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T-cell receptor (TCR) polyclonal mature T cells are surprisingly resistant to oncogenic transformation after retroviral insertion of T-cell oncogenes. In a mouse model, it has been shown that mature T-cell lymphoma/leukemia (MTCLL) is not induced upon transplantation of mature, TCR polyclonal wild-type (WT) T cells, transduced with gammaretroviral vectors encoding potent T-cell oncogenes, into RAG1-deficient recipients. However, further studies demonstrated that quasi-monoclonal T cells treated with the same protocol readily induced MTCLL in the recipient mice. It has been hypothesized that in the TCR polyclonal situation, outgrowth of preleukemic cells and subsequent conversion to overt malignancy is suppressed through regulation of clonal abundances on a per-clone basis due to interactions between TCRs and self-peptide-MHC-complexes (spMHCs), while these mechanisms fail in the quasi-monoclonal situation. To quantitatively study this hypothesis, we applied a mathematical modeling approach. In particular, we developed a novel ordinary differential equation model of T-cell homeostasis, in which T-cell fate depends on spMHC-TCR-interaction-triggered stimulatory signals from antigen-presenting cells (APCs). Based on our mathematical modeling approach, we identified parameter configurations of our model, which consistently explain the observed phenomena. Our results suggest that the preleukemic cells are less competent than healthy competitor cells in acquiring survival stimuli from APCs, but that proliferation of these preleukemic cells is less dependent on survival stimuli from APCs. These predictions now call for experimental validation.

Nierenzellkarzinome (NZKs) gelten als stark immunogene Tumore. Dies ist insbesondere auf die Infiltration durch verschiedene Immunzellpopulationen, wie T-Lymphozyten und Natürliche Killer (NK)-Zellen, sowie das klinische Ansprechen auf immuntherapeutische Strategien zurückzuführen. Bisher existieren jedoch nur sehr wenige Studien zur Rolle von humanen nativen dendritischen Zellen (DCs) in NZK-Geweben und über die Tumor-vermittelte Modulation dieser DCs. DCs nehmen als professionelle Antigen-präsentierende Zellen eine zentrale Schlüsselrolle bei der Induktion und Aufrechterhaltung der angeborenen sowie adaptiven Immunantwort ein. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit erstmals der Effekt von klarzelligen NZKs auf den Phänotyp sowie die immunmodulatorischen Fähigkeiten von 6-sulfo LacNAc+ (slan)DCs evaluiert. SlanDCs, welche eine große Subpopulation humaner Blut-DCs darstellen, sind neben der Sekretion großer Mengen proinflammatorischer Zytokine dazu befähigt, Tumorzellen direkt zu lysieren. Des Weiteren sind slanDCs in der Lage, die antitumoralen Effekte von NK-Zellen zu fördern und CD4+ T-Helfer-Zellen sowie Tumor-reaktive CD8+ T-Lymphozyten effizient zu stimulieren. Angesichts dieser proinflammatorischen Eigenschaften können slanDCs wesentlich an einer Tumor-gerichteten Immunantwort beteiligt sein. Auf dieser Grundlage erfolgte im Rahmen der vorliegenden Arbeit der immunhistochemische Nachweis von slanDCs in klarzelligen NZK-Geweben. Im Vergleich zu Tumor-freiem Nierengewebe trat in den primären Tumorgeweben eine erhöhte Zahl infiltrierender slanDCs auf. Zudem wurde die Präsenz von slanDCs in Lymphknoten- sowie Fernmetastasen von NZK-Patienten beobachtet. Weiterführende Untersuchungen an frischen klarzelligen NZK-Geweben demonstrierten, dass NZK-infiltrierende slanDCs einen unreifen Phänotyp ausprägen und Interleukin-10 produzieren. Ausgehend von diesen Erkenntnissen erfolgten funktionelle Analysen, bei denen der Einfluss der kommerziell erhältlichen klarzelligen NZK-Linien ACHN und Caki-1 sowie der primären klarzelligen NZK-Linien MZ1257RC und MZ2877RC auf bedeutende immunmodulatorische Fähigkeiten von slanDCs untersucht wurde. In diesem Zusammenhang zeigte sich, dass NZK-Zellen effektiv in der Lage sind, sowohl die slanDC-vermittelte Proliferation von CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten, als auch die slanDC-induzierte Differenzierung naïver CD4+ T-Lymphozyten in proinflammatorische T-Helfer 1-Zellen zu inhibieren. Darüber hinaus wurde demonstriert, dass NZK-Zellen das Potenzial von slanDCs zur Aktivierung von NK-Zellen hemmen. Untersuchungen der zugrunde liegenden Mechanismen zeigten, dass die funktionelle Inhibition von slanDCs durch klarzellige NZK-Zellen über membranständige Moleküle vermittelt wird. Die im Rahmen dieser Dissertation gewonnenen Erkenntnisse weisen darauf hin, dass NZKs die Ausreifung sowie wesentliche funktionelle Eigenschaften von DCs inhibieren. Dies deutet auf einen neuen Immunescape-Mechanismus klarzelliger NZKs hin, welcher auf einer Tumorzell-vermittelten Generierung von tolerogenen slanDCs basiert und eine unzureichende Aktivierung der angeborenen sowie adaptiven Tumor-gerichteten Immunantwort zur Folge hat. Diese neuen Erkenntnisse können einen Beitrag zu einem besseren Verständnis der Interaktion von NZKs mit nativen humanen DCs leisten und die Konzeption neuer therapeutischer Strategien ermöglichen, welche auf einer Verstärkung der antitumoralen Eigenschaften von DCs beruhen.

Einleitung: Zu den konventionellen αβ T-Zellen zählen die klassischen CD4+ einfach-positiven T-Helfer (Th) bzw. regulatorischen T-Zellen (Treg) sowie CD8αβ+ einfach-positive zytotoxische T-Zellen. Säugetiere besitzen jedoch noch weitere T-Zell-Subpopulationen, die entweder den T-Zell-Rezeptor αβ (TCRαβ) oder γδ (TCRγδ) exprimieren. Bei Hunden wurde bisher nur die hoch aktivierte CD4+CD8α+ doppelt-positive (dp) T-Zellpopulation des peripheren Blutes detailliert charakterisiert. Über ihre Verteilung in lymphatischem und nicht lymphatischem Gewebe ist jedoch wenig bekannt. Darüber hinaus besitzen Hunde αβ T-Zellen, die weder CD4 noch CD8α (CD4-CD8α- doppelt-negative (dn) T-Zellen) exprimieren, sowie γδ T-Zellen, deren Phänotyp bisher noch nicht untersucht wurde. Ziele der Studie: Ziel dieser Studie war es, einen Überblick über das Vorkommen und den Phänotyp von nichtkonventionellen T-Zellen im peripheren Blut und Geweben des Hundes zu bieten. Zu diesem Zweck wurden CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen hinsichtlich der Expression von Oberflächenmarkern, wichtigen Transkriptionsfaktoren und Zytokinen charakterisiert. Tiere, Material und Methoden: Canine T-Zellen Zellen aus dem Blut (Stichprobenumfang: n = 10) sowie aus den Peyerschen Platten (PP; n = 10), dem Dünndarmepithel (IEL; n = 6), den mesenterialen Lymphknoten (mLN; n = 10), tracheobronchialen Lymphknoten (tLN; n = 9), der Lunge (n = 10), Milz (n = 10) und dem Thymus (n = 10) wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Studiendesign erforderte, dass die Gewebeproben von einer anderen Gruppe gesunder Beagle-Hunde (n = 12) entnommen wurden als das periphere Blut. CD4+CD8α+ dp T-Zellen wurden auf ihre Gewebeverteilung, die Expression des T-Zell-Rezeptortyps und die Zusammensetzung des CD8-Dimers (d.h. CD8αα Homodimer vs. CD8αβ Heterodimer) sowie die Expression des Aktivierungsmarkers CD25 untersucht. Um Hinweise auf die potenzielle(n) Funktion(en) von CD4+CD8α+ dp T-Zellen in Geweben zu erhalten, wurde die Expression des Transkriptionsfaktors Forkhead Box P3 (FoxP3) und des zytotoxischen Moleküls Granzym B analysiert. Darüber hinaus wurden Gewebe und Blut auf die Verteilung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen untersucht. Eine umfassende Charakterisierung von TCRαβ+CD4-CD8α- dn und γδ T-Zellen des peripheren Blutes erfolgte durch die Untersuchung der folgenden Marker: CD25 und CD5, FoxP3, GATA-3, T-Box-Transkriptionsfaktor TBX21 (T-bet) und Granzym B. Im Rahmen funktioneller Analysen wurde die Zytokinproduktion (Interferon-γ (IFN-γ) und Interleukin-17A, IL-17A) nach Stimulation der Zellen mit Phorbol-Myristat-Acetat (PMA)/Ionomycin durchgeführt. Normalverteilte Datensätze wurden mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit Bonferroni-Post-Hoc-Test (Vergleich mehrerer Gruppen) oder ungepaartem t-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) analysiert. Bei nichtparametrischen Daten wurde entweder der Kruskal-Wallis H-Test mit Dunn's Post-Test (Ver-gleich mehrerer Gruppen) oder der Mann-Whitney U-Test (zweiseitig; Vergleich zweier Gruppen) angewandt. Ergebnisse: Canine CD4+CD8α+ dp T-Zellen der Gewebe sind hauptsächlich TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ und akkumulieren in den PP (durchschnittlich 1.6 %). Obwohl CD4+CD8α+ dp T-Zellen der LN CD4 und CD8α nicht gleich stark exprimieren und zahlenmäßig gering (durchschnittlich 0,2 %) sind, sind sie teilweise FoxP3+. Dies weist auf ein regulatorisches Potential dieser Untergruppe hin. Einige CD4+CD8α+ dp T-Zellen der IEL exprimieren TCRγδ und/oder Granzym B, was die Einzigartigkeit der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten unterstreicht. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T-Zellen machen einen wesentlichen Anteil aller αβ T-Zellen in Blut (Median 14,4 %) und Gewebe (Median 15 % (Lunge) - 7,5% (PP)) aus und besitzen ein bemerkenswert hohes Expressionsniveau an CD25. CD25 wird entweder mit FoxP3 (hinweisend auf einen regulatorischen Phänotyp) oder ohne FoxP3 (hinweisend auf einen Effektorphänotyp) exprimiert. Zusätzlich weisen IFN-γ, GATA-3 oder IL-17A-exprimierende Subpopulationen Eigenschaften von konventio-nellen Typ 1 T-Helferzellen (Th1), Th2 bzw. Th17 auf. Interessanterweise wurden auch FoxP3+GATA-3+-Hybridzellen gefunden. Canine γδ T-Zellen hingegen sind entweder CD8α+ einfach-positiv oder CD4 CD8α- dn. Während TCRγδ+CD8α+ einfach-positive T-Zellen ihren zytotoxischen TCRαβ+CD8αβ+ T-Zell-Pendants ähneln (T-bet+, IFN-γ+, Granzym B+), exprimieren TCRγδ+CD4 CD8α- dn T-Zellen GATA-3 und nur geringe Mengen an T-bet und Granzym B. Schlussfolgerungen: Dies ist die erste Studie, die einen umfassenden Überblick über nichtkonventionelle T-Zell-Populationen des Hundes bietet. Hinsichtlich ihrer Gewebeverteilung, ihrer Anzahl und ihres funktionellen Potentials ist es wahrscheinlich, dass diese Zellen an wichtigen Immunreaktionen sowie an der Pathogenese von Erkrankungen des Hundes beteiligt sind. Hierzu werden weitere Studien erforderlich sein. Es ist anzumerken, dass das klassische Schema der CD4+ und CD8αβ+ einfach-positiven T-Zellen als canine Haupteffektor- bzw. regulatorische T-Zellen neu überdacht werden sollte. :1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65 / Introduction: Conventional αβ T cells comprise the classical CD4+ single-positive (sp) T helper (Th) resp. T regulatory (Treg) and CD8αβ+ sp cytotoxic T cell subsets. However, further T cell subpopulations either expressing T cell receptor αβ (TCRαβ) or γδ (TCRγδ) occur in mammals. In dogs, only the highly activated CD4+CD8α+ double-positive (dp) T cell population of peripheral blood has been characterized in detail. Yet, little is known about its distribution in lymphoid and non-lymphoid tissues. Furthermore, dogs possess αβ T cells neither expressing CD4 nor CD8α (CD4-CD8α- double-negative (dn) T cells) and γδ T cells, whose phenotype was still undefined. Aims of study: The objective of this study was to provide an overview on the occurrence and phenotype of non-conventional T cells in canine peripheral blood and tissues. To this end, CD4+CD8α+ dp, TCRαβ+CD4-CD8α- dn, and γδ T cells were characterized regarding expression of surface markers, key transcription factors, and cytokines. Animals, material and methods: Canine T lymphocytes from peripheral blood (sample size: n = 10), Peyer’s patches (PP; n = 10), epithelium of the small intestine (IEL; n = 6), mesenteric lymph nodes (mLN; n = 10), tracheobronchial lymph nodes (tLN; n = 9), lung (n = 10), spleen (n = 10), and thymus (n = 10) were analyzed by flow cytometry. Due to the study design tissue samples had to be taken from a different group of healthy Beagle dogs (n = 12) than peripheral blood. CD4+CD8α+ dp T cells were studied for their tissue distribution, expression of T cell receptor type and composition of the CD8 dimer (i.e. CD8αα homodimer vs. CD8αβ heterodimer), as well as expression of the activation marker CD25. To define the potential function(s) of CD4+CD8α+ dp T cells in tissues, expression of the transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) and the cytotoxic molecule granzyme B were analyzed. Furthermore, tissues and blood were studied for distribution of TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells. A comprehensive characterization of blood TCRαβ+CD4-CD8α- dn and γδ T cells was made by investigation of the following markers: CD25 and CD5, FoxP3, GATA-3, T-box transcription factor TBX21 (T-bet), and granzyme B. Functional analyses were performed by examination of cytokine production (interferon γ (IFN-γ) and interleukin 17A, IL-17A) following stimulation of cells with phorbol-myristate-acetate (PMA)/ionomycin. Normally distributed data sets were analyzed using One-way analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc test (multiple groups) or unpaired Student’s t-test (two-tailed; two groups). For nonparametric data, either Kruskal-Wallis H test with Dunn’s post-test (multiple groups) or Mann-Whitney U test (two-tailed; two groups) was applied. Results: Canine CD4+CD8α+ dp T cells of tissues can be mainly described as TCRαβ+CD4+CD8αα+CD25+ accumulating in PP (1.6% on average). Although not homogeneous in expression levels of CD4 and CD8α and low in number (0.2% on average), CD4+CD8α+ dp T cells of LN are partly FoxP3+. This indicates regulatory potential of this subset. Some CD4+CD8α+ dp T cells of IEL express TCRγδ and/or granzyme B, underlining the uniqueness of intestinal intraepithelial lymphocytes. TCRαβ+CD4-CD8α- dn T cells make up a substantial portion of all αβ T cells in blood (median 14.4%) and tissues (median 15% (lung) – 7.5% (PP)) with a remarkably high expression level of CD25. CD25 is either co-expressed with FoxP3 (reminiscent of a regulatory phenotype), or without FoxP3 (reminiscent of an effector phenotype). In addition, subsets expressing IFN-γ, GATA-3, or IL-17A suggest properties of conventional type 1 T helper cells (Th1), Th2, and Th17, respectively. Interestingly, FoxP3+GATA-3+ hybrid cells were found, too. Canine γδ T cells, on the other hand, are either CD8α+ sp or CD4-CD8α- dn. While TCRγδ+CD8α+ sp T cells resemble their TCRαβ+CD8αβ+ cytotoxic T cell counterparts (T-bet+, IFN-γ+, granzyme B+), TCRγδ+CD4-CD8α- dn T cells express GATA-3, and only low levels of T-bet and granzyme B. Conclusions: This is the first study providing a comprehensive overview on canine non-conventional T cell subsets. Regarding tissue distribution, abundance and functions resp. functional potential of these T cells, it is conceivable that they play a major role in health and diseases of dogs. Further studies examining this topic will be needed. Of note, the classical scheme of CD4+ sp Th/Treg and CD8αβ+ cytotoxic T cells as main effector/regulatory T cells in dogs should be reconsidered.:1 Introduction 1 1.1 The innate and adaptive immune system of mammals 1 1.2 Conventional αβ T cells 1 1.2.1 Cytotoxic CD8αβ+ T cells 2 1.2.2 CD4+ T cells 3 1.2.2.1 CD4+ T helper cells 3 1.2.2.2 CD4+ regulatory T cells 4 1.3 Non-conventional T cells 5 1.3.1 CD4+CD8α+ double-positive T cells 5 1.3.2 γδ T cells 7 1.3.3 CD4-CD8α- double-negative αβ T cells 8 1.4 Aims of this study 8 2 Results 10 2.1 1st publication 10 2.2 2nd publication 32 3 Discussion 55 3.1 Canine non-conventional CD4+CD8α+ double-positive T cells are a homogeneous population enriched at mucosal sites 55 3.2 Canine non-conventional CD4-CD8α- double-negative T cells are unique in abundance and phenotype 57 3.3 Concluding remarks 60 4 Summary 61 5 Zusammenfassung 63 6 Literature Cited 65

Das human pathogene Varicella-Zoster Virus (VZV) gehört zur Familie der Herpesviren und ist weltweit verbreitet. Die Primärinfektion verursacht Varicellen, welche durch einen bläschenartigen Hautausschlag charakterisiert ist. Im Anschluss daran etabliert VZV eine lebenslange Latenz und verursacht nach Reaktivierung Herpes Zoster. Seit 2004 ist der Lebendimpfstoff aus attenuierten Virionen des VZV-Stammes V-Oka in Deutschland empfohlen. Im Gegensatz zur Infektion mit zirkulierenden virulenten VZV Stämmen tritt nach Verimpfung des Vakzin-Stammes V-Oka kein Exanthem auf. Die Haut ist der Hauptreplikationsort von VZV und immunologische Unterschiede zwischen virulentem VZV und dem Vakzin-Stamm treten hier am deutlichsten auf. In der vorliegenden Arbeit konnte eine neue Immunevasionsstrategie virulenter VZV Stämme aufgedeckt werden, welche erklären könnte, wie virulente VZV Stämme frühe antivirale Immunantworten umgehen. In Hautläsionen von Herpes Zoster Patienten konnte eine massive Infiltration von myeloiden inflammatorischen Dendritischen Zellen beobachtet werden. In vitro Studien mit Monozyten abgeleiteten Dendritischen Zellen (DC), welche inflammatorische DC repräsentieren, zeigten, eine signifikant erhöhte Expression von CD1c Molekülen nach Infektion mit dem Vakzin-Stamm, sowie virulentem VZV. Funktionelle Untersuchungen mit intraepithelialen CD1c-restringierten gamma delta T Zellen zeigten, dass DC nach Infektion mit dem Vakzin-Stamm phänotypisch und funktionell reiften und somit die T Zellen zur IFN-gamma Sekretion stimulierten. Im Gegensatz dazu wurde die funktionelle Reifung von DC, die mit virulentem VZV infiziert waren, geblockt. Folglich wurde kein bioaktives IL-12 sezerniert, welches als entscheidendes Cytokin zum Aufbau einer antiviralen T-Helfer 1 Immunantwort beiträgt. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass virulentes VZV die Signalkaskade des Toll-like Rezeptors 2 (TLR2) in DC inhibiert und somit die IL-12 Produktion verhindert. / Varicella-zoster virus (VZV) which belongs to the family of herpesviruses is restricted to humans and distributed worldwide. Primary infection of VZV causes chickenpox characterized by a disseminated rash. Thereafter, VZV establishes a lifelong latency and can be reactivated to cause herpes zoster. Since 2004 the attenuated strain V-Oka of VZV was licensed for Germany to immunize children against VZV infection. In contrast to infection by circulating virulent VZV strains, vaccination with V-Oka remains asymptomatic. The skin is the major replication site of VZV and immunological differences between virulent VZV and the vaccine should become most apparent within this immune organ. In summary, this study discovered a new immune evasion strategy of virulent VZV strains which might explain how virulent VZV strains overcome innate antiviral responses. A strong infiltration of myeloid-derived inflammatory DCs has been detected in skin lesions of herpes zoster patients. In vitro studies with monocyte-derived dendritic cells (DCs), reflecting inflammatory DCs, showed that they were efficiently infected by both, the vaccine and a virulent VZV strain. Intriguingly, a significant upregulation of CD1c molecules on VZV-infected DCs was observed. Functional investigations using intraepithelial CD1c-restricted gamma delta T cells revealed that DCs infected with the vaccine virus were fully instructed to mature, thereby promoting IFN-gamma secretion of gamma-delta T cells. In striking contrast, DCs infected with virulent VZV strains were efficiently blocked to mature functionally. In detail, they did not secrete bioactive IL-12 which is an instrumental cytokine for generation of antiviral T helper 1 responses. Moreover, virulent VZV blocked Toll-like receptor 2 (TLR2) signaling in DCs thereby preventing production of bioactive IL-12 which in turn inhibited IFN-gamma secretion by gamma-delta T cells.

In this work, the influence of the second messenger cAMP on the functional plasticity of M-DC8+ dendritic cells (DC) was examined. The marker M-DC8 defines a population of native DC first described in blood. After their isolation, M-DC8+ DC acquire a mature CD83+ phenotype during a short culture ex vivo. After a challenge with LPS and IFN-g, M-DC8+ DC secrete large amounts of the proinflammatory cytokines IL-12(p70) and TNF-a surpassing by far other DC populations and monocytes. Due to their preferential induction of TH1-dominated T cell responses, M-DC8+ DC might play a role in the pathogenesis of inflammatory diseases. Different cAMP-elevating agents suppressed the proinflammatory cytokine production and enhanced the secretion of anti-inflammatory IL-10. Activity of phosphodiesterase (PDE) 4, the most important cAMP-hydrolysing enzyme in immune cells, was detected and RT-PCR revealed the expression of PDE4 subtypes 4A, 4B and 4D in M-DC8+ DC, whereas 4C was not detectable. The PDE4-specific inhibitors AWD12-281 and Roflumilast were then used to elevate cAMP concentrations. These substances have been proven to be efficient in anti-inflammatory therapies. In the presence of PDE4 inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12 and TNF-a was decreased by 90 % and 60 %, respectively, whereas the IL-10-release was doubled. These effects were only observed, if the PDE4 inhibitors where present from the beginning of the culture. The inhibition of the IL-12 secretion was reverted using an a-IL-10-receptor antibody. PDE4 inhibitor-treated M-DC8+ DC showed a reduced capacity to polarize TH1-cells, which was demonstrated analysing culture supernatants by ELISA and by single-cell analysis detecting intracellular IFN-g und IL-4. These results suggest that PDE4 inhibitors may not only be useful in the therapy of TH2-mediated diseases but also in TH1-dominated indications such as multiple sclerosis and Crohn´s disease. Despite the shift of the cytokine profile, the in vitro maturation of M-DC8+ DC was not affected by PDE4 inhibitors. The expression of CD83, CD80, CD86, MHC-molecules as well as CD54 and CD58, was assessed by FACS analysis. Correspondingly, in the presence of AWD12-281, M-DC8+ DC efficiently stimulated the proliferation of allogeneic CD4+CD45RA+ T-cells. In the second part of this study, the effects of an inhibition of cAMP-synthesis in M-DC8+ DC were analyzed. Two adenylyl cyclase (AC) inhibitors, 2,5-Dideoxyadenosine and SQ22536, clearly hampered the in vitro maturation of M-DC8+ DC. The expression of the DC maturation marker CD83 could be reconstituted using the stable cAMP-analogon 8-Br-cAMP. Measuring the intracellular cAMP concentration in M-DC8+ DC, initially low cAMP-levels were observed, but within 30 min the concentration raised and returned to original levels within 2 hrs. Blocking the cAMP synthesis by AC inhibitors, the LPS/IFN-g-induced production of IL-12, TNF-a and IL-10 was strongly reduced. Furthermore, it was demonstrated that M-DC8+ DC can only release IL-12 after a transient elevation of cAMP, i.e. they acquire a "license". Such a regulation of the IL-12 production has not been described before. Protein kinase A is an important effector molecule of cAMP. Inhibiting its activity resulted in a reduced expression of the DC maturation marker CD83 and a lower cytokine production underlining the importance of cAMP-signalling for the activation of M-DC8+ DC. In conclusion, this study provides evidence for a new concept of the immune-regulatory function of cAMP. Here, cAMP is essentially involved in the initial activation and maturation of DC and enables them to secrete large amounts of IL-12 and TNF-a upon stimulation with a TLR ligand. Conversely, a long-term elevation of cAMP-concentrations inhibits the proinflammatory effector functions of M-DC8+ DC and can induce anti-inflammatory responses by enhancing the secretion of IL-10. / In dieser Arbeit wurde der Einfluss des second messengers cAMP auf die funktionelle Plastizität von M-DC8+ dendritischen Zellen (DC) untersucht. Der Oberflächenmarker M-DC8 definiert eine zunächst im Blut beschriebene Population nativer DC. Nach ihrer Isolation erlangen M-DC8+ DC während einer kurzen Kultur einen maturen CD83+ Phänotyp. Nach Stimulation mit LPS und IFN-g produzieren native M-DC8+ DC deutlich höhere Mengen der proinflammatorischen Zytokine IL-12(p70) und TNF-a als andere DC-Populationen oder Monozyten. Dies resultiert in einer Programmierung TH1-dominierter T-Zellantworten. M-DC8+ DC könnten daher an der Pathogenese entzündlicher Krankheiten beteiligt sein. Unterschiedliche cAMP-erhöhende Substanzen supprimierten die proinflammatorische Zytokinproduktion und verstärkten gleichzeitig die Sekretion des anti-inflammatorischen IL-10. In M-DC8+ DC konnte die Aktivität von Phosphodiesterase (PDE) 4, dem wichtigsten cAMP-hydrolysierenden Enzym in Immunzellen, nachgewiesen werden. Durch RT-PCR wurde die Expression der PDE4-Subtypen 4A, 4B und 4D gezeigt, nicht aber 4C. Zur Erhöhung der cAMP-Konzentration wurden dann die PDE4-spezifischen Inhibitoren AWD12-281 und Roflumilast eingesetzt, deren klinische Effizienz bei anti-inflammatorischen Therapien belegt ist. Auch diese Substanzen verringerten die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12 und TNF-a durch M-DC8+ DC um 90 % bzw. 60 %, während die IL-10-Freisetzung etwa verdoppelt wurde. Diese starken Effekte konnten nur erzielt werden, wenn die PDE4-Inhibitoren von Beginn der Kultur an eingesetzt wurden. Die Hemmung der IL-12-Sekretion wurde in Gegenwart eines a-IL-10-Rezeptor-Antikörpers aufgehoben. Unter dem Einfluss von PDE4-Inhibitoren war die TH1-Programmierung durch M-DC8+ DC deutlich reduziert, was sowohl durch die Analyse der Zellüberstände mittels ELISA als auch auf Einzelzell-Ebene durch intrazelluläre Detektion von IFN-g und IL-4 nachgewiesen wurde. Diese Ergebnisse legen nahe, dass PDE4-Inhibitoren nicht nur für TH2-vermittelte Erkrankungen sondern auch für TH1-dominierte Indikationen wie Multiple Sklerose oder Morbus Crohn von Nutzen sein könnten. Trotz der starken Modulation des Zytokinprofils blieb die in vitro-Ausreifung M-DC8+ DC unbeeinflusst von PDE4-Inhibitoren. Untersucht wurde die Expression von CD83, CD80, CD86, MHC-Molekülen, CD54 und CD58 mittels FACS-Analyse. Entsprechend induzierten M-DC8+ DC auch in Anwesenheit von AWD12-281 die Proliferation allogener CD4+CD45RA+ T-Zellen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde untersucht, wie sich die Blockade der cAMP-Synthese auf M-DC8+ DC auswirkt. Zwei Adenylatcyclase-Inhibitoren, 2,5-Dideoxyadenosine und SQ22536, hemmten die in vitro-Maturation von M-DC8+ DC deutlich. Die CD83-Expression wurde mit 8-Br-cAMP rekonstituiert. Messungen der intrazellulären cAMP-Konzentration in unbehandelten M-DC8+ DC zeigten initial niedrige cAMP-Spiegel, die innerhalb von 30 min anstiegen und nach 2 h wieder auf das Ausgangsniveau abfielen. Die LPS/IFN-g-induzierte Produktion von IL-12, TNF-a und IL-10 wurde durch AC-Inhibitoren deutlich vermindert. M-DC8+ DC erhalten nur nach einer transienten cAMP-Erhöhung die "Lizenz" IL-12 freizusetzen. Eine derartige Regulation der IL-12-Sekretion ist bisher nicht beschrieben. Eine Hemmung des cAMP-Effektormoleküls Proteinkinase A resultierte in der reduzierten Expression des DC-Maturationsmarkers CD83 und einer verringerten Zytokinproduktion. Dies unterstreicht die Bedeutung von cAMP für die Aktivierung M-DC8+ DC. Zusammenfassend gibt diese Arbeit am Beispiel nativer humaner DC Anhalt für ein neues Konzept der immunregulatorischen Funktion von cAMP. Hierbei ist cAMP wesentlich an der Ausreifung von M-DC8+ DC beteiligt, woraufhin diese große Mengen IL-12 und TNF-a sekretieren können. Dagegen wirkt eine langfristige cAMP-Erhöhung durch die Induktion von IL-10 anti-inflammatorisch.

Multiple Sklerose (MS) ist eine heterogene Krankheit des Zentralnervensystems, deren pathologische Mechanismen noch nicht vollständig aufgeklärt sind. Die gegenwärtige Hypothese ist, daß pro-inflammatorische T-Zellen entscheidend an der Pathogenese der MS beteiligt sind. Man geht davon aus, daß eine Fehlregulation der T-Zell-Kontrolle, möglicherweise bedingt durch ein Ungleichgewicht an Apoptose-regulierenden Molekülen, dabei eine Rolle spielt. Tatsächlich zielen therapeutische Strategien darauf ab, T-Zell-Aktivierung, Proliferation und Produktion von Zytokinen zu verringern, oder T-Zell-Eliminierung zu fördern. Diese Arbeit sollte zum einen die Bedeutung regulatorischer Faktoren klären, die für das überleben der T-Zellen von MS-Patienten verantwortlich sind. Zum anderen sollten die antiproliferative oder Apoptose-fördende Wirkung potentiell therapeutisch wirksamer Moleküle untersucht werden. Eine eingeschränkte Regulation der autoreaktiven T-Zellen durch Apoptose in der Peripherie und im ZNS trägt möglicherweise zur Pathophysiologie der MS bei. Als Schlüsselfaktoren der Regulation von Apoptose wurden Mitglieder der Bcl-2-Familie in MS-Patienten und Probanden untersucht. Diese Faktoren wurden in Relation zu der Suszeptibilität der T-Zellen gegenüber aktivierungsinduziertem Zelltod (sog. Activation-induced cell death oder AICD) überprüft. Um die in-vivo-Elimination der Antigen-reaktiven T-Zellen nachzuahmen, wurde ein in-vitro-Modell des AICD mit repetitiver T-Zell-Stimulation verwendet. Tatsächlich zeigten polyklonale T-Zellen von MS-Patienten eine verringerte Suszeptibilität für AICD, nachgewiesen sowohl durch verminderte Caspaseaktivtät (p=0.013) als auch durch DNA-Fragmentierung (p=0.0071). Weiter wurden höhere Spiegel des Proteins Bcl-XL in den Immunzellen von MS-Patienten mit Immunoblotting gemessen (p=0.014). Eine inverse Korrelation zwischen der Expression an Bcl-XL und der Empfindlichkeit der T-Zellen gegenüber AICD steht in Übereinstimmung mit vorhergehenden Daten bezüglich der Bedeutung dieses Proteins für die Apoptose-Resistenz von T-Zellen. Es wurde bereits gezeigt, daß dieses Molekül die Ausprägung der experimentell-autoimmun Enzephalomyelitis, des Tiermodells der MS, verstärkt. Zusammen mit den erhöhten Bcl-XL-Werten bei MS-Patienten, ergeben sich nun Perspektiven für einen therapeutischen Ansatz. Abgesehen von dem Konzept die apoptotische Eliminierung von T-Zellen zu unterstützen, streben gegenwärtige therapeutische Strategien an, die Aktivierung und weitere Proliferation der schädlichen T-Zellen zu hemmen. Basierend auf klinischer Erfahrung mit eher unselektiven Therapien, ist es ein therapeutisches Ziel, neue immunomodulatorische Substanzen mit besserer Selektivität zu finden, um das Nutzen/Risiko-Verhältnis zu maximieren. Aus diesem Grund wurden zwei unterschiedliche Substanzen untersucht die beide den Zellzyklus beeinflussen. Als erster Kandidat wurde der kürzlich entdeckte Todesligand TRAIL (engl.: TNF-related apoptosis inducing ligand) aus der TNF/NGF-Familie untersucht, da diesem bereits T-Zell-regulatorische Funktionen zugeschrieben worden waren, humane Antigen-spezifische T-Zellen jedoch resistent gegenüber TRAIL-induzierter Apoptose sind. Der zweite Kandidat mit potenziell therapeutischer Wirkung bei MS ist Atorvastatin, ein HMG-CoA-Reduktase-Hemmer, der bereits als Lipidsenker bei Patienten eingesetzt wird. Um die Hypothese zu überprüfen, daß diese Substanzen T-Zell-Rezeptor-Signale beeinflussen können, wurden humane Antigen-spezifische T-Zell-Linien von MS-Patienten und gesunden Probanden eingesetzt. Diese wurden hinsichtlich T-Helfer-Phänotyp und Peptid-Spezifität charakterisiert. Eine Behandlung mit TRAIL führte zur Hemmung der Proliferation in unterschiedlichem Ausmaß (6.2% - 63.8%). Atorvastatin hemmte in Abhängigkeit von der Dosis ebenso die Proliferation Antigen-spezifischer T-Zellen. Beide Substanzen wirkten antiproliferativ unabhängig von der Antigenpräsentation, aufgrund ihrer Fähigkeit, die Proliferation in Abwesenheit von professionellen Antigen-präsentierenden Zellen zu vermindern. Diese Eigenschaft weißt auf einen direkten Einfluß auf die T-Zell-Funktion hin. Die TRAIL-induzierte Hypoproliferation war assoziiert mit einer Herunterregulation der Zyklin-abhängigen Kinase CDK4 (engl.: cyclin dependent kinase 4), einem Schlüsselenzym für die nach T-Zell-Rezeptor-Stimulation einsetzende Transition von der G1- zur S-Phase des Zellzyklus. Inkubation mit Atorvastatin induzierte ebenso eine Verminderung von CDK4, begleitet von einer Erhöhung von p27Kip1. Die Atorvastatin-vermittelte Proliferations- und Zellzyklus-Blockade konnte durch Mevalonat rückgängig gemacht werden. Mevalonat ist ein Zwischenprodukt des HMG-CoA-Reduktaseweges. Atorvastatin scheint demnach einen direkten Einfluß auf diese Enzymkaskade zu haben, der wichtig für die Isoprenylierung von GTPase-Proteinen der Rho-Familie ist. T-Zell-Rezeptor-Stimulation führt zur Freisetzung von Kalzium aus intrazellulären Speichern und nachfolgend zur Öffnung transmembranöser Kalzium-Kanäle (sog. calcium release-activated calcium oder CRAC-Kanäle), die eine für die T-Zellaktivierung notwendige und anhaltende Erhöhung der intrazellulären Kalzium-Konzentration hervorruft. Nach Behandlung mit TRAIL wurde eine konzentrationsabhängige Inhibition des Einstroms extrazellulärer Kalzium-Ionen durch die CRAC-Kanäle beobachtet. Dies wurde mit löslichem TRAIL-Rezeptor-Fusionsprotein, einem TRAIL-Antagonisten, rückgängig gemacht. Die Blockade von Kalzium-abhängigen Aktivierungssignalen stellt damit möglicherweise einen primären immunregulatorischen Mechanismus für diese Todesliganden dar. Jedoch wurde keine Auswirkung von Atorvastatin auf die T-Zellaktivierung beobachtet, da der Einstrom von extrazellulärem Kalzium nicht beeinflußt wurde. Während Studien zum TRAIL-vermittelten Einfluß auf die T-Zell-Aktivierung und dem Zellzyklus erst in der präklinischen Phase sind, werden Statine, die ebenfalls den Zellzyklus beeinflussen, bereits in der Therapie anderer Erkrankungen angewand. Darüber hinaus werden derzeit bereits klinische Studien mit Statinen zur MS-Therapie durchgeführt. Weitere Untersuchungen zu den detaillierten Mechanismen antiproliferativer Substanzen mit potenziellem therapeutischen Effekt in der MS ermöglichen die Entwicklung von selektiveren immunomodulatorischen Therapien mit höherem therapeutischen Nutzen für MS-Patienten. / Multiple sclerosis (MS) is a heterogeneous disease of the central nervous system whose pathological mechanisms are far from completely understood. The current hypothesis is that pro-inflammatory T cells are orchestrating the pathogenesis of this condition. It is considered that a dysregulation in T cell control to be involved, with an imbalance in apoptosis-regulating molecules possibly playing a role. In fact, therapeutic strategies aim to reduce T cell activation, proliferation and cytokine production or to promote T cell elimination. The focus of this thesis was to identify the role of regulatory molecules for T cell survival in the immune pathogenesis of MS, and to investigate antiproliferative or apoptosis-promoting effects on T cells by potential therapeutic molecules. A limitation in the apoptotic regulation of autoreactive T cells in the periphery and in the CNS may contribute to the pathophysiology of MS. As key regulators of apoptosis, members of the Bcl-2 family were investigated in both MS patients and controls. These factors were examined in relation to the susceptibility of T cells, from both groups, towards activation-induced cell death (AICD). To mimic the in vivo elimination of antigen-reactive T cells, an in vitro model of AICD involving repetitive T cell receptor mediated stimulation was utilized. In fact, polyclonal T cells from MS patients showed a decreased susceptibility to undergo AICD as shown by both caspase activity (p=0.013) and DNA fragmentation (p=0.0071) assays. Furthermore, Bcl-XL protein levels, as measured by immunoblotting, were increased in the peripheral immune cells of MS patients (p=0.014). An inverse correlation observed between Bcl-XL levels and susceptibility of T cells to undergo AICD is in line with previous data on the significance of this anti-apoptotic protein in T cell resistance. Since this molecule has already been shown to aggravate the outcome of experimental autoimmune encephalitis, the animal model for MS, the observation of elevated Bcl-XL levels in patients offers perspectives towards therapeutic manipulation in MS. Apart from promoting apoptotic elimination, current therapeutic strategies aim at inhibiting activation and further proliferation of potentially harmful T cells. Based on clinical experience with rather non-selective therapies that promote T cell elimination, a therapeutic goal is to identify newer immunomodulatory substances with better selectivity in order to maximize the therapy's benefit to risk ratio. Thus, two different substances, both interfering with cell cycle regulation, were investigated. The first candidate was the recently discovered member of the TNF/NGF family of death ligands, TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) since it has been reported to have immunoregulatory functions and since human antigen-specific T cells were shown to be resistant towards apoptosis induction by this ligand. The second candidate drug with potential in MS therapy is atorvastatin, a 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme (HMG-CoA) reductase inhibitor and lipid-lowering drug, already indicated for anomalies in lipid metabolism. In order to prove the hypothesis that these substances interfere with T cell receptor signaling, human antigen-specific T cell lines from both MS patients and controls, characterized with regards to T helper differentiation and peptide specificity, were employed. Exogenous treatment of TRAIL resulted in an inhibition in proliferation, albeit to varying degrees (6.2% - 63.8% inhibition). Atorvastatin also inhibited proliferation of antigen-specific T cell lines in a dose-dependent manner. Both compounds induced hypoproliferation independently of antigen presentation, as shown by their ability to block T cell proliferation in response to direct T cell receptor engagement, thus indicating a direct influence on T cell function. The growth inhibition by TRAIL was associated with a downregulation of the cell cycle regulator CDK4, indicative of an inhibition of cell cycle progression at the G1/S transition. Incubating T cells with atorvastatin also induced a downregulation of CDK4 expression, which was accompanied by an upregulation of p27Kip1 expression. The atorvastatin-mediated inhibition in proliferation and cell cycle progression could be reversed by mevalonate, an intermediate product of the HMG-CoA reductase pathway, suggesting a direct involvement of atorvastatin in this pathway, necessary for the isoprenylation of small GTPase proteins of the Rho family. Utilizing a thapsigargin model of calcium influx to activate the same calcium-release activated calcium (CRAC) channels as T cell receptor-stimulation by antigen, an inhibition in calcium influx could be observed on pre-incubating T cells with TRAIL. Co-incubating with human recombinant TRAIL receptor 2 fusion protein, a competitive antagonist for TRAIL, reversed this inhibition. A direct influence on calcium influx is indicative of an influence of TRAIL on the activation status of human T cells. Therefore, TRAIL directly inhibits activation of these cells via blockade of calcium influx. However, no impact of atorvastatin on early T cell activation was observed, since calcium influx was unaffected. While TRAIL-mediated interference with T cell activation and further cell cycle progression is still in the pre-clinical phase, statins, which have also been shown here to interfere with the T cell cycle, are already employed in the clinic for other ailments. In fact, clinical trials are currently being undertaken with this group of drugs for MS. Further studies on detailed mechanisms of antiproliferative substances effective in MS will allow the development of highly selective immunomodulatory agents with increased beneficial profile as MS therapy.

CAR-T-Zell-Therapie ist eine vielversprechende neuartige Behandlungsform für Patienten mit aggressiven B-Zell Non-Hodgkin-Lymphomen (B-NHL). In dieser Arbeit wurde die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie als Alternative zur anti-CD19 CAR-T-Zell-Therapie für die Behandlung von reifen B-NHLs untersucht. CXCR5 ist ein B-Zell-homing Rezeptor, der von reifen B Zellen und follikulären T-Helferzellen (TFH Zellen) exprimiert wird. TFH Zellen wurden als tumor-unterstützend in chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) und im follikulären Lymphom (FL) beschrieben. Dieses Expressionsmuster erlaubt es, auf einzigartige Weise zeitgleich die malignen Zellen und die tumorunterstützende Mikroumgebung mithilfe von CAR-T-Zell-Therapie gerichtet gegen einen Chemokinrezeptor anzugreifen. Die wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit waren, dass (1) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet CXCR5 positive reife B-NHL Zelllinien und Patientenproben in vitro eliminierten und eine starke anti-Tumor Reaktivität in einem immundefizienten Xenotransplantationsmausmodell zeigten, (2) die anti-CXCR5 CAR T-Zellen zielgerichtet die tumorunterstützenden TFH Zellen in CLL und FL Patientenproben in vitro erkannten und dass (3) CXCR5 ein sicheres Expressionsprofil zeigte. CXCR5 war stark und häufig auf B-NHL exprimiert und die Expression auf gesundem Gewebe war auf lymphoide Zellen beschränkt. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die anti-CXCR5 CAR-T-Zell-Therapie eine neue Behandlungsmöglichkeit für Patienten mit reifen B-NHL darstellt, indem durch die anti-CXCR5 CAR-T Zellen sowohl der Tumor als auch ein Anteil der tumorunterstützende Mikroumgebung eliminiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde das Eμ-Tcl1 murine CLL Lymphommodell genutzt um die Auswirkung der Lymphomentwicklung auf die CXCR5+ T Zellen zu untersuchen. Mittels RNA-Einzelzell-Sequenzierung konnte ein profunder Einfluss des Lymphomwachstums auf das T Zell-Kompartiment der Mäuse, denen Eμ-Tcl1 Zellen gespritzt wurden, gezeigt werden. / CAR T cell therapy is a promising new treatment option for patients suffering from aggressive B non-Hodgkin lymphomas (NHLs). In CAR T cell therapy, patient-derived T cells are genetically modified to express a chimeric receptor commonly directed towards a surface antigen expressed by neoplastic cells. In this thesis, anti-CXCR5 CAR T cell therapy was investigated as an alternative to anti-CD19 CAR T cell therapy for the treatment of mature B-NHLs. CXCR5 is a B cell homing receptor expressed by mature B cells and follicular helper T (TFH) cells. TFH cells were described to support the tumor cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and follicular lymphoma (FL). This expression pattern allows simultaneous targeting of the malignant cells and the tumor-supporting microenvironment by CAR T cell therapy against a chemokine receptor in an unprecedented manner. Main findings included that (1) anti-CXCR5 CAR T cells targeted specifically CXCR5 expressing mature B-NHL cell lines and patient samples in vitro and showed strong in vivo anti-tumor reactivity in an immunodeficient xenograft mouse model, (2) anti-CXCR5 CAR T cells targeted tumor-supportive TFH cells derived from CLL and FL patient samples in vitro and (3) CXCR5 showed a safe expression profile. CXCR5 was strongly and frequently expressed by B-NHLs and its expression on healthy tissue was restricted to lymphoid cells. In summary, anti-CXCR5 CAR T cell therapy presents a novel treatment option for patients suffering from mature B-NHLs by eliminating the tumor and part of the tumor-supportive microenvironment. The second part of the project, the Eμ-Tcl1 murine lymphoma model, which mimics human CLL, was used to study the impact of lymphomagenesis on CXCR5+ T cells. Using single cell RNA sequencing, a profound influence of lymphoma growth on the T cell compartment in Eμ-Tcl1 tumor-challenged mice could be shown.