Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença granulomatosa sistêmica causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. Aproximadamente 10 milhões de pessoas que vivem em áreas endêmicas estão infectadas com P. brasiliensis e até 2% destas podem desenvolver a PCM. Períodos extensos de quimioterapia são necessários e problemas de recidiva da doença são frequentes. Vacinas anti-PCM ainda não estão disponíveis para uso em humanos, porém, nos últimos anos, testes em modelo animal mostram que estratégias vacinais são viáveis. Formulações vacinais baseadas na proteína gp43 e no peptídeo P10 específico para células T CD4+ mostram-se promissores como antígenos vacinais. No presente trabalho, testamos as propriedades de uma formulação vacinal terapêutica baseada no peptídeo P10 combinado com flagelina de S. enterica, associada ou não a quimioterapia, como tratamento da PCM experimental. Os resultados indicaram que animais tratados apenas com a vacina, combinada ou não com os quimioterápicos, não demonstraram uma redução significativa da carga fúngica no pulmão. No entanto granulomas mais organizados foram observados no pulmão dos animais que receberam a formulação vacinal. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. Approximately 10 million people living in endemic areas may be infected with this fungus and up to 2% of them may develop the disease. Extended periods of chemotherapy are often necessary to treat PCM and relapses occur frequently. PCM vaccines are not yet available for use in humans, but in recent years tests in animal models showed that vaccine strategies are viable. Vaccine formulations based in protein gp43 and a derived peptide P10, representing a CD4+ T cell-specific epitope, have showed promising results as vaccine antigens. In the present work, we tested the properties of a vaccine formulation based on the P10 peptide admixed with the S. enterica flagellin, in combination or not with chemotherapy, as a PCM therapeutic treatment. Treated mice, combined or not with chemotherapy, showed no significant reduction in lung fungal burden. Nonetheless, more organized lung granulomas were observed in animals that received the vaccine formulation.

A emergência de fenótipos de resistências aos antimicrobianos, tanto na clínica humana e veterinária quanto na agropecuária, constitui uma urgência epidemiológica. O objetivo do presente trabalho foi monitorar os mecanismos de resistência em amostras de Salmonella spp. e E. coli isoladas (2005-2010) de animais de produção agropecuária (aves e suínos) e fontes relacionadas. Do total de 143 amostras de Salmonella spp., 9% (3 S. Thyphimurium, 7 S. Schwarzengrund e 2 S. Agona) eram resistentes a cefolosporinas de amplo espectro pela produção de ESBL do tipo CTX-M-2, prevalecendo dois clusters disseminados clonalmente no ciclo de produção avícola. Em E. coli, a resistência às cefalosporinas de amplo espectro foi associada com a presença do gene blaCTX-M-2 (n=24), blaCMY-2 (n=2) e blaCTX-M-15 (n=1, novo ST, complexo clonal 206), não existindo relação clonal no ciclo de produção suína. Em 5 amostras de E. coli (suínos) resistentes a fluoroquinolonas foi confirmada a presença de genes do tipo qnr. A aquisição e disseminação de genes conferindo resistências a cefaloporinas de amplo espectro e quinolonas, em isolados de origem animal, pode ter impacto em saúde pública. / Emergence of drug-resistant phenotypes in human and veterinary medicine, and in the animal husbandry has epidemiological significance. The aim of this study was to investigate the resistance mechanisms of Salmonella and E. coli strains isolated (2005-2010) from food-producing animals (poultry and swine) and related sources. Among 143 Salmonella spp., 9% strains (3 S. Thyphimurium, 7 S. Schwarzengrund and 2 S. Agona) exhibited resistance to extended-spectrum cephalosporins, which was associated to the presence of the blaCTX-M-2 gene. These strains were clonally related (2 major clusters). Resistance to extended-spectrum cephalosporins among clonally unrelated E. coli strains from swine was associated to the presence of blaCTX-M-2 (n=24), blaCMY-2 (n=2) and blaCTX-M-15 (n=1, new ST belonging to the clonal complex 206) genes. Five E. coli strains (from swine) resistant to fluoroquinolones carried qnr genes. Acquisition and spread of genes conferring resistance to extended-spectrum cephalosporins and fluoroquinolones among Salmonella spp. and E. coli strains from food-producing animals is worrisome and it should be considered a public health issue.

Infecções pulmonares de potros jovens por Rhodococcus equi resultam em grave pneumonia levando à morte um grande número de animais todos os anos. Até o momento não há nenhuma vacina aceita globalmente para a prevenção da rodococose equina. O único tratamento preconizado é baseado em antibioticoterapia, porém os protocolos clínicos são longos, de alto custo, com efeitos colaterais e tem favorecido a seleção de cepas resistentes aos antibióticos. Diversas estratégias no desenvolvimento de uma vacina segura e eficiente contra a rodococose foram propostas, porém, não induziram um efeito protetor considerável. O principal fator de virulência do R. equi descrito e amplamente estudado é a proteína vapA, no entanto, outras proteínas localizadas na ilha de patogenicidade estão presentes em amostras de R. equi virulento extraídos de animais infectados. Trabalhos recentes têm demonstrado a presença do gene vapG em todas as cepas virulentas e este gene é altamente expresso quando a bactéria reside no interior de macrófagos, tornando-o um possível alvo vacinal. Nosso grupo já possui experiência prévia no uso de linhagem de Salmonella enterica Typhimurium atenuada carreando a proteína vapA. Baseado nos resultados positivos obtidos, foi construída uma linhagem atenuada de S. enterica Typhimurium 3987 expressando a proteína vapG. A administração desta linhagem em camundongos foi capaz de induzir proteção contra R. equi virulento. Os resultados observados foram a colonização e persistência da Salmonella nos órgãos alvo, a redução da carga bacteriana de R. equi, e a indução de um perfil imune protetor semelhante ao observado em animais adultos resistentes. Observou-se o aumento da produção de IL-12p70 e IFN-, alem da presença de níveis aumentados de IL-4 e a redução dos níveis de TNF-. Observou-se também o aumento na subpopulação de células T auxiliares (CD4+) com perfil de memória, além de aumento na população de linfócitos B totais quando comparado aos grupos controles. Este conjunto de resultados indica que a imunização com Salmonella enterica Typhimurium expressando a proteína vapG gera uma resposta imune celular eficiente tornando esta linhagem uma possível candidata a vetor vacinal. Alem disso, sugere que outros antígenos do R. equi podem ser / Pulmonary infections in young foals by Rhodococcus equi result in severe pneumonia, leading to death a large number of animals every year. There is no globally accepted vaccine for the prevention of equine rhodococosis so far. To date, the only acceptable treatment is based on antibiotics, but the clinical protocols are long lasting, expensive, having side effects and favoring the emergence of drug resistant strains. Several strategies for developing a safe and effective vaccine against rhodococosis have been proposed, however, none has induced a significant protective effect. The main virulence factor of R. equi described and extensively studied is the protein vapA, although other proteins encoded by genes in pathogenicity islands are detected in samples of virulent R. equi, isolated from infected animals. Recent works have demonstrated that the vapG gene is present in all virulent strains, and that this gene is highly expressed when bacteria reside within macrophages, making it a potential vaccine target. Our group has already been working with an attenuated Salmonella enterica Typhimurium strain expressing the VapA protein. Even though our results were very promising, we decided to construct a second vaccine strain expressing the VapG protein. Based on the positive results, it was constructed an attenuated strain of S. enterica Typhimurium 3987 expressing the vapG protein. Interestingly, the VapG-expressing strain induced protection against virulent R. equi in mouse model of infection. We could observe colonization and persistence of Salmonella vaccine cells in target organs, with reduction of bacterial loads of R. equi and induction of a protective immune profile similar to that seen in resistant adult animals. We could also observe increased production of IL-12p70 and IFN- in addition to the presence of increased levels of IL-4 and reduced levels of TNF-. Moreover, we detected an increase in the subpopulation of T helper cells (CD4), with a profile of memory, as well as in the population of B lymphocytes, when compared to control groups. This set of results shows that immunization with Salmonella enterica Typhimurium expressing the VapG protein raises an efficient cellular immune response, making this strain a potential candidate for vaccine vector. Furthermore, this work suggests that other R. equi antigens may be taken into account for vaccine construction, besides the VapA protein utilized in the majority of studies.

O presente estudo buscou avaliar os efeitos dos Mananoligossacarídeos (MOS) como aditivo alimentar no desempenho de primíparas suínas em final de gestação e em lactação, bem como no desempenho e na saúde dos leitões até os 65 dias de idade. O experimento foi realizado no Laboratório de Pesquisa em Suínos (VNP-FMVZ-USP) Pirassununga SP. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado em arranjo fatorial de tratamentos, sendo um fator o fornecimento dos MOS para fêmeas e o segundo para os leitões. Foram utilizadas 17 primíparas prenhes, tratadas a partir de 81 &plusmn;1,36 dias de gestação com 0,2% de MOS na dieta. Aos 82 &plusmn; 1,36 dias de gestação as fêmeas foram submetidas à coleta de sangue e à vacinação contra rinite atrófica progressiva, sendo pesadas quinzenalmente até a transferência para a maternidade, aos 109 &plusmn; 1,36 dias de gestação. Na segunda quinzena as fêmeas tratadas apresentaram uma vantagem numérica no ganho de peso médio diário (P=0,063). Durante o parto foram colhidas amostras de sangue e colostro para titulação de anticorpos contra o antígeno vacinal, sendo consideradas positivas 66,67% das fêmeas MOS e 42,86% das fêmeas controle. Os leitões aleitados por fêmeas tratadas tiveram um maior ganho numérico de peso na primeira semana (p=0,0614), significativo na segunda semana (p=0,047). Na terceira semana foi introduzido o segundo fator através do oferecimento de alimento sólido (0,4% de MOS). No período total, do nascimento aos 21 dias, foi observada uma vantagem numérica (p=0,0989) no ganho de peso a favor dos leitões de fêmeas MOS. As fêmeas, contudo, não diferiram quanto à variação de peso ou consumo durante a fase de lactação. Aos 23 &plusmn; 1,91 dias de idade dos leitões foi realizado o desmame abrupto com a transferência dos leitões para unidade de creche, onde foram alojados em gaiolas para 4 animais. O peso ao desmame foi maior nos leitões aleitados por fêmeas tratadas (p<0,0001), bem como em todas as pesagens semanais até a quinta semana pós-desmame. O consumo na primeira semana sofreu influência da suplementação de MOS nas fêmeas e do maior peso à desmama se mostrando superior nesses animais (P=0,049) influenciando diretamente o ganho de peso, superior na segunda semana (p=0,002). O MOS para os leitões aumentou o consumo de alimento (p=0,0784), e a conversão alimentar na segunda semana (p=0,0103). Aos 14 dias pós-desmame foram colhidas amostras de sangue para hemograma e realizada a aplicação oral de 108 UFC de Salmonella Typhimurium. Foram observadas diariamente a consistência das fezes por 28 dias e aferidas as temperaturas retais por 9 dias. Leitões tratados com MOS e os leitões oriundos de fêmeas MOS tenderam a apresentar o pico de hipertermia mais cedo que os demais (p=0,0629 e p=0,0976, respectivamente) e os leitões alimentados com MOS tenderam a ter uma temperatura de pico mais baixa (p=0,0989). Na última semana os leitões de fêmeas MOS apresentaram um maior consumo (p=0,0007) e uma incidência de Salmonella numéricamente inferior em linfonodos mesentéricos e nas fezes colhidas aos 36 dias pós-desafio. Pode-se concluir que a suplementação de MOS para primíparas prenhes e lactentes pode melhorar o desempenho e a saúde entérica de seus leitões nas fases de aleitamento e creche. / The present study evaluated the effects of mananoligossacarides (MOS) as a feed additive on the performance of primiparous sows in late gestation and lactation, as well as on performance and health status of their progeny up to 65 days of age. The experiment was conducted in the Laboratory of Swine Research (FMVZ/USP) Pirassununga SP. For this purpose a completely random factorial design was used, factors which corresponded to (1) feeding sows with MOS and (2) feeding piglets with MOS, characterizing 4 treatments: MM Feeding MOS to both sows and piglets, MC Feeding MOS only to the sows, CM Feeding MOS only to piglets, CC Control diets for both sows and piglets. A total of seventeen pregnant gilts were used, and divided into 2 groups: MOS (n=9) and Control (n=8). MOS gilts had 0,1% MOS added to their diets from 81 &plusmn; 1,36 days of gestation onward. On day 82 &plusmn; 1,36 blood was collected and vaccination against Progressive Atrophic Rhinitis was conducted. Animals were weighted biweekly until 109 &plusmn; 1,36 days of gestation, when transference to the farrowing unit was conducted. Between the first and second weighing, MOS gilts show a numerical advantage in daily weight gain (p=0,063). At farrowing, blood and colostrum samples were collected for determination antibodies titles against vaccine antigen, being considered positive 66,67% and 42,86% of MOS and Control sows, respectively. Piglets nursed by MOS sows had a numerical advantage in weight gain in the first week (p=0,0614), with statistical significance in the second week (p=0,047). On the third week, the second factor was introduced by the offering of solid feed (0,4% MOS). During the suckling period, from birth to 21 days of age, a numerical advantage in weight gain was observed for MOS sows piglets (p=0,0989). The sows themselves did not differ in weight change or feed consumption. At 23 &plusmn; 1,91 days of age, weaning was conducted, as piglets were transferred to nursing facilities and allocated in pens of 4 animals. Weight of MOS sows piglets was higher at weaning (p<0,001) and until the 5th week port-weaning. Feed consumption was affected by MOS supplementation of sows and by the higher weaning weight (p=0,0049), directly influencing weight gain, which was superior in the 2nd week. Feeding MOS to piglets enhanced feed consumption (p=0,0784) and feed conversion (p=0,0103) on the 2nd week. At 14 days of age, blood samples were collected for hemogram analysis and an oral dose of 108 CFU of Salmonella Typhimurium administered. Fecal consistency and rectal temperature were evaluated for 28 and 9 days, respectively. Piglets treated with MOS and MOS sows\' piglets tended to show a peek of hyperthermia earlier (p=0,0629 e p=0,0976, respectively). Piglets fed with MOS tended to show a lower temperature peek (p=0.0989). In the last week, MOS sows\' piglets show a higher feed consumption (p=0.0007) and a numerically inferior Salmonella incidence in mesenteric lymph nodes and feces 36 days after the bacterial challenge. In conclusion, supplementing primiparous sows with MOS during gestation and lactation can enhance their body weight gain and the performance and intestinal health of the offspring during the suckling and nursing period.

O estudo fundamentou-se na utilização de probióticos como promotores de crescimento alternativos na alimentação de suínos dada a proibição, por parte da União Européia, do uso de alguns antibióticos, que podem causar resistência aos antimicrobianos e riscos à saúde humana pelo consumo da carne. O experimento foi conduzido no Laboratório de Pesquisa em Suínos (LPS), com 160 leitões desmamados aos 23 dias de idade até os 138 dias de idade. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso em função do peso e sexo, sendo a unidade experimental considerada a baia com 4 animais, constituindo, portanto, 5 repetições por tratamento. Aos 51 dias de idade os animais foram inoculados com uma cepa de Salmonella Typhimurium via oral. Os tratamentos foram: PA 44: Probiótico A: 4 Kg/tonelada de ração, dos 23 aos 44 dias de idade; PB 44: Probiótico B: 2 Kg/ tonelada de ração, dos 23 aos 44 dias de idade; PA 65: Probiótico A: 4 Kg/tonelada de ração, dos 23 aos 44 e 2 kg/tonelada de ração dos 45 aos 65 dias de idade; PB 65: Probiótico B: 2 Kg/tonelada de ração, dos 23 aos 44 e 1 kg/tonelada de ração dos 45 aos 65 dias de idade; PA 138: Probiótico A: 4 Kg/tonelada de ração, dos 23 aos 44 e 2 kg/ tonelada de ração dos 45 aos 138 dias de idade; PB 138: Probiótico B: 2 Kg/tonelada de ração, dos 23 aos 44 e 1 kg/tonelada de ração dos 45 aos 138 dias de idade; controle positivo: ração com antimicrobiano e sem probióticos e controle negativo: ração sem antimicrobiano e sem probióticos. Foram analisados os parâmetros peso, ganho de peso, consumo de ração e conversão alimentar. Aspectos clínicos e sanitários também foram avaliados, incluindo freqüência de diarréia, temperatura retal, swabs retais para verificação da freqüência da salmonela nas fezes e parâmetros sanguíneos. As variáveis foram analisadas por medidas repetidas no tempo com contrastes. Foi utilizado o SAS 9.0. Em relação ao peso médio, observou-se, no período de creche, que o controle positivo se sobressaiu frente aos probióticos, mas no período de crescimento, por volta dos 106 dias de idade, os grupos se igualaram, não havendo diferenças significativas. No período total de creche e crescimento/terminação, o ganho de peso dos animais do controle positivo foi numericamente superior comparativamente aos probióticos (p=0,0876 para o probiótico A e p=0,0635 para o probiótico B). O consumo de ração foi menor para o controle negativo em relação aos probióticos. A conversão alimentar foi melhor para o controle positvo em relação aos probióticos, na fase de creche. Na freqüência de diarréia o efeito do desafio programado foi evidenciado, mostrando no controle negativo maior freqüência, ressaltada principalmente pela classificação em fezes líquidas, em comparação aos probióticos e controle positivo. A temperatura retal e a presença do agente nas fezes não se mostraram diferentes nos tratamentos, o mesmo ocorrendo com relação aos parâmetros sanguíneos. Portanto, as evidências encontradas quanto aos parâmetros clínicos e sanitários demonstraram de uma maneira geral, que os probióticos e os antimicrobianos podem agir de forma diferenciada, mas apresentando as mesmas respostas que repercutem em desempenhos semelhantes até o final da fase de terminação. Concluiu-se na avaliação de desempenho associada aos aspectos econômicos, que o probiótico A, dentre os tratamentos, foi mais viável, com a administração até 44 e 65 dias de idade dos leitões. A continuidade dos estudos com probióticos é necessária, dada a variabilidade de fatores que interferem no seu melhor aproveitamento como promotor de crescimento. / The study was based on the use of probiotics as growth promoter in the swine feeding due to the prohibition, by the European Union, on the use of some antibiotics by its possibility of causing antimicrobial resistance and risks for human health by meat consumption. The experiment was conducted in LPS, with 160 piglets weaned at 23 days of age until 138 days of age. The experimental design was a randomized block according to weight and sex, the experimental unit considered was the pen holding 4 animals each, thus with 5 repetitions per treatment. At 51 days of age the animals were inoculated with a strain of Salmonella Typhimurium orally. The treatments were: PA44= Probiotic A: 4 kg/ton of ration, from 23 to 44 days of age; PB44= Probiotic B: 2 Kg/ton of ration, from 23 to 44 days of age; PA65= Probiotic A: 4 kg/ton of ration from 23 to 44 days of age and 2 kg/ton of ration from 45 to 65 days of age, PB65= Probiotic B: 2 kg/ton of ration, from 23 to 44 days of age and 1 kg/ton of ration from 45 to 65 days of age; PA138= Probiotic A: 4 kg/ton of ration from 23 to 44 days of age and 1 kg/ton of ration from 45 to 138 days of age; PB138= Probiotic B: 2 kg/ton of ration from 23 to 44 days of age and 1 kg/ton of ration from 45 to 138 days of age; Positive Control= ration with antimicrobial and no probiotics and Negative Control= ration with no antimicrobials nor probiotics. The parameters analyzed were weight, weight gain, ration intake and feed conversion. Clinical and sanitary aspects were also evaluated, diarrhea frequency, rectal temperature, rectal swabs for salmonella verification and blood parameters. The variables were analyzed by repetitive measures on time with the established contrasts. SAS 9.0 was used. Regarding average weight, it was observed, during the nursery period, that the positive control stood out compared to the probiotics, but during growing, around 106 days of age, the groups equaled, with no significant differences. During the total period of nursery and growing/finishing, the weight gain from the animals of the positive control was numerically superior compared to the probiotics (p=0,0876 for probiotic A and p=0,0635 for probiotic B). Feed intake was lower for negative control when compared to probiotics. In the nursery period feed conversiom was better than the positive control in relation to probiotics. In the diarrhea frequency the effect from the programmed challenge was evidenced; showing a higher frequency in the negative control, emphasized mainly for the liquid feces classification in comparison to the probiotics and positive control. The rectal temperature and the presence of the agent in the feces did not differ between treatments, as well as the blood parameters. Therefore, the evidence found regarding clinical parameters and health in general demonstrated that probiotics ant antiotics may act differently, but with the same answer that echo in similar performaces until the end of the finishing period. In conclusion, the evaluation of performance associated with economic aspects, among the treatments, with the probiotics A, both 44 and 65, was better than the positive control. The continuation of studies with probiotics is necessary, given the variability of factors that interfere with its best use as growth promoter.

A combinação de características geográficas e climáticas no Brasil favorece o mercado agrícola, especialmente as culturas de frutas e vegetais. Esses fatores, associados às necessidades da vida atual como praticidade e redução de resíduos, favoreceram o segmento de frutas e vegetais minimamente processados. Entre os microrganismos patogênicos que podem ser transmitidos por esses produtos encontram-¬se Salmonella. sp,Listeria monocytogenes e Escherichia coli O157:H7. A irradiação é um dos métodos utilizados para prevenir e controlar esses microrganismos. Amostras de manga (Mangifera indica L.) das variedades Tommy Atkins e Haden minimamente processadas foram inoculadas com uma mistura de três cepas de Salmonella (Salmonella Infantis, Salmonella Enteritidis ATCC 13076 e Salmonella Tiphymurium ATCC 14028) e expostas a doses de 0; 0.5; 1.0; 1.3; 1.5; 1.8 e 2.0 kGy. O valor D10 para Salmonella spp. inoculada em manga minimamente processada submetida à radiação variou entre 0,52 e 0,62 kGy. Para avaliar os efeitos da radiação, amostras de manga minimamente processada foram expostas a doses de 1 e 2 kGy e amostra controle não irradiada, mantidas em refrigeração a 7&#176;C, foram utilizadas para determinação da vida-de-prateleira baseada na avaliação sensorial e análises microbiológicas. Todas as amostras irradiadas foram aceitas pelos provadores. A vida--de-prateleira da amostra de manga variedade Tommy Atkins exposta a 1 kGy foi de 4 dias, dois dias a mais que a amostra controle e que a amostra exposta 2 kGy. No caso da amostra de manga da variedade Haden todas as amostras irradiadas e a amostra controle apresentaram vida de prateleira de 4 dias. A irradiação mostrou ser um processo adequado para aumentar a segurança microbiológica de mangas minimamente processadas e, dependendo da variedade, também prolonga sua vida-de-prateleira. / Environmental and climatic aspects among consumer demand for fresh1ik:e products are responsible for the expansion of the minimally processed food market in Brazil. Minimally processed foods require less extreme treatments and additives, providing freshlike characteristics and convenience that satisfy the market requirements. Minimally processed fruits and vegetables can be source of pathogenic microorganisms such as Salmonella sp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7. Therefore, this study was carried out in order to evaluate the feasibility of irradiation to improve the microbiological safety and the shelf-life of minimally processed fruits using gamma radiation. Minimally processed mangoes (Mangifera indica L.) Tommy Atkins and Haden cultivars inoculated with a pool of Salmonella spp. were exposed to 0.0; 0.5; 1.0; 1.3; 1.5; 1,8 and 2 kGy. D10 values for Salmonella spp. inoculated in mangoes ranged from 0,52 kGy to 0,62 kGy. Sensory and microbiological tests were performed to determine the shelf-life of samples of mangoes exposed to 1 and 2 kGy and non-irradiated samples stored at 7&#176;C. All samples were accepted by members of sensory panel. The shelf-life of cultivar Tommy Atkins samples exposed to 1 kGy was 4 days, 2 days more than the non-irradiated control and the samples exposed to 2 kGy. The shelf-life of cultivar Haden samples were 4 days to irradiated and non-irradiated samples. Results showed that irradiation can improve microbiological safety of minimally processed mangoes and, depending on the cultivar, extends its shelf-life.

No presente estudo avaliou-se o potencial de aplicação da bacteriocina 2a produzida pelo Lactobacillus sake 2a em combinação com outras substâncias antimicrobianas na inibição de cepas de Salmonella isoladas de linguiça: S. Derby SD2, S. Enteritidis SE3, S. Hadar SH4, S. Panama SP5 e S. Typhimurium ST6. A partir de cultura de L. sake 2a em caldo MRS, obteve-se por extração ácida e concentração em liofilizador, um extrato protéico de bacteriocina de cerca de 500 UA/ml. Verificou-se que esse extrato protéico de bacteriocina 2a tem atividade contra Listeria monocytogenes Scott A Cmr Emr nos meios de cultura BHI, MRS e TSB com 0,1% de glicose, independente de temperatura e atmosfera de incubação. O extrato protéico de bacteriocina 2a foi utilizado só e em combinação com EDTA, ácido cítrico, ácido lático ou lisozima sobre "pool" de cepas de Salmonella. Todos os antimicrobianos testados apresentaram efeito inibidor contra Salmonella, no entanto, quando combinados à bacteriocina 2a esse efeito foi mais acentuado. Entre os tratamentos realizados, o que apresentou efeito mais potente na eliminação ou inibição de Salmonella foi a combinação bacteriocina 2a mais ácido lático 0,1%. Bacteriocina 2a também se mostrou mais eficiente que a nisina (usada como padrão) em combinações com lisozima e EDTA. O estudo permitiu verificar que existe um bom potencial de uso da bacteriocina 2a ou do L. sake 2a bac+ em alimentos em associação com os antimicrobianos ácido lático, ácido cítrico, EDTA ou lisozima. Entretanto, penas a combinação de antimicrobianos não é suficiente para eliminar ou inibir a multiplicação de Salmonella. As condições de temperatura, concentração e forma de aplicação dos tratamentos combinados podem variar e são pontos importantes quando se visa à ação direta sobre as células do patógeno ou quando este está associado a um substrato. / The objective of this study was to analyse the potential of application of bacteriocin 2a produced by Lactobacillus sake 2a in combination with other antimicrobials substances on inhibition of strains of Salmonella isolated from raw Brazilian sausages (lingüiça): S. Derby SD2, S. Enteritidis SE3, S. Hadar SH4, S. Panama SP5 and S. Typhimurium ST6. Culture of L. sake 2a grown at 30ºC in MRS broth was used to obtain a cell-free supernatant after centrifugation. This cell-free supernatant was submitted to acid extraction method for bacteriocin and water reduction by liofilization process. After this, a final fraction was obtained and denominated proteic extract of bacteriocin 2a and had a final concentration of approximately 500 A.U/mL. Proteic extract of bacteriocin 2a obtained from cultures of L. sake 2a grown in broths: BHI, MRS, and TSB with 0.1% of glucose showed bactericidal effect against Listeria monocytogenes Scott A Cmr Emr, in any condition of temperature and atmosphere. The proteic extract of bacteriocin 2a was used alone and in combination with EDTA, citric acid, lactic acid or lyzozyme on pool of strains of Salmonella. All antimicrobials tested showed inhibitory effect against Salmonella, but in combination to bacteriocin 2a this effect was more efficient on inhibition or elimination of Salmonella. Bacteriocin 2a showed be more efficient than nisin when in association with lyzozyme and EDTA. This study was able to verify that exist a great potential of application of bacteriocin 2a and/or L. sake 2a bac+, in foods in combination with the antimicrobials: lactic acid, citric acid, EDTA or lyzozyme. However, the simple combination of these antimicrobials is not sufficient to eliminate or inhibit the growth of Salmonella. Temperature conditions, concentration of antimicrobials and form of application of treatments can change and they are very important points; mainly when the aim of the study is to evaluate the direct action of antimicrobials on cells of pathogen or action of these substances on pathogen into a specific substrate.

Orientador: Marcelo Brocchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T03:47:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gregoracci_GustavoBueno_D.pdf: 6197096 bytes, checksum: 05eb5e18d8084e5c5f742c6ec5afd63d (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: Bacteriófagos são vírus que infectam bactérias e arqueias, representando as entidades biológicas mais abundantes do mundo e influenciando de maneira marcante populações naturais de seus hospedeiros. A terapia com bacteriófagos, que representa uma das primeiras formas modernas de combate a infecções bacterianas, foi recentemente redescoberta e vem sendo reavaliada seguindo metodologias atuais quanto à sua viabilidade terapêutica. Para completar a caracterização dos fagos de nossa coleção, sequenciamos completamente o genoma da maior parte destes, através da metodologia multiplex pair-ended utilizando a plataforma Illumina. Visando contribuir para verificação da viabilidade terapêutica de bacteriófagos testamos os efeitos protetor e terapêutico dos fagos Shfl1, Saen1v2 e Saen1v4, pertencentes à coleção de nosso laboratório, em modelos biológicos relevantes. O fago Shfl1, lítico contra Shigella flexneri, foi testado em ensaio de invasão em células HeLa. A redução de bactérias intracelulares foi mensurada independentemente através de plaqueamento e citometria de fluxo, além da observação direta por microscopia de fluorescência. O fago Saen1v2, lítico contra Salmonella Typhimurium, foi estudado quanto à biodistribuição e meia-vida em modelo murino, e uma variante viral com maior persistência in vivo foi selecionada. Essa variante, denominada Saen1v2p5, e o fago Saen1v4, lítico contra Salmonella Typhi, foram testados em modelo murino de infecção tifoide, contra seus respectivos hospedeiros. Encontramos similaridade genômica a fagos conhecidos, como T4, T7, T1 entre outros, em maior ou menor grau. Obtivemos um efeito protetor e terapêutico contra Shigella flexneri utilizando o fago Shfl1 em ensaio de invasão em cultura de células HeLa, verificado por todas as metodologias empregadas. Não verificamos efeito antimicrobiano in vivo do fago Saen1v2p5 em modelo murino de infecção por Salmonella Typhimurium. Por outro lado, observamos efeito terapêutico e protetor dose dependente utilizando o fago Saen1v4 em modelo murino de infecção por Salmonella Typhi. O sucesso obtido com baixas multiplicidades de infecção sugere um possível efeito indireto ou estimulação imune inespecífica / Abstract: Bacteriophages are viruses that infect Bacteria and Achaea, representing the most abundant biological entities in the world and markedly influencing natural host populations. Phage therapy, which represents one of the first modern ways to fight bacterial infections, was recently rediscovered and is being re-evaluated according to current methodologies regarding its therapeutic viability. In order to complete phage characterization in our collection, we sequenced completely the genomes of most of these, through the multiplex pair-ended methodology using the Illumina platform. Aiming to contribute to the therapeutic viability verification of bacteriophages we tested phage protective and therapeutic effects of Shfl1, Saen1v2 and Saen1v4, which belong to our collection, in biologically relevant models. Phage Shfl1, lytic against Shigella flexneri, was tested in a HeLa invasion assay. Intracellular bacteria reduction was measured independently through plating and flow cytometry, besides direct observation through fluorescent microscopy. Phage Saen1v2, lytic against Salmonella Typhimurium, was studied about its bio-distribution and half-life in murine model, and a viral variant with longer in vivo persistence was selected. This variant, denominated Saen1v2p5, and phage Saen1v4, lytic against Salmonella Typhi, were tested in murine typhoid model, against their respective hosts. Genomic similarity to known phages such as T4, T7, T1 among others, was found, in various degrees. We obtained both protective and therapeutic effect against Shigella flexneri using phage Shfl1 in the HeLa invasion assay, through all methodologies utilized. We could not verify in vivo antimicrobial effect of phage Saen1v2p5 in the murine model of Salmonella Typhimurium infection. On the other hand, we observed both therapeutic and protective dose dependent effect using phage Saen1v4 in Salmonella Typhi murine infection model. The success obtained with low multiplicities of infection may suggest a possible indirect effect or unspecific immune stimulation / Doutorado / Microbiologia / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Orientador: Arnaldo Yoshiteru Kuaye / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-21T12:24:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piton_MariaAmeliadeJesus_D.pdf: 2566267 bytes, checksum: 93031959ddc9b768a984c049dbe3e847 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Apesar da implantação de ferramentas e programas de controle para redução da incidência de Salmonella spp. nas granjas e abatedouros avícolas, a prevalência deste patógeno na cadeia produtiva avícola ainda é representativa. A adesão dos micro-organismos à superfície de equipamentos utilizados no processamento de alimentos resulta em graves problemas, pois atua como fonte de contaminação. Estes agregados de células com altas densidades populacionais presentes na superfície podem produzir moléculas sinalizadoras de quorum sensing responsáveis pela expressão de características fenotípicas específicas, dentre elas substâncias envolvidas na formação de biofilme. Uma vez instalado o biofilme, a resistência desses organismos aumenta, dificultando a ação dos sanitizantes, comprometendo a qualidade dos alimentos, além de aumentar os riscos à saúde pública. Um total de 65 cepas de Salmonella, sendo 39 isoladas de carcaças e cortes de frango e 26 isoladas de amostras de granjas, foi caracterizado quanto aos sorotipos e resistência a 24 antimicrobianos. O sorotipo Enteritidis foi o predominante representando 67,7% das cepas, seguido do sorotipo Newport com 7,7%. Um total de 10 padrões de resistência foi identificado,sendo que 96,9% das cepas apresentaram resistência a bacitracina, 87,7% a eritromicina, 83% ao ácido nalidíxico. Um total de cinco diferentes sorotipos isolados das aves vivas e também do produto final (Typhimurium, Enteritidis,Newport, Senftenberg e Infantis) foi avaliado quanto à formação de biofilmes à temperatura de 20°C após 2, 4, 8, 16, 24 e 48 horas nos meios de cultivo caldo de soja e tripticaseína (TSB) e água peptonada tamponada (APT) a 0,1%. Após 48 horas, as cepas avaliadas foram capazes de formar biofilmes sobre a superfície de cupons de aço inoxidável nos dois meios de cultivo, sendo Newport, o sorotipo que apresentou maior contagem de células aderidas em meio TSB. Em cultivo misto de Enterococcus faecalis ATCC 7080 e Salmonella Enteritidis, em meio TSB, verificou-se que ambos são capazes de formar biofilmes sobre a superfície de aço inoxidável de forma independente com predomínio do Enterococcus faecalis após 48 horas. Porém, em meio APT 0,1%, em cultivo misto, as células de Enterococcus faecalis aderiram à superfície somente após a adesão inicial das células de Salmonella Enteritidis. Os sanitizantes FARMASEPT PLUS® 0,1% e ácido peracético 300 ml.L-¹ foram os mais eficientes, seguido do hipoclorito de sódio a 5 mg.L-¹. O dióxido de cloro estabilizado a 100 mg.L-¹ se mostrou o menos eficiente com redução de apenas 1 log UFC/cm2 de células aderidas. Todas as 65 cepas de Salmonella também foram submetidas à pesquisa dos genes luxs e sdia relacionados ao sistema quorum sensing e à pesquisa de moléculas autoindutoras AI-2, utilizando o biossensor Vibrio harveyi BB170. Todas as cepas apresentaram os genes luxs e sdia e foram positivas para AI-2 nos testes de bioluminescência,com índices que variaram entre 1,13 a 1,30. Compreender a dinâmica de comunicação intercelular por meio de moléculas autoindutoras de quorum sensing e relacionar com a expressão de fatores de virulência pode esclarecer aspectos relevantes e possibilitar o desenvolvimento de estratégias para o controle de patógenos na indústria de alimentos / Abstract: In spite of the implementation of control programs for Salmonella rating reduction in poultry breeding farms and slaughterhouses, the prevalence of this pathogenic agent, which is considered the main cause of foodborne diseases, is still significant. Microorganism adhesion and biofilm formation on food processing equipment surfaces result in severe problems, since they act as the source of food contamination. These cell aggregates have a high population density on the surface and may produce quorum sensing signaling molecules. These molecules are responsible for the expression of specific phenotypic characteristics, such as the substances involved in biofilm formation. Once the biofilm is present, the resistance of the organisms increases, impairing the action of sanitizing agents and compromising food quality, which raises the risks to public health. 65 strains of Salmonella, 39 isolated from broiler carcasses and 26 isolated from poultry breeding farms, had their serotypes and resistance to 24 antimicrobial agents characterized. The predominant serotype was Enteritidis (67.7% of the strains), followed by the Newport serotype (7.7% of the strains). A total of 10 resistance patterns were identified. 96.9% of strains were resistant to bacitracin, 87.7% to erythromycin and 83% to nalidixic acid. 5 different serotypes, isolated from poultry breeding farms and from the final product (Typhimurium, Enteritidis, Newport,Senftenberg and Infantis), had the biofilm formation evaluated at 20° C after 2, 4, 8, 16, 24 and 48 hours, in Tryptic Soy Broth (TSB) and 0.1% buffered peptone water (BPW) media. After 48 hours, the strains were able to produce biofilms on the surface of stainless steel coupons in both cultivation media. The Newport serotype, in TSB, presented the highest count of attached cells. Enterococcus faecalis ATCC 7080 and Salmonella Enteritidis, in mixed cultivation in TSB, were both able to produce biofilms on the surface of stainless steel independently, with the predominance of Enterococcus faecalis after 48 hours. However, the cells of Enterococcus faecalis attached to the surface only after the initial adhesion of Salmonella Enteritidis cells, in mixed cultivation in BPW. FARMASEPT PLUS® 0.1% and peracetic acid 300 ml.L-1 were the most efficient sanitizers, followed by sodium hypochlorite 5 mg.L-¹. Stabilized chlorine dioxide 100 mg.L-1 was the least efficient sanitizer, presenting an adhered cell reduction of only 1 log cfu/cm2. All 65 Salmonella strains were also subjected to gene probing for luxs and sdia genes, which are related to the quorum sensing system. Biosensor Vibrio harveyi BB170 was also used for all these strains to detect autoinducer AI-2 signaling molecules. All strains presented luxs and sdia genes. The bioluminescence tests were positive for AI-2, with values that ranged from 1.13 to 1.30. Understanding the intercellular communication dynamic, which occurs through quorum sensing signaling molecules, and its relation to the expression of virulence factors may clarify relevant aspects and make the development of pathogen control strategies in the food industry possible / Doutorado / Tecnologia de Alimentos / Doutora em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Marcelo Brocchi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-20T14:46:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Milanez_GuilhermePaier_M.pdf: 1651986 bytes, checksum: 4681c88f937b4fe6f4d915fce0eb3f20 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: A Salmonelose e a malária são duas doenças infecciosas negligenciadas de grande prevalência no mundo, mas acometendo particularmente populações humanas que vivem em regiões e países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Apesar dos esforços ainda não existem formulações vacinais totalmente efetivas no controle destas enfermidades. Desta forma, nosso grupo tem buscado aprimorar a expressão do Domínio M2 do antígeno MAEBL de Plasmodium yoelii, que apresenta similaridade com a proteína de Plasmodium falciparum, em linhagens de Salmonella enterica Typhimurium, atenuadas para virulência. Em estudos prévios constatou-se que a expressão em níveis baixos não seria suficiente para a indução de uma resposta imune protetora. Com isso, ficou clara a necessidade de se aprimorar os níveis de expressão deste antígeno nas linhagens a serem testadas. Para tanto, o vetor de expressão anteriormente utilizado foi modificado, os codons da seqüência a ser expressa foram otimizados para expressão em salmonela e um sinal de secreção periplasmática foi adicionado no início da seqüência a ser expressa. Adicionalmente, modificamos novas linhagens atenuadas de S. enterica desenvolvidas por nosso grupo de tal forma a utiliza-las na expressão de antígenos heterólogos, empregando um sistema letal balanceado (Asd) de estabilização da expressão gênica. Apesar do sucesso na construção dos novos vetores, e da otimização de codons para a expressão, constatamos um possível efeito deletério do domínio M2 quando expresso em grande quantidade, o que impossibilitou a obtenção de algumas construções planejadas. Entretanto, os resultados obtidos na estabilização de plasmídios em novas linhagens vacinais significam um avanço no teste e uso de tais linhagens no desenvolvimento de vacinas multifatoriais / Abstract: Salmonellosis and malaria are two infectious diseases of high prevalence in the world, particularly affecting human populations living in underdeveloped regions and countries or developing countries. Despite several efforts, there is not a vaccinal formulation totally effective to control these diseases. This way, our group has sought to enhance the expression of M2 MAEBL's antigen Domain of Plasmodium yoelii, which is quite similar to same protein of P. falciparum, in attenuated strains of Salmonella enterica Typhimurium. In previous studies we found that the expression at low levels was not sufficient to induce a protective immune response. Thus, there was a clear need to improve M2 expression levels in the new strains to be tested. The expression vector previously used was modified, the m2 sequence was codon-optimized for expression in Salmonella, and a periplasmic secretion signal was added at the beginning of the sequence to be expressed. Additionally, new attenuated S. enterica strains developed by our group were modified in a way to use them in the expression of heterologous antigens, employing a balanced lethal system (ASD) for expression plasmid stabilization. Despite of the new vectors successfully built as well as codon optimization for m2 expression, we found a possible deleterious effect of the M2 domain when expressed in large quantities, making it impossible to obtain some planned constructs. However, the results obtained on stabilization of expression vectors in the new vaccine strains are an important advance for the use of such strains as multifactorial vaccines / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular