Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Alfonso Gutiérrez Ádan / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos / Doutor

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.

Setenta e seis amostras intestinais de lotes de perus apresentando ou não sinais clínicos de enterite foram avaliadas quanto à presença de adenovírus grupo 1 (TAV), vírus da enterite hemorrágica dos perus (HEV), astrovírus tipo 1 e 2 (TAstV-1 e TAstV-2), coronavírus dos perus (TCoV), reovírus, rotavírus e vírus da nefrite aviária (ANV) através da reação em cadeia da polimerase. Os resultados obtidos foram analisados quanto à região geográfica de origem das amostras, idade das aves e presença de sinais clínicos nos lotes. Foi detectada elevada positividade das amostras para pelo menos um vírus (93,4%), e grande número de amostras com associações de mais de um vírus (69,7%). Santa Catarina foi o estado com maior média de número de vírus detectados em associação nas amostras (3,14) e Goiás o estado com menor média (1,73). As amostras provenientes de aves em fase inicial de criação (1 a 4 semanas de idade) tiveram média de 3,20 vírus detectados por amostra, e 85% de detecção de TAstV-1 e TCoV (os mais frequentes), enquanto que na fase de terminação (5 a 18 semanas) foi observada menor média de vírus associados nas amostras (2,41), e os agentes mais detectados foram TAstV-1 (57,1%) e rotavírus (51,8%), no entanto, todos os vírus apresentaram menor frequência na fase de terminação do que na inicial, com exceção do TAV e reovírus. Quando os sinais clínicos estavam presentes todos os vírus foram detectados em maior percentual (sendo TAstV-1, TAstV-2 e TCoV os mais frequentes) do que nos lotes sem sinais clínicos, onde TAstV-1 e rotavírus foram os mais frequentes. Estudos posteriores são necessários para a compreensão do papel de cada vírus no desenvolvimento de enterites. / Intestinal samples from seventy-six Brazilian turkey flocks affected or not with intestinal disorders were evaluated for the presence of Adenovirus group 1 (TAV), hemorrhagic enteritis virus (HEV), Astrovirus type 1 and 2 (TAstV-1 e TAstV-2), turkey Coronavirus (TCoV), Reovirus, Rotavirus and avian nephritis virus (ANV) using the polimerase chain reaction. Geographic location, age of the flocks and the presence of clinical signs were analyzed in order to find a relationship with the viral detection. A high frequency of positive samples for at least one virus was observed (93,4%) and 69,7% of the samples showed an association of more than one agent. The highest average number of viruses detected in association (3,14) was found in the state of Santa Catarina and Goias showed the lowest average (1,73). An average of 3,20 viruses per sample was detected in poults in initial phase of the production cycle (1 to 4 weeks of age), and TAstV-1 and TCoV were detected in 85% of the samples (the most frequent viruses), while the terminanting phase (5 to 18 weeks) showed lower average number of viruses in association (2,41), and the most frequent viruses were TAstV-1 (57,1%) and rotavírus (51,8%). However, all the viruses were detected more frequently in the initial phase rather than in the terminating phase, in exception of TAV and reoviruses. A higher detection of the viruses was observed in poults with clinical signs (as TAstV-1, TAstV-2 and TCoV were the most frequent) compared to normal birds (as TAstV-1 and rotavirus were the most frequent). Furher researches should focus on the description and comprehension of the role of each virus, and the different combinations of viruses, in the development of enteric disease.

As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia

As amostras sangüíneas de 108 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de Fibrose Cística foram analisadas com o objetivo de padronizar uma PCR clássica e uma PCR- ASO para a detecção da mutação delta F508. Dos 108 pacientes analisados, 23 eram homozigotos para a deleção delta F508 (21,29%), 50 eram heterozigotos (46,29%), e 35 não portadores (32,40%). Ambas as PCR apresentaram reprodutibilidade de 100%, e houve concordância absoluta entre os resultados deste estudo e aqueles dos laboratórios de referência. Concluímos que as padronizações propostas foram bem sucedidas, e recomendamos que os pacientes sejam testados com as duas técnicas, o que, encarece a investigação laboratorial, porém, aumenta significativamente o grau de confiabilidade dos resultados / Blood samples were drawn from 110 clinically and laboratory diagnosed Cystic Fibrosis patients in order to standardize one classical amplification and one ASO-PCR for detecting the delta F508 mutation. Twenty-four of 110 patients (21,8%) were homozygous for the delta F508 deletion, 51 were heterozygous, and the remaining 35 (31,8%) were non-carriers. Both PCR techniques presented with 100% reproducibility, and there were no discrepancies between our results and those from the reference laboratories. We concluded that the 2 amplification systems were successfully standardized in this study, and recommended that all patients should be tested by both techniques in order to increase reliability, albeit the increment of laboratory costs

Acinetobacter baumannii é um patógeno oportunista, geralmente resistente a muitos antimicrobianos, que causa surtos de infecções hospitalares. Assim, a sua habilidade de formar biofilme pode explicar a capacidade de sobreviver no ambiente hospitalar e em utensílios médicos. O objetivo desse estudo foi avaliar a capacidade de duas cepas clínicas de A. baumannii obtido de hospitais de Porto Alegre, Brasil (abC e abH) e uma cepa controle ATCC 19606 (abA) formar biofilme e realizar a análise transcricional dos genes possivelmente envolvidos na produção e manutenção do biofilme: bap, abaI, ompA, bfmRS, csuAB, pgaA, pilZ, wspR, eal, eagg, IscRSU e csdA. A capacidade de formação de biofilme foi avaliada pelo método cristal violeta em superfície plástica a 25°C e 37°C nos meios LB, LB + 1% glicose, urina pura e LB + 10% sangue de carneiro. A análise transcricional foi feita por real time PCR. A cepas AbH, AbC e AbA foram fortes formadoras de biofileme em LB e LB+glicose à 25 e 37°C. Em LB+sangue, as cepas AbH e AbA foram fortes formadoras e AbC foi fraca formadora de biofilme. Em urina, a cepa AbH foi moderadamente formadora, AbC e AbA foram fracas formadoras de biofilme. Os genes wspR, pgaA, ompA, bap, abaI de AbA, csdA de AbH e o operon IscRSU foram superexpressos em biofilme; os genes eagg de AbH, pilZ e csuAB foram inibidos e os genes bfmRS, eal, eagg de AbA, csdA de AbA e abaI de AbH não possuíram uma variação significativa na expressão durante o biofilme. Portantanto, a regulação positiva dos genes wspR, pgaA, ompA, bap, csdA e do operon IscRSU é um indício de sua importância na formação e manutenção do biofilme por esse patógeno. / Acinetobacter baumannii is an opportunistic pathogen which causes a wide range of nosocomial infections, being usually multirresistent to drugs. Their ability to form biofilm can explain the feature of surviving inside hospital environment and on medical devices. The aim of the present study was to evaluate the ability of two clinically isolated MDR A. baumannii strain, obtained from a general hospital of Porto Alegre, RS, Brazil (AbH and AbC), and the reference ATCC 19606 strain (AbA), to form biofilm and to analyze the relative expression of genes putatively involved in biofilm formation: bap, abaI, ompA, bfmRS, csuAB, pgaA, pilZ, wspR, eal, eagg, IscRSU e csdA. The biofilm formation capability was evaluated by the crystal-violet staining method on plastic surfaces at 25°C and 37°C using the broth LB, LB + 1% glucose, pure urine and LB + 10% sheep blood. The trancritional profiling of the genes was analyzed through real time PCR methodologies. The strains AbH, AbC e AbA were strong biofilm producers in LB e LB+glucose at 25 and 37°C. In the broth LB+blood, the strains AbH and AbA were strong biofilm producers and AbC was week biofilm producer. In urine, the strain AbH was moderated producer, AbC and AbA were week biofilm producers. The genes wspR, pgaA, ompA, bap, abaI from AbA, csdA from AbH and the operon IscRSU were overexpressed in biofilm; the genes eagg de AbH, pilZ e csuAB were suppressed and the genes bfmRS, eal, eagg from AbA, csdA from AbA e abaI from AbH did not vary their expression significantly during the biofilm condition. In conclusion, the factors wspR, pgaA, ompA, bap, csdA and of the operon IscRSU, that were positively regulated, appear to have an important role during the process of biofilm formation by A. baumannii.

Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum and Candidatus Mycoplasma turicensis are the causative agents of feline mycoplasmosis, these agents are gram-negative, pleomorphic, small and that adhere to the surface of erythrocytes of the animal involved. Clinical signs of feline mycoplasmosis are manifestations of acute or chronic anemia, occurring weight loss, anorexia, depression, pale mucous membranes, weakness, joint pain, soreness and occasionally splenomegaly and jaundice, the animal may come to death in severe cases. The diagnosis is based on detection of the parasite in blood smears and also in molecular diagnostics using PCR. Aiming to determine the occurrence of Mycoplasma spp. in domestic cats in a region of Belém, Pará, and hematological changes of animals naturally infected by these parasites were collected 201 blood samples with EDTA for Count Blood Cells (CBC) analysis and extraction of DNA for performing the Polymerase Chain Reaction (PCR) as well as blood smears ear tip for detection of the parasite on the surface of erythrocyte. Found 5.47% (11/201) of positive examination of blood smears, being 1.47% (1/68) of males and 7.51% (10/133) than females. The DNA of Candidatus Mycoplasma haemominutum was found in 7.96% (16/201) where 16.17 % (11/68) were males and 3.75% (5/133) females, was detected Mycoplasma haemofelis in 1.49% (3/201) of samples totaling 2.94% (2/68) of males and 0.75% (1/133) of females. The CBC showed changes in erythrocytes, hematocrit and hemoglobin only in those animals with DNA of Mycoplasma haemofelis. / Mycoplasma haemofelis, Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis são os agentes causadores da micoplasmose felina, estes agentes são bactérias gram-negativas, pleomórficas, pequenas e que se aderem à superfície dos eritrócitos do animal acometido. Os sinais clínicos da micoplasmose felina são manifestações de anemia aguda ou crônica, ocorrendo perda de peso, anorexia, depressão, membranas mucosas pálidas, fraqueza, dores articulares, hiperestesia e, ocasionalmente esplenomegalia e icterícia, podendo o animal vir a óbito nos casos mais graves. O diagnóstico é baseado na detecção do parasita em esfregaços sanguíneos e também no diagnóstico molecular pela PCR. Objetivando determinar a ocorrência de Mycoplasma spp. em felinos domésticos da região de Belém-Pará, e as alterações hematológicas dos animais naturalmente infectados por estes parasitos, foram coletadas 201 amostras de sangue com EDTA para análise de hemograma e extração de DNA para realização de Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) bem como esfregaços sanguíneos de ponta de orelha para detecção do parasita na superfície do eritrócito. Foram encontrados 5,47% (11/201) de positividade no exame de esfregaço sanguíneo, sendo 1,47% (1/68) de machos e 7,51% (10/133) de fêmeas. O DNA de Candidatus Mycoplasma haemominutum foi encontrado em 7,96% (16/201) dos animais onde 16,17% (11/68) eram machos e 3,75% (5/133) eram fêmeas, já Mycoplasma haemofelis foi detectado em 1,49% (3/201) das amostras, totalizando 2,94% (2/68) de machos e 0,75% (1/133) de fêmeas. O hemograma mostrou alterações em eritrócitos, volume globular e hemoglobina apenas nos animais em que foi detectado DNA de Mycoplasma haemofelis.

A Mancha marrom é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo em todo mundo. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. O objetivo do trabalho foi utilizar marcadores moleculares e fenotípicos para avaliar a variabilidade genética em isolados monopóricos e polispóricos de Bipolaris sorokiniana de sementes de trigo oriundos do Brasil e outros países. A caracterização molecular envolveu as metodologias URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR assim como testes isoenzimáticos e de patogenicidade. A análise de patogenicidade revelou que isolados polispóricos são mais severos para as sementes que para as partes aéreas das plantas quando comparados com os monospóricos. A caracterização isoenzimática e molecular através das técnicas URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR exibiram uma grande diversidade intra-populacional. REP-PCR e ERIC-PCR revelaram maior diversidade entre os isolados, com uma similaridade inferior a 70%. No entanto, as amplificações realizadas com o BOX-PCR apresentaram um perfil com uma maior similaridade. Com os resultados obtidos a partir das amplificações com BOX-PCR um par de primers foi desenhado a partir de um fragmento comum a todos os isolados e que foi capaz de amplificar um produto único ao gênero Bipolaris sp. entre as amostras testadas. Com a realização de mais ensaios com outros microrganismos é possível que o mesmo possa ser utilizado como um marcador deste gênero. A técnica de PCR-RFLP utilizando as enzimas HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII apresentaram perfis de restrição com variação no número de fragmentos e no peso molecular. Uma possível explicação para à variabilidade observada em todas as técnicas utilizadas pode ser atribuída à condição multinucleada das células de B. sorokiniana bem como a heterocariose, que pode levar a recombinação mitótica e ao polimorfismo. / The brown spot is a major disease of wheat caused by the pathogen Bipolaris sorokiniana, responsible for large economic losses in wheat cultivation worldwide. This fungus has a wide morphological, physiological and genetic diversity. The main objective of this work was to characterize monosporic and polisporic B. sorokiniana isolates of wheat seeds from Brazil and other countries. Pathogenicity tests were conducted to evaluate the feasibility of virulence genes as well as different molecular methodologies were tested as: URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR and isoenzyme patterns of the isolates. The pathogenicity assay reveals that the polysporic isolates caused a more severe disease to seeds than to aerial parts of the plants when compared to single spore isolates. Isoenzyme and molecular characterization through the URP-PCR, PCR-RFLP, REP-PCR, BOX-PCR, ERIC-PCR techniques showed a large intra-population diversity among the isolates. REP and ERIC-PCR revealed greater diversity among the isolates with a similarity below 70%. However, the amplification results using with BOX- PCR showed a highest similarity. The PCR-RFLP using HaeIII, HinfI , HhaI , EcoRI and HindIII restriction enzymes showed a profile variation between all isolates in relation to the number and molecular weight of the fragments. However the results obtained with BOX- PCR amplifications a higher similarity was obtained. With this result a primer was designed, based on a fragment common to all isolates, and the amplifications using these primers produced a unique fragment with the Bipolaris genus among others isolates tested. More phytopatogeneic isolates must be tested in order to confirme the specificity for Bipolaris sp. With the PCR-RFLP assay, using the enzymes HaeIII, HinfI, HhaI, EcoRI e HindIII, variability was observed among the restriction patterns realated to the number of fragments and molecular weight. One possible explanation for the observed variability in all techniques used may be attributed to the condition of multinucleated cells of B. sorokiniana and the heterokaryosis which can lead to mitotic recombination and polymorphis.

O diagnóstico de neurosífilis é freqüentemente dependente dos resultados dos testes serológicos e alterações no líquido cefalorraquidiano, mas a confiabilidade desses resultados em pacientes com infecção pelo HIV-1 tem sido questionada especialmente em pacientes assintomáticos com sífilis latente. O estudo se propõe avaliar a presença de DNA do T. pallidum no LCR de pacientes assintomáticos infectados pelo HIV, com o diagnóstico de sífilis. Amostras de LCR foram coletadas de 12 pacientes infectados pelo HIV atendidos em um terciário localizado no sul do Brasil , durante o período de 2012 a 2013. A presença de DNA do T. pallidum foram analisadas nas amostras de LCR pelo método de PCR “seminested”. Dados demográficos dos pacientes, parâmetros bioquímicos, celularidade e VDRL do LCR e linfócitos T-CD4 também foram analisados. Nas amostras de LCR de cinco dos 12 pacientes (40%) foram detectados o DNA do T. pallidum . Inesperadamente, nestes doentes, os níveis de contagem de células, proteína e glicose no LCR foram normais. Além disso , nenhuma destas cinco amostras de CSF apresentou uma reacção positiva VDRL. Os títulos de VDRL no soro foram semelhantes entre pacientes positivos e negativos para a presença T. pallidum DNA no LCR. A maioria dos pacientes com DNA de T. pallidum detectável apresentaram baixos títulos de VDRL no soro. O VDRL sérico elevado com título de 1:64 foi observada em apenas um paciente. Nossos resultados demostraram que os pacientes assintomáticos infectados pelo HIV com evidência de sífilis latente e LCR normais podem apresentar DNA de T. pallidum detectável no LCR. A detecção do DNA do T. pallidum pelo nosso seminested PCR pode fornecer informações adicionais além da análise convencional do LCR para o diagnóstico de neurossífilis. presença do DNA de T. pallidum no LCR em pacientes infectados pelo HIV com sífilis latente e resultados de LCR normais pode determinar uma mudança terapêutica do uso de penicilana benzatina intramuscular para o de penicilina cristalina intravenosa aquosa para o tratamento da sífilis. / Neurosyphilis diagnosis is frequently dependent upon the results of serological tests and cerebrospinal fluid abnormalities, but the reliability of findings in patients with HIV-1 infection has been questioned, especially asymptomatic patients with latent syphilis, We present the data on the presence of T. pallidum DNA in CSF from asymptomatic HIV-infected patients with the diagnosis of syphilis. CSF and serum samples were collected from 12 HIV-infected patients attending a tertiary care located in southern Brazil, during the period 2012 to 2013. In CSF samples from five of 12 patients (40%), we detected T. pallidum DNA. Unexpectedly, in these patients, CSF cell count, protein and glucose levels were normal. In addition, none of these 5 CSF samples presented a positive VDRL reaction. Serum VDRL titers were similar between patients with positive and negative CSF T. pallidum DNA. Most patients with detectable T. pallidum DNA presented low serum VDRL titers. Serum VDRL titer of 1:64 was observed in one patient. Our results have shown that asymptomatic HIV-infected patients with evidence of latent syphilis and normal CSF might present detectable T. pallidum DNA in the CSF. The detection of T. pallidum DNA by our seminested PCR provide additional information beyond conventional CSF analysis for diagnosis of neurosyphilis. The detection of T. pallidum DNA in the CSF despite normal CSF findings in HIV-infected patients could also provide a different therapeutic approach including the use of intravenous aqueous crystalline penicillin.

Orientador: Fausto Foresti / Banca:Diogo Teruo Hashimoto / Banca: Renato Hajenius Ache de Freitas / Banca: Maria Rita de Cássia Barretto Neto / Banca: Vanessa Paes da Cruz / Resumo: Tubarões e raias estão atualmente entre os vertebrados mais ameaçados de extinção. Tal fato se deve principalmente à exploração pesqueira que permanece sem medidas eficientes de controle em quase todo o planeta, inclusive no Brasil. Considerando-se que cada espécie responde de forma independente às pressões ambientais e principalmente às ações humanas, é de fundamental importância para o desenvolvimento de planos de manejo adequado das suas populações e o ordenamento da exploração sustentável destes recursos que se proceda à caracterização da biodiversidade local, a avaliação das espécies mais capturadas e identificação dos táxons e populações mais suscetíveis à pesca. Contudo, especialmente para os elasmobrânquios, tais parâmetros são de difícil acesso, sobretudo devido às similaridades morfológicas entre as espécies e ainda, devido à prática pesqueira de remoção de partes dos animais como a cabeça e nadadeiras antes dos desembarques, inviabilizando a identificação da maioria das espécies. Segundo os registros de captura de elasmobrânquios elaborados pelo IBAMA nos últimos anos, apenas cerca de 20% dos indivíduos recebem alguma menção quanto à espécie, muitas vezes um nome popular que pode estar relacionado a mais de uma espécie biológica em diversos casos, sendo o restante do produto classificado apenas como cações. A utilização de ferramentas moleculares nos estudos da composição da biodiversidade tem proporcionado sua aplicação em diversas áreas, incluindo na identificação das espécies, no estudo de suas relações evolutivas e no auxílio de programas para a sua conservação. A identificação molecular com a utilização de técnicas do tipo PCR-multiplex e sequências barcode, que identificam características genéticas particulares de cada táxon estão atualmente sendo desenvolvidos e utilizados no reconhecimento das espécies, possibilitando a identificação... / Abstract: Sharks and rays are currently among the most threatened vertebrate to extinction. This is due mainly to the fact that overfishing remains without effective control measures in almost the entire planet, including Brazil. Considering that each species responds independently to environmental pressures, and mainly to human actions, it is of fundamental importance for the development of appropriate management plans and programming the sustainable exploitation of these resources, to proceed to the characterization of local biodiversity, in the assessment of the species caught, in the correct identification of taxa and the most susceptible populations to fishing activities. However, especially for elasmobranches, such parameters are difficult to access, especially due to morphological similarities between species and also because of the fishing practice of removing parts such as the head and fins before landings, making it impossible to identify the most species. According elasmobranches capture records prepared by IBAMA in recent years, only about 20% of individuals receiving some identification indication, often only a popular name that can be related to more than one biological species, with the remainder fishing product classified just as sharks. The use of molecular tools in studies of the composition of biodiversity has provided its application in various areas, including in the identification of the species, in the study of their evolutionary relationships, and in assisting programs for their conservation. The use of molecular identification techniques as the PCR-multiplex type, and barcode sequences using part of the mitochondrial gene sequence Cytochrome Oxidase subunit I that permit to identify particular genetic characteristics of each taxon, are currently being used in the species recognition allowing simultaneous identification of different samples. In the present work, the objective of the study was to identify the species occurring... / Doutor