La voie de réparation par excision de nucléotides (NER) répare les lésions qui distordent la double hélice d’ADN notamment ceux induits par l’irradiation UV. Le NER est subdivisé en deux sous-voies : GG-NER (Global Genome Repair) et TC-NER (Transcription-Coupled Repair). La sous-voie GG-NER enlève les dommages à l’ADN dans l’ensemble du génome. La sous-voie TC-NER répare les dommages sur le brin transcrit qui interfèrent avec la progression de l’ARN Pol II. Les défauts de la voie NER peuvent conduire à l’apparition de pathologies graves. Par exemple, des mutations dans le gène XPG, codant une 3’ endonucléase impliquée dans la voie NER, peuvent mener au xeroderma pigmentosum (XP) associé ou non au syndrome de Cockayne (CS).Récemment, le laboratoire a découvert un lien fonctionnel entre Rad2, homologue chez la levure Saccharomyces cerevisiae de la protéine XPG humaine, et le Médiateur (Eyboulet et al., 2013). Le Médiateur est un complexe multiprotéique nécessaire à la régulation de la transcription dépendante de l’ARN Pol II. Cette étude a suggéré que le Médiateur est impliqué dans la sous-voie TC-NER en facilitant le recrutement de Rad2 au niveau des régions transcrites.Mon projet de thèse visait à étudier les mécanismes moléculaires qui lient la transcription et la réparation de l’ADN. Plus précisément, d’investiguer le lien fonctionnel entre le Médiateur et la machinerie du NER chez S. cerevisiae.Lors du TC-NER, l’ARN Pol II est le premier facteur signalant le dommage à l’ADN. De plus, le Médiateur et Rad2 interagissent avec l’ARN Pol II. Pour déterminer le lien fonctionnel entre ces composants, nous avons utilisé des approches de génétique et génomique dans les mutants de TFIIH (kin28), de l’ARN Pol II (rpb9) and du Médiateur (med17). Nos résultats nous ont permis de proposer un modèle dans lequel Rad2 est recruté au niveau des régions régulatrices enrichies par le Médiateur, et Rad2 est ensuite transféré au niveau des régions transcrites de manière dépendante à l’ARN Pol II. De plus, ces résultats suggèrent que le rôle du Médiateur dans la transcription est fortement lié à son rôle dans la réparation de l’ADN.Ensuite, nous avons montré que le lien entre le Médiateur et la machinerie du NER peut être étendu à d’autres protéines du NER notamment en démontrant une interaction physique entre le Médiateur et Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 ou Rad26/CSB, en l’absence des UV. Tout comme Rad2, nous avons démontré que Rad1 et Rad10 n’ont pas de rôle majeur dans la transcription. Pour approfondir le lien entre ces protéines du NER et le Médiateur, des expériences de ChIP-sequencing ont été réalisées. Nous avons observé que le Médiateur est présent au niveau de certaines régions qui sont aussi enrichies par ces protéines du NER. Après l’induction des dommages par UV, les interactions entre le Médiateur et la machinerie du NER reste inchangées par rapport aux conditions en l’absence des UV. De plus grâce à nos expériences de ChIP, nous avons observé un changement de la liaison à la chromatine des protéines du NER et du Médiateur après l’irradiation aux UV. Des expériences de ChIP-sequencing seront réalisées pour avoir une vue globale de ces changements.En conclusion, nous avons solidifié le lien fonctionnel entre Rad2, le Médiateur et l’ARN Pol II par rapport à la réparation couplée à la transcription. Nous avons aussi démontré que le Médiateur interagit avec d’autres protéines du NER (Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 et Rad26/CSB) et colocalise avec eux sur certaines régions de la chromatine. En somme, notre projet place le Médiateur à l’interface de la transcription et de la réparation de l’ADN, deux processus essentiels dont les défauts peuvent mener à des pathologies graves. / Nucleotide excision repair (NER) is a well conserved pathway that removes helix-distorting DNA lesions such as those arising upon UV irradiation. Global genome repair subpathway (GG-NER) removes the DNA lesions in the genome overall, and transcription-coupled repair (TC-NER) removes the DNA lesions interfering with Pol II progression through actively-transcribed regions. Defects in the NER pathway may lead to severe human pathologies. For instance, mutations in human XPG gene, encoding a 3’ endonuclease essential for NER, give rise to xeroderma pigmentosum (XP) sometimes associated with Cockayne syndrome (CS). Recently, the laboratory discovered a functional link between Rad2/XPG and Mediator in Saccharomyces cerevisiae (Eyboulet et al., 2013). Mediator is a large multisubunit complex essential for transcription regulation. We suggest that Mediator is involved in TC-NER by facilitating Rad2 recruitment to transcribed genes.My PhD work aimed at addressing the molecular mechanisms of this link between transcription and DNA repair, especially by investigating the functional interplay between Mediator and the NER machinery in yeast Saccharomyces cerevisiae.RNA Pol II is the first complex of TC-NER that encounters the DNA damage. Moreover, both Mediator and Rad2/XPG interact with Pol II. However, a functional interplay between all these components related to TC-NER remained to be determined. Using genetic and genomic approaches, in particular ChIP-sequencing in TFIIH (kin28), RNA Pol II (rpb9) and Mediator (med17) mutants, our work led us to propose a model where Rad2 shuttles between Mediator on upstream activating sequence (UAS) and RNA Pol II on transcribed regions (Georges, Gopaul et al., under review). Our results also suggest that Mediator functions in transcription and DNA repair are closely related.Moreover, we showed that Mediator’s link to NER can be extended to other NER proteins. Indeed, we identified a physical interaction between Mediator and other NER proteins, including Rad1/XPF, Rad10/ERCC1 and Rad26/CSB in the absence of UV irradiation. Similarly to Rad2, we demonstrated that Rad1 and Rad10 do not have a major role in yeast transcription. To further study the functional link between Mediator and the NER machinery, we obtained the genomic distribution of different NER proteins by ChIP-sequencing. We found that some promoter regions are co-occupied by Mediator and these NER proteins, and that relationships between Mediator and these NER proteins are more complex than between Mediator and Rad2. We also investigated if physical interactions between Mediator and NER proteins are modified after UV, we did not observe any significant change. Furthermore, we observed that the chromatin binding profiles of NER proteins and Mediator are modified after UV-irradiation. ChIP-sequencing will be carried out to get a genome-wide view of their chromatin binding profiles.In conclusion, we have strengthened the link between Rad2/XPG, Mediator and RNA Pol II, providing mechanistic insights into functional interplay between these components related to transcription-coupled repair, and showed that the link between Mediator and the NER machinery can be extended to other proteins. Taken together, our results suggest a close relation between Mediator functions in transcription and in NER, two fundamental processes dysfunction of which leads to human diseases.

Le développement des Interventions Médicales Assistées par ordinateur (CAMI) est le résultat d'évolutions convergeantes dans les domaines de la médecine, physique, biomatériaux, électronique, informatique et robotique. CAMI visent à fournir les outils qui permettent au clinicien d'utiliser des données multi-modales de manière rationnelle et quantitative pour planifier, simuler et exécuter des interventions médicales mini-invasives avec précision et sans risque. Parallèlement, les avancées technologiques dans les domaines de l’automatisation, la miniaturisation, la conception assistée par ordinateur et l'usinage ont aussi mené au développement des technologies telles que la bioimpression assistée par ordinateur permettant une impression couche par couche de biomatériaux avec une géométrie contrôlée dans l’espace. Ces résultats ouvrent la voie pour l’utilisation des technologies de bioimpression pour des Interventions Médicales Assistées par ordinateur plus précises et sans risque. Dans ce travail, nous montrons que des constructions tissulaires 3D peuvent être imprimées in vivo et in situ et adaptées à la morphologie d’un défaut. Les résultats ont montré que l'impression de cellules in situ avec une résolution à l’échelle cellulaire a tendance à orienter la réparation tissulaire. / The development of Computer-Assisted Medical Interventions (CAMI) results from converging evolutions in medicine, physics, materials, electronics, informatics and robotics. CAMI aim at providing tools that allow the clinician to use multi-modal data in a rational and quantitative way in order to plan, simulate and execute mini-invasive medical interventions accurately and safely. In parallel, technological advances in the fields of automation, miniaturization and computer aided design and machining have also led to the development of bioprinting technologies which could be defined as the computer-aided, layer-by-layer deposition, transfer and patterning of biologically relevant materials. These results pave the way of using bioprinting technologies for Computer-Assisted Medical Interventions. More precisely, we show that 3D tissue constructs can be printed in vivo and in situ in relation with defect morphology. Interestingly, we demonstrate that printing cells in situ with a cell-level resolution tends to orientate tissue repair.

Ce travail de thèse s'inscrit dans le cadre d'une recherche fondamentale visant à améliorer la compréhension des mécanismes d'interaction des rayonnements ionisants avec la matière biologique en s’intéressant à la prédiction par simulations numériques des dommages précoces radio-induits à l’ADN. Dans un premier temps, une étude sur le rôle des différents niveaux de compaction de la chromatine (hétérochromatine et euchromatine) dans l’induction de ces premiers effets, à savoir les cassures de brins de l’ADN, est proposée. De nouveaux modèles géométriques réalistes de noyaux cellulaires intégrant la compaction de la chromatine ont donc été créés et utilisés dans une chaîne de calcul, basée sur le code Monte Carlo ouvert et généraliste Geant4 et son extension Geant4-DNA, permettant de simuler les étapes physique, physico-chimique et chimique menant aux cassures de brin. Les développements effectués dans cette thèse ont également permis d’étudier l’impact de plusieurs types de rayonnement (protons, alphas, photons) sur les dommages radio-induits. Les différents résultats ont été confrontés à des données expérimentales et en particulier à celles obtenues par l’équipe de radiobiologistes de l’IRSN. Enfin, une étude portant sur les effets plus tardifs comme la réparation de l’ADN et la mort cellulaire a été réalisée par l’utilisation conjointe de la chaîne de calcul et de certains modèles paramétriques issus de la littérature. Ainsi, les résultats obtenus dans cette thèse ont permis d’acquérir de nouvelles connaissances et de développer des outils de calcul qui seront bientôt disponibles en accès libre à la communauté scientifique afin de prédire des effets biologiques de plusieurs types de rayonnement dans la perspective d’améliorer les modèles de risque. / This thesis work is part of a fundamental research aimed at improving the understanding of the mechanisms of interaction of ionizing radiation with biological matter by focusing on the prediction of early radiation-induced DNA damage by numerical simulations. As a first step, a study on the role of the different levels of chromatin compaction (heterochromatin and euchromatin) in the induction of these early effects, namely DNA strand breaks, is proposed. New realistic geometric models of cell nuclei integrating chromatin compaction have therefore been created and used in a calculation chain, based on the open source and general purpose Monte Carlo code Geant4 and its extension Geant4-DNA, to simulate the physical, physico-chemical and chemical stages leading to strand breaks. Developments in this thesis have also allowed studying the impact of several types of radiation (protons, alphas, photons) on radiation-induced damage. The various results were compared with experimental data and in particular those obtained by the IRSN team of radiobiologists. Finally, a study on later effects such as DNA repair and cell death was carried out using both the calculation chain and some parametric models from the literature. Thus, the results obtained in this thesis have made it possible to acquire new knowledge and to develop calculation tools that will soon be delivered in free access to the scientific community in order to predict the biological effects of several types of radiation with the aim of improving risk models.

La migration de données entre des sources aux schémas hétérogènes est un domaine en pleine croissance avec l'augmentation de la quantité de données en accès libre, et le regroupement des données à des fins d'apprentissage automatisé et de fouilles. Cependant, la description du processus de transformation des données d'une instance source vers une instance définie sur un schéma différent est un processus complexe même pour un utilisateur expert dans ce domaine. Cette thèse aborde le problème de la définition de mapping par un utilisateur non expert dans le domaine de la migration de données, ainsi que la vérification du respect par ce mapping des contraintes d'accès ayant été définies sur les données sources. Pour cela, dans un premier temps nous proposons un système dans lequel l'utilisateur fournit un ensemble de petits exemples de ses données, et est amené à répondre à des questions booléennes simples afin de générer un mapping correspondant à ses besoins. Dans un second temps, nous proposons un système permettant de réécrire le mapping produit de manière à assurer qu'il respecte un ensemble de vues de contrôle d'accès définis sur le schéma source du mapping. Plus précisément, le premier grand axe de cette thèse est la formalisation du problème de la définition interactive de mappings, ainsi que la description d'un cadre formel pour la résolution de celui-ci. Cette approche formelle pour la résolution du problème de définition interactive de mappings est accompagnée de preuves de bonnes propriétés. A la suite de cela, basés sur le cadre formel défini précédemment, nous proposons des algorithmes permettant de résoudre efficacement ce problème en pratique. Ces algorithmes visent à réduire le nombre de questions auxquelles l'utilisateur doit répondre afin d'obtenir un mapping correspondant à ces besoins. Pour cela, les mappings possibles sont ordonnés dans des structures de treillis imbriqués, afin de permettre un élagage efficace de l'espace des mappings à explorer. Nous proposons également une extension de cette approche à l'utilisation de contraintes d'intégrité afin d'améliorer l’efficacité de l'élagage. Le second axe majeur vise à proposer un processus de réécriture de mapping qui, étant donné un ensemble de vues de contrôle d'accès de référence, permet d'assurer que le mapping réécrit ne laisse l'accès à aucune information n'étant pas accessible via les vues de contrôle d'accès. Pour cela, nous définissons un protocole de contrôle d'accès permettant de visualiser les informations accessibles ou non à travers un ensemble de vues de contrôle d'accès. Ensuite, nous décrivons un ensemble d'algorithmes permettant la réécriture d'un mapping en un mapping sûr vis-à-vis d'un ensemble de vues de contrôle d'accès. Comme précédemment, cette approche est complétée de preuves de bonnes propriétés. Afin de réduire le nombre d'interactions nécessaires avec l'utilisateur lors de la réécriture d'un mapping, une approche permettant l'apprentissage des préférences de l'utilisateur est proposée, cela afin de permettre le choix entre un processus interactif ou automatique. L'ensemble des algorithmes décrit dans cette thèse ont fait l'objet d'un prototypage et les expériences réalisées sur ceux-ci sont présentées dans cette thèse / Data exchange between sources over heterogeneous schemas is an ever-growing field of study with the increased availability of data, oftentimes available in open access, and the pooling of such data for data mining or learning purposes. However, the description of the data exchange process from a source to a target instance defined over a different schema is a cumbersome task, even for users acquainted with data exchange. In this thesis, we address the problem of allowing a non-expert user to spec- ify a source-to-target mapping, and the problem of ensuring that the specified mapping does not leak information forbidden by the security policies defined over the source. To do so, we first provide an interactive process in which users provide small examples of their data, and answer simple boolean questions in order to specify their intended mapping. Then, we provide another process to rewrite this mapping in order to ensure its safety with respect to the source policy views. As such, the first main contribution of this thesis is to provide a formal definition of the problem of interactive mapping specification, as well as a formal resolution process for which desirable properties are proved. Then, based on this formal resolution process, practical algorithms are provided. The approach behind these algorithms aims at reducing the number of boolean questions users have to answers by making use of quasi-lattice structures to order the set of possible mappings to explore, allowing an efficient pruning of the space of explored mappings. In order to improve this pruning, an extension of this approach to the use of integrity constraints is also provided. The second main contribution is a repairing process allowing to ensure that a mapping is “safe” with respect to a set of policy views defined on its source schema, i.e., that it does not leak sensitive information. A privacy-preservation protocol is provided to visualize the information leaks of a mapping, as well as a process to rewrite an input mapping into a safe one with respect to a set of policy views. As in the first contribution, this process comes with proofs of desirable properties. In order to reduce the number of interactions needed with the user, the interactive part of the repairing process is also enriched with the possibility of learning which rewriting is preferred by users, in order to obtain a completely automatic process. Last but not least, we present extensive experiments over the open source prototypes built from two contributions of this thesis

Le but d’un traitement anticancéreux est d’être spécifique et efficacité dans la durée vis-à-vis des cellules tumorales. De nombreux agents chimiothérapeutiques ont rencontré des obstacles quant à leur utilisation en raison de leur toxicité pour les cellules saines ou de la résistance développée par les cellules cancéreuses. Cela souligne la nécessité de développer des médicaments alternatifs. Notre laboratoire a développé une classe d'inhibiteurs de réparation de l'ADN, Dbait, qui agissent en détournant et en hyperactivant les protéines de la réparation de l’ADN, telles que la protéine PARP et DNA-PK. Cela conduit en conséquence à des modifications de la chromatine, visualisées par la phosphorylation pan-nucléaire de l’histone H2AX, et en l’inhibition du recrutement aux sites des dommages de plusieurs protéines de réparation. AsiDNA, une forme active de Dbait, sensibilise les tumeurs aux radiations, à la chimiothérapie, à la thérapie ciblée, sans effet sur les cellules non tumorales et les tissus sains. Dans la mesure où la chimiothérapie consiste en des traitements cycliques de l'agent anti-cancéreux, l'objectif de cette étude était d'étudier in vitro les conséquences d’un traitement répété d’AsiDNA sur les cellules tumorales et non tumorales, plus particulièrement pour ce qui concerne l’émergence de clones tumoraux résistants ou inversement de clones non tumoraux devenus sensibles au traitement. Dans un premier temps, nous avons conçu des expériences dans le but d'isoler des clones résistants au traitement par AsiDNA. Nous montrons que des traitements cycliques ne conduisent pas à des clones résistants, mais au contraire à la sélection de cellules tumorales caractérisées par une hyper sensibilité à l'AsiDNA. Cette sensibilité acquise est stable dans le temps et n'a jamais été observée en traitant des cellules non tumorales. Afin d’identifier le(s) mécanisme(s) responsable(s) de cette sensibilité acquise, nous avons comparé des cellules de sein non tumorales (MCF-10A) et tumorales triples négatives (MDA-MB-231) après 3 trois cycles de traitement par AsiDNA. Nous montrons que les traitements cycliques d'AsiDNA causent une inhibition de l'expression génique, essentiellement au niveau de gènes impliqués dans la réparation de l'ADN, le cycle cellulaire et la prolifération. Néanmoins, aucune différence dans la capacité de réparation de l'ADN, la progression du cycle cellulaire et le taux de prolifération n'est observable. Les cellules cancéreuses augmentent les voies métaboliques énergétiques pour produire d’énergie nécessaire à leur prolifération. En tenant compte du fait que l’expression de certains gènes impliqués dans les voies métaboliques sont aussi dérégulées par le traitement cyclique d’AsiDNA, nous avons émis l’hypothèse que l’épuisement métabolique pouvait être responsable de la sensibilisation des cellules tumorales à l’AsiDNA. Une étude du métabolome a révélé une dérégulation de plusieurs métabolites incluant NAD+. Nous montrons que cette dérégulation bioénergétique est responsable de l'hypersensibilité acquise des cellules cancéreuses suite au traitement par AsiDNA. Une étude bioénergétique des cellules tumorales non traitées et sélectionnées après les traitements cycliques par AsiDNA confirment une diminution de glycolyse aérobique et de la phosphorylation oxydative dans ces dernières. En conséquence de cette réduction énergétique, les cellules cancéreuses ont perdu leur caractère malin, ce qui est démontré par une inhibition de la migration et de la formation de tumeur. Nous montrons que les cellules tumorales dérivées de traitements cycliques par AsiDNA sont dépourvues de cellules souches cancéreuses dont les caractéristiques sont leur résistance aux drogues et leur phénotype invasif. En conclusion, à côté de son rôle dans l'inhibition de la réparation de l'ADN, AsiDNA interfère également avec le métabolisme énergétique des cellules cancéreuses. / The goal of anti-cancer treatment is long term specificity and efficacy towards cancer cells. Many of the clinically available chemotherapy have encountered obstacles due to their toxicity towards healthy cells or to development of resistance by the cancer cells. This emphasizes the need for development of alternative drugs. Our laboratory developed an original class of DNA repair inhibitor, Dbait, that acts by hijacking and hyper activating DNA repair proteins involved in repairing DNA breaks, such as PARP and DNA-PK. Consequently, this leads to chromatin modification, as revealed by pan-nuclear phosphorylation of H2AX, and inhibition of the recruitment at the damage site of several DNA repair proteins at the damage site. AsiDNA, an active form of Dbait linked to a cholesterol moiety, sensitizes tumours, and not non-tumour cells, to radiation, chemotherapy, targeted therapy. As most of clinical protocols of chemotherapy involve cyclic treatments, the aim of this study was to investigate consequences of cyclic AsiDNA treatment in vitro on non-tumor and tumor cells, conditions that experience cancer patients during chemotherapy. Particular emphasis was paid to emergence of resistant clones during cyclic AsiDNA treatment of tumour cells and emergence of toxicity toward normal cells. At first, various tumor and non-tumor cells were exposed to cyclic treatments consisting of one week of treatment and one week of drug-free recovery. After few cycles of treatment, we didn’t observe toxicity toward normal cells and we failed to isolate resistant clones to AsiDNA from tumor cells. Importantly, this treatment protocol induced resistance of MDA-MB-231 cells to imatinib or PARPi. Unexpectedly, we observed that sensitivity to AsiDNA increased with repeated cycles in tumor cells. This acquired sensitization was stable over time and was never observed in non-tumor cells. In an attempt to understand the specific and acquired sensitization of tumor cells along treatment, we compared non-tumor (MCF-10A) and triple-negative breast cancer (MDA-MB-231) cells that were exposed (3CAsiDNA) or not (3CMT) to 3 rounds of AsiDNA. Transcriptome analysis of MDA-MB-231 revealed global downregulation of transcription after cyclic AsiDNA treatment. Although the expression of genes involved in DNA repair, cell cycle and proliferation, was highly affected, strikingly no clear difference in DNA repair capacity, cell cycle or proliferation rate was observed between MDA-MB-231_3CAsiDNA and MDA-MB-231_3CMT. In contrary, modification of gene expression was weakly affected in non-tumor cells.As impaired DNA repair capacity or cell cycle deregulation couldn’t explain this acquired sensitivity, therefore alternative mechanisms should account for the higher mortality of cyclic treated AsiDNA cells. Cancer cells upregulate energy metabolic pathways to produce enough energy for cell proliferation and repair. Noteworthy, AsiDNA is a PARP activator requiring NAD+ consumption. Based on the fact that metabolic pathways were also deregulated at the transcriptional level, we hypothesized that metabolic exhaustion may be responsible for AsiDNA induced sensitization. Metabolome study revealed deregulation of several metabolites including NAD+. We showed that this bioenergetics deregulation is responsible for increasing sensitivity to AsiDNA. Bioenergetics study confirmed low metabolic activity after repeated AsiDNA treatment due to deregulating aerobic glycolysis and oxidative phosphorylation. As a consequence of energetic deprivation, cancer cells deregulated their malignant behavior by inhibition of migration and tumor formation. We showed that 3CAsiDNA tumor cells are depleted of cancer stem cells, which features are responsible of drug resistance and cancer invasive phenotype. Altogether, we demonstrated that AsiDNA, beside its role in DNA repair inhibition, also interferes with energy metabolism in cancer cells.

La méiose est un processus de ségrégation des chromosomes essentiel pour la gamétogenèse chez tous les organismes qui présentent une reproduction sexuée. Ce mécanisme nécessite des connections entre chromosomes homologues et des structures intermédiaires d’ADN appelées Jonction de Holliday. Ces jonctions sont résolues principalement par complexe MutLγ (Mlh1-Mlh3). Des mutations sur les gènes impliqués en méiose s’accompagnent chez l’homme de problèmes allant de la stérilité à des réarrangements chromosomiques comme la trisomie. Mlh1-Mlh3 joue aussi un rôle dans la voie de réparation des mésappariements de l’ADN (MisMatch Repair - MMR). Notre laboratoire a révélé la première structure cristalline de la région C-terminale du complexe MutLα (Mlh1-Pms1) qui est l’endonucléase majeure de la voie MMR. Mon projet de thèse s’insère dans le cadre de l’étude des différentes fonctions des MutL eucaryotes et plus particulièrement sur le mécanisme moléculaire de MutLγ (Mlh1-Mlh3). Au cours de ma thèse, nous avons déterminé la structure cristalline du domaine C-terminale du complexe Mlh1-Mlh3 qui contient le site d’endonucléase et caractérisé 3 états du site actif. Nous avons montré le rôle de Mlh1 dans le site endonucléase. Nous avons caractérisé la spécificité de ce domaine pour les Jonctions de Holliday et proposé un modèle du site de fixation de l’ADN sur le complexe entier. Ce modèle a permis de proposer un nouveau mutant de séparation de fonction de Mlh1-Mlh3, appelé KERE, qui a été analysé par gel retard et génétique. / Meiosis is key process in sexual reproduction, where chromosomes are segregated. During this process, a parental diploid cell divides into haploid gametes. This mechanism requires connections between homologous chromosomes and intermediate DNA structures called Holliday Junctions. These junctions are mainly resolved by MutLγ (Mlh1-Mlh3) complex. Mutations of genes involved in meiosis are associated with human diseases including sterility and chromosomal rearrangements such as trisomy. Mlh1-Mlh3 plays also a role in DNA mismatch repair (MMR). Our laboratory has characterized the first crystal structure of the C-terminal region of the MutLα complex (Mlh1-Pms1) which is the major endonuclease in MMR. My thesis aims at understanding the molecular mechanism of MutLγ (Mlh1-Mlh3) mainly involved in meiosis and to compare it with Mlh1-Pms1 mainly involved in MMR.We determined the crystal structure of the C-terminal domain of the MutLγ complex which contains the endonuclease site. We characterized the structure of three different states of the active site. We showed how Mlh1 is an integral part of the Mlh3 endonuclease site. We characterized the specificity of this domain for Holliday Junctions and proposed a model of the full-length complex and its DNA binding sites. Finally, we design new separation of function allele of Mlh1-Mlh3, called KERE, which was analyzed by EMSA and genetic experiments.

Plusieurs problématiques de gestion d’opérations peuvent être formalisées avec un problème d’optimisation discret. Ces modèles d’optimisation sont traditionnellement développés sous l’hypothèse que les données d’entrée sont déterministes, non impactées par des changements inattendus ou des incertitudes. Au cours des dernières années, le besoin en modèles performants, incluant des outils efficaces et permettant de réagir de manière optimale aux imprévus (perturbations), n’a cessé de croitre. En phase d’exécution d’un système, plusieurs événements imprévus (incertitudes) peuvent le perturber et le faire dévier de son parcours original voire rendre son exécution impossible. Il est vrai que ces incertitudes peuvent être considérées de manière proactive par le biais d’une optimisation stochastique ou des modèles d'optimisation robustes. Mais même avec des solutions robustes, des événements inattendus peuvent encore se produire nécessitant de revoir le plan robuste en cours d’exécution. Dans cette thèse, l’objectif est de prendre en compte ces incertitudes de manière réactive dans les modèles. Ainsi, une nouvelle méthodologie générique est proposée pour les problèmes d'optimisation de réparation / récupération. En considérant les solutions réparées / récupérées fournies par cette méthodologie appliquée à un plan initial en cours de mise en oeuvre, un décideur peut vouloir minimiser les coûts d'exploitation, mais aussi limiter les changements par rapport au plan initial. Le problème de réparation / récupération est formulé comme un problème d'optimisation multiobjectif, qui minimise des fonctions spécifiques relatives à divers critères de réparation (pilotés par les choix du décideur). / A wide variety of operations management problems can be formulated and solved as discrete optimization problems. Traditionally, these models have been mostly developed and used under the assumption that the input data are known in advance, not subject to unexpected changes, nor impacted by uncertainty. In recent years, the need for improved models providing efficient tools for quickly and optimally reacting to the occurrence of unexpected events (disruptions) has become a more and more important issue. In the execution phase, various unanticipated events will disrupt the system and make the plan deviate from its intended course and even make it infeasible.Uncertainty can be taken into account in a proactive way with stochastic optimization or robust optimization models. However, even with robust solutions, unexpected events can still occur requiring to reconsider the robust plan under execution. In this thesis, we are interested to cope with uncertainty in a reactive way. We propose a new generic methodology for repair/recovery optimization problems. When considering repair/recovery solutions for the initial plan under implementation, the decision-maker may want to minimize operating costs, but also limit the changes with respect to the initial plan. We formulate the repair/recovery problem as a multiobjective optimization problem minimizing specified functions for various repair criteria.

La résistance acquise aux traitements anticancéreux représente un problème clinique majeur. Les voies de réparation de l'ADN fournissent un mécanisme de résistance, mais celle-ci peut aussi résulter de mutations ou d'une expression réduite de la protéine ciblée. La surexpression ou la localisation nucléaire de la Y-Box binding (YB-1) protéine est considérée comme un marqueur pronostique de chimiorésistance de la tumeur. YB-1 interagit avec plusieurs partenaires ; dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur son interaction avec l'enzyme de réparation de l'ADN NTH1 (hNTH1) et l'ADN topoisomérase I (hTopoI), deux enzymes stimulées par YB-1. L'abondance du complexe hNTH1/YB-1 est accrue dans les cellules tumorales résistantes au cisplatine. La TopoI humaine est une enzyme essentielle impliquée dans la régulation cellulaire du surenroulement de l'ADN et est la cible de plusieurs agents anticancéreux. YB-1 augmente la sensibilité à l'inhibiteur de TopoI, la camptothécine, dans les tumeurs. Nous avons caractérisé les complexes YB-1/hNTH1 et YB-1/hTopoI in vitro et in vivo en utilisant des mesures de transfert d'énergie par résonance en fluorescence (ou FRET) pour identifier et développer de nouvelles stratégies pour le traitement de tumeurs chimio-résistantes. Nous avons développé et optimisé un biosenseur original basé sur le FRET pour cribler deux chimiothèques de taille moyenne afin d’identifier des inhibiteurs potentiels du complexe hNTH1/YB-1. Plusieurs «hits» ont été identifiés qui réduisent de façon significative le niveau de FRET de notre biosenseur. Pour certains de ces composés, nous avons reproduit ces résultats à partir de poudres, effectué des courbes dose-réponse et validé leurs actions en tant qu'inhibiteurs de l'interface hNTH1/YB-1 en utilisant d'autres tests d’interactions. Ensemble nos résultats démontrent que YB-1 interagit directement et stimule des enzymes de la réparation de l'ADN et du relaxation de l’ADN, et que cibler l’interface YB-1/hNTH1 représente une nouvelle stratégie intéressante pour le développement de traitements anticancéreux. / Acquired resistance to anti-cancer therapy is common and is a major clinical issue. Functional DNA repair pathways provide a common mechanism for drug resistance, but it can also result from mutations or reduced expression of the targeted protein. The overexpression or nuclear localisation of the multifunctional Y-box binding protein (YB-1) is considered as a prognostic marker for drug resistance in tumours. YB-1 has several interaction partners in cells; in this study, we have focused on its interaction with the human DNA repair enzyme NTH1 (hNTH1) and human DNA topoisomerase I (hTopoI), two enzymes that have been shown to be stimulated by YB-1. The abundance of the hNTH1/YB-1 complex was shown to increase in cisplatin-resistant tumour cells. Human TopoI is an essential enzyme involved in cellular regulation of DNA supercoiling and is the target of several anti-cancer agents. YB-1 enhances the activity of hTopoI and its sensitivity to hTopoI inhibitor, camptothecin in tumour cells. We have characterised the YB-1/hNTH1 and YB-1/hTopoI complexes in vitro and in vivo using Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) measurements to identify and develop new strategies for the treatment of drug-resistant tumours. We also designed and optimised an original FRET-based biosensor to screen two medium-sized chemical libraries in order to find potential inhibitors of the hNTH1/YB-1 complex. Several “hits” were identified that significantly reduced the FRET level of our biosensor. For some of these compounds, we have reproduced these results starting from powders, have performed dose-response curves and have validated their actions as inhibitors of the hNTH1/YB-1 interface using alternative binding assays. Taken together, our results demonstrate that YB-1 directly interacts and stimulates a DNA repair and a DNA relaxing enzyme and targeting the YB-1/hNTH1 interface represents an interesting new strategy for the development of anti-cancer drugs.

L’ADN contient l’information génétique essentielle au développement et au bon fonctionnement de tout organisme vivant. Cependant, l’ADN peut être endommagé ou modifié par une exposition régulière à différents facteurs tels que la lumière du soleil, la pollution, la radiation, etc. La cellule a ainsi développé des mécanismes de réparation très efficaces puisqu’un ADN sain est essentiel pour la santé d’un organisme. La protéine humaine PARP1 est une enzyme clé de la réparation de l’ADN. PARP1 détecte rapidement les dommages à l’ADN en s’y liant, ce qui stimule son activité catalytique. PARP1 catalyse la formation de chaînes d’ADP-ribose qui sont ajoutées à PARP1, ainsi que d’autres protéines, en tant que modification post-traductionnelle. Les chaînes d’ADP- ribose permettent la décondensation de la chromatine ainsi que le recrutement de facteurs de réparation à l’ADN endommagé. PARP1 possède plusieurs domaines régulateurs en plus de son domaine catalytique, le domaine catalytique lui-même se divisant en un domaine hélicoïdal (HD) ainsi qu’un domaine ADP- ribosyltransférase. L’augmentation de l’activité catalytique de PARP1, à la suite de sa liaison à l’ADN endommagé, implique qu’un signal allostérique se transmette à travers ses différents domaines. Le HD joue un rôle essentiel dans le relais de cette communication allostérique puisque c’est ultimement un changement de conformation du HD (i.e « ouverture ») qui révèle le site actif et active l’enzyme. De plus, il a été démontré que les inhibiteurs de PARP1 peuvent moduler l’affinité de l’enzyme pour l’ADN endommagé. Certains inhibiteurs peuvent ainsi provoquer la « capture » de l’ADN par PARP1, un phénomène qui requiert la présence du HD et qui est particulièrement toxique pour les cellules cancéreuses présentant des défauts de réparation de l’ADN. Pour cette raison, la mort cellulaire induite par les inhibiteurs de PARP1 est un traitement prometteur et quatre inhibiteurs sont déjà utilisés pour traiter le cancer des ovaires et du sein. Cependant, le mécanisme précis derrière la capture de l’ADN par PARP1 est encore nébuleux et nécessite de plus amples recherches. Puisque la capture de l’ADN par PARP1 requiert le relais d’un signal allostérique par le HD, et que l’ouverture du HD participe à cette communication, il est donc essentiel de comprendre les changements de conformations effectués par ce domaine. Nous avons ainsi obtenu pour la première fois une structure atomique de PARP1 en conformation active. Celle-ci montre que l’ouverture du HD amène la formation d’une interface additionnelle entre ce domaine et les autres domaines régulateurs de PARP1. Ainsi, entraver la formation de cette nouvelle interaction, par des mutations ponctuelles, diminue grandement l’activité catalytique de PARP1 lié à l’ADN, ce qui suggère que l’interface participe à la communication allostérique de l’enzyme. Tel que mentionné plus haut, les inhibiteurs de PARP1 peuvent moduler de manières différentes l’affinité de PARP1 pour les dommages à l’ADN et ainsi influencer distinctement la communication allostérique de l’enzyme. Nous avons caractérisé une nouvelle série d’inhibiteurs de PARP1 et évalué leur capacité à moduler l’affinité de PARP1 pour l’ADN endommagé. Nos travaux démontrent qu’un inhibiteur volumineux occupant le site actif n’augmentera pas nécessairement l’affinité de PARP1 pour les dommages à l’ADN. Leur capacité à favoriser la capture de l’ADN dépend plutôt de leur interaction avec la région du HD voisine au site actif. En résumé, nos travaux participent à l’amélioration des connaissances concernant l’activation catalytique de PARP1 et la communication allostérique. Une meilleure compréhension de l’allostérie de PARP1 permettra la conception de médicaments ayant la toxicité désirée pour tuer les cellules cancéreuses. / DNA contains the genetic instructions for the development and proper function of all living organisms. However, DNA can be broken and modified in harmful ways through daily exposures to exterior stresses such as sun light, pollution, radiation, etc. Since stable and undamaged DNA is essential for the health of an organism, cells have developed repair mechanisms to ensure that DNA damage is taken care of efficiently. The human protein PARP1 is a key enzyme that contributes to DNA repair. PARP1 rapidly detects DNA lesions which greatly stimulates its catalytic activity. PARP1 catalyzes the formation of chains of ADP-ribose that are attached covalently to PARP1 itself, or other target proteins, as a posttranslational modification. The chains of ADP-ribose allow for the recruitment of chromatin remodelling factors and repair factors to process the DNA lesions. PARP1 carries multiple regulatory domains in addition to its catalytic domain, with the catalytic domain itself composed of the helical domain (HD) and the ADP-ribosyltransferase fold. DNA damage binding greatly stimulates PARP1 catalytic activity, which requires that an allosteric signal is relayed across the enzyme’s domains. Interestingly, the HD has been found to play an essential role in the PARP1 allostery. The HD undergoes a change of conformation (i.e. opening) following PARP1 DNA damage binding which reveals the active site. Additionally, inhibitors binding the active site of the enzyme can modulate PARP1 DNA binding affinity. Some inhibitors can induce PARP1 DNA “trapping”, a phenomenon that requires the HD and appears particularly toxic to cancer cells bearing DNA repair deficiencies. Cell death induced by PARP1 inhibitors is a promising cancer treatment and four inhibitors have approval for clinical use against ovarian and breast cancers. However, the precise mechanism underlying PARP1 trapping on DNA is still unclear and requires further research. Since PARP1 trapping requires the presence of the HD, and that the HD opening is involved in relaying the allosteric signal, it remains essential to characterize its change of conformation. We have obtained for the first time atomic structures of PARP1 in a catalytically active state. Crystal structures show that the HD in open conformation forms an additional interdomain interface. Mutating this interface prevents PARP1 strong catalytic activation following DNA damage binding, suggesting that the allosteric communication is impaired. Additionally, these structures reveal how the HD active conformation leads to the reveal of the active site in the ART domain. As mentioned above, PARP1 inhibitors can modulate the enzyme’s DNA binding affinity and therefore impact its allosteric communication. We have characterized a series of novel inhibitors and tested their propensity to increase PARP1 DNA binding affinity. Our work highlights that bulky inhibitors that fill the active site will not necessarily promote PARP1 affinity for DNA lesions. Rather, it appears that inhibitors may trigger DNA trapping via their interaction with a neighboring region of the HD. Overall, our work deepens our understanding of PARP1 catalytic activation and allosteric communication. Properly understanding how PARP1 trapping occurs will help the design of specific drugs with the desired toxicity to kill cancer cells.

L’usage de composé chimique causant des dommages à l’ADN en phase S est une stratégie couramment utilisée en chimiothérapie du cancer. Ainsi, l’étude de la réponse cellulaire aux dommages subit en phase S s’avère indispensable afin de mieux comprendre les mécanismes cellulaires sous jacents à la réparation de ces dommages et pour permettre le développement ou l’amélioration de nouvelles stratégies antitumorales. Lors de chaque phase S, les nouvelles histones sont acétylées par des histones acétyltransférases (HAT) et déacétylées en fin de phase S et en début de phase G2, par des histones déacétylases (HDAC). Ce cycle d’acétylation des histones est conservé chez tous les eucaryotes. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, l’acétylation de de la lysine 56 de l’histone H3 (H3K56ac) est une marque des nouvelles histones qui est ajoutée par la HAT Rtt109 et retirée par les sirtuines Hst3 et Hst4, des HDAC de classe III. Lors de l’induction de dommages à l’ADN au cours de la phase S par des agents génotoxiques, une persistance de l’acétylation de H3K56 est observée, ce qui suggère un rôle de l’acétylation de H3K56 dans la réponse aux stress réplicatifs subits en phase S. Notre objectif est de comprendre la base moléculaire des défauts de réparation observés dans les mutants de la voie de l’acétylation de H3K56. Précédemment, nous avons réalisé des cribles chémogénétique au nicotinamide (NAM), un inhibiteur des sirtuines, afin d’identifier des gènes influençant la croissance cellulaire en absence de l’activité des sirtuines. SRS2 a été identifié parmi les gènes importants pour le maintien de la viabilité en absence des sirtuines. Srs2 est une hélicase dont l’une de ses principales fonctions est de retirer les nucléofilaments de Rad51, l’une des principales protéines de la recombinaison homologue, de l’ADN simple brin. À l’inverse, RIF1 fut trouvé parmi les gènes dont la délétion confère une meilleure résistance au NAM. Rif1 est impliqué dans le maintien de la taille des télomères, mais également dans l’inhibition des origines de réplication. Dans cette thèse, je présenterai les résultats d’un crible avec des mutants hétérozygotes diploïdes pour évaluer l’importance des gènes essentiels à la croissance cellulaire en absence des sirtuines. Plusieurs gènes impliqués dans l’initiation de la phase S sont ressortis des deux cribles, ce qui suggère que l’acétylation de H3K56 a une fonction dans le processus de réplication de l’ADN qui a lieu en phase S du cycle cellulaire. Par des méthodes de génétique classique, nous avons validé que l’inactivation de membres du complexe DDK, DBF4 et CDC7, dont la fonction est requise par l’initiation des origines de réplication, sensibilise les cellules à la présence d’acétylation constitutive de H3K56. Nous avons confirmé que l’activité toxique de Rif1 pour la viabilité cellulaire en absence des sirtuines Hst3 et Hst4 est sa fonction répressive des origines de réplication. Nous avons observé que l’activation du point de contrôle intra-S n’expliquait pas la perte de viabilité d’un mutant H3K56 constitutivement acétylé alors que l’activité des origines est compromise. Finalement, nous avons identifié un rôle de l’acétylation de H3K56 dans l’initiation des origines de réplication. La progression dans le cycle cellulaire d’une souche constitutivement acétylée sur H3K56 n’est pas ralentie lorsque le complexe DDK est fonctionnel. Toutefois, des dommages spontanés à l’ADN sont observés au cours de la phase S dans les souches dépourvues des protéines Hst3 et Hst4. Ceci suggère que le stress réplicatif observé dans les mutants de la voie de l’acétylation de H3K56 ne peut être entièrement expliqués par un ralentissement de l’initiation des origines de réplication. Nous avons utilisé un mutant srs2Δ qui présente des dommages spontanés à l’ADN et une très forte sensibilité au NAM afin d’exacerber les problèmes réplicatifs observés dans des mutant constitutivement acétylés sur H3K56. Par des méthodes de génétique classique, nous avons observé que la léthalité synthétique entre l’acétylation constitutive de H3K56 et la perte de SRS2 ne peut pas être renversé par la délétion des membres de la voie canonique de l’acétylation de H3K56 suggérant un rôle important de cette modification dans la réparaiton des dommages à l’ADN. De plus, lors d’une persistance de l’acétylation de H3K56, nous avons constaté que la présence de Rad51 s’avère toxique pour des cellules srs2∆. Ensemble, nos résultats suggèrent un rôle de l’acétylation de H3K56 complémentaire au point de contrôle intra-S pour réguler l’initiation des origines de réplication lors de stress réplicatif. Nos données révèlent des fonctions encore méconnues de l’acétylation de H3K56 ainsi que de nouveaux liens entre la structure de la chromatine et la dynamique de réplication. / The use of chemical compounds causing S-phase damage is a common strategy used in cancer chemotherapy. Thus, the study of the cellular response to S-phase DNA damage is essential to better understand the cellular mechanisms underlying the repair of this damage and to allow the development or improvement of antitumor strategies. During each S-phase, new histones are acetylated by histone acetyltransferases (HATs) and deacetylated at the end of S-phase and at the beginning of G2 phase by histone deacetylases (HDACs). This histone acetylation cycle is conserved in all eukaryotes. In the yeast Saccharomyces cerevisiae, acetylation of lysine 56 of histone H3 (H3K56ac) is a hallmark of new histones that is added by the HAT Rtt109 and removed by sirtuins Hst3 and Hst4, class III HDACs. Upon induction of DNA damage during S-phase by genotoxic agents, persistence of H3K56 acetylation is observed suggesting a role for H3K56 acetylation in the response to replicative stresses. Our goal was to understand the molecular basis of the DNA damage defects observed in H3K56 acetylation pathway mutants. Previously, we performed chemogenetic screens with nicotinamide (NAM), a sirtuin inhibitor, to identify genes that influence cell growth in the absence of sirtuin activity. SRS2 emerged as one of the important genes for maintaining viability in the absence of sirtuins. Srs2 is a helicase whose main function is to remove the nucleofilaments of Rad51, one of the major homologous recombination proteins, from single-stranded DNA. Conversely, RIF1 has emerged as one of the genes whose deletion enhances resistance to NAM. Rif1 is involved in the maintenance of telomere size, but also in the inhibition of replication origins. In this thesis, I will present the results of a screen with diploid heterozygous mutants to assess the importance of genes essential for cell growth in the absence of sirtuins. Several genes involved in S-phase initiation emerged from both screens, suggesting that H3K56 acetylation has a function in the DNA replication process that occurs in the S-phase of the cell cycle. By classical genetic methods, we validated that defective activity of the DDK complex members, DBF4 and CDC7, whose function is required by the initiation of replication origins, sensitize cells in the presence of constitutive H3K56 acetylation. We confirmed that the toxic activity of Rif1 8 for cell viability in the absence of Hst3 and Hst4 sirtuins is its repressive function of the origins of replication. We observed that activation of the intra-S checkpoint did not explain the loss of viability of a constitutively acetylated H3K56 mutant while the activity of the origins is compromised. Finally, we identified a role for H3K56 acetylation in the initiation of replication origins. By classical genetic methods, we also observed that the synthetic lethality between constitutive acetylation of H3K56 and loss of SRS2 cannot be reversed by deletion of members of the canonical H3K56 acetylation pathway. Furthermore, upon persistence of H3K56 acetylation, we found that the presence of Rad51 proves toxic to srs2Δ cells. Taken together, our results reveal previously unknown functions of H3K56 acetylation as well as novel links between chromatin structure and DNA replication dynamics.