Les altérations de la barrière hémato-rétinienne (BRB) sont associées à des maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). L’intégrité de la BRB est cruciale pour maintenir un microenvironnement rétinien en homéostasie et est étroitement régulé grâce à la régulation du transport transcellulaire et paracellulaire. Ici, nous décrirons brièvement la BRB interne, en mettant davantage l’accent sur la structure et la fonction de la BRB externe dans les états sains et malades. Nous avons hypothétisé que le dysfonctionnement des aquaporines exprimées dans des composantes de la BRB est suffisant pour générer un oedème diabétique dans une rétine diabétique. Bien que les résultats indiquent qu’aucune des aquaporines ciblées n’est suffisante pour générer un oedème cystoïde dans un modèle murin - et ce même en l’exacerbant en augmentant la perméabilité vasculaire rétinienne, nous mettons à l’avant un outil de segmentation semi-automatisé ainsi que deux modèles de recherches engageants. Le modèle murin de DT1 induit via STZ a été étudié de façon longitudinale sur un intervalle de temps modéré et pourra être ajusté pour des expériences futures en mettant à profit un outil de quantification semi-automatique performant. D’autre part, le modèle in vitro de la sénescence de l’ÉPR est conceptuellement établi et partiellement mis sur pied. Finalement, les résultats sont prometteurs et incitent à approfondir des cibles alternatives dans un modèle conceptuellement similaire, mais soit exacerbé ou plus anatomiquement près de l’humain. / Alterations in the blood-retina barrier (BRB) are associated with retinal diseases such as diabetic retinopathy and age-related macular degeneration (AMD). The integrity of the BRB is crucial for maintaining a tightly regulated and retinal microenvironment in homeostasis through the regulation of transcellular and paracellular transport. Here, we will briefly describe the inner BRB, with a greater emphasis on the structure and function of the outer BRB in both healthy and diseased states. We hypothesized that dysfunction of aquaporins expressed in components of the BRB is sufficient to generate diabetic edema in a diabetic retina. Although the results indicate that none of the targeted aquaporin are sufficient to generate a cystoid edema in a murine model, even when exacerbated by increasing retinal vascular permeability, we present a semi-automated segmentation tool and two engaging research models. A murine model and a programmation tool were developped to efficiently assess semi-automated quantitation of retinal edema. On the other hand, the in vitro model of RPE senescence is conceptually established and partially implemented. Ultimately, the results are promising and encourage further exploration of alternative targets in a conceptually similar model, either exacerbated or more anatomically close to humans.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

La dysfonction de l’endothélium vasculaire, associée à une diminution de ses propriétés vasorelaxantes et anti-thrombogéniques, survient avec le vieillissement mais également chez de plus jeunes patients athérosclérotiques présentant plusieurs facteurs de risque cardiovasculaire. Au niveau cellulaire, le vieillissement des cellules endothéliales (CE) mène à un état irréversible de non division cellulaire appelé sénescence. Ces cellules sénescentes présentent des changements spécifiques au niveau de leur morphologie et de l’expression génique, menant à leur dysfonction. La sénescence dite réplicative est déclenchée par le raccourcissement des télomères survenant à chaque division cellulaire, mais peut également être induite prématurément par le stress oxydant (SIPS). L’objectif principal de cette étude est de caractériser la sénescence de CE vasculaires isolées à partir de patients athérosclérotiques, et d’observer l’impact des facteurs de risque sur cette sénescence. Afin de confirmer la contribution des deux principales voies de la sénescence, nous avons par la suite étudié conjointement ou séparément, l’impact d’un traitement chronique avec un antioxydant sur la sénescence de CE, et d’une surexpression de la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT), une enzyme responsable de l’allongement des télomères. Nous avons isolé et cultivé des CE provenant d’artères mammaires internes prélevées lors de pontages coronariens. Selon les études, les cellules ont été infectées ou non avec un lentivirus surexprimant la hTERT, et cultivées in vitro jusqu’à sénescence, en présence ou en absence de l’antioxydant N-acétyl-L-cystéine (NAC). Différents marqueurs des deux principales voies de la sénescence (réplicative ou SIPS) ont été quantifiés. La sénescence cellulaire se développe exponentiellement avec le temps et est associée à une réduction de la viabilité et de la prolifération cellulaires. Chez les patients athérosclérotiques, le vieillissement des CE passe par les deux principales voies de la sénescence : des télomères courts initialement en culture et la durée d’exposition in vivo aux facteurs de risque cardiovasculaire prédisent une apparition prématurée de la sénescence. Toutefois, chez les fumeurs, la sénescence est exclusivement du type SIPS. Ces facteurs de risque cardiovasculaire et principalement l’hypertension, semblent accélèrer le vieillissement biologique et favoriser la dysfonction des CE. Lorsque traitées chroniquement avec le NAC, les CE présentant initialement de moindres dommages cellulaires et moléculaires ainsi qu’une meilleure défense antioxydante développent une sénescence retardée. Lorsque le NAC est combiné à une surexpression de la hTERT, les deux voies de la sénescence sont bloquées et une immortalisation cellulaire est observée. À l’inverse, dans les CE les plus endommagées par les ROS in vivo, le NAC n’a aucun effet sur le développement de la sénescence, la hTERT, seule ou en combinaison avec le NAC, retarde légèrement la sénescence mais aucune immortalisation n’est observée lorsque ces traitements sont combinés. En conclusion, nos études démontrent que l’exposition chronique au stress oxydant associé aux facteurs de risque cardiovasculaire accélère le développement de la sénescence de CE vasculaires, contribuant potentiellement à l’athérogénèse. Dans les cellules de patients athérosclérotiques, il semble exister un seuil de dommages cellulaires et moléculaires subis in vivo au-delà duquel, aucun traitement (antioxydant ou hTERT) ne peut être bénéfique. / Vascular aging is associated with a decrease in endothelial dilatory and antithrombotic functions. This typical endothelial dysfunction, however, is also present in younger patients with cardiovascular diseases (CVD). At the cellular level, aging of healthy vascular endothelial cells (EC) leads to senescence, a state of permanent growth arrest. Senescence is characterized by specific changes in cell morphology and gene expression, which reduce EC function and thus are proposed to be pro-atherogenic. Age-associated telomere shortening leads to replicative senescence of human endothelial cells, but senescence can also be induced prematurely by oxidative stress (SIPS). Our aim was to characterize senescence of EC isolated from atherosclerotic patients and look at the influence of risk factors for CVD on the onset of senescence. To confirm the contribution of each of the two mains pathways triggering senescence, we then looked at the impact on senescence of a chronic treatment with an antioxidant combined or not with an overexpression of the catalytic subunit of telomerase (hTERT), a reverse transcriptase involved in telomere elongation. We used EC isolated from internal mammary arteries discarded during coronary bypass graft surgery. Depending on the study, EC were infected or not with a lentivirus overexpressing hTERT, and cells were cultured in vitro until senescence, in the presence or the absence of the antioxidant N-acetyl-L-cysteine (NAC). Different markers of the two main pathways of senescence (replicative ou SIS) were quantified. Senescence develops exponentially with time in culture and is associated with a decrease in cell viability and proliferation. In atherosclerotic patients, cellular aging displays an overlap between replicative and stress-induced senescence: short initial telomere length in vitro and a long exposure to risk factors for CVD in vivo predict the onset of a premature senescence. However, in smoking patients, premature senescence is exclusively induced by oxidative stress. Risk factors for CVD seem to accelerate the biological aging leading to EC dysfunction. When treated chronically with NAC, EC presenting initially lower levels of damage and a better endogenous antioxidant capacity develop a delayed senescence, probably due to a slight hTERT activation. When NAC is combined with an overexpression of hTERT, both pathways triggerring senescence are blocked and cellular immortalization is observed. In contrast, in EC presenting higher levels of damage undergone in vivo, NAC has no effect by itself on the onset of senescence, hTERT delays the onset of senescence in combination or not with NAC, but no cellular immortalization was observed in NAC-hTERT cells. In conclusion, our studies show that a chronic in vivo exposition to oxidative stress associated with risk factors for CVD accelerates the onset of vascular endothelial cells senescence that could potentially contribute to atherogenesis. EC having strong antioxidant defense capacity and DNA repair mechanisms may be rescued from replicative and stress-induced senescence unless EC have undergone an insurmountable cellular and molecular damage possibly due to uncontrolled free radical production associated with risk factors for CVD.

Les kinases régulées par les signaux extracellulaires (ERK1/2) régulent une multitude de processus cellulaires, incluant la prolifération, la survie et la différenciation. Ces kinases représentent l’élément terminal de la voie ERK/MAPK, laquelle est activée dans près de 30% de tous les cancers humains et donc généralement perçue comme étant un effecteur critique de la progression tumorale. Cependant, une accumulation d’observations suggèrent que les kinases ERK pourraient également induire la suppression tumorale. Le but premier de cette thèse est de démontrer comment la signalisation par ERK peut contribuer à la suppression tumorale et de concilier les mécanismes impliqués avec son rôle dans la progression du cancer. Puisque nos travaux ont une incidence sur les bénéfices attendus de certaines thérapies actuellement en développement, le deuxième objectif de la thèse est de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour combattre le cancer. Nous avons démontré qu’une hyperactivation des kinases ERK induit la sénescence cellulaire. Le mécanisme implique la dégradation sélective et dépendante du protéasome de nombreuses protéines, ce que nous avons nommé le SAPD (Senescence-Associated Protein Degradation). Ce processus cible des protéines requises pour différentes fonctions cellulaires, incluant la progression du cycle cellulaire, les fonctions mitochondriales et la biogenèse des ribosomes. Ensuite, nos résultats montrent qu’en plus d’inhiber l’établissement de la sénescence, une diminution de la signalisation par les kinases ERK favorise la reprogrammation cellulaire, laquelle permet aux cellules précancéreuses de développer leur tumorigénicité et aux cellules cancéreuses d’acquérir des propriétés attribuables aux cellules souches. Ces observations suggèrent que les mécanismes qui inhibent la voie ERK/MAPK pourraient favoriser l’initiation du cancer, la formation de métastases et la résistance à diverses thérapies. Enfin, nous avons démontré que la metformine, utilisée pour le traitement du diabète, inhibe le facteur de transcription NF-kB. Ce dernier joue un rôle central dans la reprogrammation cellulaire et dans la production de cytokines pro-inflammatoires nocives par les cellules sénescentes. Ainsi, nous émettons l’hypothèse que la metformine pourrait être utilisée en combinaison avec certaines thérapies afin d’éviter les effets secondaires tant d’une inhibition des kinases ERK que d’une hyperactivation. Globalement, les résultats présentés démontrent que l’effet de la voie ERK/MAPK dépend de la force de son activation. Alors qu’une activation modérée peut contribuer à la prolifération de la plupart des cellules, une forte activation induit la sénescence tandis qu’au contraire, une faible activation favorise la reprogrammation des cellules cancéreuses et donc une augmentation de l’agressivité de la tumeur. Cette polyvalence de la voie suggère une certaine prudence face à l’usage des inhibiteurs de la voie ERK/MAPK. Cependant, elle nous motive à travailler au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques, lesquelles pourraient inclure la metformine. / The Extracellular Signal-Regulated Kinases (ERK1/2) regulate multiple cellular processes such as proliferation, survival and differentiation. These kinases are the last component of the ERK/MAPK pathway, which is activated in about 30% of all human cancers. Therefore, current thinking proposes that the ERK/MAPK pathway is a critical mediator of tumor progression. However, a steadily growing number of observations suggest that ERK kinases could trigger tumor suppression as well. The first aim of this thesis is to determine how ERK signaling triggers tumor suppression and to try to reconcile these mechanisms with its putative contribution to tumor progression. Since our work has a profound impact on the value of some therapies currently in development, the second aim of the thesis is to propose new strategies to fight cancer. We found that hyperactivation of the ERK kinases induces cellular senescence. Mechanistically, this involves selective proteasome-dependent protein degradation. This “Senescence-Associated Protein Degradation” (SAPD) targets proteins required for several cellular functions, including cell cycle progression, mitochondrial functions and ribosome biogenesis. Furthermore, our results showed that downregulation of ERK signaling not only inhibits the establishment of senescence but promotes cellular reprogramming, thereby allowing precancerous cells to gain tumorigenicity and cancer cells to acquire stem cell-like properties. These results suggest that mechanisms downregulating the ERK/MAPK pathway could promote cancer initiation, metastasis and resistance to multiple therapies. Finally, we demonstrated that the antidiabetic drug metformin targets the transcription factor NF-kB. The latter plays a central role in reprogramming, but also in the generation of deleterious pro-inflammatory cytokines by senescent cells. Hence, we suggest that metformin could be used in combination with other therapies to avoid the side effects of either downregulating or overactivating ERK signaling. Taken together, the results presented in this thesis demonstrate that the outcome of the ERK/MAPK pathway activity depends on signaling strength. While a moderate activation of the pathway may contribute to cell proliferation, a strong activation induces senescence and, conversely, a low activation promotes cancer cell reprogramming. This versatility of the pathway suggests caution with the use of ERK/MAPK pathway inhibitors, but motivates us to develop new therapeutic strategies, which could include metformin.

La leucémie lymphoïde représente 30% de tous les cancers chez l’enfant. SCL (« Stem cell leukemia ») et LMO1/2 (« LIM only protein ») sont les oncogènes les plus fréquemment activés dans les leucémies aiguës des cellules T chez l'enfant (T-ALL). L’expression ectopique de ces deux oncoprotéines dans le thymus de souris transgéniques induit un blocage de la différenciation des cellules T suivie d’une leucémie agressive qui reproduit la maladie humaine. Afin de définir les voies génétiques qui collaborent avec ces oncogènes pour induire des leucémies T-ALL, nous avons utilisé plusieurs approches. Par une approche de gène candidat, nous avons premièrement identifié le pTalpha, un gène crucial pour la différenciation des cellules T, comme cible directe des hétérodimères E2AHEB dans les thymocytes immatures. De plus, nous avons montré que pendant la différenciation normale des thymocytes, SCL inhibe la fonction E2A et HEB et qu’un dosage entre les protéines E2A, HEB et SCL détermine l’expression du pTalpha. Deuxièmement, par l’utilisation d’une approche globale et fonctionnelle, nous avons identifié de nouveaux gènes cibles des facteurs de transcription E2A et HEB et montré que SCL et LMO1 affectent la différenciation thymocytaire au stade préleucémique en inhibant globalement l’activité transcriptionnelle des protéines E par un mécanisme dépendant de la liaison à l’ADN. De plus, nous avons découvert que les oncogènes SCL et LMO1 sont soit incapables d’inhiber totalement l’activité suppresseur de tumeur des protéines E ou agissent par une voie d’induction de la leucémie différente de la perte de fonction des protéines E. Troisièmement, nous avons trouvé que Notch1, un gène retrouvé activé dans la majorité des leucémies T-ALL chez l’enfant, opère dans la même voie génétique que le pré-TCR pour collaborer avec les oncogènes SCL et LMO1 lors du processus de leucémogénèse. De plus, cette collaboration entre des facteurs de transcription oncogéniques et des voies de signalisation normales et importantes pour la détermination de la destinée cellulaire pourraient expliquer la transformation spécifique à un type cellulaire. Quatrièmement, nous avons trouvé que les oncogènes SCL et LMO1 sont des inducteurs de sénescence au stade préleucémique. De plus, la délétion du locus INK4A/ARF, un évènement retrouvé dans la majorité des leucémies pédiatriques T-ALL associées avec une activation de SCL, collabore aves les oncogènes SCL et LMO1 dans l’induction de la leucémie. Cette collaboration entre la perte de régulateurs de la sénescence suggère qu’un contournement de la réponse de sénescence pourrait être nécessaire à la transformation. Finalement, nous avons aussi montré que l’interaction directe entre les protéines SCL et LMO1 est critique pour l’induction de la leucémie. Ces études ont donc permis d’identifier des évènements collaborateurs, ainsi que des propriétés cellulaires affectées par les oncogènes associés avec la leucémie et de façon plus générale dans le développement du cancer. / Lymphoid leukemia represents 30% of all cancers in children. SCL (Stem cell leukemia) and LMO1/2 (LIM only protein) are the most frequently activated oncogenes in children T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Ectopic expression of the SCL and LMO1 oncogenes in the thymus of transgenic mice causes T cell differentiation arrest during the preleukemic stage followed by development of aggressive leukemia that reproduce human disease. We therefore took several approaches to decipher the genetic pathway collaborating with these oncogenes in T-ALL induction. Using a candidate approach, we first identified the pTalpha, a gene crucial for T cell differentiation, as a direct target of E2A and HEB heterodimers in immature thymocytes. Moreover, we showed that during normal thymocyte differentiation, SCL inhibits E2A and HEB function and that a dosage between E2A, HEB and SCL normally determines pTalpha gene expression. Second, using both global and functional approaches, we identified novel target genes of E2A and HEB transcription factors and showed that SCL and LMO1 impairs thymocyte differentiation at the preleukemic stage by globally inhibiting E proteins transcriptional activity through a DNA binding mechanism. Moreover, we found that SCL and LMO1 oncogenes are either not totally able to inhibit E protein tumor suppressor activity or act in a different leukemic inducing pathway than E protein loss of function. Third, we found that Notch1, a gene found activated in almost all cases of pediatric T-ALL, operate in the same genetic pathway as the pre-TCR to collaborate with the SCL and LMO1 oncogenes in leukemogenesis. Moreover, this collaboration between oncogenic transcription factors and normal signalling pathways important for cell fate determination might explain cell-type specific transformation. Fourth, we found that the SCL and LMO1 oncogenes are inducers of senescence at the preleukemic stage. Moreover, deletion of INK4A/ARF, an event found in almost all cases of SCL associated pediatric T-ALL, collaborate with SCL and LMO1 oncogenes in leukemogenesis. This collaboration with loss of senescence regulators suggests that a bypass of senescence response would be necessary for transformation. Finally, we also showed that SCL and LMO1 direct interaction is critical for leukemia induction. These studies permitted the identification of collaborating events and cellular properties affected by oncogenes associated with leukemia and more generally in cancer development.

Les virus sont utilisés depuis longtemps dans la recherche sur le cancer et ont grandement contribué à l’avancement des connaissances de même qu’à l’établissement de préceptes importants encore valables aujourd’hui dans le domaine. L’un des défis actuels est de mieux définir les étapes menant à la transition d’une cellule normale à une cellule transformée et c’est sur cette problématique que nous nous sommes penchés. Pour ce faire, nous avons tiré profit de l’utilisation de l’antigène grand-T du virus de polyome (PyLT), un virus capable d’induire des tumeurs chez les rongeurs. Cet oncogène viral à lui seul possède des propriétés intéressantes qui suggèrent que, en plus de l’immortalisation, il peut également contribuer aux événements précoces de la carcinogénèse. Ceci repose principalement sur la capacité de PyLT à induire des tumeurs en souris transgéniques et ce, avec une certaine latence ce qui suggère que des événements supplémentaires sont nécessaires. Ainsi, l’utilisation de PyLT dans un modèle de culture cellulaire permet de disséquer les changements qui lui sont attribuables. Dans un premier temps, l’établissement du profil d'expression génique associé à l'expression de PyLT dans un modèle murin nous a permis de sélectionner un bon nombre de gènes, parmi lesquels figurait Necdin. Nous avons choisi d’étudier Necdin plus en détail puisque peu d’attention était accordée à cette protéine dans le domaine du cancer, malgré que différentes données de la littérature lui suggèrent à la fois des fonctions suppresseurs de tumeur et oncogéniques. Nous avons démontré que, malgré sa fonction proposée de suppresseur de croissance, l’expression de Necdin n’est pas incompatible avec la prolifération dans la lignée cellulaire de souris NIH 3T3 et les cellules primaires humaines (IMR90), bien que l’inhibition de son expression par shARN confère un avantage prolifératif. Nous avons confirmé que Necdin est un gène cible de p53 induit par différents agents génotoxiques, toutefois son expression peut également être régulée de façon p53-indépendante. De plus, Necdin agit négativement sur l’arrêt du cycle cellulaire en réponse à l’activation de p53. Ceci suggère que Necdin est impliqué dans une boucle de régulation négative de la voie de p53 et que l’augmentation anormale de l’expression de Necdin pourrait contribuer à la perturbation la voie du suppresseur de tumeur p53. L’activation de p53 permet l’arrêt transitoire du cycle cellulaire en condition de stress, mais est aussi impliquée dans l’établissement d’un arrêt permanent nommé sénescence. La sénescence est un mécanisme de protection contre l’accumulation de mutations qui peut contribuer à l’initiation du cancer. Vu l’intéressante implication de Necdin dans la régulation de l’activité de p53, nous avons transposé les connaissances acquises du modèle murin à un modèle humain, plus adapté pour l’étude de la sénescence. La caractérisation de l’expression de Necdin dans des fibroblastes primaires humains à différents passages montre que les jeunes cellules en prolifération active expriment Necdin et que son niveau diminue avec l’établissement de la sénescence réplicative. Le même phénomène est observé lors de la sénescence prématurée provoquée par l’expression d’un oncogène et par l’exposition aux radiations ionisantes. De plus, dans des conditions normales de prolifération, la modulation de Necdin par des essais de gain et de perte de fonction n’affecte pas la durée de vie des cellules primaires. Toutefois, en condition de stress génotoxique dû à l’exposition aux irradiations, les cellules surexprimant Necdin présentent une radiorésistance accrue de la même façon que lorsque p53 est inactivé directement. Ce résultat en cellules humaines vient appuyer l’effet observé dans les cellules de souris sur l’impact qu’aura le niveau de Necdin sur la réponse de p53 en condition de stress. Un bref survol a été fait pour aborder de quelle façon nos résultats en culture cellulaire pouvaient se traduire dans des modèles de cancer chez l’humain. Nous avons caractérisé l’expression de Necdin dans deux types différents de cancer. D’abord, dans le cancer de l’ovaire, le niveau élevé de Necdin dans les tumeurs à faible potentiel de malignité (LMP) en comparaison aux cancers agressifs de l’ovaire de type séreux suggère que l’expression de Necdin se limite aux cellules de cancer LMP, qui présente généralement un p53 de type sauvage. Son expression est aussi retrouvée dans deux lignées cellulaires du cancer de l’ovaire non-tumorigéniques en xénogreffe de souris, dont l’une possède un p53 fonctionnel. De plus, la caractérisation de Necdin dans les lignées cellulaires du cancer de la prostate suggère une relation entre son expression et la présence de p53 fonctionnel. Dans le cancer de la prostate, tout comme pour le cancer de l’ovaire, Necdin semble être présent dans les lignées représentant un stade moins avancé de la maladie. L’utilisation de l’oncoprotéine virale PyLT nous a permis de révéler des propriétés intéressantes de Necdin. Nous proposons que dans certains contextes, l’expression constitutive de Necdin pourrait contribuer au cancer en retardant une réponse par p53 appropriée et possiblement en participant à l’augmentation de l’instabilité génomique. La fonction potentiellement oncogénique de Necdin quant à sa relation avec p53 que nous avons révélée requiert davantage d’investigation et les cancers caractérisés ici pourraient constituer de bons modèles à cette fin. / Viruses have been used extensively in cancer research and have contributed greatly to the advancement of knowledge as well as to the establishment of important concepts still valid in the field today. Currently, one of the challenges in cancer research is to better define the individual steps that contribute to the transition of a normal cell to a transformed cell. To address this important issue, we characterized a model system based on the expression of polyomavirus large-T antigen (PyLT), derived from a virus capable of inducing tumors in rodents. Importantly, PyLT is able to induce tumors in transgenic mice, although only after a latent period, suggesting that additional transforming events are necessary. Hence, the PyLT viral oncogene possesses several interesting properties, which suggest that, beside its role in immortalization, PyLT can contribute to the early events of carcinogenesis. Here, we used a cell culture model to dissect the early changes associated with the presence of PyLT. The establishment of a gene expression profile associated with PyLT expression in a mouse cell line model allowed us to select a number of genes whose levels were modulated by the presence of this viral oncogene. Among candidate genes, we chose to further study Necdin in more details because even if only a limited number of reports existed for this protein, there was evidence suggesting that Necdin displays either tumor suppressor or oncogenic functions within different contexts. We demonstrated that, despite the proposed growth suppressor function of Necdin, its expression was not incompatible with the proliferation in the mouse NIH 3T3 cell line and in human IMR90 primary cells. Nonetheless, the inhibition of Necdin expression by shRNA confered a proliferative advantage. We confirmed that Necdin was a p53 target gene inducible by different genotoxic stresses, although its expression was also regulated in a p53-independent manner. Moreover, Necdin acted negatively on cell cycle arrest in response to p53 activation. These results suggest that Necdin is involved in a negative feedback loop of the p53 pathway and that abnormal elevation of Necdin expression could contribute to the disruption of the p53 tumor suppressor pathway. p53 activation allows transitory cell cycle arrest under stress conditions and it is also involved in the establishment of a permanent growth arrest called senescence. Senescence represents a protective mechanism preventing the accumulation of mutations that could contribute to cancer initiation. As our research supports a role for Necdin in the regulation of p53 activity, we transposed the knowledge acquired from our mouse model to a human model more suitable to study senescence. The characterization of Necdin expression in human primary fibroblasts at different passages revealed that Necdin was expressed in actively proliferating young cells and its expression decreased gradually during the establishment of replicative senescence. The same phenomenon was observed during premature senescence induced by both oncogene expression and ionizing radiation exposure. Moreover, in normal growth conditions, Necdin modulation by gain- and loss-of-function assays did not affect the life span of primary cells. However, in a genotoxic stress conditions caused by irradiation, Necdin overexpressing cells presented an increase radioresistance comparable to when p53 was directly inactivated. These results in human cells supports the effect observed in mouse cells relative to the impact of Necdin levels on a p53 response under stress conditions. We initiated preliminary experiments to address whether our results in cell culture could be translated to human cancer models. We characterized Necdin expression in two types of human cancers. First, in ovarian cancer, we observed elevated levels of Necdin expression in low malignant potential serous ovarian cancers (LMP) when compared to aggressive serous ovarian cancers. Our results suggest that Necdin expression was limited to LMPs, which usually present a wild type p53 gene. Necdin expression was also found in two ovarian cancer cell lines, which were both non-tumorigenic in a mouse xenograft assay, and interestingly one of the cell line had a functional p53. Moreover, the characterization of Necdin expression in four prostate cancer cell lines also suggested a relationship between its expression and the presence of functional p53. In prostate cancer, as in ovarian cancer, Necdin expression seems to be detected in cell lines representing less aggressive forms of the disease. The use of the PyLT viral oncoprotein allowed us to reveal interesting properties for Necdin. We propose that, in some contexts, the constitutive expression of Necdin could contribute to cancer promotion by delaying appropriate p53 responses and possibly promoting genomic instability. The potential oncogenic function of Necdin, and its relationship with p53 as revealed by the research described in this dissertation, requires more investigation. Preliminary results suggest that human ovarian and prostate cancers could be good models to address the role of Necdin in carcinogenesis.

Les mécanismes cellulaires anti-prolifératifs, lesquels comprennent l’apoptose, aussi appelée la mort cellulaire programmée, l’arrêt transitoire du cycle cellulaire et la sénescence, permettent à la cellule de prévenir, en réponse à différents stress, l’accumulation de mutations pouvant conduire à une prolifération incontrôlée et, éventuellement, au développement d’une tumeur. La régulation de ces différents mécanismes requiert l’activation de protéines appelées des suppresseurs de tumeur, dont le principal est p53. p53 est un facteur de transcription dont la stabilisation et l’activation conduit à une hausse de l’expression de gènes directement impliqués dans l’arrêt de la prolifération. Au cours des dernières années, l’ensemble des travaux sur p53 ont permis de mettre en évidence la complexité de sa fonction, de même que la multitude de voies de signalisation et de protéines avec lesquelles il coopère pour maintenir l’intégrité du génome. De ce fait, l’étude des mécanismes d’activation de p53 est de mise pour la compréhension de sa régulation et, éventuellement, pour la prévention et l’élaboration de nouvelles stratégies de traitement contre le cancer. L’objet de cette thèse est la mise en évidence d’un mécanisme d’activation de p53 et de la sénescence par la protéine SOCS1, un suppresseur de la signalisation par les cytokines. Ce mécanisme implique une interaction directe entre les deux protéines, plus précisément entre le domaine SH2 de SOCS1 et le domaine de transactivation de p53. SOCS1 interagit également, au niveau de son SOCS Box, avec les kinases ATM et ATR de la voie du dommage à l’ADN de façon à faciliter la phosphorylation de p53 en sérine 15. Ainsi, en interagissant à la fois avec p53 et ATM/ATR, SOCS1 contribue à la stabilisation et à l’activation de p53. En accord avec ce modèle, l’inhibition de SOCS1 dans des fibroblastes humains normaux tend à diminuer le nombre de cellules sénescentes suite à l’expression de l’oncogène ca-STAT5A et à réduire l’accumulation nucléaire de p53 dans ces cellules. De la même façon, les lymphocytes T provenant de souris Socs1-/-Ifnγ-/- sont moins susceptibles d’entrer en apoptose que les lymphocytes provenant de souris Socs1+/+Ifnγ+/+, suite à une exposition à des radiations. Dans les deux contextes, on observe une baisse de l’expression des gènes cibles de p53, ce qui démontre que SOCS1 est impliquée dans l’activation de p53 in vivo. Cette thèse a également pour but de mettre en évidence l’implication de SOCS1 dans l’activation d’autres facteurs de transcription et, par le fait même, de démontrer qu’elle peut agir comme un régulateur plus général de la transcription. Une étude approfondie de l’interaction entre SOCS1 et p53 a permis de démontrer que le domaine de transactivation II de p53 (acides aminés 36-67) est suffisant pour l’interaction. Plus précisément, il semble que le tryptophane 53 (W53) et la phénylalanine 54 (F54) sont les principaux résidus impliqués. Une analyse structurale de ce domaine de p53 a conduit à l’identification d’un motif conservé dans plusieurs autres facteurs de transcription pourvus d’un domaine de transactivation acide, dont p63, p73 et E2F1. En accord avec ces résultats, SOCS1 est en mesure d’interagir avec chacune des deux protéines. Ainsi, la capacité de SOCS1 d’interagir et de réguler l’activité de p53 peut s’étendre à d’autres facteurs de transcription. En terminant, le mécanisme présenté dans cette thèse contribue à la compréhension de la régulation de p53, le principal suppresseur de tumeur de la cellule. De plus, il met en évidence une nouvelle fonction de SOCS1, laquelle était jusqu’alors essentiellement connue pour inhiber la voie de signalisation JAK/STAT. Ce nouveau rôle pour SOCS1 permet d’expliquer de quelle manière une activation aberrante de la signalisation par les cytokines peut déclencher la sénescence ou l’apoptose. Enfin, le fait que SOCS1 puisse réguler différents facteurs de transcription permet de la qualifier de régulateur général des facteurs de transcription composés d’un domaine de transactivation acide. / In response to different stress, three anti-proliferative mechanisms, namely apoptosis, also called programmed cell death, transient growth arrest and senescence, prevent the cells from cumulating mutations that can lead to uncontrolled proliferation and, eventually, to tumor development. Regulation of these mechanisms requires the activation of proteins called tumor suppressors. One of them, p53, is a transcription factor whose stabilization and activation lead to an increase in expression of genes directly implicated in cell cycle arrest. In the past years, studies about p53 showed how much its function is complex and with how many signaling pathways and proteins it cooperates to maintain genome integrity. Thus, studying the activation mechanisms of p53 is essential to understand its regulation and, thereby, to prevent tumor development and to elaborate new strategies for cancer treatment. The first aim of this thesis is to show a new activation mechanism of p53 and of senescence by the protein SOCS1, a suppressor of cytokine signaling. This mechanism implies a direct interaction between the two proteins, specifically between the SH2 domain of SOCS1 and the N-terminal transactivation domain of p53. SOCS1 also interacts with the DNA damage-regulated kinases ATM and ATR via its C-terminal domain, which contains a SOCS Box, to facilitate the phosphorylation of p53 on its serine 15. Thus, by interacting at the same time with p53 and ATM, SOCS1 contributes to stabilization and activation of p53. In accordance with this model, SOCS1 inhibition in human normal fibroblasts decreases the number of senescent cells in which the activated oncogene STAT5A is expressed and reduces p53 nuclear accumulation in these cells. In the same way, T cells from Socs1-/-Ifnγ-/- mice are less likely to undergo apoptosis than T cells from Socs1+/+Ifnγ+/+ mice, after exposure to γ radiation. In both contexts, the expression of p53 target genes is decreased, which indicates that SOCS1 is implicated in p53 activation in vivo. This thesis also aims to show the role of SOCS1 in the activation of other transcription factors and, thereby, to show that it can act as a more general regulator of transcription. A detailed study of the interaction between SOCS1 and p53 showed that the transactivation domain II of p53 (amino acids 36-67) is sufficient for the interaction. Specifically, it seems that tryptophan 53 (W53) and phenylalanine 54 (F54) are essential for the interaction. A structural analysis of this p53 region highlights an acid transactivation domain actually conserved in many others transcription factors, such as p63, p73 and E2F1. In accordance with this observation, SOCS1 is able to interact with both proteins. Thus, the capacity of SOCS1 to interact with p53 and to regulate its activity may extend to other transcription factors. The mechanism showed in this thesis contributes to the understanding of p53 regulation and highlights a new function for the SOCS1 protein. Indeed, until now, SOCS1 was mostly known to be a negative regulator of the JAK/STAT pathway. Moreover, this new role for SOCS1 explains how an aberrant cytokine signaling can trigger senescence or apoptosis. Finally, the fact that SOCS1 can regulate different transcription factors allows us to consider it as a general regulator of transcription factors containing an acid transactivation domain.

La sénescence cellulaire, ou l’arrêt irréversible de la prolifération, influence des processus physiologiques et pathologiques, comme le cancer. Parmi les caractéristiques de la sénescence, se retrouve le PSAS ou phénotype sécrétoire associé à la sénescence. Le PSAS est composé d’une variété de cytokines, facteurs de croissance et protéases. Ses actions pro- et anti-tumorale sont connues, mais l’on ignore laquelle prédomine. Mes travaux s’attardent aux effets du PSAS sur l’induction de la sénescence dans les cellules environnantes et à sa régulation. Nous avons démontré que le PSAS ne synergise pas avec la dysfonction télomérique chronique ou aigue, afin de causer un arrêt de croissance. Également, l’étude du mécanisme responsable de l’induction de la sénescence par stress à la chromatine, suggère que la kinase c-Abl n’est pas requise pour cette voie, contrairement à des publications antérieures. Mes travaux éclairent les mécanismes d’action et la régulation du PSAS dans la sénescence induite par dysfonction télomérique et par stress à la chromatine. / Cellular senescence, or irreversible proliferation arrest, is known for its influence on physiological and pathological processes, such as cancer. Among the features found in the senescent phenotype is the inflammatory secretome, also known as the senescence associated secretory phenotype (SASP). The SASP consists of a variety of factors such as cytokines, growth factors and proteases. It is widely recognized that SASP can have either a pro- or anti-tumor effect, but it is not clear which one predominates. My work focused on the SASP effects on the induction of senescence in surrounding cells and its regulation mechanisms. We demonstrated that the SASP does not synergize with chronic or induced telomere dysfunction to cause cellular proliferation arrest. Also, study of chromatin stress-induced senescence mechanism suggests that kinase c-Abl is not required for this pathway, contrary to what had been previously published. My work helps understand the regulatory and working mechanisms of the SASP in chromatin stress-induced and telomere dysfunction-induced senescence models.

Le cancer de l’ovaire (COv) est le cancer gynécologique le plus létal chez la femme et les traitements existants, chirurgie et chimiothérapie, ont peu évolué au cours des dernières décennies. Nous proposons que la compréhension des différents destins cellulaires tels que la sénescence que peuvent choisir les cellules du cancer de l’ovaire en réponse à la chimiothérapie pourrait conduire à de nouvelles opportunités thérapeutiques. La sénescence cellulaire a été largement associée à l’activité de la protéine TP53, qui est mutée dans plus de 90% des cas de cancer de l’ovaire séreux de haut grade (COv-SHG), la forme la plus commune de la maladie. Dans nos travaux, à partir d’échantillons dérivés de patientes, nous montrons que les cultures primaires du cancer de l’ovaire séreux de haut grade exposées au stress ou à des drogues utilisées en chimiothérapie entrent en senescence grâce à l’activité d’un isoforme du gène CDKN2A (p16INK4A). Dans ces cellules, nous avons évalué les caractéristiques fondamentales de la sénescence cellulaire tels que les altérations morphologiques, l’activité béta galactosidase associée à la sénescence, les dommages à l’ADN, l’arrêt du cycle cellulaire et le phénotype sécrétoire associé à la sénescence. En utilisant des micromatrices tissulaires construites à partir d’échantillons humains de COv-SHG pré- et post-chimiothérapie, accompagnées de leurs données cliniques, nous avons quantifié des marqueurs de sénescence incluant une diminution de la prolifération cellulaire quelques semaines après chimiothérapie. De façon intéressante, l’expression de p16INK4A dans les échantillons de COv-SHG prétraitement corrèle avec une survie prolongée des patientes suite au traitement. Ceci suggère ainsi pour la première fois un impact biologique bénéfique pour la présence de cellules cancéreuses qui sont capable d’activer la sénescence, particulièrement pour le traitement du cancer de l’ovaire. Dans le but de complémenter les thérapies actuelles avec des approches de manipulation pharmacologique de la sénescence, nos résultats suggèrent qu’il serait important de déterminer l’impact positif ou négatif de la sénescence induite par la thérapie sur la progression de la maladie et la survie, pour chaque type de cancer de façon indépendante. / Human ovarian cancer (OvCa) is the deadliest gynecologic malignancy and existing surgical/chemotherapeutic treatment options have been relatively static for decades. We propose that understanding OvCa cell fate decisions taken in response to chemotherapy could guide new therapeutic opportunities. Damage-induced cellular senescence is often associated with TP53 activity, which is heavily mutated in high grade serous (HGS) OvCa (>90%), the most common form of this disease. Here, using patient derived tissues, we show that primary HGS-OvCa cultures predominantly trigger CDKN2A- associated (p16INK4A isoform) senescence following exposure to stress or chemotherapy. Key senescence hallmarks including altered morphology, senescence-associated-Betagalactosidase, DNA damage, cell cycle arrest and the senescence-associated secretory phenotype were evaluated and detected in damaged cells. Using tissue microarrays built from pre- and post-treatment human HGS-OvC tissue samples with accompanying clinical data, we quantified post-treatment hallmarks of senescence including reduced cell proliferation weeks after chemotherapy. Importantly, p16INK4A expression in pretreatment HGS-OvC samples correlated with increased patients survival, suggesting for the first time that senescence-competence in human cancer cells may have a beneficial impact on treatment outcomes for patients. In order to guide the potential improvement of existing human therapies via pharmacological senescence manipulation, our results suggests that it is important to determine for many types of human cancer whether treatment-induced senescence positively or negatively impacts disease progression and patient survival.

Les lymphocytes constituent un modèle original de cellules somatiques puisqu’ils sont capables de réactiver la télomérase lorsqu’ils sont stimulés. Nous avons montré que les lymphocytes, en culture prolongée et soumis à des stimulations itératives par la PHA, présentent une diminution progressive de l’activité télomérasique interrompue à chaque stimulation par une augmentation transitoire. Ces variations sont corrélées positivement aux variations de hTERT et de la longueur des télomères. Les foyers γ-H2AX et 53BP1 et leur localisation au niveau des télomères augmentent lors du vieillissement cellulaire. Nous montrons un dysfonctionnement des télomères au cours de la sénescence lymphocytaire in vitro résultant d’une érosion accrue des télomères et d’une diminution de l’expression des protéines qui les coiffent. Le mécanisme des variations précoces de l’expression de hTERT lors de l’activation lymphocytaire restaient à comprendre. Les conséquences du traitement des lymphocytes par différents immunosuppresseurs agissant tous de façon directe ou indirecte sur l’activation de NFAT suggéraient le rôle de NFAT dans la régulation transcriptionnelle de hTERT. Nous avons montré i) 5 éléments de réponse potentiels pour NFAT au niveau du promoteur de hTERT, ii) l’activation in vitro du promoteur de hTERT par NFAT essentiellement via un site consensus localisé dans le coeur du promoteur de hTERT en position -40 et une synergie fonctionnelle entre NFAT et SP1, iii) la liaison directe de NFAT sur le promoteur de hTERT via ce site consensus in vivo. Ainsi, NFAT1 régule la transcription de hTERT et est impliqué dans l’activation de la télomérase lors de la stimulation lymphocytaire / Lymphocytes are an example of somatic cells capable to induce telomerase activity when stimulated. We showed that lymphocytes, during long-term culture and repeated PHA stimulations, present a progressive drop in telomerase activity interrupted at each stimulation by a transitory increase. These variations are positively correlated with hTERT and telomere length variations. γ-H2AX and 53BP1 foci and their localization on telomeres increase with cell aging. We show a telomere dysfunction during in vitro lymphocyte senescence resulting from an excessive telomere shortening and a decrease in shelterin content. The mechanism involved in early variations of hTERT expression during lymphocyte activation remained to be understood. Consequences of lymphocyte treatment with different immunosuppressors, all acting directly or indirectly on NFAT activation, suggested a role for NFAT in the regulation of hTERT transcription. Five putative responsive elements for NFAT were identified in the hTERT promoter. We showed that NFAT activates in vitro the hTERT promoter mainly via a consensus site localized in the promoter core at position -40 and a functional synergy between NFAT and SP1. Furthermore, NFAT1 binds directly to the endogenous hTERT promoter via this consensus site in vivo. Thus, NFAT positively regulates the hTERT transcription and we propose its implication in telomerase activation during lymphocyte stimulation