Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2012-05-21T16:16:48Z No. of bitstreams: 1 2012_JaquesMirandaFerreiraSouza.pdf: 1466502 bytes, checksum: a3e11d9bfc528999e781e05214053d36 (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2012-05-23T11:44:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JaquesMirandaFerreiraSouza.pdf: 1466502 bytes, checksum: a3e11d9bfc528999e781e05214053d36 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-05-23T11:44:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JaquesMirandaFerreiraSouza.pdf: 1466502 bytes, checksum: a3e11d9bfc528999e781e05214053d36 (MD5) / Aprendizagem associativa pode ocorrer por condicionamento operante, através do qual o animal consegue antecipar eventos futuros baseado em suas experiências como consequências de seus próprios comportamentos. Trata-se de uma forma de aprendizagem que o homem compartilha com outros animais, incluindo invertebrados. O uso de ratos e abelhas como modelos biológicos em estudos comportamentais tem ajudado na compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na aprendizagem por condicionamento operante. O objetivo desse trabalho foi identificar proteínas envolvidas no processo de aprendizagem por meio de análises proteômicas cerebrais de abelha mandaçaia (Melipona quadrifasciata) e rato (Rattus norvegicus). Neste trabalho, foram padronizadas condições para separação de extratos cerebrais de abelhas por meio de eletroforese bidimensional (2DE). Os perfis que apresentaram melhor resolução de spots proteicos foram obtidos com as seguintes condições: concentração de anfólitos a 1,5 %, CHAPS a 1 % e reposição de DTT no cátodo durante a isoeletrofocalização. Proteomas cerebrais de abelhas treinadas por condicionamento operante e controles foram comparados através de DIGE, mas nenhuma diferença de expressão proteica foi observada até o momento. Em relação a ratos, o primeiro mapeamento em grande escala por LC-MS/MS de proteomas de córtex pré-frontal de rato foi realizado, até onde sabemos. Foi possível identificar 923 proteínas, valor seis vezes maior quando comparado a outros estudos presentes na literatura. As proteínas identificadas foram categorizadas de acordo com sua localização e função biológica. A localização subcelular assim se dá: 21 % citosol, 18 % membrana plasmática, 13% mitocôndrias, 10 % núcleo, 8% citoesqueleto, 6 % complexo de Golgi ou retículo endoplasmático, 3 % proteínas extracelulares, 3 % outras organelas e 18 % de proteínas intracelulares. Entre as proteínas identificadas no córtex pré-frontal podemos destacar quatro delas como sendo descritas com envolvimento em processos de aprendizagem : contactin-2, calbindin, subunidade gamma da proteína quinase c (PKCgamma) e gp78. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Associative learning can occur by operant conditioning, when the animal can anticipate future events based on his experiences as a consequence of their own behaviour. That is a form of learning that humans share with others animals, including invertebrates. The use of rats and bees as biological models in behavioural studies have helped in understanding the molecular mechanisms involved in learning by operant conditioning. The aim of this study was to identify proteins related to the learning process through proteomic analysis of brains from "mandacaia" bee (Melipona quadrifasciata) and rat (Rattus norvegicus). In this study, conditions for separation of bee brain extracts by two-dimensional electrophoresis (2DE) were optimized. The profiles showing better protein spots resolution were obtained with the following conditions: 1,5% ampholytes concentration, 1% CHAPS and DTT replacement in the cathode during isoeletric focusing. Brain proteomes of bees trained by operant conditioning and control groups were compared by DIGE, but no difference in protein expression was observed so far. For rats, the first large-scale LC-MS/MS mapping of prefrontal cortex proteomes was achieved to our know ledge. A total of 923 proteins was identified, a value six times higher than other studies in the literature. The identified proteins were categorized according to their location and biological function. The subcellular localizations were 21% cytosol, 18% plasma membrane, 13% mitochondria, 10% nucleus, 8% cytoskeleton, 6% endoplasmic reticulum and Golgi complex, 3% extracellular proteins, 3% other organelles and 18% other intracellular proteins. Among the proteins identified in the prefrontal cortex, four of them can be highelihted as they are described in the literature as involved in learning processes: 2-contactin, calbindin, gamma subunit of protein kinase c (PKCgamma) and gp78.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2015. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-21T18:16:21Z No. of bitstreams: 1 2015_ MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3285845 bytes, checksum: 93709babd1c56f8cfed907b5c6c1318d (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-05-22T11:49:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_ MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3285845 bytes, checksum: 93709babd1c56f8cfed907b5c6c1318d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T11:49:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_ MarcosViniciusPereiraGondim.pdf: 3285845 bytes, checksum: 93709babd1c56f8cfed907b5c6c1318d (MD5) / A modulação de CD4 é uma das principais características da infecção por HIV e Nef desempenha um papel importante neste processo. Foi observada uma clara relação entre a degradação do receptor viral CD4, com o aumento da infecciosidade e a replicação viral, sugerindo a participação deste fenômeno na patogênese e progressão da infecção. No entanto, os mecanismos envolvidos na internalização e degradação de CD4 mediada por Nef não são totalmente compreendidas e diferentes proteínas celulares têm sido apontadas como importantes parceiros celulares de Nef. Nef agiria na superfície celular como um conector da cauda citoplasmática da molécula CD4, com membros do complexo adaptador heterotetramérico de clatrina, redirecionando a molécula CD4 para vesículas endocíticas. Uma bomba de prótons vacuolar (V-ATPase) e a proteína Epsn15 foram envolvidas no aumento da força de ligação Nef e a subunidade μ2 de AP-2. Com a finalidade de evitar a reciclagem de CD4 para a superfície celular, uma segunda conexão entre CD4 e a proteína β-COP é estabelecida por Nef, o que permitiria direcionar o receptor para degradação lisossômica. Adicionalmente, duas proteínas foram também envolvidas no mecanismo a tioesterase humana II (hTE-II/AcoT8) e a dinamina 2 (Dyn2). Entretanto experimentos para validar a relevância fisiológica dessas proteínas não foram conclusivos. Neste trabalho, pretendemos determinar a relevância fisiológica das proteínas: AP1, AP2, AP3, VH1 ATPase vacuolar, β-COP e AcoT8, na modulação de CD4 mediada por Nef, em linhas de células T e linfócitos T CD4+ de sangue periférico, infectados pelo HIV-1 . Primeiramente, análises de FRET-FACS entre alelos de Nef e as proteínas celulares apresentaram diferentes níveis de interação. O receptor CD4 mostrou variáveis níveis de interação com os alelos de Nef, NA7, NL4.3 e Mac239 (39%, 15% e 13%, respectivamente) e uma forte interação com as proteínas Ap2, β-COP (50,4%, 32% respectivamente). Por outro lado os alelos de Nef mostraram interagir principalmente com Ap2, β-COP e AcoT8, este ultimo apenas com o alelo NA7. Experimentos de microscopia confocal confirmaram os resultados obtidos por FACS-FRET mostrando em alguns casos alterações claras na localização subcelular destas proteínas. Finalmente, o silenciamento da expressão endógena das proteínas celulares na linha de célula T SupT-1 e em linfócitos primários CD4+ mostrou a proteína AP2 como sendo necessária e suficiente para a modulação de CD4 mediada por Nef. / Down-modulation of CD4 is one of the hallmarks of HIV infection and Nef plays a major role in this process. Has been observed a clear relation between the CD4 viral receptor degradation with the infectivity and viral replication, which suggest the high relevance of this mechanism during the pathology and infection progress. However, the exact mechanisms governing Nef mediated internalization and degradation of CD4, are incompletely understood and different cellular proteins have been suggested as key players. Nef would act on the cell surface as a connector in cytoplasmic tail of CD4 molecule with members of heterotetrameric clathrin adapter complex, redirecting the CD4 molecule for endocytic vesicles. Vacuolar proton pump (V-ATPase) and Epsn15 protein would be involved enhancing the strength binding of Nef on subunit μ2 of AP-2. In order to avoid recycling of CD4 to the cell surface, a second connection between CD4 and β-COP is established by Nef protein, which would direct the receptor to lysosomal degradation. Additionally, two proteins were also involved in the mechanism human thioesterase II (hTEII/AoT8) and dynamin 2 (DYN2). However experiments to validate the physiological relevance of these proteins were not conclusive. In this work, we aim to address the physiological relevance of AP1, AP2, AP3, VH1 vacuolar ATPase, β-COP and AcoT8 for Nef mediated down-modulation of CD4 receptor in T-cell lines, and infected primary isolated CD4 positive cells. First, FRET-FACS analyses with different Nef HIV-1 strains showed different levels of interaction. The receptor CD4 shown variable level of interaction with Nef alleles; NA7, NL4.3 and Mac239 (39%, 15% e 13%, respectively) and a strong interaction with Ap2, β-COP (50,4%, 32% respectively). On other hand, the alleles shown interacts mainly with Ap2, β-COP, and AcoT8 (only with NA7 alleles). Confocal microscopy experiments confirmed FACS-FRET results showing clear changes in subcellular localization of these proteins. Finally, endogenous cellular proteins knock-down experiments by RNA interference in transduced SupT1 and primary lymphocyte CD4+ cells showed AP2 protein as being necessary and sufficient for Nef CD4 down-modulation.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2017. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2017-06-21T15:23:09Z No. of bitstreams: 1 2017_FelipeSilvaRedorat.pdf: 3524406 bytes, checksum: e6d1df094ec3fee8264548d8fca4c1d4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-07-31T16:42:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_FelipeSilvaRedorat.pdf: 3524406 bytes, checksum: e6d1df094ec3fee8264548d8fca4c1d4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-31T16:42:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_FelipeSilvaRedorat.pdf: 3524406 bytes, checksum: e6d1df094ec3fee8264548d8fca4c1d4 (MD5) Previous issue date: 2017-07-31 / No Brasil o câncer de pâncreas representa 2% de todos os tipos de câncer, sendo responsável por 4% do total de mortes por essa doença. Seu tratamento raramente se restringe a remoção cirúrgica do tumor devido a elevada agressividade desta doença. Para a maioria dos casos a alternativa terapêutica é a cirurgia e/ou a quimioterapia associada ou não a radioterapia. O câncer de pâncreas é uma doença silenciosa com diagnóstico geralmente tardio, o que dificulta significativamente o tratamento devido a presença de metástases. Este fator também contribui decisivamente para um pobre prognóstico e uma sobrevida após o diagnóstico bastante reduzida, variando de seis a dezoito meses para um grande número de casos. As drogas de primeira escolha para serem utilizadas na quimioterapia desse tipo de câncer, Gencitabina e o 5-fluoracila (5-FU), atuam interferindo com a capacidade celular de sintetizar seu DNA, e assim inibindo a mitose e induzindo a morte celular por apoptose. Em razão dos mecanismos de ação destes fármacos causarem elevada toxicidade para todas as células, o tratamento do câncer de pâncreas está associado a diversos efeitos adversos severos como por exemplo a pancitopenia. Apesar dos avanços terapêuticos para o tratamento do câncer, o câncer de pâncreas persiste como o grande desafio, necessitando urgentemente de alternativas terapêuticas centrais e adjuvantes, que sejam eficientes na eliminação das células tumorais e tumorais com menos toxicidade para às células normais. Com base no acima exposto, nosso grupo passou a avaliar a proteína RAS mutada (KRAS), presente em mais de 40% dos casos de cânceres de pâncreas. Em seguida, nosso grupo sintetizou nove derivados de quinolonas com potencial predito computacionalmente de interferência indireta com a atividade das proteínas RAS. Desta forma, o objeto deste trabalho foi realizar a prova de conceito sobre as propriedades dos derivados das quinolonas atuarem reduzindo ou anulando a atividade anormal de KRAS, na expectativa que este potencial de inibição pudesse contribuir com a redução da taxa de proliferação celular, redução da migração celular e indução da apoptose nestas células tumorais. Embora os agentes aqui avaliados não tenham apresentado resultados promissores para o seu emprego direto, nossos resultados abrem um amplo horizonte para a síntese de outras séries de derivados das quinolonas que com elevado potencial de uso como drogas efetivas no tratamento do câncer de pâncreas. / In the Brazil, pancreatic cancer represents 2% of all cancer types. Accounting for 4% of all deaths from this disease. Its treatment is rarely restricted to the surgical removal of the tumor due to the high aggressiveness of this disease. For most cases the alternative therapy is surgery and/or chemotherapy associated or not with radiotherapy. Pancreatic cancer is a silent disease with a generally late diagnosis, which makes treatment difficult because of metastases presence. This factor also contributes decisively to a poor prognosis and a very short life after diagnosis, ranging from six to eighteen months for many the cases. The first choice drugs that are used in chemotherapy of this type of cancer, Gemcitabine and the 5-fluororacil (5-FU), act interfering with the cellular capacity to synthesize its DNA, thus inhibiting the mitosis and inducing the cell death by apoptosis. Because the mechanisms of action of these drugs cause high toxicity to all cells, the treatment of pancreatic cancer is associated with several severe adverse effects such as pancytopenia. Despite therapeutic advances in the treatment of cancer, pancreatic cancer persists as the major challenge, urgently requiring central therapeutic alternatives and adjuvants, which are efficient in eliminating tumor and tumor cells with less toxicity to normal cells. Based on the above, our group went on to evaluate the RAS protein (KRAS), changed in more than 40% of cases of pancreatic cancers. Next, our group synthesized nine quinolone derivatives with computational potential of indirectly interfering with the activity of RAS proteins. Thus, the objective of this work was to carry out the proof of concept on the properties of the quinolones derivatives to reduce or cancel the abnormal activity of KRAS, in the expectation that this potential inhibition could contribute to the reduction of the rate of cell proliferation, reduction of migration Cell and induction of apoptosis in these tumor cells. Although the agents evaluated here have not presented promising results for their direct use, our results open a wide horizon for the synthesis of other series of quinolone derivatives that with high potential of use as effective drugs in the treatment of pancreatic cancer.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, 2016. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:21:06Z No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-10-10T18:22:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_PaulaBeatrizSantiago.pdf: 14571538 bytes, checksum: e6692f71f1b3e972f9f5a7e93a8a6ea1 (MD5) Previous issue date: 2017-10-10 / Programa de apoio a Núcleos de excelência (PRONEX); Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES); Fundação de Apoio à Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF); Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP). / A doença de Chagas é causada pelo tripanossomatídeo Trypanosoma cruzi, geralmente transmitido ao hospedeiro vertebrado através do contato com as fezes do inseto vetor infectado durante o repasto sanguíneo. A lesão vascular ocasionada pela picada do triatomíneo hematófago desencadeia no hospedeiro manifestações que poderiam interferir na alimentação, tais como resposta imune, inflamação e hemostasia. No entanto, os insetos hematófagos são capazes de neutralizar essas defesas através de um complexo repertório de moléculas salivares, fundamentais para a manutenção do fluxo sanguíneo e o sucesso do repasto. No intuito de conhecer a complexidade molecular da saliva dos triatomíneos Rhodnius neglectus e Triatoma dimidiata, esta tese descreve os transcritomas de suas glândulas salivares utilizando sequenciamento de próxima geração. Foram obtidos 5.704 transcritos a partir da biblioteca de cDNA das glândulas salivares de T. dimidiata e 5.705 da biblioteca de R. neglectus, dos quais 662 e 636, respectivamente, codificam proteínas secretadas. A análise revelou a expressão de famílias gênicas já descritas na saliva de outros hematófagos, como lipocalinas, grupo abundante, antígeno-5 e apirases. Além disso, inibidores de proteases do tipo Kazal e proteases também foram encontrados. Adicionalmente, o conteúdo salivar foi submetido à análise proteômica, sendo identificadas 111 e 73 proteínas nos proteomas de T. dimidiata e R. neglectus, respectivamente. Os resultados obtidos validaram alguns transcritos putativamente secretados. Este estudo evidenciou que a saliva dos triatomíneos investigados tem característica multifuncional diretamente relacionada a diferentes atividades anti-inflamatórias, anti-hemostáticas e imunomoduladoras. O estudo dos compostos salivares auxilia a compreensão acerca da biologia dos vetores e transmissão de doenças, da evolução dos hematófagos, além de estimular a busca por novos fármacos. / Chagas disease is caused by Trypanosoma cruzi trypanosomatid, usually transmitted to vertebrate host through contact with faeces of infected vector insects during a blood meal. The vascular injury caused by the bite triggers symptoms capable to preventing an association with the host, such as immune response, inflammation and haemostasis. However, hematophagous arthropods are able to neutralize these defenses through a complex repertoire of salivary proteins acting as vasodilators, antiplatelets and anticoagulants. These molecules are essential for the blood flow maintenance and the success of the blood meal. In order to understand the salivary molecular complexity of Rhodnius neglectus and Triatoma dimidiata, this work describes their salivary glands (SG) transcriptome using next-generation sequencing. It was possible to obtain 5,704 transcripts from T. dimidiata and 5,705 from R. neglectus SGs, of which 662 and 636 encoded putatively secreted proteins respectively. The analysis revealed the expression of gene families already described in the saliva of other hematophagous insects, such as lipocalin, abundant protein family, antigen-5 and apyrases. Besides, Kazal type protease inhibitors and proteases were also found. In addition, the salivary content was submitted to proteomic analysis, being possible to identify 111 and 73 proteins in T. dimidiata and R. neglectus proteomes respectively. The results validated some putatively secreted transcripts. This work showed that saliva of the triatomines investigated here possess multi-functional feature directly related to different anti-inflammatory, anti-hemostatic and immunomodulatory activities. Salivary research helps the understanding of vector biology and disease transmission, hematophagous evolution, in addition to stimulating the search for new drugs.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Saúde Animal, 2013. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2013-04-25T13:54:56Z No. of bitstreams: 1 2013_SamaraMaguilnik.pdf: 9025516 bytes, checksum: 981c46a828462e9a1b79c086f94c55bd (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2013-04-26T12:36:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_SamaraMaguilnik.pdf: 9025516 bytes, checksum: 981c46a828462e9a1b79c086f94c55bd (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-26T12:36:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_SamaraMaguilnik.pdf: 9025516 bytes, checksum: 981c46a828462e9a1b79c086f94c55bd (MD5) / O sucesso na criação e conservação das araras depende de boas práticas de manejo e da identificação e tratamento de doenças, o que pode ser desafiador, pois as aves tendem a mascarar os sinais de enfermidade. Sendo assim, a utilização de ferramentas diagnósticas como o proteinograma é imperativo, pois são capazes de avaliar de forma abrangente o estado de saúde desses indivíduos. Este estudo teve como objetivo determinar o proteinograma de araras mantidas em cativeiro por meio da eletroforese de proteínas, correlacionando a espécie, sexo e ambiente com possíveis variações no perfil eletroforético, assim como buscou averiguar se infecções por hematozoários hemosporídeos se prestam como modelo de resposta de fase aguda, acarretando modificações no padrão proteico. Ademais, pretendeu avaliar a eletroforese de proteínas como ferramenta diagnóstica. A eletroforese em gel de agarose das proteínas séricas foi realizada em diferentes espécies de araras, fêmeas e machos, positivas e negativas para hemosporidioses e alocadas em três grupos distintos conforme o ambiente de origem no Distrito Federal ou Goiás. Não foram evidenciadas alterações significativas nas frações proteicas entre indivíduos positivos e negativos. O sexo interferiu nas concentrações de pré-albumina, as quais foram inferiores nas fêmeas. O fator ambiente resultou em mudanças nas frações β e γ globulinas. Concluiu-se que a variável ambiente é a maior responsável pelas discrepâncias observadas e atribuiu-se a isto a presença de uma possível enfermidade crônica. Por fim, pode-se afirmar que a eletroforese de proteínas é uma ferramenta diagnóstica muito sensível, porém, inespecífica. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Success in breeding and conservation of macaws depends on good management practices and the identification and treatment of diseases, which can be challenging, because the birds tend to mask the signs of illness. Thus, the use of diagnostic tools such as proteinogram is imperative, as they are able to assess widely the health status of these individuals. The aim of this study was to determine the proteinogram of macaws kept in captivity with protein electrophoresis, correlating the species, gender, and environment with possible changes in the electrophoretic profile, and to establish whether infections by blood hemosporidian parasites may be used as a model of acute phase response and modify the protein pattern. In addition, this study intended to evaluate the protein electrophoresis as a diagnostic tool. The agarose gel electrophoresis of serum proteins was carried out in different species of macaws, male and female, positive and negative for hemosporidiosis, and allocated into three distinct groups depending on the original environment in Distrito Federal or Goias. There were no significant changes in protein fractions between positive and negative individuals. Gender has interfered in prealbumin levels, which were lower in females. The environment has led to alterations in β- and γ-globulins fractions. It was concluded that environment is the most responsible for the observed differences and this is probably attributed to the presence of a chronic illness. Finally, the protein electrophoresis is a highly sensitive, but non-specific, diagnostic tool.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2005. / Submitted by Alexandre Marinho Pimenta (alexmpsin@hotmail.com) on 2009-11-06T21:57:39Z No. of bitstreams: 1 dissertacao RAILENE DE AZEVEDO PEREIRA.pdf: 2038438 bytes, checksum: 2a881ae8945df3475524a3521b0ed467 (MD5) / Approved for entry into archive by Gomes Neide(nagomes2005@gmail.com) on 2010-10-27T14:33:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao RAILENE DE AZEVEDO PEREIRA.pdf: 2038438 bytes, checksum: 2a881ae8945df3475524a3521b0ed467 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-10-27T14:33:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao RAILENE DE AZEVEDO PEREIRA.pdf: 2038438 bytes, checksum: 2a881ae8945df3475524a3521b0ed467 (MD5) Previous issue date: 2005 / Os inibidores de α-amilase e de proteinases vegetais tem sido amplamente estudados, devido ao papel destes fatores de resistência contra insetos-praga. Este trabalho tem como objetivo identificar inibidores de α-amilase e de proteinases, presentes em sementes de Phaseolus coccineus e sementes de algaroba (Prosopis juliflora), com potencial inseticida no controle da broca-do-café (Hypothenemus hampei) e de pragas de grãos armazenados de feijão Acanthoscelides obtectus e Callosobruchus maculatus. Um gene que codifica para o inibidor de α-amilase de 223 resíduos de aminoácidos, denominado AI-Pc1 foi clonado de sementes de Phaseolus coccineus, acesso 35590. AI-Pc1 tem 70 a 98% de identidade de aminoácidos com outros inibidores de α-amilases de feijão, já descritos. Uma construção contendo o gene AI-Pc1, regulado pelo promoter da fitohemaglutinina PHA-L, foi introduzida em plantas de fumo, via Agrobacterium tumefasciens. A presença e expressão do gene AI-Pc1 em plantas transformadas (parental T0 e geração T1) foi confirmada por reação de cadeia da polimerase (PCR), Western blot e ELISA. Extrato protéico das sementes de plantas transformadas reagiram positivamente com o anticorpo policlonal contra o anticorpo αAI-1, enquanto que nenhuma reação foi observada em plantas não transformadas. Ensaios imunológicos mostraram que AI-Pc1 representa cerca de 0,05% da proteína solúvel total de sementes de plantas (T0). A proteína recombinante expressa em plantas de fumo foi biologicamente ativa onde 125 ng de inibidor AI-Pc1 inibe 65% da atividade da α-amilase de H. hampei. Utilizando semente de P. coccineus, acesso 35619, um inibidor de proteinase serínica pertencente à classe Bowman-Birk foi purificado utilizando técnicas cromatográficas que incluem coluna de troca iônica DEAE-Cellulose, coluna de filtração molecular Superdex 75, coluna fase-reversa líquida de alta pressão Vydac C-18 e Source 5RPC. O inibidor, denominado de PcBBI1, é uma proteína rica em cisteína e estável ao calor em pH alcalino. Análises por MALDI-TOF/MS mostraram que o inibidor PcBBI1 esta presente em semente de P. coccineus na forma de um monômero de 8.689 Da ou de um dímero de 17.378 Da. O efeito inibitório de PcBBI1 foi analisado por ensaio in vitro para tripsina e quimotripsina pancreática bovina e para proteinases digestivas de larvas de H. hampei. O inibidor foi fortemente ativo contra as enzimas semelhantes à tripsina de H. hampei, inibindo 80% da atividade proteolítica. Adicionalmente, um inibidor de proteinase cisteínica foi isolado das sementes de algaroba (Prosopis juliflora). Este inibidor, denominado de Pj, foi purificado usando uma coluna de filtração molecular Sephacryl S-200 seguido por uma coluna de fase-reversa líquida de alta pressão Vydac 18 TP. O inibidor Pj mostrou uma massa molecular de 20.000 Da por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS e massa molecular de 19.276 Da por espectrometria de massa. A inibição da papaína pelo inibidor Pj foi do tipo não-competitivo, com um valor de Ki de 0.59 x 10-9. A atividade gelatinásica da papaína também foi fortemente inibida pelo inibidor Pj. A seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal do inibidor Pj mostrou homologia com a seqüência de aminoácidos da extremidade N-terminal de inibidores de proteinase da família Kunitz. Pj foi fortemente efetivo contra proteinases digestivas do gorgulho do feijão Acanthoscelides obtectus e do gorgulho de caupi Callosobruchus maculatus e foi moderadamente ativo contra proteinases digestivas do gorgulho da vagem Mimosestes mimosae e do gorgulho do feijão comum Zabrotes subfasciatus. Estes resultados sugerem que o inibidor AI-Pc1 e PcBBI1 isolados de P. coccineus e o inibidor Pj purificado de sementes de P. juliflora são candidatos promissores para obter cultivares de plantas resistentes ao ataque destes insetos-praga. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Plant α-amylase and proteinases inhibitors are extensively studied, in part due to their role as defense factors against insect pests. In this works, we have identified α-amylase and proteinase inhibitors, found in of Phaseolus coccineus bean and algaroba (Prosopis juliflora) seeds. Those molecules exhibit an insecticidal potential in the control of coffee berry borer (Hypothenemus hampei) and pests from stored grains of beans Acanthoscelides obtectus and Callosobruchus maculatus A gene encoding an α-amylase inhibitor protein of 223 amino acids residues, named aAI-Pc1, was isolated from an wild bean P. coccineus, acess 35590. aAI-Pc1 has 70-98% amino acid identity with other known bean α-amylase inhibitors. A construction with aAI-Pc1 gene driven by the PHA-L phytohemaglutinin promoter was introduced into tobacco plants by Agrobacterium-mediated transformation. The presence and expression of the aAI-Pc1 gene in regenerated (T0) and progeny (T1) transformant plants were determined by PCR amplification, enzyme-liked immuno sorbent assay (ELISA) and immunoblot analysis. Seed protein extracts from selected transformant reacted positively with polyclonal antibody raised against αAI-1, while no reaction was observed with untransformed plants. Immunological assays showed that aAI-Pc1 represented up to 0.05% of the total soluble proteins in seeds of T0 plants. The recombinant inhibitor expressed in tobacco plants was biologically active and 125 ng aAI-Pc1 inhibited 65% of the H. hampei α-amylase activity. A serine proteinase inhibitor belonging to the Bowman-Birk class was purified from P. coccineus seeds, acess 35619, using chromatographic techniques that include DEAE-Cellulose ionic exchange column, Superdex 75 gel filtration column and reverse phase high performance liquid chromatography column (Vydac C-18 and Source 5RPC). The inhibitor, nominated PcBBI1, is a protein cystein-rich and heat stable at alkaline pH MALDI-TOF/MS analysis showed that the inhibitor is present in the seeds from P. coccineus as a monomer of 8.689 Da or a dimmer of 17.378 Da. The inhibitory effect of PcBBI1 towards trypsin and chymotrypsin from bovine pancreas and digestive proteinases from H. hampei larvae was analyzed in vitro assay. The inhibitor was highly active against trypsin-like enzymes from H. hampei, inhibiting 80% of proteolytic activity. Additionally, a proteinaceous inhibitor with high activity against papain was found in seeds of the xerophytic algaroba tree (Prosopis juliflora). The proteinase inhibitor Pj was purified using Sephacryl S-200 gel filtration followed by reverse-phase high-performance liquid chromatography on a Vidac 18 TP. Inhibitor Pj showed a Mr of 20.000 on sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis an a Mr of 19.276 Da by mass spectrometry. The inhibitor of papain by the Pj inhibitor was the noncompetitive type, with a Ki value of 0.59 x 10-9 M. The gelatinase activity of papain was strongly inhibited by Pj too. The N-terminal amino acid sequence of the Pj inhibitor showed homology with the N-terminal amino acid sequence of the Kunitz-proteinase inhibitor family. Pj was strongly effective against digestive proteinases from bean weevil Acanthoscelides obtectus and cowpea weevil Callosobruchus maculatus and Mexican bean weevil Zabrotes subfasciatus. The data shown here suggest that the protein present in algaroba seeds is involved with defense responses to insects and may be an important tool to be used in engineering plants resistant to bean weevils.

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-14T17:39:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Durigan_JoseFernando_D.pdf: 16475647 bytes, checksum: c980f665748b2b60279bd66b8c55ae06 (MD5) Previous issue date: 1985 / Resumo: Este trabalho descreve a toxicidade e o valor protéico relativos a doze cultivares de feijão (Phaseolus vulgaris, L.), produzidos pelo Instituto Agronômico de Campinas, ou seja: Aroana, Cara Suja, Jalo, Goiano Precoce, Carioca, Piratã-l, Iguaçú, Rico-23, Aeté-l, Aeté-3, Rosinha G2 e Roxinho. Estabelecida a composição centesimal dos grãos de todos os cultivares, seguiu-se o estudo da toxidez verifi-cando-se que ratos Wistar alimentados com farinha integral de grãos crus, como única fonte protéica, sucumbiam no período de 3,8 ('Goiano precocel) a 8,4 dias ('Aroan~'). Quando esta farinha integral foi misturada com caseína, evidenciaram-se prejuízos no aproveitamento da ração e no desenvolvimento dos animais, expressos pelas diminuições de peso, de digestibilidade, de valor biológico e de utilização líquida das proteinas (NPU). Estabeleceu-se um correlacionamento positivo e significativo entre a toxicidade, expressa em perda de peso proteína inger! -da, e a atividade hemaglutinante total, enquanto que a atividade antitríptica e o conteúdo de taninos não mostraram correlação com o efeito tóxico.O efeito prejudicial das lectinas manifestou-se pela interação das mesmas com as vilosidades intestinais, causando-lhes graves danos e levando os animais a um aproveitamento inadequado dos nutrientes da ração. Estes efeitos, quando intensos e prolongados, podem levar os ratos ã morte,apesar da capacidade de adaptação e/ou recuperação, demonstrada pelos mesmos. As análises de aminoácidos, por cromatografia gasosa ou de troca iônica, revelaram-se equivalentes e comprova ram que as proteínas dos grãos dos cultivares estudados são deficientes em aminoácidos sulfurados e relativamente ricos em lisina, leucina,' isoleucina, fenilalanina + tirosina e treonina. Não se detectou correlacionamento entre o conteúdo de enxofre total e os teores de aminoácidos sul furados. Contudo, foram encontradas correlações positivas e significativas entre o conteúdo deste elemento e os valores de NPR, ganho de peso, ganho de peso/consumo de proteina, determinados com grãos autoclavados. O conteúdo de metionina potencialmente disponível, da proteína dos grãos, determinado através da reação com BrCN e avaliação por cromatografia gasosa, apresenta correlação significativa com o de metionina biologicamente disponível. O tratamento térmico foi bastante efetivo na eliminação da toxidez natural dos grãos, tornando suas proteínas capazes de promover o desenvolvimento dos ratos. A baixa digestibilidade destas proteínas, também foi atribuída ã eliminação fecal de elevado teor glicoprotéico decorrente da exaustão e degradação, das células caliciformes, causada pela passagem do feijão através do trato intestinal dos animais. Apesar das diferenças. significativas na toxicidade de grãos crus dos cultivares estudados, o valor protéico foi equivalente para todos, quando estes foram tratados térmicamente / Abstract: In the present work, the relative toxicity and protein value of seeds of twelve cultivars of common beans(Phaseolusvulgaris~ L.) were studied. Seeds of the cultivars Aroana, Cara Suja, Jalo, Goiano Precoce, Carioca,Piratã-l,Iguaçú, Rico-23, Aeté-l, Aeté-3, Rosinha G2 and Roxinho, were obtained from the Instituto Agronômico de Campinas, SP. The percent composition of the seeds of all cultivars was ascertained. Toxicity studies showed that Wistar rats died within 3,8 ('Goiano Precoce') to 8,4 days ('Aroana')when fed whole seed flour, as the only protein source. When whole seed flour was mixed with casein, strong impairment to ration utilization and animal deveIopment, were observed, and they were expressed as loss of weight, decreased protein digetibility, biological value and net protein utiIization. positive and significant correlation between toxici ty and hemaggIutinin activity was stabIished. On the other hand, antitriptic activity and tannin content did not show any correlation with -the toxic effect. The detrimental effect of lectins was evident by their interaction with the intestinal villi, which resulted in strong structure damage and, thus causing inadequate utilization of ration nutrients. These effects when strong and prolongated can cause the rat' s death, in spite of their adaptive and recovering capacity. Amino acid determination by gas or ion exchange chromatography, showed equivalent results: the seed proteins of alI cultivars studied were deficient in sulfur amino acids, but relatively rich in lysine, leucine, isoleucine, phenylalanine + tyrosine and threonine. No correlation was detected between the total sulfur content and the content of sulfur amino acids in the protein. However, a positive and significant correlation was obtained between the sulfur content and NPR, weight gain/ protein consumption, determined in autoclaved seeds. The content of biologically available methionine of seed proteins, was correlated with the content of chemical ly available methionine as determined by the reaction withBrCN and gas chromatography. "Heat treatment was effective for removing the natural toxicity of common beans, enabling the seed proteins to serve as growth promoters for the rato The low digestibili ty of these proteins was believed to be due to the fecal elimination of high.quantities of nitrogen, mainly glycoprotein as a consequenGe of the exahustion and degradation of goblet cellsi a direct result of the passage of raw bean components throught the intestinal tract of the animaIs. In spite of high difference in toxicity among the cultivars, the protein value was about the same for all cultivars studied. / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-16T15:20:48Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1293935 bytes, checksum: b779340631eccc4bf24d086b2784d036 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-16T15:20:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1293935 bytes, checksum: b779340631eccc4bf24d086b2784d036 (MD5) Previous issue date: 2015-07-30 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A dengue é a doença mais importante causada por um arbovírus no mundo. O vírus da dengue pertence à família Flaviviridae e possui 4 sorotipos antigenicamente distintos. São vírus de RNA fita simples, polaridade positiva, com o genoma de aproximadamente 11 Kb que é traduzido em uma poliproteína subdividida em três proteínas estruturais e sete proteínas não- estruturais (que estão relacionadas com a replicação viral, expressão das proteínas virais e virulência dos sorotipos). Nos últimos vinte anos têm sido observado um incremento significativo na atividade epidêmica, expansão da distribuição geográfica e transmissão contínua dos diferentes sorotipos em áreas onde a doença não era prevalente. Um dos eventos mais alarmantes tem sido o aumento do número de casos da Febre da Dengue Hemorrágica (FDH) nas Américas. Um ponto ainda limitante dos testes diagnósticos que capturam o anticorpo presente no soro de pacientes infectados consiste na dificuldade de obtenção de baixo custo e produção em grande escala dos antígenos. Diante destas considerações objetivou-se expressar a proteína não-estrutural (NS1) do vírus dengue-2 em plantas transgênicas de Arabidopsis thaliana. O gene da proteína NS1 foi otimizado para a expressão em plantas e clonado no plasmídeo pCAMBIA3301. O vetor de expressão pCAMBIA3301/NS1 foi utilizado para transformação de Arabidopsis thaliana. A terceira geração de plantas transformadas foi selecionada em homozigose dominante. A transformação de Arabidopsis thaliana foi evidenciada pela imunolocalização da proteína NS1 marcada dentro do lúmen do retículo endoplasmático em tecidos foliares. Este sistema será utilizado para obtenção do antígeno NS1 com finalidade de aplicação em testes de diagnóstico da dengue. / Dengue fever is the most important disease caused by an arbovirus in the world. The dengue virus belongs to the Flaviviridae family and has four antigenically distinct serotypes. They are single stranded RNA viruses, positive polarity, with a genome of approximately 11 Kb which is translated into a polyprotein subdivided in three structural proteins and seven non-structural proteins (that are related to viral replication, expression of viral proteins and virulence of serotypes). In the last twenty years, it was observed a significant increase in the epidemic activity, expansion of the geographical distribution and streaming of different serotypes in areas where the disease was not prevalent. One of the most alarming events was the increase in the number of cases of dengue hemorrhagic fever (DHF) in the Americas. A further limiting point of the diagnostic tests that capture antibody present in the serum of infected patients is the difficulty of obtaining low-cost and large-scale production of the antigens. Due to this factor, we aimed to build a system in transgenic Arabidopsis thaliana expressing the nonstructural protein (NS1) of the dengue-2 virus. The gene of the NS1 protein was optimized for expression in plants and cloned into the plasmid pCAMBIA3301. The expression vector pCAMBIA3301/NS1 was used for transformation of Arabidopsis thaliana. The third generation of transformed plants were selected by dominant homozygous. The construction of a transgenic Arabidopsis thaliana system was demonstrated by immunolocalization of the NS1 protein into the lumen of the endoplasmic reticulum in the leaf tissues. This system will be used to obtain the NS1 antigen with application purpose of dengue diagnostic tests.

Orientador : Aluisio Jose Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos e Agricola / Made available in DSpace on 2018-07-16T23:53:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leal_TaniaTeresinhadeSouza_M.pdf: 5192636 bytes, checksum: db6eda422dacd694306d7f1bc717df27 (MD5) Previous issue date: 1980 / Resumo: As larvas das espécies Chrysomya albiceps, Chrysomya chloropyga e Chrysomya megacephala foram inicialmente utilizadas neste estudo. A espécie C. chloropyga, foi selecionada por seu comportamento semelhante em dieta natural (carcaça) e na dieta de leite e levedura (STOFFOLANO, 1974). Verificou-se inicialmente, o efeito de diferentes niveis de proteína na dieta, no desenvolvimento das larvas, utilizando-se a:rcD fonte proteica leite em pó integral, leite em pó integral combinado com levedura, caseína e caseína combinada com levedura, nos níveis de 2, 4, 6, 8 e 10%. Nas dietas de leite e de leite e levedura, as porcentagens de ganho de peso foram proporcionais ao nível de proteína das dietas nos níveis 2 e 4%. Nos níveis 6, 8 e 10%, não houve crescimento, provavelmente devido à alta concentração de sólidos nas dietas. Com a utilização de caseína e caseína combinada com levedura, obtivemos respostas de crescimento proporcionais ao níve1 de proteína das dietas até o nível 8% para as dietas de caseína e levedura e até o nível 10%, para as dietas de caseína. Como as dietas contendo levedura apresentaram resultados superiores aos obtidos somente com leite ou caseína como fontes proteicas e, sendo levedura uma fonte rica em ácido ribonucleico, este substituiu a levedura nas dietas de caseína, obtendo-se resultados superiores aos até então obtidos.- A série de dietas contendo caseína e RNA foi por este motivo utilizada como padrão nos ensaios subseqüentes. Verificamos então, respostas das larvas quando proteinas de diferentes origens eram adicionadas às dietas. No primeiro grupo de dietas as farinhas das leguminosas feijão e soja foram utilizadas, testando-se também o efeito de tratamento térmico e o de suplementação com metionina no desenvolvimento das larvas. A suplementação de feijão crú com metionina não aumentou a porcentagem de ganho de peso das larvas, o que ocorreu após o tratamento térmico e também com a suplementação da farinha tratada. Nas dietas com farinha de soja crua, quando suplementadas com metionina, as larvas apresentaram porcentagem de ganho de peso maior do que as dietas não suplementadas. O tratamento térmico também melhorou a qualidade das dietas. Os cereais arroz, milho e trigo foram utilizados como contendo cereal como única fonte proteica, para milho e trigo. A suplementação das dietas com aminoácidos limitantes produziu resultados superiores ou próximos aos obtidos com as dietas complementadas. Um último ensaio foi realizado utilizando-se ovo integral liofilizado como fonte proteica, obtendo-se resultados bastante satisfatórios, embora as dietas não contivessem RNA adicionado, confirmando que o desempenho da dieta depende do balanço adequado de nutrientes / Abstract: The growth of Chrysomya albiceps, Chrysomya chloropyga and Chrysomya megaceplala larvae toward a natural (mice carcass) and milk-yeast diets was studied. The larva of C. chloropyga was selected because of its identical growth in both diets. Experiments were carried out to study the effect of different protein levels and different protein sources as well. Four pratein sources were utilized in this study: l)dried whole milk, 2) dried whole milk-plusyeast, 3) casein and 4) casein cornbined with yeast. The protein levels were 2, 4, 6, 8 and 10% for each one of the diets. In the dried whole milk and dried whole milk-plus-yeast the gain in body weight was proportional to the protein content of the diets, at the levels af 2 and 4%. At 6, 8 and 10% the growth was impaired, probably due to the high solid concentration in the diets. When the caseio and the casein-plus-yeast diets were utilized, the growth was proportional to the protein content of the diets up to the leveI of 8%, in the case of the casein plus-yeast diet, and up to 10% for the casein diet. When yeast was incorporated to the diets, the growth rates were always higher than those obtained without it. This result was not surprising sinee yeasts are a good natural source of ribonucleic acid. The addition of RNA to the casein diet showed even better results, in terms of growth, than the casein-plus-yeast diet. For this reason, the casein diet to which RNA was added, was taken as the standard diet throughout this study. The effect af different protein saurces on the growth rates of C. chloropyga larvas was investigated in another set of experiments. The ability of bean (Phaseolus vulgaris) and soy-bean (Glycine max) proteins to support grawth as well as the effect of heat treatment and L-methionine supplementation were studied. The larvae did not respond to the supplementation of the unheated bean protein with L-methionine, however the growth rates were higher when the flour was heat-treated and when the heated-treated flour was supplemented with L-methionine. In the case of unheated soy flour, there was a better growth response after L-methionine addition; heated soy flour supported higher growth rates than the unheat flour both with and without L-methionine addition. Rice corn and wheat were also testes as protein sources for the C. Chloropyga larvae. Corn and wheat when supplemented with limiting amino acids elicited a better growth response than the unsupplemented sources. Supplementation of corn, rice and wheat with bean and soy-bean protein was beneficial to the growth of C. Chloropyga larvae. Dried whole egg vlas also tested, giving higher growth rates when compared with any other protein source / Mestrado

Mosquitos transgênicos incapazes de transmitir malária podem ser um controle alternativo, mas atualmente não estão disponíveis. O estudo da interação mosquitopatógeno é importante para melhorar o desenho de genes. A proteína circumsporozoita (CSP) tem dois domínios conservados que podem estar envolvidos na penetração dos esporozoítos na glândula salivar. Nosso objetivo foi expressar peptídeos contendo essas regiões na hemolinfa do mosquito usando o sistema de expressão transiente vírus Sindbis e a tecnologia de transgênese. Se a CSP está envolvida neste processo, os peptídeos competirão com spz impedindo a penetração. Cinco vírus sindbis e quatro linhagens transgênicas foram construídos e desafiados por P. gallinaceum. Nossos resultados mostram que os peptídeos não impediram a penetração de spz na glândula salivar, principalmente porque os peptídeos recombinantes não foram produzidos ou detectados. Aprimorar o desenho de genes, usando a otimização de códons e outras tecnologias, será essencial para a expressão de proteínas exógenas em mosquitos transgênicos. / Transgenic mosquitoes that impair malaria transmission can be an alternative control but currently an effective line is not available. A better understanding of mosquito interaction with pathogens is very important to improve refractory transgene design. Circumsporozoite protein (CSP) has two conserved domains that could be involved in spz penetration into mosquito salivary glands. Our aim was to express peptides encompassing these conserved regions in the mosquito hemolymph using Sindbis virus transient expression system and transgenesis technology. If CSP is involved in this process these peptides will compete with sporozoites impairing its penetration. Five Sindbis virus and four transgenic lines were constructed and challenged with P. gallinaceum. Our results showed these peptides could not impair sporozoites penetration in salivary glands, mainly because the recombinant proteins could not be produced or detected. Improving transgene design using codon usage and other technologies will be essential for expressing foreign proteins in transgenic mosquitoes.