Made available in DSpace on 2014-12-17T14:03:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DanielCL_DISSERT.pdf: 3446622 bytes, checksum: 86a8ec4f8ed7a90274cc61a7f0f71422 (MD5) Previous issue date: 2012-09-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / The Chromobacterium violaceum is a β-proteobacterium Gram-negative widely found in tropical and subtropical regions, whose genome was sequenced in 2003 showing great metabolic versatility and biotechnological and pharmaceutical potential. Given the large number of ORFs related to iron metabolism described in the genome of C. violaceum, the importance of this metal for various biological processes and due to lack of data about the consequences of excess of iron in free-living organisms, it is important to study the response mechanism of this bacterium in a culture filled with iron. Previous work showed that C. violaceum is resistant to high concentrations of this metal, but has not yet been described the mechanism which is used to this survival. Thus, to elucidate the response of C. violaceum cultured in high concentrations of iron and expecting to obtain candidate genes for use in bioremediation processes, this study used a shotgun proteomics approach and systems biology to assess the response of C. violaceum grown in the presence and absence of 9 mM of iron. The analysis identified 531 proteins, being 71 exclusively expressed by the bacteria grown in the presence of the metal and 100 just in the control condition. The increase in expression of proteins related to the TCA cycle possibly represents a metabolic reprogramming of the bacteria caused by high concentration of iron in the medium. Moreover, we observed an increase in the activity assay of superoxide dismutase and catalase as well as in Total Antioxidant Activity assay, suggesting that the metal is inducing oxidative stress in C. violaceum that increases the levels of violacein and antioxidant enzymes to better adapt to the emerging conditions. Are also part of the adaptive response changes in expression of proteins related to transport, including iron, as well as an increased expression of proteins related to chemotaxis response, which would lead the bacteria to change the direction of its movement away from the metal. Systems Biology results, also suggest a metabolic reprogramming with mechanisms coordinated by bottleneck proteins involved in transcription (GreA), energy metabolism (Rpe and TpiA) and methylation (AhcY) / A Chromobacterium violaceum ? uma β-proteobact?ria Gram-negativa encontrada amplamente em regi?es tropicais e subtropicais, cujo genoma foi sequenciado em 2003 mostrando grande versatilidade metab?lica e potencial biotecnol?gico e farmac?utico. Dada ? grande quantidade de ORFs relacionadas com o metabolismo de ferro descritas no genoma da C. violaceum, a import?ncia deste metal para diversos processos biol?gicos e devido ? car?ncia de dados a respeito das conseq??ncias do excesso do ferro em organismos de vida livre, ? importante estudar o mecanismo de resposta desta bact?ria em meio repleto com ferro. Trabalhos anteriores mostram que a C. violaceum apresenta resist?ncia a grandes concentra??es desse metal, embora ainda n?o tenha sido descrito qual mecanismo ? utilizado para esta sobreviv?ncia. Assim, visando elucidar a resposta da C. violaceum cultivada em alta concentra??o de ferro e esperando-se obter genes candidatos para serem utilizados em processos de biorremedia??o, o presente trabalho utilizou a abordagem de prote?mica em shotgun e Biologia de Sistemas para avaliar a resposta de C. violaceum cultivada na presen?a e aus?ncia de 9 mM de ferro. A an?lise identificou 531 prote?nas, sendo 71 expressas exclusivamente pela bact?ria cultivada na presen?a do metal e 100 apenas na condi??o controle. O aumento na express?o de prote?nas relacionadas com o ciclo do TCA possivelmente representa uma reprograma??o metab?lica na bact?ria causada pela grande concentra??o de ferro no meio. Al?m disso, foi observado um aumento no ensaio de atividade das enzimas Super?xido dismutase e Catalase, bem como no ensaio de Atividade Antioxidante Total, sugerindo que o metal est? induzindo um quadro de estresse oxidativo em C. violaceum, que passou a aumentar os n?veis de violace?na e enzimas antioxidantes para melhor se adaptar ? condi??o emergente. Tamb?m faz parte da resposta adaptativa a altera??o na express?o de prote?nas relacionados a transporte, inclusive de ferro, e com a resposta quimiot?xica, o que levaria a bact?ria a mudar a orienta??o de sua locomo??o afastando-se do metal. Os dados de Biologia de Sistemas tamb?m sugerem uma reprograma??o metab?lica com mecanismos coordenados por gargalos proteicos envolvidos com transcri??o (GreA), metabolismo energ?tico (Rpe e TpiA) e metila??o (AhcY)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Durante o tratamento radioterápico para tumores localizados na região torácica, parte do coração frequentemente é incluída no campo de tratamento e pode receber doses de radiação ionizante, significativas em relação à terapêutica. A irradiação do coração é capaz de causar importantes complicações cardíacas ao paciente, caracterizadas por alterações funcionais progressivas cerca de 10 a 20 anos após a exposição do órgão. Devido ao seu alto grau de contração e grande consumo energético, o tecido cardíaco é altamente dependente do metabolismo oxidativo que ocorre nas mitocôndrias. Danos as estas organelas podem levar ao decréscimo da produção de energia, tendo um impacto direto sobre a performance cardíaca. Ainda, ao interagir com as células, a radiação ionizante pode gerar uma série de eventos bioquímicos que conduzem a uma resposta celular complexa, em que muitas proteínas parecem estar envolvidas. Tendo em vista tais conhecimentos, o objetivo do estudo foi avaliar o aspecto ultraestrutural do tecido cardíaco, a bioenergética mitocondrial e a expressão diferencial de proteínas após irradiação. Os ensaios foram realizados em amostras de tecido cardíaco de ratos Wistar irradiados com dose única de 20 Gy direcionada ao coração. As análise tiveram início 4 e 32 semanas após irradiação. A análise ultraestrutural foi realizada através de microscopia eletrônica de transmissão. A respiração mitocondrial foi mensurada em oxígrafo, a partir das taxas de consumo de oxigênio pelas fibras cardíacas. A identificação de proteínas diferencialmente expressas foi investigada através de duas técnicas proteômicas: 2D-DIGE (2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis) e uma abordagem label-free seguida de espectrometria de massas. Os resultados mostraram que os efeitos tardios da radiação incluem a degeneração das mitocôndrias e das unidades contráteis do tecido cardíaco, disfunções na cadeia respiratória mitocondrial e expressão diferencial de proteínas envolvidas no metabolismo energético de carboidratos, lipídeos e da fosfocreatina. De forma geral, o estudo mostrou que a irradiação cardíaca prejudica o processo de síntese energética, conduzindo a um déficit da taxa respiratória mitocondrial como efeito tardio. Tal evento pode culminar em disfunções mecânicas no coração, caracterizando o desenvolvimento de doenças cardíacas radioinduzidas. / During radiotherapy for tumors located at toracic region, part of the heart is often included in the treatment field and may receive a significant ionizing radiation dose comparing to the therapeutics. Heart irradiation is able to cause substantial cardiac complications to patient, characterized by functional progressive changes from 10 to 20 years after the exposure of the organ. Because of its high level of contraction and large energetic consumption, cardiac tissue is highly depending on oxidative metabolism which happens at mitochondrias. Damage to these organelles can lead to decreased energy production, having a direct impact on cardiac performance. Even when interacting with cells, ionizing radiation can generate a series of biochemical events that lead to a complex cellular response, in many proteins seem to be involved. Given this knowledge, the aim of the study was to evaluate the ultrastructural appearance of cardiac tissue, mitochondrial bioenergetics and differential expression of proteins after irradiation. The tests were performed on samples of cardiac tissue of rats irradiated with single dose of 20 Gy directed to the heart. The analysis started 4 to 32 weeks after irradiation. The ultrastructural analysis was performed by transmission electron microscopy. Mitochondrial respiration was measured in oxigraph from rates of oxygen consumption by cardiac fibers. The identification of differentially expressed proteins was investigated using two proteomic techniques: 2D-DIGE (2-D Fluorescence Difference Gel Electrophoresis) and a label-free approach followed by mass spectrometry. The results showed that the late effects of radiation include degeneration of mitochondria and contractile units of cardiac tissue, dysfunction in the mitochondrial respiratory chain and differential expression of proteins involved in energy metabolism of carbohydrates, lipids and phosphocreatine. In general, the study showed that the cardiac irradiation damages the process of synthesis energy, leading to a deficit in mitochondrial respiratory rate as late effect. Such event may result in mechanical dysfunction in the heart, characterizing the development of radiation-induced heart disease.

nÃo hà / O presente estudo avaliou os efeitos da inclusÃo de 13% de farelo de castanha de caju (CNM) na dieta de carneiros Morada Nova nos parÃmetros seminais e proteÃnas do plasma seminal. Vinte carneiros foram distribuÃdos em dois grupos iguais: grupo castanha de caju (CNG) e grupo controle (COG). O CNG e COG receberam 13% e 0% de CNM na dieta durante 90 dias. Os grupos foram comparados para peso corporal, circunferÃncia escrotal, parÃmetros seminais e proteÃnas do plasma seminal, utilizando o MÃtodo de Shotgun Proteomics. Peso corporal e circunferÃncia escrotal aumentaram durante os 90 dias do perÃodo experimental em ambos grupos, porÃm nÃo existiu diferenÃa significativa entre CNG e COG. Contudo, apÃs 60 dias, o consumo de matÃria seca foi inferior no CNG (2,9  0,1; aos 90 dias) em relaÃÃo ao COG (3,4  0,1; aos 90 dias). Os parÃmetros seminais nÃo diferiram entre CNG e COG. A anÃlise shotgun proteomics identificou isoaspartil peptidase L asparaginase, gliceraldeÃdo 3 fosfato desidrogenase e prostaglandina H2 D isomerase com alta expressÃo no CNG quando comparado COG. Ao mesmo tempo, 12 proteÃnas do plasma seminal apresentaram baixa expressÃo no CNG, identificadas como beta galactosidase, caltrina, beta mannosidase, glutationa peroxidase, sorbitol desidrogenase, clusterina, albumina and serotransferrina. AlÃm disso, 20 proteÃnas detectadas no plasma seminal do COG foram ausentes no CNG e cinco proteÃnas foram presentes somente nos carneiros que receberam dieta hiperlipÃdica. Em conclusÃo, o presente estudo descreveu, pela primeira vez, os efeitos de uma dieta hiperlipÃdica nos parÃmetros do sÃmen fresco e do plasma seminal de carneiros. Enquanto os critÃrios seminais nÃo foram afetados, proteÃnas especÃficas do fluido seminal foram alteradas em decorrÃncia da dieta com castanha de caju. Visto os aspectos multifuncionais dessas proteÃnas, nÃs sugerimos que certos aspectos da fertilidades de carneiros podem ser alteradas se a castanha de caju for fornecida. / The present study was carried out to evaluate the effects of 13% of cashew nut meal (CNM) inclusion in the diet of Morada Nova rams on semen parameters and seminal plasma proteins. Twenty rams were distributed in two equal groups: cashew nut group (CNG) and control group (COG). The CNG and COG received 13% and 0% of CNM in the diet for 90 days. The groups were compared for live weight, scrotal circumference, seminal parameters and seminal plasma proteins, using shotgun proteomics. Body weight and scrotal circumference increased during the 90-day experimental period in both cashew nut-fed and control groups but with no differences between CNG and COG. However, after 60 days until 90 days, percentage of dry matter intake (% live weight) was inferior in CNG (2,9  0,1; at 90 days) group than COG (3,4  0,1; at 90 days). The sperm quality parameters were not different between CNG and COG.The shotgun proteomics analysis identified isoaspartyl peptidase L asparaginase, glyceraldehyde 3 phosphate dehydrogenase and prostaglandin H2 D isomerase with higher expression in the cashew nut group as compared to animals receiving the control diet. Conversely, 12 seminal plasma proteins had lower expression in the cashew nut group, identified as beta galactosidase, caltrin, beta mannosidase, glutathione peroxidase, sorbitol dehydrogenase, clusterin, albumin and serotransferrin. Moreover, 20 proteins detected in the seminal plasma of the control animals were absent in the cashew nut fed animals and five were present only in the rams receiving the high fat diet. In conclusion, the present study describes, for the first time, the effects of a high fat diet on parameters of the fresh semen and seminal plasma proteins of rams. While sperm criteria were not affected, specific seminal fluid proteins did change as the result of cashew nut feeding. Given the multifunctional aspects of such proteins, we suggest that certain aspects of the ram fertility can be altered if cashew nut is provided.

FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O objetivo do estudo foi identificar e caracterizar as proteÃnas do fluido da rete testis de carneiros Morada Nova. Os testÃculos, obtidos de seis carneiros Morada Nova abatidos, foram imediatamente dissecados. A cabeÃa do epidÃdimo foi separada para ter acesso aos ductos eferentes. O fluido oriundo dos ductos eferentes foi obtido por massagem do testÃculo. Posteriormente, o fluido foi centrifugado para remoÃÃo dos debris celulares e espermatozoides. As proteÃnas foram precipitadas com acetona a -20ÂC e quantificadas pelo mÃtodo de Bradford. Cada amostra (400 μg) foi focalizada em tiras de 13 cm (pH 4-7) e a segunda dimensÃo foi realizada em SDS-PAGE a 15%. Os gÃis obtidos foram escaneados com um ImageScanner II (GE Lifesciences, EUA) e analisados utilizando o aplicativo PDQuest versÃo 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories, EUA). Os spots detectados apÃs a anÃlise dos mapas 2-D no PDQuest foram cortados dos gÃis e submetidos a digestÃo com tripsina. As proteÃnas foram identificadas por espectrometria de massa em tandem. A informaÃÃo sobre a proteÃna adquirida pela busca no MASCOT foi analisada atravÃs da utilizaÃÃo do programa para anotaÃÃes de proteÃnas (STRAP). Redes de interaÃÃo proteÃna-proteÃna foram obtidas a partir do banco de dados STRING versÃo 9.0. Nos gÃis foram detectados em mÃdia 227  32,1 spots, onde 51% das proteÃnas se encontraram acima de 40 kDa representando 65% da intensidade de todos os spots detectados nos gÃis. Com base na anÃlise da ontologia gÃnica, os processos biolÃgicos mais comuns associados Ãs proteÃnas do fluido rete testis foram regulaÃÃo (24,28%) e processos celulares (23,27%). LigaÃÃo (27,42%) e a atividade catalÃtica (19,30%) corresponderam Ãs funÃÃes moleculares mais frequentes. As proteÃnas mais intensamente expressas foram: albumina, clusterina, serotransferrina, imunoglobulina gama-1 e alfa-2-HS-glicoproteÃna. A maioria das proteÃnas identificadas desempenha importantes papÃis nos processos de espermatogÃnese, proteÃÃo espermÃtica, motilidade, capacitaÃÃo e reaÃÃo acrossÃmica. O fluido da rete testis possui vÃrias proteÃnas envolvidas na espermatogÃnese, o que representa um importante fator, uma vez que estas molÃculas contribuem para o desenvolvimento das cÃlulas germinativas, participando no transporte e conversÃo de substÃncias requeridas para a produÃÃo dos gametas masculinos. / The aim of the study was to identify and characterize the proteins of the rete testis fluid from Morada Nova rams. The testicles, obtained from six slaughtered Morada Nova rams, were immediately dissected. The head of the epididymis was separated to gain access to the efferent ducts. The fluid from the efferent ducts was obtained by testis massage. Thereafter, the fluid was centrifuged to remove cell debris and sperm. Proteins were precipitated with acetone at -20ÂC and quantified by the Bradford assay. Each sample (400 Âg) was focused in strips of 13 cm (pH 4-7) and the second dimension was conducted on SDS-PAGE 15%. The gels were scanned with an ImageScanner II (GE Lifesciences, USA) and analyzed using the PDQuest version 8.0.1 (Bio-Rad Laboratories, USA). Spots detected after PDQuest analysis of 2-D maps were cut from gels and submitted to trypsin digestion. Proteins were identified using tandem mass spectrometry. Protein information obtained by MASCOT was analyzed using the software tool for searching annotations of proteins (STRAP). Protein-protein interaction networks were obtained from STRING version 9.0 database. In the gels were detected 227  32.1 spots (mean  SD), where 51% of the proteins were found above 40 kDa, corresponding to 65% of the intensity of all spots detected. Based on gene ontology analysis, the most common biological processes associated with proteins from rete testis fluid were regulation (24.28%) and cellular process (23.27%). Binding (27.42%) and catalytic activity (19.30%) corresponded to the most frequent molecular functions for those proteins. The most intensely expressed proteins were: albumin, clusterin, serotransferrin, immunoglobulin gamma-1 chain and alpha-2-HS-glycoprotein. The rete testis fluid has a large quantity of proteins related to the spermatogenesis. This feature is important in view of the fact that these molecules contribute to the development of the germ cells, as a result of the transport and conversion of substances required to the production of male gametes.

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / A anemia falciforme à uma doenÃa genÃtica frequente, decorrente de uma modificaÃÃo pontual na posiÃÃo seis do gene da hemoglobina, que resulta em alelos diferentes, que quando transcrito, codifica a hemoglobina S, que leva a formaÃÃo das hemÃcias falcÃmicas. As hemÃcias contendo hemoglobina S adquirem, em condiÃÃes de hipÃxia, a forma de foice, causando crise vaso oclusiva nos portadores. O presente trabalho teve como objetivo isolar proteÃnas da membrana eritrocitÃria de pacientes com anemia falciforme (nas fases sintomÃtica e assintomÃtica) e correlacionar alteraÃÃes identificadas nestes perÃodos, utilizando Cromatografia LÃquida de Alta PressÃo (HPLC)-Troca iÃnica, SDS-PAGE 1D e 2D e Espectrometria de Massa (MS). Foi realizada anÃlise proteÃmica em proteÃnas de membrana eritrocitÃria obtidas de amostras de sangue perifÃrico de trÃs pacientes, colhidas ao longo de dois anos, e separadas de acordo com a presenÃa (PC) ou ausÃncia de crise vaso oclusiva (PSC) no momento da coleta. O grupo controle foi formado por dois indivÃduos sem diagnÃstico de hemoglobinopatia. Foi identificada a presenÃa de maior concentraÃÃo de proteÃnas na membrana de eritrÃcitos falcÃmicos, em especial nos pacientes PSC e evidenciou-se que durante as crises a quantidade de proteÃna presente na membrana do eritrÃcito dos pacientes sofre reduÃÃo (20,7% - PC1; 34,2% - PC3 e 45,2% - PC2). Dentre as 159 proteÃnas extraÃdas da membrana de eritrÃcitos falcÃmicos, 148 foram identificadas, e 11 nÃo foram identificadas, usando-se como parÃmetro a base de dados TagIdent ExPASy. Dentre as proteÃnas nÃo identificadas, seis foram extraÃdas da membrana eritrocitÃria de pacientes PC e cinco de pacientes PSC. A identificaÃÃo da proteÃna PRDX2 (uma peroxirredoxina com massa molecular aparente de 41 kDa) com massa molecular aparente inferior a 30 kDa sugere a alteraÃÃo estrutural desta proteÃna. A nÃo identificaÃÃo de 11 proteÃnas extraÃdas da membrana de eritrÃcitos falcÃmicos sugere alteraÃÃo quantitativa na expressÃo proteica destes pacientes. Nossos resultados sugerem ainda que as crises vaso-oclusivas podem estar relacionadas a uma reduÃÃo na concentraÃÃo total de proteÃnas da membrana eritrocitÃria nos pacientes. / Sickle cell anemia is a common genetic disorder resulting from a specific change in position six of the hemoglobin gene, which results in different alleles, which when transcribed, codes for hemoglobin S which leads to the formation of sickle erythrocytes. Red blood cells containing hemoglobin S acquire in hypoxic conditions, the sickle-shaped, causing vaso-occlusive crisis in patients. This study aimed to isolate erythrocyte membrane proteins of patients with sickle cell anemia (in symptomatic and asymptomatic stages) and to correlate changes identified in these periods, using High Performance Liquid Chromatography (HPLC - ion exchange), SDS-PAGE (1D and 2D) and Mass Spectrometry (MS-ESI)). Was performed proteomic analysis in erythrocyte membrane proteins obtained from peripheral blood samples from three patients, collected over two years, and separated according to the presence (PC) or absence of vaso-occlusive crisis (PSC) at the time of collection. The control group consisted of two individuals with no diagnosis of hemoglobinopathies. We identified the presence of a higher concentration of membrane proteins in sickle cell erythrocytes, particularly in CSP patients and showed that during attacks the amount of protein present in the erythrocyte membrane of patients undergoes reduction (20.7% -PC1; 34 2% - PC3 and 45.2% - PC2). Among the 159 membrane proteins extracted from sickle cell erythrocytes, 148 were identified and 11 were not identified, using as parameter the database ExPASy TagIdent. Among the proteins not identified, six were extracted from the plasma membrane of PC patients and five PSC patients. The identification of PRDX2 protein (peroxiredoxin with an apparent molecular mass of 41 kDa) with an apparent molecular weight below 30 kDa, suggesting the structural change of this protein. Failure to identify 11 proteins extracted membrane of sickle cell erythrocytes suggests quantitative changes in protein expression of these patients. Our results also suggest that the vaso-occlusive crises may be related to a reduction in total protein concentration of the erythrocyte membrane in patients.

O típico sabor de chocolate é único, obtido somente de sementes fermentadas, secas e torradas de cacau, não podendo ser sintetizado artificialmente. O desenvolvimento desse sabor é influenciado pela constituição genética das sementes, processamento pós-colheita e manufatura. Proteínas dos cotilédones são potencialmente precursores do sabor e aroma de chocolate. O presente trabalho teve como objetivo analisar diferenças qualitativas e quantitativas nas proteínas de sementes de três genótipos de Theobroma cacao após a colheita e durante a fermentação, de forma a correlacionar estes resultados com diferenças na qualidade (sabor e aroma) obtidas por análise sensorial. Um dos desafios foi o isolamento de proteínas das sementes, evitando o alto teor de polifenóis e polissacarídeos que interferem na separação das proteínas e na análise do proteoma. A metodologia de extração composta por filtração em Miracloth, solubilização e precipitação em ácido ticloroacético (TCA) apresentou géis de maior resolução e repetibilidade, tendo sido escolhida como metodologia de extração protéica para estudo das alterações no proteoma das sementes de cacau durante a fermentação. Foi necessária também a utilização de kit comercial de purificação de proteínas e utilização de método de coloração com nitrato de prata para garantir géis com resolução dos spots e repetibilidade satisfatórias. Os spots foram isolados e após digestão tríptica, submetidos ao sequenciamento por cromatografia líquida associado ao espectrômetro de massas. Os espectros foram analisados pelo programa MASCOT MS/MS Ion Search, utilizando bancos de dados do NCBI. Análises dos mapas 2-D mostraram variação no número de spots entre as variedades. Ao final da fermentação, as proteínas ainda presentes nas sementes das variedades SIAL 70 e Catongo eram ácidas, e o processo de degradação foi caracterizado pelo desaparecimento de quase todas as proteínas neutras ou básicas e também de algumas proteínas ácidas; as proteínas com massa molar acima de 35 kDa também foram todas degradadas. Na variedade CCN 51, não ocorreu o mesmo perfil degradativo, havendo proteínas até pI 6,5 e massa molar acima de 100 kDa. Dos cem spots submetidos ao sequenciamento, 89 foram identificados. As proteínas 21kDa e vicilina foram as proteínas mais abundantes nos cotilédones. Correlacionando os resultados da análise sensorial e a proteômica concluiu-se que existe correlação tanto quantitativa como qualitativa das proteínas dos cotilédones de cacau e possivelmente com as proteínas precursoras de sabor de chocolate / Typical chocolate flavor is unique, only obtained from fermented, dried and roasted cocoa seeds, and can not be synthesized artificially. The flavor development is influenced by the genetic constitution, post-harvest processing and manufactures. Cotyledons proteins are believed to be the precursors of the chocolate flavor. The aim of the present work was to analyze qualitative and quantitative protein differences in seeds of three cocoa genotypes after harvesting and during the fermentation and to correlate these results with differences in quality (flavor and aroma) obtained by sensorial evaluation. One of the challenges was the isolation of proteins from cocoa seeds, avoiding the high content of polyphenols and polysaccharides which disturb protein separation and proteome analysis. The methodology of extraction by filtration in Miracloth, solubilization and precipitation in trichloroacetic acid showed the highest gel resolution and reprodutivity, and, thus, was chosen to be used in the analyses of the proteome of cocoa seeds during the fermentation. It was also necessary to use commercial kit for protein purification and a silver-based staining method with nitrate to guarantee gels with spots resolution and satisfactory reproducibility. Proteins were excised from de gels and after tryptic digestion, MS analysis was conducted by on line chromatografhy using a Cap-LC coupled to a mass spectrometer. The spectra were processed using MASCOT MS/MS Ion Search, and the sequences searched against NCBI databases. The 2-DE maps analysis of cocoa seeds showed significant variation of the spots number among the genotypes. At the end of fermentation, proteins still present in the Sial 70 and Catongo genotypes were acid and the degradation process was characterized by the disappearance of almost all the neutral or basic proteins and also some acid proteins. The genotype CCN 51 did not show the same degradation profile. Of the spots submitted to the mass spectrometer, 89 were identified. The 21kDa protein and vicilin were the most abundant proteins in the cocoa cotyledons. Correlating sensorial analysis and the proteomic results we could observe the existence of quantitative as qualitative correlation of proteins from cocoa cotyledons and possibly with the precursors proteins of chocolate flavor

A fluorose dentária é uma patologia que ocorre durante a formação dos dentes na presença de doses excessivas de fluoreto (F-). Os mecanismos pelos quais o F provoca a fluorose ainda são poucos conhecidos. A influência de fatores genéticos tem sido considerada na suscetibilidade/resistência do indivíduo em desenvolver a fluorose. Duas linhagens de camundongos (A/J e 129P3/J) com diferença na resistência ou suscetibilidade à fluorose dentária foram utilizadas para determinar se a suscetibilidade à fluorose pode ser explicada pela diferença no metabolismo e se há diferença no perfil protéico dos rins e urina destes animais. Para isso, um estudo metabólico foi conduzido com 18 camundongos A/J (suscetível) e 18 129P3 / J (resistente) após o desmame. Cada amostra foi dividida em 3 grupos, com diferentes concentrações de F- na água de beber (0, 10 e 50 ppm F). Uma vez que um estudo piloto revelou que os camundongos A/J ingeriam um maior volume de água quando comparado com o 129P3/J, a concentração de F- na água dada aos camundongos A/J foi ajustada semanalmente a fim de fornecer doses semelhantes de F- para ambas linhagens. Os animais foram mantidos em gaiolas metabólicas (n = 2/gaiola) por 7 semanas, com livre acesso à água e dieta de baixa ingestão de F- (0,95 ppm). A ingestão e excreção de F- foram calculadas, bem como os níveis de F- no plasma, no fêmur e no rim. O grau de fluorose dentária foi avaliado usando análise de fluorescência quantitativa (QLF) e exame clínico. Os perfis proteômicos renal e urinário foram examinados utilizando 2D-PAGE e coloração com azul de Coomassie.. Os dados do estudo metabólico foram testados para diferenças significativas pela ANOVA a 2 critérios (p <0,05). As imagens dos géis e as diferenças estatísticas (ANOVA, p<0,05) foram analisadas pelo programa Image Master Platinum 7.0. Os camundongos da linhagem A/J submetidos à alta concentração de fluoreto apresentaram um grau de fluorose significativamente maior quando comparado com a linhagem 129P3/J. A ingestão total de F- não diferiu significativamente entre as linhagens. A excreção total de F- foi significativamente maior para os camundongos A/J, devido à maior excreção urinária de F-. As duas linhagens não diferiram em relação à absorção F-, mas os animais 129P3/J retiveram significativamente maiores quantidades de F-, que foi consistente com níveis mais elevados de F- no fêmur, no entanto, os níveis de F- no plasma não diferiram significativamente entre as linhagens. Para os rins, a análise quantitativa de intensidade detectou, entre as linhagens A/J e 129P3/J, 122, 126 e 134 spots diferencialmente expressos nos grupos controle, e que receberam baixa e alta concentração de F-, respectivamente. Para a urina, 84 spots diferencialmente expressos foram observados para o grupo controle, 68 para o grupo que recebeu baixa concentração de F- e 66 para o grupo que recebeu alta concentração de F-. Os dados mostraram que há diferenças metabólicas e no perfil de expressão protéica renal e urinária intrínsecas a estas linhagens e que a exposição ao F- é capaz de alterar estes padrões. / Dental fluorosis occurs during tooth formation when excessive doses of fluoride (F) are ingested. The mechanisms that underlie the pathogenesis of dental fluorosis are not known so far. The influence of genetic factors has been considered in individual susceptibility/resistance to develop fluorosis. Two inbred mice strains (A/J and 129P3/J) have been reported to have different susceptibilities to dental fluorosis. They were used in the present study to determine if the susceptibility to dental fluorosis can be explained by alterations in F metabolism and to evaluate if there is difference in the profile of protein expression in kidney and urine of these animals. For this, a metabolic study was conducted with 18 A/J (susceptible) and 18 129P3/J (resistant) weanling mice. Each strain was divided into 3 groups, with differed according to the F concentration given in the drinking water (0, 10 and 50 ppm F). Since a pilot study showed that the A/J mice drank a higher volume of water when compared with the 129P3/J, the F concentration in the water given to the A/J mice was weekly adjusted in order to provide similar F intakes for both strains. The mice were housed in metabolic cages (n=2/cage) for 7 weeks, with free access to water and low-F diet (0.95 ppm). F intake and excretion were calculated, as well as plasma, femur and kidney F levels. The degree of dental fluorosis was assessed using QLF and clinical examination. Renal and urinary proteome profiles were examined using 2D-PAGE and coomassie brilliant blue staining. Data were tested for significant differences by 2-way repeated-measures ANOVA (p<0.05). The gels images and statistical differences (ANOVA, p <0.05) were analyzed by the Image Master Platinum 7.0 software. Significantly higher QLF scores were observed for the A/J mice submitted to 50 ppm F. The total F intake did not significantly differ between the strains. The total F excretion was significantly higher for the A/J mice, due to the higher urinary F excretion. The two strains did not differ in respect to F absorption, but the 129P3/J mice retained significantly higher amounts of F, which was consistent with their higher femur F levels. Plasma F levels, however, did not significantly differ between the strains. For kidney, quantitative intensity analysis detected, between strains A/J and 129P3/J, 122, 126 e 134 spots differentially expressed in the control group, in the group receiving low and high F concentrations, respectively. For urine, 84 spots differentially expressed were detected for control group, 68 for the group receiving low F concentration and 66 for the group receiving high F concentration. Data showed that intrinsic differences occur in the metabolism of F and profile of protein expression between these strains and that these profiles can be altered in the presence of F.

Orientador: Emmanuel Dias-Neto / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-10T18:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martins-de-Souza_Daniel_D.pdf: 2995342 bytes, checksum: bba6d65f7fb9ab2fd672a1027a054163 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A esquizofrenia é um distúrbio mental debilitante que afeta aproximadamente 1% da população mundial, caracterizado por sintomas produtivos como delírios e alucinações e sintomas negativos como apatia e decréscimo das emoções. Nesta tese, realizamos estudos do transcriptoma e do proteoma em tecido cerebral de pacientes com esquizofrenia, buscando identificar genes e proteínas envolvidas com esta doença. Em nossas análises transcricionais, utilizamos a técnica de Serial Analysis of Gene xpression (SAGE), uma abordagem ainda inédita em esquizofrenia. Os dados permitiram a análise de mais de 20 mil transcritos, e apontaram para o possível envolvimento de genes associados a processos como mielinização, função sináptica, metabolismo energético e homeostase de cálcio, incluindo genes anteriormente envolvidos com esquizofrenia, e também uma boa parcela de genes até então não associados com a doença. Uma pequena fração destes novos marcadores foi avaliada por Real-Time PCR permitindo a confirmação de alguns achados de SAGE. ossas análises de proteoma foram feitas com as técnicas de eletroforese de duas dimensões, seguida por espectrometria de massas e pela técnica de shotgun proteomics, também inédita em esquizofrenia. Estas análises foram realizadas com amostras de diferentes regiões cerebrais, incluindo córtex pré-frontal e lobo temporal anterior, e apontaram para alterações quantitativas em proteínas relacionadas com a homeostase de cálcio, citoesqueleto, metabolismo energético e de oligodendrócitos. De modo geral, observamos uma boa consistência entre os resultados obtidos quando estudamos diferentes classes de marcadores potenciais (genes e proteínas). Por muitas vezes os genes alterados não corresponderam a alterações quantitativas nas mesmas proteínas, no entanto, na maior parte dos casos, observamos alterações consistentes nas mesmas vias. Observamos a regulação diferencial do metabolismo de oligodendrócitos, energético, sináptico e revelamos a provável alteração da homeostase de cálcio em cérebros de pacientes com esquizofrenia, além de identificarmos genes e proteínas diferencialmente expressas nunca relacionadas à doença. Nossos dados reforçam achados prévios, apontam potenciais biomarcadores e podem fornecer novas pistas na compreensão da esquizofrenia / Abstract: Schizophrenia is a mental debilitating disorder that affects 1% of the world population. It is characterized by positives symptoms such as delirium and hallucinations and negative symptoms such as apathy and emotion decrease. Here, we have studied the ranscriptome and proteome of brain samples of patients with schizophrenia, in an attempt to identify genes and proteins markers of the disease. Our transcriptome analyses of pre-frontal cortex were performed with Serial Analysis of Gene Expression (SAGE), here used for the first time in the study of schizophrenia. The data obtained allowed the analysis of approximately 20,000 transcripts, which suggested the importance of myelinization, synaptic function, energy metabolism and calcium homeostasis, in the genesis of schizophrenia. A series of genes previously implicated in the disease were identified, together with new potential markers which were revealed here for the first time. A small fraction of these was validated using realtime PCR, which confirmed some of the SAGE findings. Two-dimensional gel electrophoresis, mass spectrometry and shotgun proteomics were the approaches used here for large-scale protein analysis in schizophrenia. These approaches were used in brain samples derived from distinct areas such as pre-frontal cortex and anterior temporal lobe, and indicated quanitative alterations of proteins involved with calcium homeostasis, energy and oligodendrocyte metabolism and cytoskeleton. In general, a good correlation was observed when the different approaches (transcriptome and proteome) were used. In may cases, the alterations of some genes was not reflected by a correspondent alteration of the encoded protein. However, in most cases, reproducible alterations were found in the same pathways. Beside the identification of new schizophrenia-related genes and proteins, we also confirmed the the differential regulation of oligodendrocyte, synaptic and energetic metabolism, in this disease.Our data reinforce previous findings, and suggest new potential biomarkers that may contribute to the understanding of schizophrenia / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T12:28:36Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T12:33:01Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-22T12:33:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Laurine Lacerda Pigosso - 2012.pdf: 3120628 bytes, checksum: 05c24b721e04453fce0116ba2470c24a (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2012-07-31 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The genus Paracoccidioides comprises a complex of phylogenetic species of dimorphic pathogenic fungi, the etiologic agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a disease confined to Latin America and of marked relevance in its endemic areas due to its high frequency and severity. The members of the Paracoccidioides genus are distributed in distinct phylogenetic species (S1, PS2, PS3 and 01-like) that potentially differ in their biochemical and molecular characteristics. In this work, we performed the proteomic characterization of different members of the genus Paracoccidioides. We compared the proteomic profiles of Pb01 (01-like), Pb2 (PS2), Pb339 (S1) and PbEPM83 (PS3) using 2D electrophoresis and mass spectrometry. The proteins/isoforms were selected based on the staining intensity of the spots as determined by image analysis. The proteins/isoforms were in-gel digested and identified by peptide mass fingerprinting and ion fragmentation. A total of 714 spots were detected, of which 343 were analyzed. From these spots, 301 represented differentially expressed proteins/isoforms among the four analyzed isolates, as determined by ANOVA. After applying the FDR correction, a total of 267 spots were determined to be differentially expressed. From the total, 193 proteins/isoforms were identified by PMF and confirmed by ion fragmentation. Comparing the expression profiles of the isolates, the proteins/isoforms that were related to glycolysis/gluconeogenesis and to alcohol fermentation were more abundant in Pb01 than in other representatives of the genus Paracoccidioides, indicating a higher use of anaerobic pathways for energy production. Those enzymes related to the oxidative stress response were more abundant in Pb01, Pb2 and Pb339, indicating a better response to ROS in these members of the Paracoccidioides complex. The enzymes of the pentose phosphate pathway were abundant in Pb2. Antigenic proteins, such as GP43 and a 27-kDa antigenic protein, were less abundant in Pb01 and Pb2. The proteomic profile indicates metabolic differences among the analyzed members of the Paracoccidioides genus. / O gênero Paracoccidioides compreende um complexo de espécies filogenéticas do fungo patogênico dimórfico, agente etiológico da paracoccidioidomicose (PCM), uma doença restrita à América Latina e de relevância acentuada em suas áreas endêmicas, devido à sua alta frequência e gravidade. Os membros do gênero Paracoccidioides são distribuídos em espécies filogenéticas distintas (S1, PS2, PS3 e 01-like) que diferem potencialmente nas suas características bioquímicas e moleculares. Neste trabalho, foi realizada a caracterização proteômica de diferentes membros do gênero Paracoccidioides. Foram comparados os perfis proteômicos de Pb01 (01-like), Pb2 (PS2), Pb339 (S1) e PbEPM83 (PS3) utilizando eletroforese 2D e espectrometria de massa. As proteínas / isoformas foram selecionados com base na intensidade de coloração dos spots conforme determinado por análise de imagem. As proteínas / isoformas foram excisadas do gel, digeridas e identificadas por PMF (Peptide mass fingerprinting) e fragmentação iônica. Um total de 714 spots foi detectado, 343 foram analisados. A partir destes spots, 301 apresentaram-se diferencialmente expressos entre os quatro isolados analisados, determinado por ANOVA. Depois de aplicar a correção FDR, um total de 267 spots foram diferencialmente expressos. Do total, 193 / isoformas proteínas foram identificadas por PMF e confirmadas por fragmentação iônica. Comparando-se os perfis de expressão dos isolados, as proteínas / isoformas que foram relacionados para a glicólise / gliconeogênese e fermentação alcoólica foram mais abundantes em Pb01 do que em outros representantes do gênero Paracoccidioides, indicando uma maior utilização das vias anaeróbias para a produção de energia. Enzimas relacionadas com a resposta ao estresse oxidativo foram mais abundantes em Pb01, Pb2 e Pb339, indicando uma melhor resposta às ROS nestes membros do complexo Paracoccidioides. As enzimas da via das pentoses foram abundantes em Pb2. Proteínas antigênicas, tal como GP43 e uma proteína antigênica de 27 kDa, foram menos abundantes em Pb01 e Pb2. O perfil proteômico indica diferenças metabólicas entre os membros analisados do gênero Paracoccidioides.

Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2015-11-19T17:05:05Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-11-20T13:06:28Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-20T13:06:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Amanda Rodrigues de Oliveira - 2015.pdf: 1754949 bytes, checksum: 32fc5784ffa91959642465ef80f3019f (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-03-10 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Goiás - FAPEG / Paracoccidioides is a termodimorphic fungus that causes paracoccidioidomycosis (PCM), the most frequent systemic mycosis that affects mainly the rural population in Latin America. The fungus grows as yeast when grown at 35-37° C and as mycelium at temperatures below 28° C. The establishment and severity of the disease depends on factors inherent to the fungus and the host. The diversity presented among isolates of the same genus has been explored between the microorganisms and attempt to clarify differences possibly related to virulence existing between isolates that cause the same disease. The secretion of proteins in a cell is a highly dynamic mechanism and is directly involved in the first pathogen contact with the host cells, enabling their survival, multiplication and dissemination. In order to try to elucidate this diversity the proteomic profile of secretome of two isolates of Paracoccidioides, PbEpm83 and Pb01, that in our experimental conditions of infection showed different behaviors was characterized. The use of Ultra Performance liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MSE) allowed the identification of 92 proteins / isoforms among the strains. Of the 92 proteins identified, 36 were preferentially secreted in PbEpm83 and 35 preferentially secreted in Pb01. Among the identified we can highlight proteins related to various biological processes: adhesion to the ECM, proteins related to thermal and oxidative stress, cell rescue, defense and virulence, proteins with immunogenic capacity, proteins related to defense against antifungal, heat shock proteins, among others. Our analysis showed that most of the proteins identified using non-conventional secretory pathways. Among the identified proteins there are already related proteins as virulence factors, such as, ATP synthase, mitochondrial Peroxiredoxin PRX 1, fructose bisphosphate aldolase, Didpeptidil peptidase, Thioredoxin, TCTP, Hsp70 and Hsp88. Our results highlight the importance of secreted proteins in the establishment of infection and that these species, within the same genus, maintain differences in the levels of protein expression that may reflect their behavior in the success of the infection. / Paracoccidioides é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose (PCM), a mais frequente micose sistêmica que afeta, principalmente, a população rural na América Latina. O fungo cresce como levedura quando cultivado à 35-37 °C e como micélio à temperaturas inferiores à 28 °C. O estabelecimento e severidade da doença dependem de fatores inerentes ao fungo bem como ao hospedeiro. A diversidade apresentada entre isolados de um mesmo gênero tem sido explorada entre micro-organismos e procura elucidar diferenças possivelmente relacionadas à virulência existentes entre isolados que causam a mesma doença. A secreção de proteínas em uma célula é um mecanismo altamente dinâmico e que está diretamente envolvido nos primeiros contatos do patógeno com as células do hospedeiro, capacitando sua sobrevivência, multiplicação e disseminação. A fim de tentar elucidar essa diversidade o perfil proteômico do secretoma de dois isolados de Paracoccidioides, PbEpm83 e Pb01, pertencentes à duas espécies filogenéticas diferentes, que em nossas condições experimentais de infecção apresentaram comportamentos diferentes foi caracterizado. A utilização da Cromatografia Líquida de Ultraperformance acoplada à Espectrometria de Massas (UPLC-MSE) permitiu a identificação de 92 proteínas/isoformas entre as amostras testadas. Das 92 proteínas identificadas, 36 foram preferencialmente secretadas em PbEpm83 e 35 preferencialmente secretadas em Pb01. Dentre as identificadas podemos destacar proteínas relacionadas à vários processos biológicos: adesão à MEC, proteínas relacionadas ao estresse térmico e oxidativo, resgate celular, defesa e virulência, proteínas com capacidades imunogênicas, proteínas relacionadas à defesa contra antifúngicos, proteínas de choque térmico, entre outras funções. Nossas análises mostraram que a maioria das proteínas identificadas utilizam vias secretórias não-convencionais. Entre as proteínas identificadas estão proteínas já relacionadas como fatores de virulência: ATP sintase, Peroxirredoxina mitocondrial PRX 1, Frutose bifosfato aldolase, Didpeptidil peptidase, Tioredoxina, TCTP, Hsp70 e Hsp88. Nossos resultados ressaltam a importância das proteínas secretadas no estabelecimento da infecção e que estas espécies dentro do mesmo gênero mantêm diferenças nos níveis de expressão proteica que podem refletir em seu comportamento no sucesso da infecção.