La dérégulation du système de surveillance qui bloque la prolifération lorsque l'intégrité du génome est compromise fait partie intégrante de la cancérogenèse. Nous cherchons à décortiquer les mécanismes qui, en phase G2, orchestrent l'arrêt du cycle cellulaire, irréversible, en présence des lésions de l'ADN (sénescence) ou réversible (quiescence), en absence de signaux mitogéniques ou confluence. L'objectif du premier volet fut d'élucider les rôles respectifs de l'inhibiteur de CDK (CKI) p21Waf1 et des kinases Chk1 et Chk2 dans l'arrêt en G2 dû au stress génotoxique menant à la sénescence. Nous avons montré que dans les cellules humaines normales cet arrêt nécessite l'action de p21 et Chk1 tandis que Chk2 n'est pas requise. Au contraire, dans plusieurs lignées cancéreuses, malgré la présence de p53, ce rôle de p21 est compromis à cause d'une activation inefficace de la kinase ATM. Par conséquent, en dépit d'une forte activation de Chk1 bloquant la mitose, ces cellules ne parviennent pas à initier la sénescence (Lossaint et al., soumis). L'objectif du deuxième volet fut de mettre en évidence le programme déclenchant la quiescence lors de confluence ou en absence de sérum. Les travaux antérieurs de l'équipe ont montré que cette décision pouvait être prise avant la mitose même si l'arrêt du cycle n'a lieu qu'en phase G1 suivante. En étudiant les fibroblastes synchronisés nous avons trouvé que la quiescence est précédée par l'inhibition pré-mitotique de la phosphorylation de pRb due à une diminution de cycline D1 et une stabilisation du CKI p27Kip1 (Chassot et al., 2008). De plus, nos résultats récents montrent que la présence de sérum entre le point R et la mitose est requise pour initier la réplication de l'ADN au cycle suivant. Les travaux futurs devraient élucider comment différentes voies de signalisation, via la voie cycline D-pRb, affectent divers composants de l'appareil de réplication de l'ADN pour inhiber la progression du cycle de façon réversible ou irréversible. / Cancer is a multi-step process resulting from abrogation of several barriers to uncontrolled proliferation. They include inhibitory pathways with appropriate checkpoints that lead to reversible (quiescence) or irreversible (senescence, apoptosis) block of cell proliferation. We are especially interested in pathways orchestrating cell cycle exit that operate in the G2 phase. The first objective of this thesis was to decipher mechanisms that prevent mitosis in response to DNA damage. We found that Cdk inhibitor p21Waf1 plays a crucial role in blocking mitotic onset in normal cells; acting in tandem with checkpoint kinase Chk1, p21 inactivates mitotic Cdks and inhibits pRb phosphorylation, thereby irreversibly blocking mitotic entry. In contrast, in p53-proficient transformed cells, the induction of p21 in G2 is impaired, most likely because of deficient ATM activation. While, in some cases, Chk1 hyper-activation prevents mitosis, the absence of p21 compromises the senescence program from G2. Finally, we showed that Chk2 is dispensable for G2 arrest in both non-transformed and transformed cells (Lossaint et al., submitted). Our second objective was to elucidate the pathways that induce quiescence (G0). This reversible cell cycle exit occurs in G1, requires pRb family members and p27Kip1-dependent Cdk inactivation. Based on observations obtained in our team and the data in the literature, we hypothesized that reversible cell cycle exit program might be launched before mitosis. By using an in vitro wounding model, we showed that confluence-driven quiescence is preceded by pre-mitotic CDK inhibition by p27, cyclin D1 downregulation and reduced pre-mitotic pRb phosphorylation (Chassot et al., 2008). Moreover, our results obtained in synchronized fibroblasts that were serum-starved after release from G1/S block suggest that cyclin D1 might stimulate proliferation by keeping pocket proteins phosphorylated during G2/M progression (Lossaint et al., in preparation).

La bioingénierie de greffons endothéliaux cornéens est une des solutions réalistes en cours de développement dans quelques laboratoires pour palier au grand déséquilibre entre pénurie mondiale de dons de cornée et besoins immenses et croissant des populations. Cette véritable médecine régénérative consistera à injecter des cellules endothéliales (CEs) dans la chambre antérieure aux stades précoces des dystrophies endothéliales et, pour les stades avancées des pathologies endothéliales, à reconstruire in vitro des greffons endothéliaux composés d'un support transparent et biocompatible colonisé par une monocouche des CEs. Dans les 2 cas, la première étape obligatoire est la production de masse de CEs ou de "CE-like". Dans ce travail, nous avons exploré les différentes possibilités pour obtenir suffisamment de CEs fonctionnelles pour envisager des applications cliniques : 1- L'expansion de CEs natives prélevées sur des cornées de donneurs, ou culture primaire, se heurtent aux capacités prolifératives limitées des CEs in vitro. Un des prérequis étant la compréhension des mécanismes d'arrêt de la prolifération des CEs humaines, nous avons fait la synthèse bibliographique des connaissances sur leur cycle cellulaire et leur sénescence, et présentons 2 articles originaux: le premier utilise un microarray spécifique de 112 gènes de contrôle du cycle cellulaire pour comparer les profils transcriptionnels des CEs de 6 modèles biologiques comportant théoriquement un stimulus prolifératif croissant: in vivo, post mortem, organoculture, culture primaire confluente, culture primaire non confluente et lignée immortalisée. Nous identifions de nombreux acteurs impliqués dans l'arrêt du cycle, en particulier ceux impliquant une réponse à des dommages oxydatifs de l'ADN. Le second article explore les capacités prolifératives résiduelles des CEs de donneurs âgés de plus de 50 ans, sont les plus nombreux en Europe et donc les pourvoyeurs habituels de CEs pour la bioingénierie. Nous montrons qu'une optimisation des techniques de culture permet d'obtenir in vitro une mosaïque endothéliale de 2000 cellules/mm2. Enfin, un troisième article montre qu'un stimulus physique inattendu constitué d'un train d'impulsion électrique permet d'obtenir un très grand nombre de figures mitotiques mais uniquement dans des zones de faible DCE, démontrant encore une fois l'importance majeur de l'inhibition de contact dans l'arrêt prolifératif. 2- La sélection et l'expansion, par culture en sphère, des progéniteurs endothéliaux de la périphérie endothéliale pourrait être un moyen de contourner la sénescence de la majorité des CEs. La synthèse bibliographique montre que la plupart des travaux publiés émanent d'une seule équipe japonaise. Dans notre second article, nous avons montré l'existence de rares "label-retaining cells" dans les cornées de donneurs âgés, qui pourraient correspondre à ces progénieteurs. Nous avons aussi montré qu'il était possible d'obtenir des sphères avec ces donneurs. 3- La différenciation de cellules souches embryonnaires, mésenchymateuses ou des cellules pluripotentes induites est enfin la troisième voie qui pourrait permettre de produire des CEs en grand nombre. La méthode d'induction de la différenciation pourrait reproduire le schéma physiologique et désormais bien caractérisé de formation de l'endothélium à partir du mésenchyme périoculaire dérivé de la crête neurale et que nous rappelons au début de notre mémoire bibliographique. Nous rappelons également les méthodes utilisables pour caractériser les cellules obtenues: vérification de leur identité par immunomarquage d'un panel de protéines caractéristique (en absence de marqueur unique spécifique) et vérification de leur fonctionnalité par mesures de leurs capacités de pompage ionique, au minimum de façon indirecte sur chambre d'électrophysiologie de type Ussing, au mieux de façon directe en quantifiant la déturgescence d'une cornée humaine conservée dans le bioréacteur breveté du BiiGC / Corneal endothelial engineering is becoming a more and more realistic solution to restore vision from corneal edema. This method focus to regenerate corneal endothelium by direct injection of corneal endothelial cells (ECs) into patient anterior chamber at the early stage of endothelial dystrophies, or by grafting a transparent biocompatible material covered by a monolayer of ECs. These two techniques require both in vitro isolation and amplification of ECs or endothelial-like cells. In this thesis, different strategies to obtain a high quantity of functional ECs for clinical application are explored: 1- Due to the limit proliferative capacity of EC, the first strategy consists to analyze mechanisms implicated EC cell cycle arrest and then to optimize protocol for native EC isolation or for cell proliferation activation ex vivo. This is summarized in three publications. The first publication describes the cell cycle regulation by comparing transcriptional expression of 112 genes in 6 biological models of EC with different proliferative profile: in vivo, postmortem, organ-culture, confluent primary culture, non confluent primary culture and immortalized cell line. , The key molecular actors identified using the combining microarray analysis and gene ontology methods are consistent with previous findings about oxidative DNA damage mechanism. The second publication characterizes EC differentiation process and its impact on EC proliferative capacity in old donor corneas. Analyses of differentiation/progenitor markers and of proliferative capacity underline the differentiation process of EC from the centre to the peripheral corneal endothelium. Thereby, an optimized culture protocol was developed, allowing the formation of high-density monolayer (> 2000 cells/mm2) with stable endothelial morphology. We proved the possibility to make profit from a majority of old-donor cornea grafts invalidated for penetrating graft In the third publication, the activation of endothelial cell cycle by electric pulses directly in corneal graft was characterized. We confirm the activation of endothelial cell cycle at different phases but also the damage of tissue during electroporation. 2- Second strategy consists of the amplification of ECs from potential EC progenitors. Using sphere forming culture and a new method to detect slow-cycling cells, we demonstrate the existence of "young" ECs population with higher proliferative capacity in corneal periphery. The isolation of ECs by sphere formation is one possible step for ECs selection in vitro. 3- The differentiation of embryonic stem cells, mesenchymal stem cells or induced pluripotent stem cells into corneal endothelial cells is the third approach considered by our laboratory. The manipulation of stem cells differentiation would be based on the molecular mechanisms implicated in the formation of corneal endothelium from periocular mesenchymal cells described in the first part of the bibliography. Finally, in order to validate the quality of endothelial cell mass obtained, we revisited recent methods for the evaluation of corneal endothelial identity (immunolocalisation of specific markers), for the measurement of pump activity of cell monolayer (Ussing chamber, perfusion chamber) or directly in deswelled cornea using the bioreactor patented by the BiiGC laboratory

Comprendre l'impact des changements globaux sur la dynamique des populations animales représente un enjeu sociétal majeur pour favoriser le maintien de la biodiversité. Le milieu de montagne permet de travailler sur de petites communautés d'herbivores à forte valeur patrimoniale, cynégétique ou emblématique. Il s'agit en effet d'un milieu en pleine mutation depuis plusieurs décennies à cause de la déprise agricole et du développement récent de l'écotourisme et des activités humaines récréatives. Ces changements ont conduit à l'aménagement et à la modification de nombreux habitats. Par ailleurs, le milieu montagnard est fortement saisonnier et semble particulièrement sensible au changement global actuel. L'effet des changements climatiques récents reste pourtant encore mal évalué. L'augmentation de la température moyenne des 30 dernières années est susceptible de modifier la dynamique des ressources disponibles pour les herbivores, mais aussi la chronologie d'accès à ces ressources, notamment à travers la diminution du couvert neigeux en hiver et sa fonte accélérée au printemps. L'objectif de cette thèse est donc d'évaluer l'effet des variables climatiques locales et globales sur les traits d'histoire de vie des herbivores de montagne, principalement à travers l'exemple de la marmotte alpine (Marmota marmota), un mammifère social et hibernant. Ce travail a permis de mieux appréhender les mécanismes d'action du climat sur la démographie des espèces de montagne, mais aussi de mettre en évidence le déclin continu d'une population de marmottes Alpines, dans les Alpes françaises, depuis les années 1990. Il pourrait ainsi servir de base pour établir les règles de gestion de cette espèce emblématique, et maintenir une forte biodiversité dans les écosystèmes de montagne / Natural systems responses to global change are of major concern for human societies to maintain high species diversity. Mountains, and particularly alpine climate, offer the opportunity to work with small mammalian herbivore communities, with a strong patrimonial, hunting or emblematic value. Since the last decades, mountains are indeed facing major changes, due to the loss of agricultural lands and the recent development of ecotourism and human recreational activities. Those changes have modified natural habitats and their management planning a lot. Additionally, alpine climate is strongly seasonal and seem particularly sensitive to the actual global change. However, the recent impact of climate change on species and natural habitats is still under-evaluated. The increase in the average global temperature of the last 30 years could modify resources dynamics for a wide variety of species. The availability of resources, but also the chronology of access to these resources, for example through the decrease of snow cover in winter and its accelerated thaw in spring, is of crucial importance for herbivore populations. The aim of this thesis is therefore to evaluate the potential role of local and global climatic factors on life history traits of mountain herbivores, mostly through the example of the alpine marmot (Marmota marmota), a social and hibernating mammal. This work allowed us to better understand the mechanisms underlying the effect of climate change on mountain mammal population dynamics and demography; but also to highlight the continuous decline of an alpine marmot population in the French Alps since the 90s. Conservation strategies and practices could thus arise from this work, in order to maintain biodiversity in mountainous ecosystems

Depuis plusieurs années, la sénescence cellulaire a été majoritairement étudiée comme un processus causé par le vieillissement des cellules et un mécanisme pour limiter la propagation des cellules précancéreuses. Cette perspective a changé suite aux publications des groupes Serrano et Keyes, qui ont démontré la présence des cellules sénescentes très tôt durant le développement embryonnaire de la souris. Dernièrement, le laboratoire de Dr Roy a identifié le pronéphros, un organe transitoire qui est remplacé par le mésonéphros (homologue du rein chez les humains) à la maturité, les fascicules du nerf olfactif ainsi que les gencives comme des zones riches en cellules sénescentes durant le développement de l’axolotl. Ces évidences suggèrent que la sénescence est une réponse biologique survenant non seulement lors du vieillissement, mais est également une réponse physiologique pouvant être activée par différents signaux présents dans son environnement. À ce jour, bien que plusieurs chercheurs ciblent l’identification des points de contrôle de la sénescence cellulaire, on connaît peu de chose sur le rôle des cellules sénescentes durant le développement embryonnaire et la manière dont celui-ci pourrait influencer la croissance et la morphogenèse des organismes. Dans la présente étude, on cherche à identifier les gènes qui sont importants dans la sénescence développementale. Les résultats de séquençage d’ARN dans le pronéphros de l’axolotl ont démontré un enrichissement significatif du gène PEBP1, qui code pour une protéine surtout connue pour son rôle inhibiteur sur la kinase Raf. De plus, nos résultats semblent démontrer une diminution de l’activité bêta galactosidase dans le pronéphros de l’axolotl en développement lorsque celui-ci est traité à la Locostatin, un inhibiteur pharmacologique qui bloque l’interaction de PEBP1 avec RAF. Nous suggérons que PEBP1 pourrait être important pour soit l’activation ou le maintien du caractère sénescent dans les organes en développement de l’axolotl. Un phénomène qui semble être important pour conserver la fonctionnalité de l’organe en transition. / For several years, cellular senescence has been mainly studied as a process caused by the aging of cells and a mechanism to limit the propagation of precancerous cells. This perspective changed following the publications of Serrano and Keyes, who demonstrated the presence of senescent cells very early in the embryonic development of mice. Recently, the laboratory of Dr. Roy identified the pronephros, a transient organ which is replaced by the mesonephros (kidney counterpart in humans) at maturity, the olfactory nerve fascicles as well as the gums as areas rich in senescent cells during the development of axolotl. The evidence suggests that senescence is not only related to the aging process, but rather a physiological response which is activated by various signals present in its environment. To date, although several researchers are targeting the identification of control points for the activation of senescence, little is known about the role of senescent cells during embryonic development and how it could influence growth and morphogenesis. In the present study, we seek to identify the genes that are important in developmental senescence. The results of RNA sequencing in the axolotl pronephros have, among other things, demonstrated a significant enrichment of the PEBP1 gene which codes for a protein that acts as an inhibitor of the Raf kinase. Our findings support the idea that cellular senescence that occurs during the embryonic development of the axolotl is dependent on PEBP1 since the pharmacological inhibitor of PEBP1 (Locostatin), which blocks the interaction of PEBP1 with RAF, seems to affect the activity of senescent beta galactosidase. We suggest that PEBP1 is necessary for either the activation or the maintenance of senescence in the pronephros during embryogenesis. We further suggest that embryonic senescent is crucial for the morphogenesis of the developing organ perhaps by keeping the organ functional during the transition.

La peau est un organe se trouvant à l’interface de notre organisme et de notre environnement. Ellesubit un vieillissement qui se traduit par des modifications affectant ses différentes couches. Parmi celles-cile derme est particulièrement affecté. Les fibroblastes, présents dans le derme, synthétisent des moléculesde la matrice extracellulaire ainsi que des enzymes de dégradation. Lors du vieillissement, cette sécrétionest modifiée favorisant ainsi la sécrétion d’enzymes et la dégradation du derme. L’un des objectifs de ces travaux de thèse est d’évaluer les modifications ayant lieu chez les fibroblastes lors du vieillissement. Pour cela, trois modèles de vieillissement de fibroblastes primaires dermiques humains ont été développés et caractérisés. Une étude transcriptomique a été réalisée par PCR quantitative en temps réel et a permis de mettre en évidence des différences d’expression de gènes codant pour des composants du derme. Dans le but de développer des actifs cosmétiques à visée « anti-âge », des extraits riches en polysaccharides ont été réalisés à partir de plantes et de microorganismes, puis leur efficacité a été évaluée sur des modèles de peaux humaines. L’appareil de Golgi est un organite jouant un rôle majeur dans la modification post-traductionnelle et la sécrétion. La modification structurale de celui-ci lors du vieillissement a été évaluée sur les modèles de fibroblastes en utilisant des techniques de microcopie optique et électronique. Les résultats montrent une altération de la morphologie du réseau trans-golgien chez les fibroblastes sénescents, l’un des modèles développés au cours de ces travaux. Chez ces cellules, le TGN présente une morphologie particulière qui s’étend dans le cytoplasme. Ainsi, lors de la sénescence, nous avons pu révéler par le biais d’une étude transcriptomique que l’expression de gènes impliqués dans la structure et la fonctionnalité de l’appareil de Golgi étaient modifiée. Les résultats obtenus lors de cette thèse ont permis de mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques innovants pour le criblage d’actifs dermo-cosmétiques à visée «anti-âge». / Skin is an important organ of the human body representing a protective structure in direct contactwith the external environment. During aging, skin undergoes dramatic changes including alteration ofdermal cells and components. Among these, fibroblasts synthetize and secrete a large variety ofcomponents and degrading enzymes involved in the modulation of dermal structure and functions. It isestablished that modification of the secreted components and enzymes during aging is related to dermisdegradation. This work aims to characterize aging-related alteration in fibroblasts. For this purpose, three aged human dermal primary fibroblast models have been developed. A transcriptomic study, using real-time quantitative PCR, has also been undertaken and has shown modifications in the expression of genesencoding dermal proteins. Using these results and in order to develop “anti-aging” cosmetic ingredients, extracts from polysaccharides-rich plant and microbial cells have been prepared and their efficiency evaluated on skin explants.As the Golgi apparatus is a major organelle of the secretory pathway, its structural organization has been investigated in fibroblasts using microscopy. The data show a marked alteration of trans-Golgi network morphology in aged cells. In contrast to its small and compact structure in young cells, the trans-Golgi network displays a large and expanded configuration in senescent cells. In addition, a transcriptomic analysis reveals that the expression of some genes, related to Golgi shape and/or function, is significantly modified in senescent cells. These genes could be then, used as innovating targets for the screening of novel dermo-cosmetic products with anti-aging activity.

Il a été suggéré que l’autophagie pouvait participer au processus fibrotique en favorisant la différenciation du fibroblaste en myofibroblaste. La sénescence cellulaire a aussi été montrée comme impliquée dans la réparation tissulaire et la fibrose. Des liens ont été établis entre autophagie et sénescence. Cette étude a pour but d’investiguer les liens possibles entre autophagie, sénescence et différenciation myofibroblastique afin de mieux comprendre les mécanismes moléculaires régulant la réparation tissulaire et la fibrose. Les fibroblastes carencés en sérum pendant quatre jours montrent des ratios LC3B-II/-I élevés et des niveaux de SQSTM1/p62 diminués. L’augmentation de l’autophagie est accompagnée d’une augmentation de l’expression des marqueurs de différenciation myofibroblastique ACTA2/αSMA et collagènes de type 1 et 3 et de la formation de fibres de stress. Les fibroblastes autophagiques expriment les marqueurs de sénescence CDKN1A (p21) et p16INK4a (p16) et montrent une augmentation de l’activité beta-galactosidase associée à la sénescence. L’inhibition de l’autophagie à l’aide de différents inhibiteurs de phosphoinositide 3-kinase de classe I et de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PtdIns3K) ou par inhibition génique à l’aide d’ARN interférant ATG7 bloquent l’expression des marqueurs de différenciation et de sénescence. L’expression et la sécrétion de CTGF (connective tissue growth factor) sont augmentées chez les fibroblastes autophagiques. L’inhibition de l’expression du CTGF par interférence génique prévient la différenciation myofibroblastique, démontrant l’importance de ce facteur pro-fibrotique pour la différenciation induite par l’autophagie. La phosphorylation de la kinase RPS6KB1/p70S6K, cible du complexe MTORC1, est abolie dans les fibroblastes autophagiques. La phosphorylation d’AKT à la Ser473, une cible du complexe MTORC2, diminue lors de la carence en sérum des fibroblastes mais est suivie d’une rephosphorylation après 2 jours. Ce résultat suggère la réactivation de MTORC2 lors d’une autophagie prolongée. Ceci a été vérifié par inhibition de l’autophagie dans les fibroblastes carencés en sérum. Les inhibiteurs de PtdIns3K et le siRNA ATG7 bloquent la rephosphorylation d’AKT. L’inhibition de la réactivation de MTORC2, et donc de la rephosphorylation d’AKT, est aussi obtenue par exposition des fibroblastes à la rapamycine, le Torin 1 ou par inhibition génique de RICTOR. Ces traitements inhibent l’augmentation de l’expression du CTGF ainsi que des marqueurs de différenciation et de sénescence, démontrant le rôle central joué par MTORC2 dans ces processus. Le stress oxydant peut induire la sénescence et la carence en sérum est connue pour augmenter la quantité de ROS (reactive oxygen species) dans les cellules. Afin d’investiguer le rôle des ROS dans la différenciation et la sénescence induites par l’autophagie, nous avons incubés les fibroblastes carencés en sérum en présence de N-acetyl-L-cysteine (NAC). Le NAC diminue la production de ROS, diminue les marqueurs d’autophagie, de sénescence et de différenciation myofibroblastique. Le NAC inhibe aussi la phosphorylation d’AKT Ser473. L’ensemble de ces résultats identifient les ROS en association avec une autophagie prolongée comme des nouveaux activateurs du complexe MTORC2. MTORC2 est central pour l’activation subséquente de la sénescence et de la différenciation myofibroblastique. / Recent evidence suggests that autophagy may favor fibrosis through enhanced differentiation of fibroblasts in myofibroblasts. Cellular senescence is also involved in tissue repair and fibrosis. Autophagy has been linked with senescence. This study focuses on understanding the molecular mechanisms linking autophagy, senescence and myofibroblast differentiation and the roles they could play in wound healing and fibrosis. Fibroblasts, serum starved for up to 4 days, showed increased LC3B-II/-I ratios and decreased SQSTM1/p62 levels. Autophagy was associated with acquisition of markers of myofibroblast differentiation including increased protein levels of ACTA2/αSMA (actin, α 2, smooth muscle, aorta), enhanced gene and protein levels of COL1A1 (collagen, type I, α 1) and COL3A1, and the formation of stress fibers. Autophagic fibroblasts showed expression of the senescence markers CDKN1A (p21) and p16INK4a (p16) and also exhibit increase in Senescence Associated-beta-galactosidase activity. Inhibiting autophagy with different class I phosphoinositide 3-kinase and class III phosphatidylinositol 3-kinase (PtdIns3K) inhibitors or through ATG7 silencing prevented myofibroblast differentiation and senescence markers expression. Autophagic fibroblasts showed increased expression and secretion of CTGF (connective tissue growth factor), and CTGF silencing prevented myofibroblast differentiation. Phosphorylation of the MTORC1 target RPS6KB1/p70S6K kinase was abolished in starved fibroblasts. Phosphorylation of AKT at Ser473, a MTORC2 target, was reduced after initiation of starvation but was followed by spontaneous rephosphorylation after 2 d of starvation, suggesting the reactivation of MTORC2 with sustained autophagy. Importantly, inhibition of autophagy with PtdIns3K inhibitors or ATG7 silencing blocked AKT rephosphorylation. Inhibiting MTORC2 activation with long-term exposure to rapamycin, Torin 1 or by silencing RICTOR, a central component of the MTORC2 complex, abolished AKT rephosphorylation. RICTOR silencing, Torin 1 and rapamycin treatments prevented CTGF and ACTA2 upregulation and induction of senescence markers demonstrating the central role of MTORC2 activation in CTGF and senescence induction for myofibroblast differentiation. Since oxidative stress is a known inducer of senescence, we investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in autophagy-induced myofibroblast differentiation and senescence markers induction. Exposing fibroblasts to N-acetyl-L-cysteine (NAC) decreased production of ROS during serum starvation, inhibited autophagy and significantly decreased the expression of senescence and myofibroblast differentiation markers. NAC also inhibited the phosphorylation of AKT Ser473, establishing the importance of ROS in fuelling MTORC2 activation. Collectively, these results identify ROS production in association with sustained autophagy as novel inducers of MTORC2 signaling which in turn concomitantly activate senescence and myofibroblast differentiation.

Le cancer du pancréas est la quatrième cause de décès par cancer au Canada. Avec des mutations activatrices de KRas présentes dans près de 90% des lésions bénignes et tumeurs, ce cancer arbore une activation de la voie MAPK très tôt dans son développement. Or, peu de littérature existe sur les étapes clés de la progression et sur le rôle précis de cette signalisation dans le passage des lésions bénignes (PanIN) au stade avancé (PDAC). Depuis plusieurs années, notre laboratoire s’intéresse aux kinases ERK1/2, actives en aval de Ras, des acteurs centraux du programme de sénescence cellulaire, soit un programme antitumoral intrinsèque aux cellules. L’hypothèse centrale des présents travaux est donc que les mutations de KRas acquises dès le stade PanIN induisent une sénescence qui agit comme barrière à la progression tumorale, et que l’atténuation du signal de ERK est impliquée dans le contournement de ce mécanisme. La première partie de cette thèse montrera donc les avancées que nous avons faites sur la caractérisation de la progression entre le stade bénin et le stade avancé, de laquelle l’acquisition d’un caractère souche, la transition épithélio-mésenchymateuse et le développement d’une dépendance mitochondriale semblent être des déterminants. Ensuite, nous présenterons nos découvertes sur le rôle des kinases ERK1/2, de la sénescence cellulaire et du stress nucléolaire dans une nouvelle approche visant à restaurer un mécanisme de suppression tumorale inspiré des lésions bénignes et impliquant une altération de la biogenèse ribosomique. Finalement, pour bonifier cette nouvelle stratégie, nous présenterons les résultats d’un criblage CRISPR-Cas9 génome-entier nous ayant permis d’identifier les composantes d’une stratégie « one-two punch » basée sur l’induction de sénescence dans les cellules PDAC combinée à l’inhibition de la Glutathion peroxydase 4 (GPX4), de façon à promouvoir une sénolyse efficace dans ce contexte. Dans leur ensemble, les travaux présentés dans cette thèse montrent un avancement significatif dans la compréhension de la biologie des cancers pancréatiques en identifiant à la fois des vulnérabilités intrinsèques et inductibles afin de générer de nouvelles idées thérapeutiques pour ce cancer hautement fatal. / Pancreatic cancer is the fourth leading cause of death by cancer in Canada. With frequent activating mutations in KRas in up to 90% of benign lesions and tumors, this cancer possesses an early activation of the MAPK pathway. However, key events of its progression from the PanIN stage to the PDAC stage and the precise role of MAPK signaling in it are still poorly understood. For many years, our laboratory has taken interest in the ERK1/2 signaling pathway, activated downstream of oncogenic Ras and a key mediator of cellular senescence. Cellular senescence is considered an intrinsic antitumor mechanism due to its ability to stably halt the cell cycle. The central hypothesis of this work is then that KRas mutations that are acquired at the PanIN stage induce cellular senescence which acts as a barrier against tumor development. Still, this powerful mechanism can be circumvented as cells tend to attenuate the ERK1/2 signaling to promote progression and acquisition of more aggressive features. Thus, the first part of this thesis will present our most recent advances in characterizing the progression events between PanIN and PDAC stages, during which stem cell features acquisition, epithelial-mesenchymal transition and mitochondrial dependency seem to occur. Next, we will present our discoveries regarding the implication of ERK1/2 kinases, cellular senescence and nucleolar stress in a new approach to restore a tumor suppression mechanism inspired by the PanIN stage and based on ribosome biogenesis alteration. Finally, to potentiate this strategy, we will show the results of a genome-wide CRISPR-Cas9 screen that identified the components of a “one-two punch” approach to induce cellular senescence in PDAC cells and to efficiently eliminate them by GPX4 inhibitors-mediated senolysis. Globally, the work presented in this thesis show significant progress in the field of pancreatic cancer, identifying previously unknown vulnerabilities of those cancer cells and paving the way for the development of new therapeutic combinations.

La sénescence cellulaire et l'apoptose ont évolué comme des puissantes barrières protectrices contre la transformation néoplasique. La sénescence est un état d'arrêt permanent de la prolifération dans lequel les cellules restent métaboliquement actives. La sénescence cellulaire est déclenchée par différentes sources de stress, notamment les oncogènes activés, le dysfonctionnement des télomères, les dommages à l'ADN et des défauts dans la réplication provoqués par des agents génotoxiques, des espèces réactives de l'oxygène, etc. Ce processus complexe engage deux voies différentes de suppresseurs de tumeurs, les voies p53/p21 et p16INK4a/pRb, et les deux voies doivent être compromises dans les cellules humaines afin de contourner la sénescence. Par conséquent, décrire la relation entre l'activation des oncogènes, l'arrêt de la prolifération induite par la sénescence et l'échappement à l'état de sénescence est essentiel pour comprendre le processus de tumorigenèse. KDM4A est un membre de la sous-famille KDM4 des Jumonji lysine déméthylases ciblant les variantes di- et triméthylées de l'histone H3 lysine 9 (H3K9) et l'histone H3 lysine 36 (H3K36). Les trois premiers membres de la sous-famille KDM4A, KDM4B et KDM4C sont également capables de lier l'histone 4 lysine 20 di-méthyl/tri-méthyl (H4K20me2/3) et l'histone 3 lysine 4 tri-méthyl (H3K4me3), via leurs domaines Tudor consécutifs. KDM4A module négativement l'activité de la voie p53, en ciblant directement le suppresseur de tumeur CHD5, et est également un régulateur négatif de la réponse aux dommages de l'ADN. Les niveaux d'expression de KDM4A sont souvent élevés dans les cellules cancéreuses et diminués pendant la sénescence cellulaire. La motivation principale de cette thèse est d'élargir nos connaissances actuelles sur la façon dont la réorganisation de la chromatine influence la stabilité du phénotype de sénescence. Dans la première partie de ce travail, nous abordons la fonction de méthylation de H4K20 et H3K9, dans le contexte des foyers d'hétérochromatine associés à la sénescence (SAHF: senescence-associated heterochromatin foci). Nous démontrons que l'intégration de H4K20me3 dans les SAHF dépend de l'incorporation précédente de H3K9me3 et révélons les méthyltransférases H4K20 impliquées dans ce processus. Nous proposons un mécanisme moléculaire par lequel H4K20me3 et H3K9me3 coopèrent avec p53 dans la répression stable des gènes cibles de E2F au cours de la sénescence induite par l'oncogène Ras. Dans la deuxième partie de la thèse, nous présentons une voie de dégradation lysosomale (c'est-à-dire l'autophagie médiée par des chaperons) en tant que nouveau mécanisme potentiel par lequel les cellules modulent les niveaux de KDM4A pendant la sénescence. Nos résultats suggèrent que la méthylation dans les lysines des histones régule la stabilité de sénescence en réponse à l'oncogène Ras et révèlent le potentiel d'induction de la sénescence par inhibition ciblée de KDM4A dans le traitement du cancer. / Cellular senescence and apoptosis have evolved as potent protective barriers against neoplastic transformation. Senescence is a state of stable arrest of proliferation in which cells remain metabolically active. Cellular senescence is triggered by different sources of stress, including activated oncogenes, telomere dysfunction, DNA damage and replication defects elicited by genotoxic agents, reactive oxygen species, etc. This complex process engages two different tumor suppressor pathways, the p53/p21 and p16INK4a/pRb pathways that need to be compromised in human cells in order to circumvent the senescence-associated growth halt. Hence, describing the relationship between oncogene activation, senescence-induced proliferation arrest and escape from the senescence state remains essential to understand tumorigenesis. KDM4A is a member of the KDM4 sub-family of Jumonji lysine demethylases targeting di- and tri-methylated histone H3 lysine 9 (H3K9) and histone H3 lysine 36 (H3K36). The first three sub-family members KDM4A, KDM4B and KDM4C are also able to bind histone 4 lysine 20 di-methyl/tri-methyl (H4K20me2/3) and histone 3 lysine 4 tri-methyl (H3K4me3), via their tandem Tudor domain. KDM4A negatively modulates the activity of the p53 pathway, by directly targeting the tumor suppressor CHD5, and is also a negative regulator of the DNA damage response. KDM4A expression levels are often elevated in cancer cells and decreased during cellular senescence. The principal motivation for this thesis is to expand our current knowledge on how chromatin reorganization influences the stability of the senescence phenotype. In the first part of this work we address the function of H4K20 and H3K9 methylation, in the context of the senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). We demonstrate that integration of H4K20me3 into the SAHF depends on the previous incorporation of H3K9me3 and reveal the H4K20 methyltransferases involved in this process. We propose a molecular mechanism by which H4K20me3 and H3K9me3 cooperate with p53 in the stable repression of E2F target genes during oncogenic Ras-induced senescence. In the second part of the thesis we present a lysosomal-degradation pathway (i.e. chaperone-mediated autophagy) as a novel potential mechanism by which cells modulate KDM4A protein levels during senescence. Our results strongly suggest that histone lysine methylation contributes to the stability of the senescence response to the Ras oncogene and reveal the potential of senescence induction by targeted inhibition of KDM4A in the treatment of cancer.

Environ 30% des cancers humains ont une mutation gain de fonction dans l’oncogène RAS, menant à une prolifération cellulaire accrue et une expansion clonale. Cependant, il est bien établi qu’une hyperactivation soutenue de cette voie mène au phénotype inverse, soit la sénescence cellulaire, définie par un arrêt stable de la prolifération. Ce destin cellulaire caractérise les lésions bénignes et la progression vers une tumeur maligne est associée à son contournement. Toutefois, les mécanismes moléculaires permettant aux cellules de distinguer entre une signalisation normale et oncogénique par RAS afin de les engager vers la sénescence plutôt que la prolifération demeurent inconnus. Ainsi, l’hypothèse à la base de ces travaux est que la décision d’engagement vers la sénescence implique une reprogrammation transcriptionnelle qui précède l’établissement des phénotypes caractéristiques de la sénescence, tel le phénotype sécrétoire (SASP) (Article 1). Nous avons ainsi identifié un point de restriction (SeRP) critique pour l’engagement des cellules vers la sénescence en réponse à l’oncogène HRASG12V. Ce SeRP intègre l'intensité et la durée du stress oncogénique, tout en gardant une mémoire des stress antérieurs, en modulant l’accessibilité à la chromatine via l’induction d’un réseau auto-régulé de facteurs de transcription comprenant notamment ETV4 et RUNX1 (Article 2). Notre modèle actuel nous porte à croire que cette augmentation d’accessibilité à la chromatine impliquerait principalement une décondensation de l’hétérochromatine périnucléolaire. Ceci mènerait à l’induction du SASP et aux défauts de ribogénèse observés dans la sénescence. Nous montrons d’ailleurs via la génération d’un modèle murin transgénique que l’induction de tels défauts de ribogénèse à l’échelle systémique mène à un phénotype de vieillissement prématuré suggérant une sénescence des cellules souches (Article 3). Les cellules souches ayant des niveaux particulièrement élevés de ribogénèse et étant très sensibles à des altérations de leur niche tels que l’inflammation chronique, nous pensons que, de manière fortuite, ce modèle reproduit en quelque sorte les conséquences du SeRP. En somme, l’ensemble des travaux présentés dans cette thèse permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires régulant l’engagement vers la sénescence. À termes, ces nouvelles notions permettraient de concevoir des stratégies thérapeutiques permettant de faire pencher la balance vers la sénescence dans un contexte de cancers mutés en RAS. / Around 30% of human cancers have a gain-of-function mutation in the RAS oncogene, resulting in increased cell proliferation and clonal expansion. However, it is well established that a sustained hyperactivation of this same pathway leads instead to the opposite phenotype, namely cellular senescence, which is defined by a stable proliferation arrest. This cell fate characterizes benign lesions and progression to malignancy is associated with its bypass. However, the molecular mechanisms allowing cells to distinguish between normal and oncogenic RAS signaling in order to commit them to senescence rather than proliferation remain unknown. Thus, the hypothesis underlying the present work is that this decision to commit to senescence involves a transcriptional reprogramming that precedes the establishment of the senescence-characteristic phenotypes such as the secretory phenotype (Article 1). We have thus identified a restriction point (SeRP) critical for the commitment of cells towards senescence in response to HRASG12V oncogene. This SeRP integrates both the intensity and duration of oncogenic stress while keeping a memory of previous stresses. This integration is achieved by modulating chromatin accessibility via the induction of a self-regulated network of transcription factors including among others ETV4 and RUNX1 (Article 2). Our current model leads us to believe that this increase in chromatin accessibility during the SeRP would mainly involve decondensation of perinucleolar heterochromatin. This would lead to the induction of the pro-inflammatory secretome of senescent cells (SASP) and the ribogenesis defects observed in senescence. Besides, we show via the generation of a transgenic mouse model that the induction of such ribogenesis defects at the systemic scale leads to a premature aging phenotype suggesting stem cells senescence (Article 3). Stem cells having particularly high levels of ribogenesis and being very sensitive to alterations of their niche such as chronic inflammation, we believe that serendipitously, this model somehow reproduces the consequences of the SeRP. In short, all the work presented in this thesis allows for a better understanding of the molecular mechanisms regulating the commitment to senescence. Ultimately, these new notions would allow to design therapeutic strategies to tip the balance towards senescence in the context of RAS-mutated cancers.

Les altérations de la barrière hémato-rétinienne (BRB) sont associées à des maladies rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique et la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). L’intégrité de la BRB est cruciale pour maintenir un microenvironnement rétinien en homéostasie et est étroitement régulé grâce à la régulation du transport transcellulaire et paracellulaire. Ici, nous décrirons brièvement la BRB interne, en mettant davantage l’accent sur la structure et la fonction de la BRB externe dans les états sains et malades. Nous avons hypothétisé que le dysfonctionnement des aquaporines exprimées dans des composantes de la BRB est suffisant pour générer un oedème diabétique dans une rétine diabétique. Bien que les résultats indiquent qu’aucune des aquaporines ciblées n’est suffisante pour générer un oedème cystoïde dans un modèle murin - et ce même en l’exacerbant en augmentant la perméabilité vasculaire rétinienne, nous mettons à l’avant un outil de segmentation semi-automatisé ainsi que deux modèles de recherches engageants. Le modèle murin de DT1 induit via STZ a été étudié de façon longitudinale sur un intervalle de temps modéré et pourra être ajusté pour des expériences futures en mettant à profit un outil de quantification semi-automatique performant. D’autre part, le modèle in vitro de la sénescence de l’ÉPR est conceptuellement établi et partiellement mis sur pied. Finalement, les résultats sont prometteurs et incitent à approfondir des cibles alternatives dans un modèle conceptuellement similaire, mais soit exacerbé ou plus anatomiquement près de l’humain. / Alterations in the blood-retina barrier (BRB) are associated with retinal diseases such as diabetic retinopathy and age-related macular degeneration (AMD). The integrity of the BRB is crucial for maintaining a tightly regulated and retinal microenvironment in homeostasis through the regulation of transcellular and paracellular transport. Here, we will briefly describe the inner BRB, with a greater emphasis on the structure and function of the outer BRB in both healthy and diseased states. We hypothesized that dysfunction of aquaporins expressed in components of the BRB is sufficient to generate diabetic edema in a diabetic retina. Although the results indicate that none of the targeted aquaporin are sufficient to generate a cystoid edema in a murine model, even when exacerbated by increasing retinal vascular permeability, we present a semi-automated segmentation tool and two engaging research models. A murine model and a programmation tool were developped to efficiently assess semi-automated quantitation of retinal edema. On the other hand, the in vitro model of RPE senescence is conceptually established and partially implemented. Ultimately, the results are promising and encourage further exploration of alternative targets in a conceptually similar model, either exacerbated or more anatomically close to humans.