O câncer é um problema de saúde pública, especialmente entre os países em desenvolvimento. Está entre as doenças de maior taxa de mortalidade e é responsável por mais de 12% de todas as causas de óbito no mundo. Uma proteína denominda Amblyomin-X foi obtida a partir de uma biblioteca de cDNA das glândulas salivares do carrapato Amblyomma Cajennense e expressa na bactéria Escherichia coli BL21DE3. Essa proteína é capaz de induzir a morte de células tumorais, além de ter pouca ou nenhuma atividade contra células normais, diminuindo assim os efeitos colaterais nos pacientes em tratamentos contra o câncer. Através deste trabalho foi possível elaborar um protocolo para obtenção de elevadas concentrações celulares e produção da proteína recombinante AmblyominX em biorreatores com capacidade total de 15 L. Uma vez que a proteína é intracelular, foram estudados alguns parâmetros e estratégias de cultivo do microrganismo para obtenção de alta concentração celular, tais como: composição do meio de cultura, identificação dos substratos limitantes e inibitórios e vazão de alimentação da fonte de carbono. Foi definido um meio de cultura adequado para atingir elevadas concentrações celulares na etapa de crescimento da E. coli, visando garantir elevadas concentrações de produto recombinante. Ensaios conduzidos em biorreatores com esse meio resultaram em concentrações celulares e densidade ótica (DO600nm) iguais a 40,0 g/L e 76,6, respectivamente, para a etapa de crescimento celular e 59,8 g/L e 161, respectivamente, no final da etapa de produção da proteína de interesse. Os ensaios conduzidos em reatores mostraram que concentrações de ácido acético acima de 0,4 g/L causam inibição do crescimento celular, portanto, foi elaborada uma estratégia eficaz de alimentação exponencial dos substratos limitantes (fontes de carbono e magnésio) na etapa de crescimento dessa bactéria para atingir elevadas concentrações celulares, mantendo-se a velocidade específica de crescimento (µx) menor que 0,2 h-1, abaixo do valor máximo, com a finalidade de evitar a formação de ácido acético. Este trabalho permitiu também conhecer os parâmetros cinéticos para a produção da proteína Amblyomin-X, tais como, a velocidade específica máxima de crescimento (max), a produtividade celular global (Pxglobal), a produtividade celular máxima (Pxmáx) e o fator de conversão de substrato em célula (Yx/s) na etapa de batelada alimentada, cujos valores foram, respectivamente, de 0,30 h-1, 13,8 g de célula/h, 14,1 g de célula/h e 0,37 g de célula/g de substrato. Para a avaliação da biossíntese da proteína recombinante foram realizadas análises de gel de poliacrilamida por eletroforese e a quantificação foi feita pela análise de Bradford. A concentração de proteína Amblyomin-X no final da etapa de síntese alcançou 8,57 g/L. / Cancer is a public health problem, especially among developing countries. It is among the diseases with the highest mortality rate and accounts for more than 12% of all causes of death in the world. A protein called Amblyomin-X was obtained from a cDNA library of Amblyomma Cajennense tick salivary glands and it was expressed in the bacterium Escherichia coli BL21DE3. This protein is able to induce death of tumor cells, as well as having little or no activity against normal cells, thus reducing the side effects in patients on cancer treatments. In this work it was possible to elaborate a protocol for obtaining high cellular concentrations and production of the recombinant Amblyomin-X protein in bioreactors with a total capacity of 15 L. Since the protein is intracellular, some parameters and strategies of culture of the microorganism for obtaining a high cell concentration, were: composition of the culture medium, identification of limiting and inhibitory substrates and feed rate of the carbon source. A culture medium suitable for achieving high cell concentrations in the growth stage of E. coli was defined in order to guarantee high concentrations of recombinant product. Experiments conducted in bioreactors with this medium resulted in cellular concentrations and optical density (DO600nm) of 40.0 g / L and 76.6, respectively, for the cell growth step and 59.8 g / L and 161, respectively, at the end of the production stage of the protein of interest. Experiments conducted in reactors showed that acetic acid concentrations higher than 0.4 g/L cause inhibition of cell growth, therefore, an effective strategy of exponential feeding of the limiting substrates (carbon and magnesium sources) was elaborated in the growth stage of this bacteria to reach high cellular concentrations, maintaining the specific growth rate (µx) less than 0.2 h-1, below the maximum value, in order to avoid the formation of acetic acid. This work also allowed to know the kinetic parameters for Amblyomin-X protein production, such as the maximum specific growth rate (max), the overall cellular productivity (Pxglobal), the maximum cellular productivity (Pxmax) and the conversion factor of substrate in cell (Yx/s) in the fed batch stage, whose values were respectively 0.30 h-1, 13.8 g cell/h, 14.1 g cell/h and 0.37 g of cell/g of substrate. For the evaluation of recombinant protein biosynthesis, polyacrylamide gel analyzes were performed by electrophoresis and quantification was done by the Bradford analysis. The Amblyomin-X protein concentration at the end of the synthesis step reached 8.57 g/L.

No presente trabalho, cultivou-se o microrganismo Escherichia coli RR1, contendo o vetor que carrega o gene estrutural para a síntese do hormônio de crescimento humano (hGH) (baseado no promotor pL e pR do fago l sob controle do repressor termosensível cI857) em processos descontínuo e descontínuo-alimentado realizados em biorreatores com capacidade útil de 2 e 4 L. Tal cepa é auxotrófica com relação aos aminoácidos l-leucina e l-prolina e à tiamina (vitamina B1). Nos cultivos descontínuos com concentrações menores de extrato de levedura e bactotriptona em relação ao meio denominado basal, a concentração celular foi baixa, atingindo 2,4 g.L-1, com fator de conversão glicose à células de 0,25 g.g-1. Em cultivos descontínuos com aumento (em relação ao meio basal) da concentração de extrato de levedura e de bactotriptona e com adição de l-prolina, a concentração celular alcançou valores da ordem de 5,9 g.L-1 e fator de conversão glicose à células de 0,48 g.g-1, simultaneamente à maior formação de acetato (2,5 g.L-1), este último prejudicial ao processo. Contudo, este resultado de crescimento celular não se repetiu devido a mudança do lote de células utilizado entre o primeiro e o segundo conjunto de ensaios. Os cultivos descontínuos-alimentados foram realizados com diferentes formas de alimentação bem como diferentes composições de solução de alimentação. Uma alimentação contínua com velocidade exponencial e composição semelhante à do meio, pareceu ser a mais favorável, levando à concentração celular final de 9,2 g.L-1 e fator de conversão glicose a células, na fase descontínua-alimentada, de 0,36 g.g-1. Os ensaios com indução térmica não foram eficientes provavelmente devido à problemas na detecção das concentração de glicose existente no instante inicial da ativação da síntese do hGH. Esta glicose presente pode ter prejudicado a formação do hGH por conseqüência do processo fermentativo causado pelo aumento da temperatura e pela presença de elevada concentração de nutrientes complexos. O meio de cultivo utilizado possivelmente não supriu as necessidades metabólicas da célula para a síntese do hormônio de crescimento humano e em nenhum dos cultivos com indução térmica houve a produção de hGH. / In the present work, the host Escherichia coli RR1, having the vector with the structural gene for human growth hormone (hGH) synthesis, based on pL or pR promoters from bacteriophage l under the control of the thermosensitive repressor cI857, was cultivated in batch and fed-batch cultures in bioreactors with working volumes of 2 and 4 L. This host has amino acids (l-leucine and l-proline) and thiamine (Vitamin B1) auxotrophy. Batch cultures under low yeast extract and bacto-tryptone concentrations (relative to the basal medium) resulted in a low biomass yield (2.4 g.L-1) and cell yield on glucose (0.25 g.g-1). Increasing these concentrations and adding l-proline to the medium led to higher biomass formation (5.9 g.L-1), cell yield on glucose (0.48 g.g-1) and acetate high levels (2.5 g.L-1), which were harmful to the process. However, these results of cellular growth were not reproducible due to different cell stocks applied. The fed-batch cultures were performed under different feeding strategies and different nutrients concentrations of the feeding solution. A continuous exponential feeding rate with growth medium-like composition seemed to be the most favorable, reaching final cellular concentration of 9.2 g.L-1 and yield on glucose on fed-batch mode of 0.36 g.g-1. The heat-shock runs were not efficient probably due to problems in detection of glucose concentration existing on initial instant of hGH activation synthesis. Glucose interferes with the hGH synthesis because the fermentation caused by temperature shift and presence of high complex nutrients concentration. The culture medium used, probably was not able to supply cell metabolic needs for the human growth hormone synthesis and in no other temperature-induced experiment the hGH production was observed.

Streptococcus pneumoniae é o patógeno causador de diversas doenças com alta mortalidade e morbidade, como meningite e pneumonia. As vacinas disponíveis baseiam-se na resposta contra o polissacarídeo capsular (PS), porém possuem elevado custo e cobertura limitada aos sorotipos vacinais. O objetivo deste estudo foi avaliar a eficácia da imunização nasal com PspAs recombinantes de família 1 (rPspA1 e rPspA2) e de família 2 (rPspA3, rPspA4 e rPspA5) em um modelo de cocolonização da nasofaringe de camundongos, utilizando isolados que expressam diferentes PspAs (PspA1 ao PspA4). Esse modelo visa analisar a eficácia da vacinação frente à exposição a diferentes pneumococos, uma situação comum, especialmente em crianças. Os experimentos deste projeto avaliaram a colonização com misturas de isolados dos sorotipos 6B e 23F e expressando PspA1, PspA2, PspA3 ou PspA4, mostrando uma análise ampla da cobertura vacinal contra pneumococo das diferentes formulações contendo as variantes do antígeno PspA e a importância desse antígeno para o desenvolvimento de uma nova vacina. / Streptococcus pneumoniae is the cause of several diseases with high mortality and morbidity, such as meningitis and pneumonia. The available vaccines are based on the response against the capsular polysaccharide (PS), but they have a high cost and coverage restricted to the vaccine serotypes. The purpose of this study was to evaluate the efficacy of nasal immunization with recombinant PspAs from family 1 (rPspA1 and rPspA2) and from family 2 (rPspA3, rPspA4 and rPspA5) in a model of co-colonization of the mouse nasopharynx, using isolates expressing different PspAs (PspA1 to PspA4). This model aims to analyze the effectiveness of vaccination upon exposure to different pneumococci, a common situation, especially in children. The experiments in this project assessed colonization with mixtures of isolates of serotypes 6B and 23F, expressing PspA1, PspA2, PspA3 or PspA4, showing a wide vaccination coverage analysis of different formulations containing the PspA variants against pneumococcus and the importance of this antigen to the development of a new vaccine.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-β1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-β1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-β1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-β1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-β1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-β1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-β1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-β1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-β1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-β1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-β1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-β1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-β1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-β1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-β1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-β1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-β1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

A lagarta L. obliqua tem se destacado por apresentar em sua hemolinfa proteínas com atividade biológica demonstrada em cultivos celulares. A literatura disponível não apresenta trabalhos sobre a expressão da proteína antiapoptótica de L. obliqua, então este estudo objetiva a clonagem e expressão da proteína antiapoptótica presente na hemolinfa de L. obliqua, em sistema bacteriano Escherichia coli. O RNAm extraído do tegumento de L. obliqua deu origem a um cDNA obtido por RT-PCR, o qual foi clonado em vetor pCR II-TOPO para posterior transformação de bactérias E. coli JMQC. Na expressão heteróloga, o fragmento foi subclonado em vetor pET28a e transformadas bactérias E. coli BLQC. A indução de expressão foi realizada com IPTG 1 mM. A APLOrEC purificada por cromatografia foi identificada por Western Blot. A atividade biológica da APLOrE foi analisada em células VERO e L929 após indução de morte e verificou-se que esta protegeu os cultivos induzidos com 4mM de H2O2 portanto, eficaz na manutenção estrutural do citoesqueleto destas células. / The caterpillar L. obliqua has become known for performing in their hemolymph proteins with biological activity demonstrated in cell cultures. The available literature does not provide studies on the expression of antiapoptotic protein L. oblique, so this study aims cloning and expression of anti-apoptotic protein present in the hemolymph of L. oblique, bacterial system in Escherichia coli. The extracted mRNA L. obliqua husk gave a cDNA obtained by RT-PCR, which was cloned into pCR II-TOPO vector for subsequent transformation of E. coli bacteria JMQC. The heterologous expression, the fragment was subcloned into pET28a vector and transformed E. coli bacteria BLQC. The induction of expression was performed with 1 mM IPTG. The APLOrEC purified by chromatography was identified by Western blot. The biological activity was examined in APLOrE VERO and L929 cells after death induction, and it was found that this protected crops H2O2 induced with 4mM therefore effective in the structural maintenance of the cytoskeleton of such cells.

Enquanto as células humanas sintetizam purinas pela via de novo e pela via de recuperação, protozoários parasitas as sintetizam somente pela via de recuperação. Por essa razão, as enzimas que compõem essa via são importantes alvos para o desenvolvimento de novas drogas antiparasitárias. A enzima APRT converte adenina e &#945-D-5-fosforibosil 1-pirofosfato (PRPP) a AMP na via de recuperação de purinas. Nesse trabalho, a APRT e a APRT-His recombinantes foram caracterizadas por métodos bioquímicos e espectroscópicos. As expressões do gene aprt contidos nos vetares pET29+ (Novagen) e pQE30 (Qiagen) renderam 5 e 10 mg.mL-1 de APRT e APRT-His, respectivamente, na forma solúvel. A APRT permaneceu estável e homogênea in vitro em Tris pH 7,5 contendo 5 mM de MgSO4 e 150 mM de KCl mas a APRT-His mostrou-se instável e insolúvel nesse pH e acima de 0,5 mg.mL-1. O estudo de solubilidade revelou que a APRT-His é parcialmente estabilizada em Tris pH 8,5 contendo 150 mM de KCl devendo ser purificada e mantida nesse tampão durante os ensaios espectroscópicos e a adição de 50 mM de histidina mostrou-se eficiente para a concentração da enzima até 8mg.mL-1. A caracterização bioquímica da APRT e da APRT-His revelou que elas são diméricas nos seus tampões e têm PI igual a 6,45 &#177 0,20 e 7,7 &#177 0,16, respectivamente. Os ensaios de atividade enzimática indicaram que a APRT é duas vezes mais ativa do que a APRT-His. Os espectros de CD da APRT-His foram mais intensos do que os espectros da APRT e mostraram perfil de hélice &#945 . Os resultados da desconvolução revelaram que a APRT-His tem cerca de 10% mais hélice-&#945 do que a APRT. O valor de teor de estrutura secundária da APRT equivale aos valores extraídos dos dados cristalográficos da APRT de L donovani e de L tarentolae. Os espectros de emissão de fluorescência mostraram que a APRT-His e a APRT possuem máximos de emissão em 342 e 332 nm, respectivamente. Além disso, eles indicaram que o PRRP e o AMP suprimem a fluorescência do Trp presente na APRT. A supressão foi relacionada à posição dos ligantes localizados no sítio ativo da enzima e a ausência de supressão nas amostras de APRT-His foi relacionada à presença de Mg2+. Os resultados indicam que a presença dos resíduos de histidina na região N-terminal da APRT-His induziu a modificação estrutural da enzima levando a precipitação contínua. Nesse sentido, a ausência dos resíduos de histidina incorporados à enzima favoreceu a estabilidade da proteína in vitro. / Human cells synthesize purine nucleotide by again and salvage pathways, while parasitic protozoa use only salvage pathways. For this reason, the enzymes that compound the salvage pathway are important targets to development of new antiparasitic drugs. The enzyme adenine phosphoribosyltransferase (APRT) converts adenine and &#945-D-5-phosphoribosyll-pyraphosphate (PRPP) to adenosine monophosphate (AMP) at salvage pathway. In this work, the APRT and APRT-His recombinants had been characterized by biochemical and spectroscopic methods. The expression of the aprt genes from L. tarentolae inserted into pET29+ (Novagen) and pQ30 (Qiagen) vectors yielded 5 and 10 mg.mL-1 of the APRT and APRT-His, on soluble form, respectively. The APRT remained stable and homogeneous in vitro at Tris pH 7.5 containing 5 mM MgSO4 and 150 mM KCl, but APRT-His was instable and insoluble above 0.5 mg.mL-1 at the same pH. The solubility study showed that histidine increased the APRT-His solubility and it is partially stabilized at Tris pH 8.5 containing 150 mM KCl. The addition of the histidine 50 mM was efficient for concentrations up to 8 mg.mL-1.Then, the APRT-His was purified and storage in that buffer for spectroscopic assays. The biochemical characterization of the APRT and APRT-His indicated that a both are dimercs in its buffers, and they have isoelectric points at pH 6.45 &#177 0.20 and 7.7 &#177 0.16, respectively. By enzymatic activity assays, the APRT is twice activer than APRT-His. The CD spectra of the APRT-His were more intense than the APRT spectra. and showed helix &#945 profile. The fluorescence spectra marked a maximum emission fluorescence at 342 nm for the APRT-His and 332 um for the APRT. In addition, the spectra revealed that PRPP and AMP quenched the fluorescence of the tryptophan (Trp) into APRT. The quench was related to position of the ligands inside active site of the enzyme and the absent of fluorescence of the Trp, inside APRT-His, was related to absent of the Mg2+. The results has demonstrated that the presence of the histidine residues at N-terminal region of the APRT-His induced to conformational changes of the enzyme following to continuos precipitation. In the same sense, the absent of histidine residues associated to enzyme favored to stability of the protein in vitro.

O HIV-1 é o agente etiológico da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) e o HTLV-I da leucemia/linfoma de célula T no adulto (ATL) e da paraparesia espástica tropical ou mielopatia associada ao HTLV (HAM/TSP), principalmente. Ambos são retrovírus com genoma RNA e possuem o gene gag que codifica as proteínas p24 (HIV-1 e HTLV-1) e p19 (HTLV-1) que formam o capsídeo e a matriz do vírus, respectivamente, e o gene env que codifica as proteínas gp41 e gp120 (HIV-1) e gp21 e gp46 (HTLV-1) que compõem o envelope viral. Os primeiros anticorpos produzidos nas infecções por ambos os vírus são destinados a essas proteínas e os diferentes testes diagnósticos disponíveis no mercado usam uma combinação dessas proteínas virais. O diagnóstico precoce é de extrema importância para o controle da epidemia, tratamento dos indivíduos e planejamento dos gastos com saúde pública. Os kits diagnósticos usados em laboratórios clínicos, bancos de sangue e hospitais brasileiros para o diagnóstico destas viroses são na sua maioria de empresas estrangeiras e o Brasil despende milhares de reais importando esses materiais. No Brasil, há a necessidade e incentivo para a produção de sistemas de diagnóstico com tecnologia nacional. Neste trabalho, os genes das proteínas p24, gp41 e gp120 do HIV-1 e p19 do HTLV-1 foram clonados com sucesso em diferentes vetores e em diferentes linhagens de E. coli, porém essas proteínas não foram expressas. As proteínas gp21, p24 e gp46 do HTLV-1 foram produzidas em bactérias BL21(DE3) com vetor pET28a(+). Essas três proteínas foram solubilizadas dos corpos de inclusão, purificadas por IMAC e identificadas pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. As proteínas recombinantes gp21, p24 e gp46 foram reconhecidas pelos soros de indivíduos com HTLV-1 e não foram reconhecidas por soros de indivíduos com HIV-1 e saudáveis, o que confere a elas especificidade e grande potencial diagnóstico. Os resultados deste trabalho são os primeiros passos para atingir o objetivo maior de produzir todas as sete proteínas em maior escala e, por fim, chegar a produção de um kit diagnóstico sensível, específico e barato com tecnologia nacional, diminuindo os gastos com a importação destes produtos e fomentando a indústria biotecnológica nacional. / HIV-1 is the etiologic agent of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) and HTLV-I is the cause of adult T-cell leukemia/lymphoma (ATL) and HTLV-I-associated myelopathy or tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). Both are retroviruses with RNA genome and possess the gene gag and env. The gag gene encodes for p24 protein (HTLV-1 and HIV-1) and p19 (HTLV-1) forming the viral capsid and matrix, respectively, and the env gene encodes for proteins gp120 and gp41 (HIV-1) and gp21 and gp46 (HTLV-1) making the viral envelope. The first antibodies produced in infections by both viruses are against these proteins and the various diagnostic tests on the market use a combination of those viral proteins. Early diagnosis is extremely important to control the epidemia, treatment of individuals and planning of public health expenditures. The diagnostic kits used in clinical laboratories, blood banks and in Brazilian hospitals for the diagnosis of these viruses are mostly from foreign companies. Brazil spends thousands of reais importing these materials. In Brazil, there is a need and incentive for the production of diagnostic systems with national technology. In this study, the genes of p24, gp41 and gp120 of HIV-1 and p19 of HTLV-1 have been successfully cloned in different vectors and different strains of E. coli, but these proteins were not expressed. The proteins gp21, gp46 and p24 of HTLV-1 were produced in bacteria BL21 (DE3) with vector pET28a (+). These three proteins were solubilized from inclusion bodies, purified by IMAC and identified by Western blotting techniques and mass spectrometry. The recombinant proteins gp21, p24 and gp46 were recognized by sera from patients with HTLV-1 and were not recognized by sera from individuals with HIV-1 and healthy people, which gives them great specificity and diagnostic potential. These results are the first steps to achieve the ultimate goal of producing all seven proteins on a larger scale and finally get the production of a diagnostic kit sensitive, specific and cheap with national technology, reducing spending on imports of these products and fostering the national biotechnology industry.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2017-06-07T14:31:32Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) / Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2017-06-08T13:00:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-08T13:00:56Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Ana Muñoz Vianna.pdf: 2420695 bytes, checksum: 23ce0fe8a151274827065f7b3c62e03a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-02-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / A theileriose, doença endêmica no Brasil, é uma piroplasmose causada pelo protozoário intraeritrocitário, Theileria equi. Provoca perdas associadas tanto a fatores clínicos como a restrição ao trânsito de animais soropositivos. A transmissão de T. equi ocorre principalmente no repasto do carrapato, o qual inocula suas formas infectantes (esporozoítos) nos equídeos, que são os hospedeiros vertebrados. O diagnóstico e a prevenção desta enfermidade se fazem necessários em áreas endêmicas e não endêmicas devido à disseminação dos vetores e do protozoário e de sua alta prevalência. Diferentes plataformas de ELISAs têm sido desenvolvidas com a utilização de antígenos recombinantes. A proteína de superfície de merozoíto EMA-2 é liberada no citoplasma e na membrana do eritrócito, sugerindo ser um dos primeiros antígenos reconhecidos pelo sistema imune. O objetivo desse estudo foi avaliar a proteína EMA-2 de Theileria equi, expressa em Pichia pastoris, como imunobiológico. Após expressão da glicoproteína EMA-2 foi desenvolvido um ELISA indireto. O ELISA demonstrou sensibilidade de 90,9% e especificidade de 83,3% quando comparado ao kit comercial de cELISA. A proteína também demonstrou imunogenicidade ao testarmos soros de camundongos imunizados com EMA-2 recombinante, por imunofluorescência. Sendo a proteína EMA-2 antigênica e imunogênica, poderá ser usada, além dos testes de diagnóstico, como antígeno para o desenvolvimento de vacinas de subunidade. / Theileriosis, endemic disease in Brazil, is a piroplasmosis caused by intra-erythrocytic protozoan, Theileria equi. Causes losses associated with both clinical factors and restriction on the movement of positive animals. Transmission of T. equi occurs mainly during tick feeding which inoculates their infective forms (sporozoites) in horses, which are the vertebrate hosts. The diagnosis and prevention of this disease is needed in endemic and non endemic areas due to the presence of vectors and protozoa. Different ELISAs platforms have been developed using recombinant antigens. EMA-2 is released into the cytoplasm and erythrocyte membrane, suggesting that one of the first antigens recognized by the immune system. The aim of this study was to evaluate the EMA-2 protein of Theileria equi, expressed in Pichia pastoris, as immunobiological. After expression of EMA-2 glycoprotein, an indirect ELISA was developed. The ELISA demonstrated sensitivity of 90.9% and specificity of 83.3% when compared to the commercial kit cELISA. The protein also showed immunogenicity when test the sera of immunized mice with recombinant EMA-2 by immunofluorescence. As the EMA-2 protein antigenic and immunogenic, it may be used diagnostic tests as well as a promising antigen for the development of subunit vaccines.

A leucemia linfóide aguda (LLA) é considerada uma doença grave dos glóbulos brancos, sendo mais comum e mais agressiva em crianças e adolescentes. O tratamento para a LLA tem avançado devido aos estudos para a otimização de drogas já utilizadas em quimioterapias. Entre essas drogas estão as enzimas L- asparaginases (ASPases) que atuam reduzindo a concentração de L-asparagina (Asn) na corrente sanguínea, impedindo a proliferação das células cancerosas, visto que essas não conseguem sintetizar quantidades apropriadas desse aminoácido. No entanto, o medicamento por ser oriundo de um procarioto causa severas reações alérgicas aos usuário, afim de diminuir a imunogenicidade deste quimioterápico, é importante gerar um biofármaco oriundo de um eucarioto. Neste âmbito, obtivemos a Pichia pastoris recombinante responsável pela produção da enzima ASPase intermembranar, oriunda do gene ASP3 de Saccharomyces cerevisiae. Através do planejamento experimental, foi possível ter um aumento de 5 vezes na atividade obtida na condição inicial. O clone Mut+ alcançou sua melhor atividade de 8,6 U/g de célula nas seguintes condições: 20°C, pH inicial 6 e 1,5% de concentração de indutor. / Acute lymphoblastic leukemia (ALL) is considered a serious disease of white blood cells, is more common and more aggressive in children and adolescents. Treatment for ALL has advanced due to studies for drug optimization already used in chemotherapy. Among these drugs are the enzymes L-asparaginases (ASPases) which act by reducing the concentration of L-asparagine (Asn) in the bloodstream, preventing the proliferation of cancer cells, since these can not synthesize appropriate amounts of this amino acid. However, the drug to be derived from a prokaryote causes severe allergic reactions to the user, in order to decrease the immunogenicity of the chemotherapy, it is important to generate a biopharmaceutical derived from a eukaryote. In this context, we obtained the recombinant Pichia pastoris responsible for producing the enzyme ASPase intermembrane, coming from the ASP3 gene of Saccharomyces cerevisiae. Through the experimental design, it was possible to have a 5-fold increase in activity obtained at the initial condition. The Mut + clone achieved their best activity of 8.6 U/g cell under the following conditions: 20 °C, initial pH 6 and 1.5% of inducer concentration.