A diarréia neonatal é o principal problema sanitário que acomete os bezerros nas primeiras semanas de vida, causando grandes prejuízos devido à morbidade, mortalidade, custos com tratamento e atraso no desenvolvimento. Os rotavírus são os mais importantes agentes virais causadores de gastroenterites em crianças e diarreia em diferentes espécies animais. Além do seu impacto econômico na produção animal, os bovinos podem atuar como reservatórios da diversidade genética e antigênica para humanos. Assim, o diagnóstico deste agente é fundamental para o desenvolvimento de medidas profiláticas mais especificas visando o seu controle. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de PCR em Tempo Real para a detecção de rotavírus bovinos em sistema Taqman® tendo como alvo, a proteína não-estrutural 5 (NSP5). Para isso, 113 amostras de fezes bovinas foram coletadas de reabanhos do estado de São Paulo, e previamente testadas por PCR convencional. Para a padronização da PCR em Tempo Real, a estirpe padrão foi clonada, gerando um plasmídeo com 3x1010 cópias/reação. Como controle exógeno foi utilizado β-actina. O limite de detecção foi determinado por diluições seriadas na base 10, detectando até 6x101 cópias/µl. A curva padrão da PCR em Temo Real para a detecção do segmento codificador da proteína NSP5 teve como resultados, uma eficiência de 100,47%; com slope igual a -3,18 e R2 de 1,0. De um total de 113 amostras testadas pela PCR convencional 63 delas (55,7%) foram consideradas positivas para rotavírus. Dessas mesmas amostras testadas, 5 não amplificaram para β-actina e não foram incluídas nas análises posteriores. Para a PCR em Tempo Real o limite de detecção foi considerado o valor de 6x101 cópias/reação, sendo definido o ponto de corte o ciclo (Ct) de número 36 para o teste com a amostra viral a partir do DNA ligado em vetor plasmidial. Considerando-se o ponto de corte de 60 (6x101) cópias/reação, das 108 amostras testadas, 63 (58,3%) foram consideradas positivas ao teste. O valor de concordância obtido através do teste Kappa, a um intervalo de confiança de 95%, a partir dos resultados gerados entre os testes de PCR convencional e PCR em foi de 0.279 (baixa concordância). Os resultados obtidos nesse estudo demonstrou que o teste foi eficiente podendo ser utilizado para um diagnóstico rápido e eficiente do rotavirus do grupo A, aumentando assim o repertório dos testes já estabelecidos / Neonatal diarrhea is the main health problem affecting the calves in the first weeks of life, causing major losses due to morbidity, mortality, treatment costs and delayed development. Rotaviruses are the most important causative agents of viral gastroenteritis in children and in different animal species. In addition to its economic impact on livestock, cattle can act as reservoirs for genetic and antigenic diversity for human samples. Therefore, the diagnosis of this agent is critical to the development of more specific preventive measures for their control. The objective of this work is to develop a method of PCR for rotavirus detection in cattle using TaqMan® system targeting the 5 nonstructural protein (NSP5). For this, 113 samples of cattle feces were collected from farms of São Paulo, and previously tested by convencional PCR. To PCR standardization, the standard sample was cloned, generating plasmid 3x1010 copies/reaction. The β-actin was usede as exogenous control. The limit of detection was determined by serial dilutions, to detect 6 x101 copies/µl. The standard curve of PCR to encoding segment detection NSP5 protein had as a result, an efficiency of 108.5%; with slope equal to -3.18 and R2 equal 1.. From a total of 113 samples tested by conventional PCR 63 (55.7%) were positive for rotavirus. From these samples 5 not amplifyed for β-actin gene and were not included in subsequent analyzes. For detection limit of Real-Time PCR was considered the amount of 6x101 copies / reaction, the cut-off being defined cycle (Ct) number 36 to the test with a viral sample from the DNA ligated into plasmid vector. Considering the cut-off 60 (6x101) copies/reaction of the 108 samples tested, 63 (58.3%) were positive to the test. The correlation value obtained by the Kappa test, at a 95% confidence interval, based on results generated between the conventional and PCR testing PCR was 0.279 (low agreement). The results of this study demonstrated that the probe can be efficiently used for a fast and efficient diagnosis of rotavirus of group A, thereby enhancing the repertoire of the established tests

Os rotavírus estão entre os principais causadores de diarreia em humanos e animais, inclusive em mamíferos e aves. Os sintomas da doença geralmente incluem diarreia e depressão, aumento da mortalidade, e \"runting and stunting syndrome\", caracterizado principalmente por perda de peso, também tem sido atribuído a infecções por rotavírus em aves. O capsídeo externo da partícula viral é formado pelas proteínas estruturais VP4 e VP7 que possuem antígenos de neutralização baseados nos quais os rotavírus são classificados em genotipos P e G, respectivamente. O capsídeo intermediário é formado pela VP6 que define os grupos de rotavírus de A-G de acordo com a reatividade de anticorpos ou sequenciamento nucleotídico desta proteína. A proteína não estrutural NSP5 está envolvida no processo de replicação viral, sendo essencial para a formação dos viroplasmas. Este estudo teve o objetivo de pesquisar a frequência de ocorrência de rotavírus dos grupos A e D, em amostras fecais de aves de diferentes criações comerciais brasileiras, seguida da caracterização dos genotipos P e G, dos rotavírus do grupo A, através de sequenciamento nucleotídico. Para isso, 111 pools de amostras fecais foram processados através das técnicas de ELISA, PAGE e RT-PCR (NSP5), resultando em 43 (38,73%) amostras positivas pelas três técnicas. Definiram-se os genotipos G5, G8 e G11 através de RT-PCR (VP7) e o genotipo G19 após reação de RT-PCR seguida de sequenciamento nucleotídico. Definiu-se ainda o genotipo P[31] a partir do sequenciamento de amostras positivas por RT-PCR (VP4). Das 111 amostras processadas por RT-PCR visando o gene codificador da VP6, obtiveram-se 4 sequências que confirmaram tratar-se de rotavírus do grupo D. Os genotipos G5, G8 e G11 estão relacionados a surtos em bovinos e suínos, enquanto que os genotipos G19 e P[31] estão descritos em aves. Conclui-se que os rotavírus encontram-se amplamente disseminados nas criações comerciais brasileiras devido à elevada frequência da ocorrência e que existe a possibilidade de transmissão interespécie. / Rotavirus are a major cause of diarrhea in humans and animals, including several mammalian and avian species. The symptoms of the disease generally include diarrhea and depression, increased mortality and the chronic runting and stunting syndrome mainly characterized by weight loss have also been linked to rotavirus infections of birds. The outer layer of the virus particle is formed by VP4 and VP7 proteins, which possess neutralization antigens. Based on VP7 and VP4 the rotavirus are classified into genotypes G and P respectively. The intermediate layer consists of VP6 which defines the rotavirus groups. Based on the antibody reactivity and sequence identity of VP6, seven rotavirus groups (A to E) have been defined. The NSP5 are involved in viral replication and they are essential for the formation of viroplasm. Here we report the occurrence of group A and D rotavirus in feces of broilers, layers and broiler breeders from Brazilian poultry farms. A total of 111 pools of intestinal contents were processed in this study, using a ELISA, PAGE and RT-PCR (NSP5) techniques. Out of 111 pools of fecal samples tested, 43 showed positive results (38.73%) for rotavirus. Were typed the G5, G8 e G11 genotypes using the RT-PCR (VP7) and the G19 genotype using a RT-PCR followed by nucleotide sequencing reaction of the amplicons. Was defined the P[31] genotype using the RT-PCR (VP4) technique followed by nucleotide sequencing reaction. Out of 111 pools of fecal samples tested by RT-PCR (VP6), 4 showed positive results for rotavirus of group D. The G5, G8 and G11 are typical bovine and porcine rotavirus genotypes, whereas the G19 and P[31] genotypes are found in birds. As a conclusion, rotavirus is widely spread in commercial Brazilian poultry farms due to the high frequency of occurrence and there is the possibility of interspecies transmission.

De um total de 187 amostras fecais coletadas no ambulatório do Hospital Universitário/USP, entre 1994 a 1996, 54 (28,9%) foram positivas para rotavírus. Entre as amostras caracterizadas por EGPA foram identificados nove perfis eletroforéticos longos, dois curtos e um tipo não usual. O subgrupo II e o sorotipo G2 foram os mais freqüentemente identificados. Foram caracterizadas três amostras com misturas de sorotipos. As amostras positivas e mais 163 amostras, coletadas em um laboratório particular, em 2000, foram genotipadas. Os genótipos G2P[4] e G1P[8] foram os mais freqüentes nos anos de 1994-1996 e G1P[8] e G9P[8], os mais freqüentes em 2000. Os genótipos G3 e G4 foram detectado em menor freqüência. No HU, 20 (38,5%) amostras foram caracterizadas como misturas de genótipos G e 16 (29,6%), como misturas de genótipos P; não foram identificadas misturas em 2000. Dezoito amostras foram caracterizadas como P[10] por RT-PCR mas a análise da seqüência de nucleotídeos mostrou uma homologia de 90,7 a 98,0% com a amostra padrão P[8]. / From 187 fecal samples collected from outpatients at Hospital Universitário (HU)/ USP, between 1994 to 1996, 54 (28,9%) were positive for rotavirus. Positive samples were submitted to electropherotyping, subgrouping, and G serotype. Electropherotypes were characterized as nine different long genome profiles, one short and one unusual profile. Subgroup II and G2 serotype were the most frequently found and three samples showed mixed serotypes. Rotavirus samples and an additional 163 positive fecal samples, collected in a private laboratory in 2000, were G and P genotyped. Genotypes G2P[4] and G1P[8] were the most frequently found in 1994-1996 and, in 2000, G1P[8] and G9P[8] were the most frequent. Genotype G3 and G4 were detected as minor strains in both years. For HU, G genotype mixtures were found in 20 (38.5%) samples and P mixtures were found in 16 (29.6%). No mixtures were identified in 2000. Nucleotide sequencing and phylogenetic analysis of 18 P[10] samples by RT-PCR showed 90.7 to 98.0% homology with the P[8] prototype.

O rotavírus é a principal causa de diarréia em crianças em todo o mundo. Infecta também adultos, mas não há dados completos sobre a sua incidência nesse grupo nem sobre o papel de anticorpos preexistentes na proteção contra o vírus. O objetivo do trabalho foi avaliar a presença de anticorpos IgA e IgG anti-rotavírus SA-11, por ELISA, em amostras de soro de adultos saudáveis e sua ação neutralizante frente ao vírus, em ensaios de neutralização. Por Immunoblotting foi avaliado o reconhecimento de proteínas virais pelos anticorpos séricos. Observou-se que os títulos das amostras foram muito variáveis, sendo os de IgG superiores aos de IgA. Todas as amostras mostraram-se capazes de neutralizar o vírus em diferentes níveis, porém não foi possível estabelecer uma correlação com os títulos de anticorpos. Foi observado que anticorpos da classe IgG reconhecem mais proteínas virais que os da classe IgA. Este trabalho pode ser considerado mais um passo na elucidação do papel dos anticorpos séricos IgA e IgG anti-rotavírus na infecção em adultos. / Rotavirus has been considered the leading cause of diarrhea in children worldwide. The virus also infects adults but there is no conclusive data neither on the incidence of infection on this group nor on the role of pre-existing antibodies. The aim of the work was to evaluate the presence of anti-rotavirus SA-11 IgA and IgG by ELISA in serum samples of healthy adults and the serum neutralizing ability against the virus by neutralization assays. Immunoblotting was used to evaluate viral proteins recognition by serum antibodies. The antibody titers were extremely variable where IgG titers are greater than IgA ones. All samples were able to neutralize the virus in different levels but it was not possible to establish a correlation between antibody titers and neutralization ones. Immunoblotting assays revealed that IgG antibodies recognize more viral proteins than IgA did. This work can be considered a valuable step for elucidating the role of serum anti-rotavirus IgG and IgA antibodies in adults infection.

Os vírus entéricos humanos são encontrados no esgoto e em subprodutos dos processos de tratamento. Recentemente vem sendo recomendados como indicadores de qualidade microbiológica em normas da legislação brasileira e também nas de outros países, mas ainda com parâmetros a definir. O objetivo do estudo é a avaliação e a comparação entre métodos clássicos e moleculares aplicados à detecção de vírus entéricos em amostras de água de reúso e de lodo, visando subsidiar a legislação brasileira. Ensaios de semeadura experimental de protótipos de rotavírus e de adenovírus foram realizados nas matrizes ambientais e os vírus detectados por métodos clássicos (cultivo celular e reação de imunoperoxidase) e moleculares (PCR/nested-PCR, RT-PCR e ICC-PCR), determinando-se os limites de detecção de cada método para cada matriz. A pesquisa de rotavírus e adenovírus presentes naturalmente em 25 amostras de água de reúso e em 25 de lodo possibilitou a comparação dos métodos propostos. O ICC-PCR mostrou ser o método mais factível a ser aplicado na área de saneamento. / Human enteric viruses are common contaminants of raw sewage and subproducts of sewage treatment processes. In recent years, those viruses were recommend as new microbiological indicators in different matrices in Brazilian legislation and others countries, although some questions should be elucidated. At present, the aim was to evaluate and compare the efficiencies of standard and molecular virological methods for detection of human enteric viruses in sludge and reclaimed water samples. Rotavirus and adenovirus were experimentally spiked in the proposed matrices and virus recovery and detection limits established for each method and matrice. Viruses naturally presented in 25 samples of sludge and 25 samples of reclaimed water were assayed by all methods and results evaluated and compared for statistical significance. From all methods evaluated, ICC-PCR showed to be the most suitable for virus surveillance in sludge and reclaimed water.

Os rotavírus e coronavírus são importantes agentes virais associados às enteropatias em suínos, tendo implicações em Saúde Animal, Saúde Pública e no Agronegócio. Apesar disso, são escassos os trabalhos em nosso meio que visaram detectá-los e caracterizá-los com maior amplitude, especialmente os coronavírus. Nesse sentido, determinou-se a ocorrência das amostras circulantes destes vírus a partir de materiais clínicos oriundos de diversas granjas produtoras de suínos de 12 diferentes municípios do Estado de São Paulo, mediante o emprego de três reações, previamente descritas, em paralelo: uma multiplex nested RT-PCR para detecção simultânea de dois coronavírus suínos que podem ser encontrados nas fezes desses animais, o Vírus da Gastroenterite Transmissível (TGEV) e o Vírus da Diarreia Epidêmica dos Suínos (PEDV), e rotavírus do grupo A; uma nested RT-PCR para investigar a existência de algum pancoronavírus nos animais pesquisados; e uma RT-PCR para verificar a ocorrência do TGEV e do Coronavírus Respiratório Suíno (PRCoV), o qual também pode ser observado em materiais fecais de porcos. Para a primeira reação, foram utilizados dois pares de primers dirigidos ao gene S do TGEV (951pb e 793pb), dois ao gene M de PEDV (425pb e 291pb), e dois ao gene NSP5 do rotavírus (317pb e 208pb); para a segunda, foram empregados quatro primers direcionados ao gene RdRp dos coronavírus (251pb e 136pb); e para a terceira, foi usado um par de primers tendo como alvo o gene S (886pb para TGEV e 205 a 214pb para PRCoV). Os dados obtidos demonstraram que há uma elevada frequência de ocorrência de rotavírus nas criações comerciais, acometendo 40,37% do total de amostras testadas (88/218) e 91,6% dos municípios amostrados (11/12 municípios). Os coronavírus não foram detectados nas criações. Os fragmentos de rotavírus amplificados provenientes da multiplex nested RT-PCR foram purificados e caracterizados através da determinação das sequências de nucleotídeos, referentes aos genes VP4 e VP7. Foi possível o sequenciamento nucleotídico total do gene VP7 de uma amostra, e o sequenciamento parcial de 34 (aproximadamente 24,74% a 35,57% da região codificadora) e 23 (aproximadamente 63,19% a 98,77% da região codificadora) amostras para o gene VP4 e VP7, respectivamente. Quanto aos genotipos, foram detectados o G3, G5 e G9 em combinação com P[6], P[13] (e/ou P[22]) e P[23]. Formulações vacinais disponíveis comercialmente contemplam apenas os genotipos G4 e G5 dos rotavírus, o que demonstra uma desvantagem em termos de proteção de animais suscetíveis, visto que somente um deles (G5) foi encontrado nos animais analisados no presente estudo. O conhecimento deste víru permite estudos quanto à transmissão zoonótica e interespécies deste micro-organismo e o fortalecimento do controle e de medidas profiláticas direcionadas ao agente. / The rotavirus and coronavirus are important viral agents associated with enteropathies in pigs, with implications for Animal Health, Public Health and Agribusiness. Nevertheless, there is little data about the detection and characterization of these viruses, especially the coronavirus. This study determined the occurrence of them on farrow-to-finish pig farms from 12 different cities in the São Paulo State, Brazil. For this purpose, three reactions, previously described, were performed: multiplex nested RT-PCR for simultaneous detection of two porcine coronavirus that can be found in the feces of these animals, the Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) and the Porcine Epidemic Diarrhea Virus (PEDV), and group A rotavirus; a nested RT-PCR to investigate the occurrence of any member of the genus Coronavirus; and a RT-PCR for detection of the TGEV and Porcine Respiratory Coronavirus (PRCoV), which can also be observed in fecal samples of swine. For the first reaction, we used two pairs of primers targeting the S gene of TGEV (951bp and 793bp), two primers targeting to the M gene of PEDV (425bp and 291bp), and two primers targeting the NSP5 gene of group A rotavirus (317bp and 208bp). For the second reaction, four primers were used targeting to the RdRp gene of coronaviruses (251bp and 136bp). In the third reaction, a pair of primers was used targeting the S gene (886bp to TGEV and 205-214bp to PRCoV). This data showed that 40.37% of the total samples tested (88/218) and 91.6% of the cities (11/12 cities) were positive for rotavirus. Coronaviruses were not detected on farms examined in this study. The rotavirus positive stools were characterized based on PCR and nucleotide sequence analyses for the VP4 and VP7 genes. The VP7 complete nucleotide sequencing was obtained for one sample, and partial nucleotide sequencing for 34 (about 24.74% to 35.57% of coding region) and 23 (about 63.19% to 98.77% of coding region) samples for the VP4 and VP7 gene, respectively. The genotypes G3, G5 and G9 in combination with P[6], P[13] (and / or P[22]) and P[23] was found. Commercially available vaccine formulations include only the G4 and G5 rotavirus genotypes, which demonstrates a disadvantage in terms of protection of susceptible animals, whereas only one (G5) was detected in the animals analyzed in this study. The knowledge of this virus allows studies of the zoonotic and interspecies transmission of this microorganism and the strengthening of control and prophylactic measures directed to the agent.

As cepas vacinais rotavírus reassortants G1, G2, G3, G4 e G9 foram obtidas de um rearranjo genético entre cepas humanas de rotavírus do grupo A do sorotipo G (D, DS-1, P, ST-3 e AU32) e a cepa bovina UK-Bovine. Neste estudo, a cepa reassortant de rotavírus IB-BRV-4-G4 foi formulada, em duas condições, sem adjuvante (Esquema 1) e com adjuvante (Esquema 2) para imunização de camundongos Balb/c. Três AcMos da classe IgM foram obtidos da fusão utilizando animais do Esquema 1 e com o esquema 2 foram obtidos 3 AcMos, dois da classe IgA e um da subclasse IgG1. Destes últimos, dois AcMo (IgA) reconheceram somente epitopos conformacionais em teste de Dot-blot. Entretanto, o AcMo 3 (IgG1) foi reativo a proteínas virais também por Western Blotting, em uma região de perfil eletroforético coincidente com a glicoproteína VP7 de rotavírus. Os resultados mostram que o esquema II de imunização resultou em AcMo específicos para o sorotipo G4, sendo o AcMo IgG1 um forte candidato a ser utilizado nos testes de potência da vacina pentavalente de rotavírus do Instituto Butantan. / The rotavirus strain (G1, G2, G3, G4 and G9) were obtained of reassortants between human rotavirus of the group A and G serotypes (D, DS-1, P, ST-3 and AU32) and a strain from bovine (UK-Bovine).In this study, IB-BRV-4-G4 reassortant rotavirus strain was used to immunize Balb/c mice. Two schedules of immunization were used in the animals, one with IB-BRV-4-G4 (E1) and other with rotavirus antigen and adjuvant (E2). Three monoclonal antibodies of IgM class were obtained of cells from mice immunized only with rotavirus antigen (E1) and with (E2) was obtained three monoclonal antibodies, two producers the IgA class and one the IgG1 subclass. The IgA clones were reactive to G4 serotype rotavirus antigen only in the Dot-blot test. The mAb IgG1 was also reactive to viral proteins in a region of electrophoresis profile in the Western blotting test that coincided with the glycoprotein VP7 of rotavirus. The results indicate that the IgG1 obtained is specific to G4 serotype of rotavirus. It is candidate to be for use in the potency test of pentavalent vaccine.

Orientadora: Maria da Glória Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: O presente estudo teve como objetivo determinar a ocorrência de rotavírus do grupo A e a genotipagem G e P de estirpes detectadas em bezerros de rebanhos leiteiros e gado de corte, durante o período de julho de 2006 a setembro de 2008, em propriedades rurais do Estado de São Paulo, Brasil. Foram amostrados 395 bezerros, na faixa etária entre 1 e 60 dias, independentemente da manifestação clínica de diarréia, de 18 rebanhos bovinos, sendo nove de exploração leiteira e nove de gado de corte. Por meio da técnica de eletroforese em gel de poliacrilamida (EGPA), determinou-se a ocorrência de rotavírus em 33,3% (06/18) entre os rebanhos e de 8,6% (34/395) na população amostrada. A maior freqüência de infecção foi detectada em animais com idade entre 16 e 30 dias (p < 0,01). Foram diagnosticados bezerros infectados por rotavírus tanto em animais com sinais clínicos de diarréia (22%;29/133) quanto naqueles clinicamente normais (1,9%;05/262), existindo, porém, uma correlação entre a presença da infecção e a manifestação clínica da diarréia (p<0,01). Em relação ao tipo de exploração, nos rebanhos leiteiros 0 percentual de ocorrência foi de 5,3% (14/264), enquanto que nos rebanhos de gado de corte o rotavírus teve maior ocorrência (15,3%; 20/131). A análise do perfil do genoma de rotavírus por EGPA identificou dois eletroferótipos distintos, cujas diferenças estavam localizadas na posição de migração dos segmentos 2, 3, 7, 8 e 9. A genotipagem pela reação em cadeia pela polimerase (RT-SNMPCR) das amostras de rotavírus revelou a que as estirpes circulantes nos rebanhos eram G6P[5], G10P[5], não foi possível fazer associação com o genotipo P[1]. / Abstract: The present study aimed to determine the Group A rotavirus and G/P genotyping in detected virus strains in dairy and beef cattle calves from July 2006 to September 2008 in São Paulo State-Brazil farms. 395 calves in 18 flocks (9 dairy cattle and 9 beef cattle) from 1 to 60-day-old were sampled, independently whether manifesting clinically diarrhea or not. By using Poliacrylamide Gel Electrophoresis Technique (PAGE), the rotavirus occurrence of 33.3% (06/18) among flocks and 8.6% (34/395) among the population sampled were determined. The higher infection frequency was detected in 16-to-30-day-old calves (P<0.01). Rotavirus-infected flocks rotavirus-infected were diagnosticated as much the ones having clinical symptoms of diarrhea (22%, 29/133) as the ones clinically normal (1.9%, 05/262), shawing a correlation between the presence of infection and the diarrhea manifestation (p<0.01). Related to the kind of exploration, the occurrence in dairy cattle was 5.3% (14/264) while in the beef cattle the occurrence was higher (15.3%, 20/131). The rotavirus genome profile analysis by PAGE identified two distinct electroferotypes, in which differences were located in the following segment migration positions: 2, 3, 7, 8 and 9. The genotyping of the Rotavirus sample by polymerase chain reaction (RT-snmPCR) revealed that the circulating strains among the flocks were G6P[5], G10P[5] e G?P[1]. / Mestre

Orientador: Maria da Gloria Buzinaro / Banca: Samir Issa Samara / Banca: Ricardo Luiz Moro de Sousa / Resumo: Os rotavírus são os principais agentes causadores de diarreias em várias espécies animais e nos seres humanos, causando grandes prejuízos econômicos e de saúde pública. Uma característica marcante desse vírus é a grande diversidade genotípica das estirpes circulantes. Informações sobre genotipagem são imprescindíveis para estabelecer mecanismos de vigilância epidemiológica da infecção por rotavírus. O presente trabalho teve como objetivo discutir a epidemiologia de rotavírus na espécie bovina por meio de estudos desenvolvidos entre os anos 2006 e 2010, no Laboratório de Rotavirose da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho" (FCAV/Unesp). Foram obtidas 803 amostras de fezes de bezerros, na faixa etária de 1 a 90 dias, com e sem diarreia, de 48 rebanhos de gado bovino leiteiro e de corte localizados no Estado de São Paulo. As amostras foram caracterizadas com base nos testes de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). O teste de PAGE indicou animais positivos em 33,3% (16/48) dos rebanhos e 6,1% (49/803) das amostras analisadas. Nos rebanhos leiteiros foram detectados animais infectados por rotavírus nas diferentes faixas etárias de até 90 dias de idade, enquanto nos rebanhos de corte alta frequência (22,8%) de amostras positivas foi verificada em bezerros entre 1 e 15 dias (P<0,05). A análise do perfil do genoma no PAGE identificou sete eletroferótipos, característicos de rotavírus do grupo A, indicando grande diversidade genômica do rotavírus nos rebanhos estudados. A caracterização molecular dos genótipos G (VP7) e P (VP4) pela RT-PCR identificou o genótipo G6P[5] como o mais comum. Foram construídos mapas que analisaram a distribuição espacial dos rotavírus detectados. O trabalho de identificação do rotavírus é de grande valia, uma vez que... / Abstract: Rotavirus is the major causative agent of diarrhea in several animal species and humans, causing large economic and public health damage. A striking feature of this virus is the great genotypic diversity of circulating strains. Genotyping information is essential to establish surveillance mechanisms of rotavirus infection. This study aimed to discuss the epidemiology of rotavirus in cattle through studies conducted between 2006 and 2010, the Rotavirus Disease Laboratory of the Faculty of Agriculture and Veterinary Sciences of the Universidade Estadual Paulista "Julio de Mesquita Filho" (FCAV / UNESP), 803 samples of feces of calves were obtained, ranging in age from 1 to 90 days, with and without diarrhea, 48 herds of dairy and beef cattle in the State of São Paulo. The samples were characterized on the basis of electrophoresis tests on polyacrylamide gel (PAGE) and then reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). The PAGE test indicated positive animals in 33.3% (16/48) of the herds and 6.1% (49/803) of the samples. In dairy herds infected animals were detected rotavirus in different age groups (P> 0.05), while in the high frequency cut herds (22.8%) of positive samples was observed in calves between 1 to 15 days (P <0,05). The genome profile analysis in PAGE identified seven eletropherotypes characteristic of rotavirus group A, indicating a high genomic diversity of rotavirus in the herds. The molecular characterization of genotype G (VP7) and P (VP4) by RT-PCR identified the genotype G6P [5] as the most common. Maps were constructed to analyze the spatial distribution of detected rotavirus. Rotavirus identification work is of great value, since it is evident that different genotypes agent is spread in São Paulo presenting different forms of production / Mestre

Os rotavírus são os responsáveis pela ocorrência de diarreias em humanos e outras diversas espécies animais. Estão amplamente disseminados na suinocultura, inclusive no Brasil. As proteínas não estruturais 2 e 5 (NSP2 e NSP5) dos rotavírus estão envolvidas nas etapas de replicação viral, sendo essenciais para a formação do viroplasma, uma estrutura citoplasmática no interior da qual ocorre a morfogênese das novas partículas virais. Entretanto, são escassos os estudos sobre a diversidade genética destas proteínas em rotavírus circulantes nas criações brasileiras. Até o presente momento, a NSP2 pode ser classificada em nove genotipos (N1 ao N9) e a NSP5, 11 (H1 ao H11), sendo que em humanos foram descritos os genotipos N1, N2, N3 e H1, H2 e H3, e em suínos N1 e H1. Este estudo teve o objetivo de caracterizar as amostras circulantes de rotavírus em termos da diversidade da NSP2 e NSP5. Para isso, um total de 63 amostras fecais provenientes de criações de suínos localizadas em seis diferentes municípios do Estado de São Paulo, Brasil, foram previamente triadas mediante a técnica de nested-PCR. Destas, nove tiveram os respectivos segmentos genômicos amplificados pela reação de RT-PCR, sendo que em sete foi possível o sequenciamento nucleotídico parcial para NSP2 e, em seis, o sequenciamento total para NSP5. Todas foram caracterizadas como genotipo N1 e H1. Considerando o gene NSP2, nas amostras aqui definidas, a identidade nucleotídica variou de 100% a 86,4%, e em termos de aminoácidos, de 100% a 91,5%, enquanto que para NSP5 foi de 100% a 95,1%, e de 100% a 97,4% respectivamente para nucleotídeos e aminoácidos. Conclui-se que os genotipos das amostras circulantes na região de estudo estão em concordância com aqueles descritos na literatura para a espécie suína, e que há a hipótese de interação entre rotavirus de origem humana e animal. Estes dados são úteis para uma vigilância mais abrangente dos rotavírus circulantes e contribuem para uma melhor compreensão da patogenia, epidemiologia e prevenção da doença, inclusive no que diz respeito ao seu caráter zoonótico. / Rotaviruses are responsible for the occurrence of diarrhea in humans and several other animal species. They are widespread in pig farms, including in Brazil. The non-structural proteins 2 and 5 (NSP2 and NSP5) of rotavirus are involved in viral replication and they are essential for the formation of viroplasm, a cytoplasmic structure within which occurs morphogenesis of new viral particles. However, there are very few studies on the genetic diversity of those proteins in circulating rotavirus in Brazilian swine raisings. So far, nine NSP2 genotypes have been identified (N1 to N9) and eleven for NSP5 (H1 to H11). In humans, genotypes N1, N2, N3 and H1, H2, H3 have been described, whereas in pigs, H1 and N1 have been described. This study is aimed at characterizing circulating samples of rotavirus in terms of diversity of NSP2 and NSP5. For this purpose, a total of 63 fecal samples from pig farms located in six different cities in the state of São Paulo, Brazil, were previously screened by nested-PCR technique. Of those, nine had their genomic segments amplified by RT-PCR, and in seven it was possible to obtain the partial nucleotide sequencing for NSP2, whereas in six, the total sequencing for NSP5. All were characterized as genotype H1 and N1. Considering the gene NSP2, the strains nucleotide identity, defined herein, ranged from 100% to 86.4% and in terms of amino acids, from 100% to 91.5%. Whereas for NSP5, it was from 100% to 95.1 %, and 100% to 97.4% for nucleotides and amino acids, respectively. It is concluded that the genotypes of the strains circulating in the region of study are in agreement with those reported in literature for swine, and that there is the possibility of interaction between human and animal rotaviruses. These data are useful for a broader surveillance of circulating rotaviruses and contribute to a better understanding of the pathogenesis, epidemiology and disease prevention, especially in regard to its zoonotic aspect.