totais, velocidade de crescimento, ELISA e Western Blot. Os diversos isolados foram agrupados com base em conjuntos de dados sobre suas características genéticas, identificando-se agrupamentos de acordo com a dispersão geográfica e hospedeiros de onde foram isolados. Foram construídos dois dendogramas pelo teste de compatibilidade permitindo classificar os isolados em três grupos: i)grupo formado pelos isolados de Rondônia e Pará e ii) grupo formado pelos isolados de Rondônia, Pará e Amazonas e o iii) grupo formado pelo isolado de Mato Grosso; o segundo teste separou os isolados em dois grandes grupos: i) grupo formado pelos isolados da Bahia, Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso e Rondônia e ii) grupo formado pelo isolado do Pará. O dendograma criado pelo perfil protéico permitiu agrupar os isolados em três grupos, de acordo com o hospedeiro e região de origem: (1) grupo formado pelo isolado de Theobroma cacao de Ouro Preto D’Oeste; (2) grupo constituído pelos isolados de Theobroma cacao da Bahia e os diversos isolados de Solanaceae do Estado de Minas Gerais, Bahia e São Paulo e grupo (3) formado pelo isolado de Lianas (cipós). De forma geral, conclui-se que há ampla diversidade genética entre os isolados de C. perniciosa provenientes das diferentes regiões brasileiras e em relação aos hospedeiros, comprovando-se haver elevada capacidade adaptativa caracterizada pela prevalência em ambientes diversos e pela disseminação a longas distâncias geográficas. Há também indicativos de que a velocidade de crescimento do fungo pode ser um dos fatores importantes para assegurar a colonização, já que é correlacionada com a dispersão geográfica, e também, para a seleção de biótipos patogênicos e para a variabilidade genética do fungo. / The genetic diversity of Crinipellis perniciosa was evaluated how much to the capacity of adaptation of different genotypes to the geographic dispersion and the preferential or distinguishing association with hosts. Polisporics isolated of C. perniciosa proceeding from different Brazilian States (AM, RO, MG, BA, SP, MT e PA) and different hosts (Theobroma cacao L., Solanum cernuum, Solanum paniculatum, Solanum grandiflorum L., Solanum and lianas), had been analyzed by the techniques of somatic compatibility (SCG - Somatic Compatibility Group), through reactions of compatibility and/or incompatibility, the gel use of proteins electrophoresis, speed of growth, ELISA and Western Blot. Diverse the isolated ones had been grouped on the basis of different data on its genetic characteristics, identifying to groupings in accordance with the geographic dispersion and hosts of where they had been isolated. Two dendrogramas for the compatibility test had been constructed allowing to classify the isolated ones in three groups: i)group formed by isolated of Rondônia and Pará and ii) group formed for the isolated ones of Rondônia, Pará and Amazonas and iii) group formed for the isolated one of Mato Grosso; as the test separated the isolated ones in two great groups: i) group formed for isolated of the Bahia, the Minas Gerais, São Paulo, Mato Grosso and Rondônia and ii) group formed for the isolated one of Pará. The dendrograma created by the protein profile allowed to group the isolated ones in three groups, in accordance with the host and region of origin: (1) group formed for isolated of Theobroma cacao of Ouro Preto D'Oeste; (2) group consisting of isolated of Theobroma cacao of the Bahia and diverse the isolated ones of Solanaceae of the State of Minas Gerais, Bahia and São Paulo and group (3) formed by the isolated one of Liana. Of general form, it is concluded that it has ample genetic diversity enters the isolated ones of C. perniciosa proceeding from the different Brazilian regions and in relation to the hosts, proving to have high capacity of adaptation characterized by the prevalence in diverse environments and the dissemination the long geographic distances. It has also indicative of that the growth speed can be one of the factors important to assure the correlated settling since with the geographic dispersion, favors new biotypes, important factor for the genetic variability of fungus.

A podridão floral dos citros (PFC) é uma doença causada pelo fungo Colletotrichum acutatum responsável por causar grandes danos à produção de citros no Brasil. A doença surge apenas em botões florais com 8mm de comprimento ou maiores, levando a formação de lesões alaranjadas nas pétalas, lesões necróticas no estigma, promove a queda prematura dos frutos e a retenção do cálice e pedúnculo, sendo este último sintoma denominado estrelinha. Este trabalho tem por objetivo: observar o modo de penetração do fungo no hospedeiro Citrus sinensis Valência e os estágios posteriores da colonização, verificar se há fatores estruturais e químicos pré-formados que expliquem o porquê do fungo não conseguir infectar botões florais com menos de 8mm, caracterizar anatomicamente o sintoma estrelinha e estigmas lesionados, investigar ultraestruturalmente pétalas inoculadas, analisar se há o estabelecimento de uma infecção quiescente nos tecidos foliares, analisar grãos de pólen após a inoculação in vivo e in vitro com o fungo. Botões florais sadios, pétalas e estigmas com e sem lesões, foram submetidos às técnicas convencionais de microscopia de luz e eletrônica. Folhas e grãos de pólen foram inoculados e analisados. Foi desenvolvida uma nova técnica de coloração para tecidos vegetais infectados por fungos. A resistência dos botões florais menores que 8mm pode estar associada às barreiras químicas e estruturais pré-formadas. O ápice, nesses botões, apresenta papilas entremeadas, cristais de oxalato de cálcio no mesofilo e câmara subestomática e cavidades de óleo localizadas muito próximas umas das outras. Botões com 8mm e 12mm possuem, no ápice, papilas com arranjo frouxo, ausência de cristais e maior distanciamento entre as cavidades de óleo. No ápice da pétala, verificou-se que as células papilosas são osmóforos. No sintoma estrelinha, nota-se sob a região de abscisão do ovário a instalação de um meristema de cicatrização. A lignificação das paredes das células da medula do receptáculo e do pedúnculo floral está associada à retenção destas estruturas na planta. Nas pétalas infectadas, o C. acutatum pode penetrar intra, intercelularmente e via estômato. O fungo pode crescer de modo subcuticular e intramural e coloniza todos os tecidos da pétala. A nova técnica de coloração se mostrou muito útil nas análises histopatológicas. O fungo associa-se aos tecidos vasculares. Acérvulos ocorrem em ambas as faces das pétalas. A cutícula nos estágios mais avançados da lesão apresenta-se alterada, ou seja, ocorre a perda da ornamentação estriada e maior deposição de material lipofílico. A síntese de materiais lipofílicos envolve o retículo endoplasmático liso e rugoso e plastídios. Vesículas provenientes de dictiossomos e de corpos multivesiculares são observadas ao longo da parede celular e estão associadas ao depósito de material lipofílico na cutícula. No estigma lesionado há a formação de uma camada de proteção. O fungo apresenta quimiotropismo e cresce em direção aos grãos de pólen infectando-os 24 horas após a inoculação. Sugere-se que C. acutatum pode utilizar grãos de pólen para a sua dispersão. Após 48 horas da inoculação as folhas apresentam conídios germinados com apressórios. / The postbloom fruit drop (PFD) is a disease caused by Colletotrichum acutatum responsible for causing great damage to citrus crops in Brazil. The disease appears only in flower buds 8 mm in length or greater, leading to orange lesions in petals, necrotic lesions on the stigma, promoting the young fruit drop and the retention of the calyx and peduncle, which is called buttons. In this context, this study aimed to: observe the fungus penetration mode into the host Citrus sinensis \'Valência\' and the later stages of colonization; study the presence of preformed structural and chemical factors to explain why the fungus cannot infect floral buds with less than 8 mm in length; characterize anatomically the symptom \"buttons\" and injured stigmas; investigate the ultrastructural changes in tissues of inoculated petals; analyze whether there is the establishment of a quiescent infection in leaf tissues, analyze pollen grains after inoculation in vivo and in vitro with the fungus. Healthy buds, petals and stigmas with and without lesions, were processed and analyzed using conventional light and electron microscopy techniques. Leaves and pollen grains were also inoculated and analyzed with light microscopy. It was developed a new staining method for fungal-infected plant tissues. The resistance of flower buds smaller than 8mm may be associated with preformed structural and chemical barriers. These buttons display the apex with interspersed papillae, with crystals in mesophyll and substomatic chamber and oil cavities, which are located very close to each other on the abaxial surface. In 8mm and 12mm flower buds, the papilas in the apex become weakly interspaced, the crystals are not observed and there is the increase of the distance between the oil cavities. The papillose cells are osmophores. In the symptom \"button\", it is noted in the abscission of the ovary, an installation of wound meristem. There is also the lignification in the pith of receptacle and pedicel that can be associated with the retention of these structures in the plant. In infected petals, it was found that C. acutatum can penetrate intra and intercelullar or via stomata. The fungus may grow subcuticular and intramural and colonize all tissues of petal. The new staining technique developed has proved very useful for histopathological analysis. The fungus is closely associated with vascular tissues. The acervulli occur on both surfaces of petals. The cuticle in the later stages of the lesion is altered, i.e., there is loss of striated ornamentation and increased deposition of lipophilic material. The synthesis of lipophilic materials involves rough and smooth endoplasmic reticulum and plastids. Vesicles from dictyosomes and multivesicular bodies were observed throughout the cell wall and are associated with the deposit of lipophilic material in the cuticle. There is the formation of protective layer over the stigma damaged area. The fungus shows chemotropism and grows toward the pollen infecting it 24 hours after inoculation. It is suggested that C. acutatum can use pollen grains for dispersal. After 48 hours of inoculation, the leaves have germinated conidia with appressoria.