L’hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie grave caractérisée par une obstruction progressive des artères pulmonaires de petit calibre, conduisant à une augmentation des résistances vasculaires pulmonaires et, à terme, à une défaillance cardiaque droite et au décès du patient. La vasoconstriction, le remodelage vasculaire et la dysfonction endothéliale pulmonaire sont autant de facteurs qui contribuent au développement et à la progression de la maladie. Plusieurs arguments sont également en faveur d’une hypothèse de désordres immunologiques, voire autoimmuns, dans la physiopathologie de l’HTAP. Malgré ces données, le lien entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans cette maladie restent peu connus. Ce travail de thèse a donc eu pour objectif d’étudier et mieux comprendre la nature et les conséquences d’une communication aberrante entre cellules endothéliales pulmonaires et système immunitaire dans la pathogénèse de l‘HTAP, afin d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour cela, nous avons analysé le rôle de la dysfonction endothéliale dans la régulation de deux processus de la dysfonction immunitaire : l’autoimmunité pour la réponse adaptative d’une part, et la sécrétion de cytokines en ce qui concerne la réponse innée d’autre part. A travers ce travail de thèse, nous avons mis en évidence l’existence d’une communication aberrante entre endothélium pulmonaire et système immunitaire dans l’HTAP et montré que l‘endothélium pulmonaire jouait un rôle primordial dans le contrôle des réponses adaptatives, en régulant la fonction des lymphocytes T régulateurs via la leptine, et dans la participation active à la réponse innée, en acquérant un phénotype pro-inflammatoire. Cette meilleure compréhension du rôle de la dysfonction endothéliale dans la dérégulation du système immunitaire présente dans l’HTAP pourrait aider au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques dans cette maladie. / Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a severe disease characterized by a progressive obstruction of small pulmonary arteries, leading to an increase in pulmonary vascular resistance and ultimately right heart failure and death. Vasoconstriction, vascular remodeling and pulmonary endothelial dysfunction contribute to the disease development and progression. Increasing evidence are also suggesting the importance of immune disorders, such as autoimmunity, in PAH pathophysiology. Despite these data, the link between pulmonary endothelium and immune system is still unclear. The objective of this work was to investigate and elucidate the nature and the consequences of an aberrant communication between pulmonary endothelial cells and immune system in PAH pathogenesis, in order to identify new therapeutical targets. Therefore, we analyzed the role of endothelial dysfunction in the control of two types of altered immune responses: autoimmunity for the adaptive response and cytokine secretion for the innate response. In this work, we highlighted the existence of an aberrant communication between pulmonary endothelium and immune system in PAH and showed that pulmonary endothelium played a key role in the control of adaptive responses, by regulating regulatory T lymphocyte function in a leptin-dependent manner, and by actively participating to the innate responses through a pro-inflammatory phenotype. A better understanding of the role of endothelial dysfunction in PAH immune system dysregulation may help to the development of new therapeutical strategies for this disease.

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão e o padrão de distribuição de linfócitos citotóxicos (LCs) e linfócitos T regulatórios (LTregs) no tecido gengival de pacientes com doença periodontal através de análise imunoistoquímica. Foram selecionados 30 pacientes (10 por grupo) com diagnóstico de periodontite agressiva (PA), periodontite crônica (PC) e gengiva clinicamente saudável (controle); dos quais foi colhida uma amostra de tecido gengival. A distribuição das células (epitélio e córion) foi identificada usando os imunomarcadores CD56, CD57, Granzima B e Perforina (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). A imunoexpressão foi avaliada, utilizando representação de imagem por meio de um sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz, adaptado a uma câmera de alta resolução. Contagens independentes de 10 campos separados para cada caso foram feitas. Two-way ANOVA e posterior teste de Fisher foram utilizados para observar diferenças entre os diagnósticos e os marcadores; e teste t de Student para observar diferenças entre epitélio e córion (p<0.05). Os resultados indicaram que pacientes com PA e PC apresentaram um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+, em relação ao grupo controle, porém sem diferenças entre si; um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+ foi observado em relação às células Granzima B+ e Perforina+ em todos os pacientes. Em relação aos LTregs, o número de células CD25+ e FOXP3+, foi significativamente diferente entre PA, PC e controle, aparecendo em maior número na PC. Células CD4+ foram observadas em número similar em pacientes com PA e PC, diferindo significantemente do grupo controle; em pacientes com PA e PC, foi observado um número significantemente maior de CD4+, em relação às células CD25+ e FOXP3+. Pacientes com PA e PC tem maior número de LCs no tecido gengival em relação ao grupo controle sugerindo a participação destas células na patogênese da PA e PC. Pacientes com PA apresentaram menor número de LTregs no tecido gengival em comparação aos pacientes com PC, sugerindo que estas células podem estar envolvidas no mecanismo de regulação do processo inflamatório e reabsorção óssea. / This project aims to observe the expression and distribution of cytotoxic lymphocytes (LCs) and regulatory T lymphocytes (LTregs) in gingival tissue from periodontal disease affected patients through immunohistochemical analysis. 30 patients (10 per group) diagnosed with aggressive periodontitis (PA), chronic periodontitis (PC) and clinically healthy gingiva (control) were selected; from which a sample of gingival tissue was collected. The distribution of cells (epithelium and chorion) was identified using the immunomarkers CD56, CD57, Granzyme B, Perforin (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). The immunoexpression was assessed using image representation by a computer system, comprising a light microscope adapted to a high resolution camera. Independent counts of 10 separate fields for each case were done. Two-way ANOVA and posterior Fisher´s Test were used to observe differences between diagnostics and immunomarkers; and unpaired Student t test to observe differences between epithelium and chorium (p<0.05). The results indicates that patients with PA and PC presented a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells, in relation to control, but without differences between each other; a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells was observed in relation to Granzyme B and Perforine cells in all patients. Related to the LTregs, the number of CD25+ and FOXP3+ cells was significantly different between PA, PC and control, appearing in greater number in PC. CD4+ cells were observed in similar number in patients with PA and PC, it was observed a significantly higher number of CD4+, in relation to CD25+ and FOXP3+ cells. Patients with PA and PC have a greater number of LCs in gingival tissue in relation to control group - suggesting the participation of this cells in the pathogenesis of PA and PC. Patients with PA presented less LTregs in gingival tissue when compared to PC patients, suggesting that this cells may be involved in the regulatory mechanism of the inflammatory process and bone resorption.

Introdução: Uma proporção significante de pacientes infectados por HIV-1 (pacientes HIV-1+) tratados com inibidores de protease (IPs) desenvolve mutações de resistência. Estudos recentes têm mostrado que células T CD8+ de pacientes HIV- 1+ reconhecem epitopos de Pol incluindo mutações selecionadas por drogas. Nenhum epitopo CD4+ da protease foi descrito na base de dados de Los Alamos. Objetivo: Considerando que a protease de HIV-1 é alvo de terapia antiretroviral e que essa pressão pode selecionar mutações, nós investigamos se mutações selecionadas por IPs afetariam o reconhecimento de epitopos da protease de HIV-1 por células T CD4+ em pacientes tratados com IPs. Nós investigamos o reconhecimento de três regiões da protease preditas de conter epitopos de células T CD4+ bem como mutações induzidas por IPs por células T CD4+ em pacientes HIV- 1+ tratados com IPs. Materiais e Métodos: Quarenta pacientes HIV-1+ tratados com IPs foram incluídos (30 em uso de Lopinavir/ritonavir, 9 em uso de Atazanavir/Ritonavir e 1 em uso exclusivo de Atazanavir). Para cada paciente determinou-se a seqüência endógena da protease de HIV-1, genotipagem viral e tipagem HLA classe II. Utilizamos o algoritmo TEPITOPE para selecionar peptídeos promíscuos, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR, codificando as três regiões da protease de HIV-1 cepa HXB2 (HXB2 4-23, 45-64, e 76-95) e 32 peptídeos adicionais contidos nas mesmas regiões incorporando as mutações induzidas por IPs mais freqüentes no Brasil. Os 35 peptídeos foram sintetizados. Respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ aos peptídeos foram determinadas por ensaios de proliferação com diluição do corante CFSE. Ensaios de ligação a alelos HLA classe II foram realizados para confirmar a promiscuidade desses peptídeos e avaliar a habilidade de se ligarem a moléculas HLA presentes em cada paciente. Resultados: Todos os peptídeos foram reconhecidos por pelo menos um paciente e respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ a pelo menos um peptídeo da protease de HIV-1 foram encontradas em 78% e 75% dos pacientes, respectivamente. A terceira região (Protease 76 95) foi a mais freqüentemente reconhecida. Ao compararmos as respostas de células T às seqüências da protease do HIV-1 endógeno, observamos que a maioria dos pacientes não foi capaz de reconhecer peptídeos idênticos às essas seqüências, porém reconheceram peptídeos variantes diferentes das mesmas regiões. Apenas sete pacientes responderam às seqüências endógenas. Verificamos que diversos peptídeos endógenos que não foram reconhecidos apresentaram ausência de ligação a alelos HLA portados por estes pacientes, sugerindo que mutações selecionadas por pressão imune tenham levado ao escape de apresentação de antígeno e evasão de resposta de linfócitos T CD4+. Alternativamente, isso poderia ser explicado pela presença de um vírus replicante distinto presente no plasma uma vez que somente foram obtidas seqüências provirais. Conclusão: Epitopos selvagens e mutantes da protease do HIV-1 reconhecidos por células T CD4+ foram identificados. Também verificamos que a maior parte dos pacientes não reconheceu as seqüências da protease endógena enquanto que reconheceram seqüências variantes. O reconhecimento de seqüências não-endógenas poderia ser hipoteticamente conseqüência de alvo de populações HIV-1 minoritárias; protease de HERV que contém regiões de similaridade com a protease do HIV-1; ou seqüências de HIV-1 presentes apenas em parceiros virêmicos. A falha de reconhecimento de seqüências endógenas seria mais provável devido ao escape imune, do que ao nível de apresentação ou reconhecimento por células T. Isso implica em uma conseqüência patofisiológica na evasão de respostas de células T contra a protease de HIV-1 e no fato de ser tradicionalmente considerada uma proteína pouco antigênica / Introduction: A significant proportion of protease inhibitor (PI)-treated HIV-1 infected (HIV-1+) patients develop resistance mutations. Recent studies have shown that CD8+ T cells from HIV-1 patients can recognize antiretroviral drug-induced mutant Pol epitopes. No HIV-1 protease CD4 epitopes are described in the Los Alamos database. Aims: Given that the protease of HIV-1 is a target of antiretroviral therapy and this pressure may lead to the selection of mutations, we investigated whether PI-induced mutations affect the recognition of HIV-1 protease epitopes by CD4 + T cells in PI-treated patients. We investigated the recognition of three protease regions predicted to harbor CD4+ T cell epitopes as well as PI-induced mutations by CD4+ T cells of PI-treated HIV-1+ patients. Methods: Forty PI-treated HIV-1+ patients were included (30 undergoing Lopinavir/ritonavir, 9 undergoing Atazanavir/ritonavir and 1 undergoing exclusively Atazanavir treatment). For each patients, the endogenous HIV-1 protease sequence, viral genotype and HLA class II typing were determined. We used the TEPITOPE algorithm to select promiscuous, multiple HLA-DR-binding peptides encoding 3 regions of HIV-1 HXB2 strain protease (HXB2 4-23, 45-64, and 76-95) and 32 additional peptides contained in the same regions, but encompassing the most frequent PI-induced mutations in Brazil. The 35 peptides were thus synthesized. Proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against peptides were determined by the CFSE dilution assay. HLA class II binding assays were made to confirm the promiscuity of these peptides and evaluate their ability to bind the HLA molecules carried by each patient. Results: All tested peptides were recognized by at least one patient and proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against at least one HIV-1 protease peptide were found in 78% and 75% patients, respectively. The third region (Protease 76-95) was the most frequently recognized. By comparing T-cell responses to HIV-1 endogenous protease sequences, we found that most patients failed to recognize identical peptides of those sequences, but recognized different variant peptides of the same region. Only seven patients responded to endogenous sequences. We found that several endogenous peptides that failed to be recognized showed no binding to the HLA alleles carried by that given patient, suggesting that mutations selected by immune pressure have led to escape of antigen presentation, as well as direct escape of the CD4+ T cell response. Alternatively, it could have been due to the presence of a different replicating virus in the plasma-since we only obtained proviral sequences. Conclusion: Wild-type and mutant HIV-1 protease epitopes recognized by CD4+ T cells were identified. We also found that most patients failed to recognize their endogenous protease sequences, while they recognized variant sequences. The recognition of non-endogenous sequences could hypothetically be a consequence of targeting a minor HIV-1 population; HERV protease, that contains regions of similarity with HIV-1 protease; or HIV-1 sequences present only in viremic partners. The failure to recognize endogenous sequences is most likely due to immune escape, either at the level of presentation or direct T cell recognition. This may have a pathophysiological consequence on evasion of T cell responses against protease and the fact that it has been considered traditionally a poorly antigenic HIV-1 protein.

Background. Islet amyloid polypeptide (IAPP, also known as amylin) is a 37-amino acid peptide principally co-secreted with insulin from the beta-cells of the pancreatic islets. Some of the physiological actions of human amylin (hIAPP) include glucose regulation, suppression of appetite and stimulation of renal sodium and water reabsorption. Amylin deficiency and diminished post-prandial amylin response have been reported in advanced stages of type 1 and type 2 diabetes. In autopsy specimens of type 2 diabetes, amyloid is found in 40--90% of cases. During the characterization of islet morphology of aged hIAPP transgenic mice, I observed pathological features suggestive of immune dysregulation. Review of literature also suggested possible immuno-modulating functions of human amylin in in vitro experiments. Since autoimmunity and innate immunity are implicated in aging and diabetes, I explored the immunological role of amylin with particular focus on CD4+CD25+ T regulatory cells and toll-like receptors (TLR) which are known mediators of autoimmunity and innate immunity respectively. / Conclusions. Human amylin may play an important role in modulating immunity mainly through stimulating CD4+CD25+ Treg cells, decreasing PLN and altering expression of TLR-4 and cytokines. If these findings are confirmed in in vivo model, human amylin has the potential to become a novel and promising therapy to prevent and reverse autoimmune disease such as autoimmune type 1 diabetes. / Hypothesis. Human amylin may have immunomodulating effects which may have implications on pathogenesis of autoimmune type 1 diabetes. / Materials and methods. Male hemizygous hIAPP transgenic mice (n=32) and their nontransgenic littermates (n=20) were fed with normal chow and studied longitudinally up to 18 months of age with measurement of plasma insulin, glucose and amylin at regular intervals. Detailed oral glucose tolerance test, intra-peritoneal insulin tolerance test, insulin and amylin protein expression were examined at 3, 7, 12 and 18 months of age. Histological changes of pancreas and spleen including changes in CD4+CD25+ T regulatory cells and cytokines were examined at 12 and 18 months. / Objectives. (1) I systemically characterized the morphological, functional and immune regulatory role of human amylin in aged hIAPP transgenic mice which include metabolic profiles, plasma levels of amylin and insulin as well as morphological changes of pancreatic lymph nodes (PLN). (2) I then examined splenic expression of TLR-4 associated changes in cytokines (TNF-alpha, TGF-beta, and IL-6). (3) I also examined the expression level of receptor activity modifying proteins (RAMPs) in pancreas and spleen. (4) I finished by investigating the role of human amylin on stimulating CD4+CD25+ T regulatory (Treg) cells in hIAPP transgenic mice and peripheral blood monocytes (PBMC) from healthy subjects. / Results. (1) With aging, the hIAPP transgenic mice demonstrated increased plasma amylin, decreased plasma insulin, reduced insulin to amylin ratio and improved insulin sensitivity (p&lt;0.05). (2) The aged hIAPP transgenic mice showed changes in immune function as indicated by: (a) Reduced number and size of PLN (p&lt;0.05). (b) Decreased expression level of TLR-4 in splenocytes (p&lt;0.05). (c) Increased expression of transforming growth factor-beta (TGF-beta) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) protein but decreased level of IL-6 in splenocytes (p&lt;0.05). (3) The changes in the levels of immune cytokines such as IL-1, IL-2, IL-4, IL-10, IL-17, interferon-gamma and GM-CSF were similar between hIAPP transgenic and nontransgenic mice (p>0.05). (4) The levels of RAMP1, RAMP2, and RAMP3 were higher in the spleen of hIAPP transgenic mice than nontransgenic mice (p&lt;0.05). (5) The hIAPP transgenic mice showed higher percentage of CD4+CD25+ Treg cells compared with nontransgenic littermates. Treatment with human amylin, but not rat amylin, increased the percentage of FoxP3+CD4+CD25+ Treg cells in both splenic T lymphocytes of hIAPP transgenic mice and PBMCs of healthy subjects ex vivo (p&lt;0.05). / He, Lan / Adviser: Juliana C.N. Chan. / Source: Dissertation Abstracts International, Volume: 73-01, Section: B, page: . / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2010. / Includes bibliographical references (leaves 176-199). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Electronic reproduction. [Ann Arbor, MI] : ProQuest Information and Learning, [201-] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Abstract also in Chinese.

Ip Wai-Ki. / "July 2003." / Thesis (Ph.D.)--Chinese University of Hong Kong, 2003. / Includes bibliographical references (p. 261-290). / Electronic reproduction. Hong Kong : Chinese University of Hong Kong, [2012] System requirements: Adobe Acrobat Reader. Available via World Wide Web. / Mode of access: World Wide Web. / Abstracts in English and Chinese.

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

INTRODUÇÃO: A Síndrome de Sézary (SS) é um linfoma cutâneo de células T (LCCT), caracterizado por eritrodermia, linfadenopatia generalizada e presença de células tumorais na pele, linfonodos e sangue periférico. Os linfócitos TCD8+ têm papel fundamental na resposta imune antitumoral, entretanto, há escassos estudos evidenciando seu perfil fenotípico e funcional. Considerando que a resposta imunológica do paciente com SS está suprimida, estratégias para potencializar a imunidade inata e adaptativa com agonistas de receptores Toll-like (TLRs) têm sido exploradas. OBJETIVO: Caracterizar o perfil de marcadores de ativação/inibição das células TCD8+, seus estágios de diferenciação, capacidade de resposta a IL-7/IL-15 e ao agonista de TLR7/TLR8 de pacientes com SS. METODOLOGIA: Foram selecionados 15 pacientes com SS (7 homens e 8 mulheres) com 48-85 anos do Ambulatório de Linfomas Cutâneos, do HC-FMUSP, e um grupo de controle com 24 indivíduos sadios. A análise de marcadores de ativação/inibição e diferenciação celular em células TCD4/TCD8+ do sangue periférico foi realizada por citometria de fluxo. A expressão de marcadores extracelulares e citocinas intracelulares em células mononucleadas do sangue periférico (CMN) após estimulação com o agonista de TLR7/TLR8 foi analisada por citometria de fluxo. Além disto, o efeito de IL-7 e IL-5 em células T foi avaliado pela fosforilação de STAT5, na capacidade de proliferação mitogênica e expressão de BCL-2 em CMNs, como também pelos níveis séricos de IL-7 por citometria de fluxo. RESULTADOS: Os pacientes com SS mostram perfil fenotípico de ativação crônica nos linfócitos TCD8+ periféricos, decorrente do elevadopercentual de células TCD8+ CD38+, redução percentual de TCD8+ CD127+ (IL-7R) e da população naive. Além disso, ocorreu aumento de expressão de PD-1 na população naive de células TCD8+. O marcador de ativação, CD26, até então apenas relacionado com linfócitos TCD4, foi detectado em reduzida percentagem de linfócitos TCD8. A resposta para IL-7/IL-15 parece estar funcionalmente presente tanto nos linfócitos TCD4 quanto nos linfócitos TCD8. Contudo, foi encontrado um perfil diferenciado e heterogêneo de fosforilação de STAT5 assim como de expressão de BCL-2 nos linfócitos TCD8+ de pacientes com SS. O nível sérico de IL-7 reduzido dos pacientes com SS foi inversamente correlacionado com o número absoluto de linfócitos TCD4+. CONCLUSÃO: Os linfócitos TCD8+ dos pacientes com SS encontram-se reduzidos em números absolutos, e possuem um perfil alterado de diferenciação celular e expressão de marcadores extracelulares. A redução percentual da população de TCD8+ naive associada com a presença de moléculas de ativação crônica mostra um perfil de imunosenescência. As células TCD8+ exibem baixa capacidade de resposta aos ligantes de TLR intracelulares, provavelmente devido ao perfil de ativação crônica. Além disso, há resposta parcial dos linfócitos TCD8+ às citocinas ligantes do receptor yc. Nossos resultados evidenciam alterações em linfócitos TCD8+ que debilitam a resposta imune antitumoral e que pode contribuir com a patogênese da síndrome de Sézary / INTRODUCTION: Sézary syndrome (SS) is a cutaneous T cell lymphoma (CTCL), characterized by erythroderma, generalized lymphadenopathy and the presence of tumor cells in the skin, lymph nodes and peripheral blood. The TCD8+ lymphocytes play a key role in anti-tumor immune response, whereas, there are few studies showing its phenotypic and functional profile in SS. Considering that the immune response of SS patient is suppressed, strategies to enhancing the innate and adaptive immunity by Toll-like receptors (TLRs) agonists have been explored. OBJECTIVE: To characterize the profile of activation/inhibition markers of CD8+ T cells, their stages of differentiation, ability of response to IL-7/IL-15 and TLR7/TLR8 agonist of patients with SS. METHODOLOGY: Fifteen SS patients were enrolled (7 men and 8 woman) with 48-85 years from the Clinic of Cutaneous Lymphomas, HC-FMUSP, and a control group of 24 healthy individuals. Analysis of activation/inhibition markers and cellular differentiation in CD4/CD8 T cells from peripheral blood were assessed by flow cytometry. The expression of extracellular markers and intracellular cytokines in mononuclear cells in the peripheral blood (CMN) were evaluated by flow cytometry. Moreover, the effect of IL-7 and IL-15 stimulation in T cells was assessed by the STAT5 phosphorylation, proliferative mitogenic capacity, BCL-2 expression in CMNs as well as serum IL-7 levels by flow cytometry. RESULTS: Patients with SS show a phenotypic CD8 T peripheral lymphocytes profile of chronic activation, due to the high percentage of CD8+CD38+ T cells, reduced percentage of CD8+CD127+ (IL-7R) and naïve population. Furthermore, it was observed an increased PD-1 expression in the naïve CD8+ T cells. The activation marker CD26, previously only associated with CD4 T lymphocyte, was detected at decreased percentage in CD8 T lymphocytes. The TLR7/TLR8 agonist did not affect the IFN-? and TNF secretion of CD8 T lymphocytes of SS patients, in contrast to the control group. The response to IL-7/IL-15 appears to be functional in both CD4 and CD8 T lymphocytes. However, it was founded a differentiated and heterogeneous profile of STAT5 phosphorylation and Bcl-2 expression in the CD8 T lymphocytes in SS patients. The reduced IL-7 serum of patients with SS was inversely correlated with the absolute number of CD4 T lymphocytes. CONCLUSION: CD8 T lymphocytes of patients with SS are reduced in absolute numbers, and show an altered cellular differentiation profile and extracellular markers expression. The reduced percentage of CD8 naïve population associated with chronic activation of molecules reveals an immunosenescence profile. The CD8 T cells exhibit low ability to ligands of intracellular TLR receptors, probably due to chronic activation profile. In addition, there are partial response of CD8 T lymphocytes to the cytokine receptor ?c. Our results show disturbance in CD8 T lymphocytes that may impair the anti-tumor response contributing to the pathogenesis of Sézary syndrome

INTRODUÇÃO: A variante hipocromiante da micose fungoide - MF - (MFh) apresenta características peculiares, como a predileção por indivíduos jovens e melanodérmicos e curso clínico crônico. Estudos especulam a patogênese da hipocromia comparando-a à do vitiligo. No Brasil, faltam dados que permitam conhecer sua importância na saúde pública. O presente trabalho visou avaliar a epidemiologia, a histopatologia e a imunofenotipagem de uma amostra de pacientes com diagnóstico de MFh e propor hipóteses dos mecanismos patogênicos da hipocromia, além de comparar pacientes portadores de lesões hipocrômicas exclusivas com aqueles portadores de outras formas de MF com lesões hipocrômicas concomitantes. MÉTODOS: Foram selecionados pacientes do Ambulatório de Linfomas Cutâneos do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e classificados em três grupos: A (21 portadores apenas de lesões hipocrômicas); B (15 portadores de outras formas de MF com lesões hipocrômicas concomitantes) e C (8 pacientes com diagnóstico de MF clássica, estes apenas para avaliações histológica e imuno-histoquímica). Foram obtidos dados clinicoepidemiológicos e realizadas análises histológica e imuno-histoquímica de biópsias das lesões e de pele normal, como controle. Para o estudo imuno-histoquímico foram utilizados os marcadores para imunofenotipagem da neoplasia, Melan-A, tirosinase, SCF, CD117 e MITF. RESULTADOS: Do total de pacientes acompanhados naquele ambulatório, os pacientes com MF portadores de lesões hipocrômicas corresponderam a 16%. As medianas das idades de início da doença e dos tempos de história foram de, no grupo A 25 anos e 8 anos; no grupo B, 29 anos e 13 anos, respectivamente; houve predomínio de indivíduos melanodérmicos , acometimento do sexo feminino e a maioria dos pacientes encontrava-se em estágios iniciais da doença em ambos os grupos. A avaliação histológica revelou achados semelhantes, como epidermotropismo de linfócitos atípicos e infiltrado dérmico linfomonocitário nas lesões hipocrômicas e não-hipocrômicas. O imunofenótipo CD8+ do infiltrado neoplásico epidérmico foi mais frequente no grupo A, ao passo que os grupos B e C apresentaram mais casos com imunofenótipo CD4+. A avaliação da função melanocítica das lesões hipocrômicas do grupo A revelou diminuição significativa da imunomarcação dos melanócitos por todos marcadores em comparação à pele normal e às lesões do grupo C. Em relação ao grupo B, não houve diferenças para as lesões hipocrômicas, não-hipocrômicas e pele normal, quando avaliadas dentro do próprio grupo (exceto para Melan A). A expressão de SCF pelos queratinócitos foi irregular sobretudo nas lesões hipocrômicas. DISCUSSÃO: Os pacientes com lesões hipocrômicas apresentaram características semelhantes (idade precoce, predomínio do sexo feminino, doença indolente). Mostrou-se que indivíduos melanodérmicos tem maior chance de apresentar lesões hipocrômicas. Além da redução de melanócitos e do receptor melanocítico CD117 em relação à pele normal já demonstradas previamente, mostrou-se, como no vitiligo, a redução da expressão do MITF, fator vital para a função e sobrevida do melanócito. Além disso, também se explicitou desbalanço da produção de citocinas melanogênicas pelos queratinócitos. CONCLUSÃO: A presença de lesões hipocrômicas pode ser considerada um marcador de bom prognóstico na MF. Diferentes mecanismos, como ação celular citotóxica e a alteração do microambiente da unidade epidérmica, colaboram para hipocromia das lesões da MFh / INTRODUCTION: The hypopigmented variant of mycosis fungoides - MF - (MFh) presents specific characteristics, such as a predilection for young and melanodermic individuals, and chronic clinical course. Studies speculate the pathogenesis of the hypopigmentation comparing it to vitiligo\'s. In Brazil, the lack of data prevents the knowledge of its importance in public health. This study aimed to evaluate the epidemiology, the histopathology and the immunophenotyping of a sample of patients diagnosed with MFh and to propose hypotheses of the pathogenic mechanisms of hypopigmentation, in addition to comparing exclusive hypopigmented lesion-bearer patients with those bearing other types of MF with concomitant hypopigmented lesions. METHODS: Patients were selected from the Cutaneous Lymphoma Clinic, from Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo and classified in three groups: A (21 hypopigmented only lesion- bearers); B (15 bearers of other types of MF with concomitant hypopigmented lesion) and C (8 patients diagnosed with classical MF, being those only for histology and immunohistochemistry evaluations). Clinical- epidemiological data were obtained and histology and immunohistochemistry analyses of lesion biopsies and normal skin, as a control, were made. For the immunohistochemistry study, the markers for immunophenotyping the neoplasm, Melan-A, tyrosinase, SCF, CD117 and MITF were used. RESULTS: Of the total number of patients treated at that clinic, the MF patients bearing hypopigmented lesions were 16%. The medians of the age of disease onset and the medical history time were 25 years and 8 years in group A; 29 years and 13 years in group B, respectively; there were a predominance of melanodermic individuals, involvement of the female sex, and the majority of the patients were in early stages of the disease in both groups. The histological evaluation revealed similar findings, such as epidermotropism of atypical lymphocytes and lympho-monocytic dermal infiltrate in hypopigmented and non-hypopigmented lesions. The CD8+ immunophenotype of the epidermal neoplastic infiltrate was more frequent in group A, while groups B and C showed more cases of CD4+ immunophenotype. The evaluation of the melanocytic function of the hypopigmented lesions in group A revealed a significant decrease of immunostaining of the melanocytes by all markers when compared to normal skin and group C lesions. Regarding group B, there were no differences to hypopigmented and non-hypopigmented lesions and normal skin, when evaluated within the group itself (except for Melan A). The SCF expression by the keratinocytes was irregular especially in hypopigmented lesions. DISCUSSION: Patients with hypopigmented lesions showed similar characteristics (early age, female sex predominance, indolent disease). It has been showed that melanodermic subjects are more likely to have hypopigmented lesions. In addition to the previously-showed reduction of melanocytes and CD117 melanocytic receptor related to normal skin, it has been showed, as in vitiligo, the reduction of MITF expression, a vital factor for the function and survival of the melanocyte. Besides that, it has been also made explicit a production imbalance of melanogenic cytokines by the keratinocytes. CONCLUSION: The presence of hypopigmented lesions can be considered a marker of good prognosis in MF. Different mechanisms, such as cytotoxic cellular action and the change of the microenvironment of the epidermal unit, collaborate for the hypopigmentation of the lesions of MFh

INTRODUÇÃO: A patogênese da hepatite C crônica resulta principalmente de mecanismos imuno-mediados com a atuação central das citocinas tanto na lesão hepatocelular como na eliminação e na persistência do vírus da hepatite C (VHC). OBJETIVOS: Investigar a resposta imune adaptativa da hepatite C crônica através da expressão das células inflamatórias no tecido hepático e de citocinas no tecido hepático e no sangue, relacionando-os com dados demográficos, laboratoriais e histológicos. MÉTODOS: Pacientes com hepatite C crônica, virgens de tratamento foram selecionados no ambulatório de Moléstias Infecciosas do Hospital das Clínicas. Foram utilizados dois grupos controles para comparação: de doadores de sangue saudáveis e fragmentos de biópsia hepática de doadores de órgãos. Todos os controles selecionados não tinham evidência de hepatopatia. As seguintes citocinas foram analisadas no sangue pelo método quantitativo de ELISA no sangue dos casos e dos doadores de sangue: interleucina (IL) 1, IL2, IL4, IL6, IL 10, interferon (IFN) , fator de necrose tumoral (TNF) e fator de crescimento e transformação (TGF) . As mesmas citocinas e as populações celulares CD4+, CD8+, CD45RO+, CD57+, CD68+ e S100 foram quantificadas através de método imuno-histoquímico no espaço portal e no lobo hepático dos casos e dos doadores de fígado. Esses dados foram posteriormente associados às alterações histológicas pela classificação de Ishak. RESULTADOS: Foram selecionados 51 pacientes com hepatite C crônica, 58% do gênero masculino; 66,6% brancos e média de idade de 39 anos (variando de 20 a 59). Foram selecionados 33 doadores de órgãos e 51 doadores de sangue. Comparando com os doadores de sangue, os casos apresentaram maiores níveis séricos de IL2 (p <0,001), IL10 (p <0,001), INF (p 0,018) e TGF (p <0,001). Na análise das biópsias hepáticas, os casos apresentaram maior expressão de LTCD4+ portais (p <0,001), LTCD8+ portais (p <0,001), IL4 lobular (p 0,001), IL10 lobular (p 0,007), INF lobular (p <0,001), TNF portal (p <0,001) e lobular (p <0,001), TGF portal (p <0,001) e lobular (p <0,001) do que os doadores de órgãos. Entre os casos, houve correlações significantes diretas entre os seguintes marcadores e as alterações histológicas: CD4+ portal com a atividade peri portal (p 0,004); CD4+ lobular com a atividade lobular (p 0,017); TGF lobular com a atividade lobular (p 0,016); IL1 portal com atividade peri portal (p 0,009) e IL8 do sangue e fibrose (p 0,036). As populações celulares foram correlacionadas às citocinas no fígado dos casos e houve significância direta entre: CD4+ portal e TNF portal (p 0,004); CD8+ portal e TGF portal (p 0,030); CD57+ portal e IL10 portal (p 0,008); CD57+ lobular com TGF lobular (p 0,040) e IL2 lobular (p 0,048); S100 portal e IL10 portal (p 0,014). Não houve correlação significante entre as citocinas do fígado e as citocinas do sangue nos pacientes com hepatite C crônica. A carga viral do VHC teve correlação indireta com LTCD8+ lobulares (p 0,020), IL2 portal (p 0.049) e lobular (p 0.004). DISCUSSÃO: O comando da resposta imune nesta casuística foi orquestrado pelos linfócitos T CD4+ e CD8+, com predomínio da resposta Th1 e o principal local dos eventos foi o espaço portal. A compartimentalização da resposta imune ao VHC foi evidenciada pela ausência de correlações significantes entre as citocinas do tecido hepático e do sangue nos pacientes com hepatite C crônica. / BACKGROUND: The pathogenesis of chronic hepatitis C results mainly of immunological mechanisms with cytokines playing a central role in hepatocellular necrosis and in the immunopathogenic process involved in viral clearance and persistence. AIM: To investigate immune response to hepatitis C virus (HCV) through expression of inflamatory cells in liver and cytokines in liver and serum, and assess the relationship with demografic, laboratorial and histological features. METHODS: Naïve patients with chronic hepatitis C were selected from Infectious Diseases Division at a University Hospital. Two sets of controls were selected for comparison: healthy blood donors and liver biopsy specimens from liver donors. All controls had no evidence of hepatic disease. The following cytokines were analyzed by quantitative ELISA method in serum of cases and healthy blood donor controls: interleukin (IL) 1, IL2, IL4, IL6, IL10, interferon (IFN) , tumor necrosis factor (TNF) , and transforming growth factor (TGF) . The same cytokines and cellular populations of CD4+ T lymphocytes (TL), CD8+ TL, CD45+, CD57+, CD68+ and S100 were quantified by immunohistochemistry in acinar and portal spaces in liver biopsies of cases and liver donor controls. These data were additionally associated to histological parameters by Ishak Score. RESULTS: Were selected 51 patients with chronic hepatitis C, 58% were males; 66,6% white and the median age was 39 (range 20 to 59) years. Were selected 33 liver donors and 51 blood donors. Compared with heathy blood donor controls, cases showed higher levels of IL2 (p <0.001), IL10 (p <0.001), INF (p 0.018) and TGF (p <0.001). In liver biopsy analyses, cases showed greater expression of the following cell populations and cytokines: portal CD4+ TL (p <0.001), portal CD8+ (p <0.001), acinar IL4 (p 0.001), acinar IL10 (p 0.007), acinar INF (p <0.001), portal TNF (p <0.001), acinar TNF (p <0.001), portal TGF (p <0.001) and acinar TGF (p <0.001). Among cases, significant positive correlations were found between the following markers and Ishak graded patterns: portal CD4+TL and periportal inflammation (p 0.004); acinar CD4+ and focal inflammation (p 0.017); acinar TGF and focal inflammation (p 0.016); portal IL1 and periportal inflammation (p 0.009) and IL8 in blood and fibrosis (p 0.036). The cellular populations were correlated to cytokines in liver of hepatitis C patients and there was significant positive correlation between: portal CD4+ and portal TNF (p 0.004); portal CD8+ TL and portal TGF (p 0,030); portal CD57+ and portal IL10 (p 0,008); acinar CD57+ and acinar TGF (p 0,040) and acinar IL2 (p 0,048); portal S100 and portal IL10 (p 0,014). No significant correlation was found between liver and serum cytokines in cases. Hepatitis C viremia was inversely correlated to acinar CD8+ TL (p 0.020); portal (p 0.049) and acinar IL2 (p 0.004). DISCUSSION: The command of the immune response in this casuistic was orchestrated by CD4+ TL and CD8+ T lymphocytes, with predominance of Th1 answer, and the main site where of the events ocurred was the portal space. The compartimentalization of immune response to HCV was evidenced by the absence of significant correlations between cytokines in hepatic tissue and blood from patients with chronic hepatitis C.

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes