Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

L’Ostéoarthrose (OA) est une maladie articulaire entrainant une dégénérescence du cartilage et une ossification de l’os sous-chondral. Elle touche un Canadien sur 10 et pourtant l’origine de cette pathologie est encore inconnue. Dans le cadre de ce projet, la contribution de deux facteurs de transcription, NFAT1 et PITX1, dans la régulation transcriptionnelle du promoteur d’IHH a été examiné compte tenu de l’implication potentielle de la voie hedgehog (Hh) et de ces facteurs dans la pathogenèse de l’OA. La voie de signalisation Hh régule la croissance et la différenciation des chondrocytes. Indian hedgehog (IHH), l’un des trois membres de la famille Hh, contrôle leur prolifération et leur différenciation. / Osteoarthritis (OA) is the most common joint disorder and is characterized by cartilage degradation and endochondral ossification. One in every ten Canadians is affected, yet its aetiopathogenesis remains unknown. In this present study, two new regulators of the IHH promoter, NFAT1 and PITX1, were studied. The downregulation of IHH expression by these factors could contribute to the OA pathogenesis. The Hedgehog (Hh) signaling pathway regulates chondrocyte growth and differentiation in the growth plate. Indian hedgehog (IHH), one of its members, stimulates chondrocyte proliferation and osteoblast differentiation. IHH is essential in skeletogenesis, osteoblastogenesis and cartilage growth.

Avec la récente découverte que plus de 90% du génome humain est transcrit activement, il est raisonnable d'assumer que les mécanismes de régulation post-transcriptionnelle sont les moyens primaires contrôlant le transfert de l'information de l'ARN messager à la protéine. Ces mécanismes de régulation nécessitent généralement plusieurs éléments et motifs d'ARN en cis retrouvés à l'intérieur des ARN messagers. La structure G-quadruplexe sort de l'ordinaire en terme de motif d'ARN. L'empilement des G-quartets, formés de quatre guanines coplanaires interagissant entre elles via des paires de bases Hogsteen, la présence d'un contre-ion et la structure en tétrahélice procurent à la structure G-quadruplexe une stabilité remarquable. Cette stabilité amalgamée à ces caractéristiques structurales uniques, font de ce motif un élément de régulation post-transcriptionnelle en cis très prometteur. Cette thèse présente une étude des capacités de la structure G-quadruplexe à agir comme un élément de régulation de l'ARN. Tout d'abord, j'ai exploré l'habilité d'une structure G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme en développant et caractérisant une nouvelle classe de ribozyme, le G-quartzyme. Le G-quartzyme résulte de la fusion d’un motif G-quadruplexe au ribozyme VHD antigénomique. Une activité catalytique dépendante de la présence de potassium en solution a été observée pour ce nouveau ribozyme. La caractérisation de cette chimère G-quadruplexe-ribozyme a permis d'apprécier la flexibilité et la capacité du G-quadruplexe à moduler l'activité catalytique d'un ribozyme. Par la suite, j'ai étudié les G-quadruplexes présents dans les 5-UTR des ARNm en utilisant une approche robuste composée de trois étapes, in silico, in vitro et in cellulo. Cette méthodologie a permis d'avoir une vue d'ensemble du phénomène. L'analyse de neuf candidats de front a été la clé afin d'apprécier l'ampleur des G-quadruplexes dans les 5'-UTR agissant comme répresseurs traductionnels. Les résultats obtenus ont permis d'identifier des nouvelles règles régissant la formation de structure G-quadruplexe d'ARN in vitro et in cellulo. Ce travail suggère que ces répresseurs de la traduction sont vastement distribués à travers le transcriptome. Finalement, cette même approche a été utilisée afin d'explorer les G-quadruplexes présents dans les 3’-UTR des ARNm. Cette analyse m'a permis de discerner un nouveau rôle pour cette structure, celui de stimuler la polyadénylation alternative d'un messager. L'étude plus en détail d'un candidat, FXR1, démontre que la présence d'un G-quadruplexe dans son 3'-UTR augmente l'expression d'un transcrit plus court, produit par polyadénylation alternative, contenant moins de sites de liaison aux microARNs résultant en un gain de synthèse protéique. Les résultats recueillis lors de ce travail suggèrent également que la présence de ce motif dans les 3'-UTR diminue l'efficacité d'un site de polyadénylation situé en aval de celui-ci. Clairement, les G-quadruplexes présents dans les 3-UTR possèdent différents rôles pouvant affecter l'expression d'un gène. En conclusion, ces études ont permis de soulever l'importance majeure des G-quadruplexes d'ARN dans différents phénomènes, dont l'expression génique, et de définir de nouvelles règles majorant leur formation et leur interaction dans divers contextes cellulaires. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent que la structure G-quadruplexe, en plus d'être largement distribuée à travers le transcriptome, possède plusieurs caractéristiques faisant de celle-ci un élément de régulation de l'ARN des plus compétent. L’identification et la caractérisation de phénomènes cellulaires associés aux G-quadruplexes s'avèrent indispensables afin de développer de nouvelles thérapies géniques ciblant ces structures.

Le concept d’opéron, défini en 1960 par Jacob et Monod comme étant un groupe de gènes transcrits ensemble et dont les produits concourent à la réalisation d'une même fonction physiologique, est resté jusqu’à tout récemment pratiquement inchangé. Selon ce modèle, toute régulation génétique a lieu au niveau transcriptionnel et est médiée par des facteurs protéiques. Cependant, au cours de la dernière décennie, une révolution a eu lieu alors qu’il fut démontré que des petites molécules d'ARN, appelés sRNAs (small RNAs), sont capables de réprimer de manière post-transcriptionnelle l’expression d’ARN messagers (ARNm) chez les procaryotes. Leur mécanisme d'action consiste généralement à inhiber la traduction d'un ARNm en compétitionnant avec la liaison des ribosomes sur le site de liaison des ribosomes (SLR) situé dans la région 5' non traduite d’un ARNm. Cette inhibition de la traduction s’accompagne généralement d'une dégradation rapide de l’ARNm cible. Les recherches que j'ai effectuées au cours de mes études de 2e et 3e cycle ont permis de découvrir des mécanismes alternatifs par lesquels les sRNAs peuvent réprimer l’expression d’ARNm cibles. J'ai tout d’abord démontré que l’expression du petit ARN RyhB lors d'une carence en fer entraîne la dégradation seulement partielle de l’ARNm polycistronique iscRSUA. De plus, j'ai participé à l’élucidation du mécanisme de dégradation d'un ARNm par l’action d'un sRNA. En effet, nous démontrons que le site de clivage de la RNase E se situe plusieurs centaines de nucléotides en aval dans le cadre de lecture de la cible et que l'arrêt de la traduction n'est pas suffisant à l’obtention d'une dégradation rapide d'un ARNm cible. Finalement, j'ai caractérisé un nouveau mécanisme par lequel un sRNA peut réprimer la traduction d’un ARNm en s’appariant loin en amont du SLR par le recrutement de la protéine chaperon Hfq. Nous démontrons que c'est la protéine qui joue le rôle principal dans la compétition avec les ribosomes.

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d'éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l'analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n'est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d'éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L'étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l'expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l'enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d'expliquer la faible efficacité de l'enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l'enzyme. Une technique de mesure d'activité in vitro a été également développée. Une stratégie d'expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d'une protéine d'environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l'extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose nickel. Les tests d'activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l'enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l'enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l'acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l'action partielle de la Cfa synthase de O. oeni.

Dans l'objectif d'augmenter le bien-être des individus qu'ils représentent, les pouvoirs publics encouragent une politique dynamique de l'innovation pharmaceutique pour permettre l'accès des patients à des traitements dont le rapport bénéfices/risques est favorable. Dans le même temps, les dépenses doivent être rationalisées compte tenu du caractère limité des ressources. Nous avons cherché à apporter un éclairage sur les effets des politiques de soutien à l'innovation sur les prix hospitaliers des médicaments en France (prix non administrés), dans le contexte d'un marché en forte croissance avec l'essor de médicaments onéreux issus des biotechnologies. A travers l'étude de trois dispositifs (médicaments financés en sus de la tarification à l'activité, autorisations temporaires d'utilisation et médicaments orphelins), nous avons montré l'importance de la contribution de l'innovation à la croissance des dépenses. La recherche d'une efficacité productive, nécessaire pour éviter le gaspillage des ressources, doit s'accompagner d'une réflexion sur la disposition à payer de la société pour des médicaments innovants.

Le développement embryonnaire précoce des mammifères femelles s'accompagne de l'inactivation transcriptionnelle d'un de leurs deux chromosomes X. Cet évènement est initié suite à l'expression mono-allélique de l'ARN non codant Xist, qui est contrôlée par de nombreux éléments cis-régulateurs présents dans le centre d'inactivation du chromosome X (Xic) - tel son anti-sens répresseur Tsix. Mon travail de thèse a consisté à développer des approches permettant d'appréhender le paysage structural dans lequel s'exerce cette régulation. La caractérisation de l'architecture tridimensionnelle du Xic, par des techniques basées sur la capture de conformation chromosomique (3C) et l'hybridation in situ en fluorescence (FISH), m'a permis de mettre en évidence que les promoteurs respectifs de Xist et Tsix sont engagés dans des interactions physiques intimes avec des loci distaux, localisés au sein du Xic, et de montrer qu'au moins certaines de ces régions exercent un effets régulateurs à longue-distance. Les éléments du Xic contactés par les régions promotrices de Xist et de Tsix sont en outre fondamentalement différents, chacune engageant des associations chromosomiques sur plusieurs centaines de kilobases dans leur direction 5' respective.Ce travail a également permis de révéler des propriétés insoupçonnées de l'architecture chromosomiques. En effet, le Xic apparaît scindé en plusieurs sous-régions, couvrant chacune entre 200kb et 1Mb, à l'intérieur desquelles les interactions chromosomiques sont préférentiellement établies. L'existence de ces domaines d'interaction s'intègre avec d'autres propriétés structurales du génome, tels la composition de la chromatine sous-jacente et l'association à la lamine nucléaire, mais n'apparaît pas en dépendre directement. En étudiant la dynamique de la conformation chromosomique du Xic au cours de la différenciation cellulaire, j'ai pu constater la robustesse de cette organisation, sauf sur le chromosome X inactif, qui se distingue par la perte des contacts chromosomiques préférentiels détectables sur son homologue actif.Enfin, j'ai pu mettre en évidence que la variabilité du repliement général du chromosome X amène à un instant donné chaque allèle de Tsix à contacter physiquement des jeux de séquences distales différents, suggérant que l'environnement structural instantané de chacun de ces allèles à l'orée de l'activation mono-allélique de Xist est différent. Ce travail, combinant des approches à l'échelle de la population cellulaire d'une part et de la fibre de chromatine unique d'autre part, apporte une nouvelle vision du paysage structural et régulateur dans lequel s'inscrit le contrôle de l'activité transcriptionnelle de Xist, et fourni de nouvelles perspectives concernant les principes fondamentaux de l'organisation topologique des chromosomes chez les mammifères.

Cette thèse traite de la synchronisation et de la désynchronisation des systèmes dynamiques. Dans une première partie nous abordons, sous l'angle de la biologie systémique, le problème de la désynchronisation qui consiste à induire un comportement chaotique dans un système ayant une dynamique stable. Nous étudions ce problème sur un réseau génétique appelé V-système, inventé afin de coupler le plus simplement possible une bifurcation de Hopf et une hystérèse. Après avoir démontré qu'un champ de vecteurs de R^n présentant un tel couplage peut, sous certaines conditions, avoir un comportement chaotique, nous donnons un ensemble de paramètres pour lequel le V-système associé satisfait ces conditions et vérifions numériquement que le mécanisme responsable du chaos prend place dans ce système. Dans une deuxième partie, nous nous intéressons à la synchronisation de systèmes organisés hiérarchiquement. Nous commençons par définir une structure hiérarchique pour un ensemble de 2^n systèmes par une matrice représentant les étapes d'un processus de regroupement deux par deux. Cela nous amène naturellement au cas d'un ensemble de Cantor de systèmes, pour lequel nous obtenons un résultat de synchronisation globale généralisant le cas fini. Enfin nous traitons de la situation où certains défauts apparaissent dans la hiérarchie, i.e que certains liens entre les systèmes sont brisés. Nous montrons que l'on peut accepter un nombre infini de liens brisés, tout en gardant une synchronisation locale, à condition que ces liens soient uniquement présents aux N premiers étages de la hiérarchie (pour un N fixé) et qu'ils soient suffisamment espacés dans ces étages.

Notre recherche sur les pratiques d'évaluations informelles orales d'enseignants, apporte une contribution pour décrire, expliquer, comprendre les modalités et les dynamiques de l'enseignement dans leurs relations aux élèves en cours d'apprentissages. Nous posons la conjecture suivante : " Sur une année scolaire, les pratiques d'enseignement évaluatives informelles orales d'enseignants relèvent de la dynamique qui s'établit entre leurs ressources personnelles et professionnelles, leurs environnements d'exercice professionnel et des " émergents " en situations d'enseignement-apprentissage ". Quatre enseignants de C.E.2 ont été filmés, chacun neuf fois sur une année, à raison de trois séances : une de Français, une de Mathématiques et une d'Éducation Physique et Sportive, par trimestre. Nous étudions les " Unités Évaluative Orale " qui allient verbal et non-verbal. Les ressources professionnelles des enseignants s'actualisent par l'étude de leurs Sentiments d'Efficacité Personnelle (S.E.P.). Leur environnement d'exercice professionnel est perçu à travers les statuts qu'ils attribuent à leurs élèves.Ces enseignants évaluent fréquemment, en sont à l'initiative, leurs énoncés sont brefs, parfois implicites (le non-verbal permettant d'en saisir le sens). Ce sont les " faibles " qui sont les plus évalués. La fréquence des évaluations est moindre en E.P.S.. Le plus souvent, lorsque les S.E.P. sont élevés, les évaluations sont " positives " et adressées aux " forts " ; lorsque les S.E.P. sont modérés, les évaluations sont " négatives ", principalement en E.P.S. ; lorsque les S.E.P. sont faibles, les évaluations sont " négatives " et s'adressent à la " classe entière ".

Le système génétique complexe des mitochondries de plantes supérieures n'a pu être étudié par des approches transgéniques car les méthodes conventionnelles ne permettent pas de transformer ces organites. Une approche alternative a été développée au laboratoire, grâce à l'existence d'un processus naturel assurant l'import d'ARN de transfert (ARNt) du cytosol dans les mitochondries. Il a été montré qu'un mime d'ARNt peut servir in vivo de navette pour importer dans les mitochondries de plante des ARN-passagers exprimés à partir de transgènes nucléaires. L'utilisation d'un transribozyme comme séquence-passagère a permis d'obtenir l'invalidation spécifique d'un ARN messager (ARNm) majeur dans les mitochondries de cellules végétales transformées. Nous avons mis en oeuvre cette stratégie pour développer des études de régulation mitochondriale. Cinq ARNm mitochondriaux (nad9, sdh3, cob, cox3 et atp9) ont été choisis comme cibles pour des transribozymes spécifiques à tête de marteau. Après validation de l'activité de ces ribozymes in vitro, les vecteurs d'expression portant les transgènes correspondants ont servi pour transformer des cultures cellulaires de Nicotiana tabacum, des plantes d'Arabidopsis thaliana (pour nad9, cob, cox3 et atp9) et des plantes de N. tabacum (pour sdh3). L'invalidation spécifique des ARN mitochondriaux ciblés par les ribozymes a été établie in vivo. La réponse, en termes de régulation, à l'invalidation des cibles individuelles a été analysée au niveau de l'ensemble du transcriptome. Alors qu'il a été généralement considéré jusqu'à présent que les processus de régulation mitochondriaux chez les plantes se passent essentiellement au stade post-transcriptionnel, nos résultats sont fortement en faveur de mécanismes de coordination des ARNm dans les mitochondries et entre les organites et le noyau.