Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2017-11-21T15:24:13Z No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-21T15:24:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Luiz Cosme da Silva Junior.pdf: 2262385 bytes, checksum: 934698e0a82f5115f0317ed2075d1c57 (MD5) Previous issue date: 2017-08-30 / Financiadora de Estudos e Projetos - Finep / The economic impact caused by Aujeszky's disease (AD) has decreased with the use of vaccines deleted for the gE gene of the AD Virus and diagnostic tests for the detection of antibodies specific to the protein corresponding to the deleted gene for differentiation of infected animals from the vaccinated - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). The goal of this work was to clone and express the gene related to the extramembrane portion of the gE glycoprotein of the DA virus in E. coli expression system using synthetic gene with optimized codons and thioredoxin fused protein (Trx), and to evaluate its potential use in ELISA. After cloning, expression and identification of recombinant gE protein (gErec*Trx) in Western blotting with anti-His antibody, gErec*Trx (approximately 60 kDa) was used as antigen in ELISA (ELISAgErec) using Protein G peroxidase as conjugate. Samples previously tested in virus neutralization (VN) and in commercial ELISA were tested in ELISAgErec, and the cutoff point (> 0.13) was defined by ROC curve analysis. A total of 599 sera from pigs were used, of which 208 were positive VN and 391 negative in commercial ELISA for the detection of antigE antibodies from the DA virus, of which 300 originated from Certified Porcine Breeding Farms (GRSCs) and 91 from Technological properties of the State of Pernambuco. ELISAgErec presented sensitivity of 97.6% and specificity of 96.4%. To evaluate the analytical sensitivity and limit of detection, the international reference serum for AD was used, and for analysis of the analytical specificity were tested sera from pigs Pathogen-Specific Free (SPF) vaccinated with the main vaccines used in pigs. ELISAgEr showed greater sensitivity than the commercial ELISA thus demonstrating its ability to distinguish healthy and vaccinated animals from infected animals. In addition, to showing good solubility, gErec remained immunoreactive in the same titre in ELISAgErec after several months stored at 4 °C, and even after thermal stress at 70 °C it presented the same results. / O impacto econômico causado pela Doença de Aujeszky (DA) tem diminuído com uso de vacinas deletadas para o gene gE do Vírus da DA e testes diagnósticos para detecção de anticorpos específicos para a proteína correspondente ao gene deletado, para diferenciação dos animais infectados dos vacinados - DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated individuals). O objetivo com este trabalho foi clonar e expressar o gene referente a porção extramembranar da glicoproteína gE do vírus da DA em sistema de expressão E. coli utilizando gene sintético com códons otimizados e proteína fusionada a tiorredoxina (Trx), e avaliar seu potencial uso em ELISA. Após a clonagem, expressão e a identificação da proteína gE recombinante (gErec*Trx) em Western blotting com anticorpo anti-His, a gErec*Trx (aproximadamente 60 kDa) foi usada como antígeno em ELISA (ELISAgErec) utilizando Proteina G peroxidase como conjugado. Amostras previamente testadas em virusneutralização (VN) e em ELISA comercial foram testadas no ELISAgErec, e o ponto de corte (>0,13) foi definido por análise da curva ROC. Foram utilizados 599 soros de suínos, sendo 208 positivos virusneutralização (VN) e 391 negativos em ELISA comercial para detecção de anticorpos antigE do vírus da DA, sendo 300 oriundas de Granjas de Reprodutores Suínos Certificadas (GRSCs) e 91 de propriedades tecnificadas do estado de Pernambuco. O ELISAgErec apresentou sensibilidade de 97,6% e especificidade de 96,4%. Para avaliar a sensibilidade analítica e o limite de detecção foi testado o soro internacional de referência para a DA, e para avaliação da especificidade analítica foram testados soros de suínos Livre de Patógenos Específicos (SPF) vacinados com as principais vacinas usadas em suínos. O ELISAgEr apresentou maior sensibilidade que o ELISA comercial demonstrando assim sua capacidade de distinguir animais sadios e vacinados dos animais infectados. Além de apresentar boa solubilidade a gErec se manteve imunorreativa no mesmo título no ELISAgErec após vários meses estocada a 4 °C, e mesmo após estresse térmico a 70 °C apresentou mesmos resultados.

NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase / NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis

NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase / NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Oxidative stress is an important molecular mechanism of lead (Pb) toxicity. The thioredoxin system (selenoenzyme thioredoxin reductase-TrxR, thioredoxin protein- Trx and NADPH) is essential for the antioxidant defense and cellular redox control. In our previous study, it was showed that cytosolic renal TrxR1 activity of rats increased after acute and long-term exposure to Pb and this was the only parameter that changed after both exposures to low Pb doses. Then, it was suggested that TrxR1 could operate in the early defense against Pb toxicity and it could also be used as a bioindicator of early effects of Pb. Thus, the main objective of this thesis was to investigate the role of thioredoxin system in Pb-induced changes, evaluating: I) in vitro the activity of purified TrxR1, as well as the activity and the protein expression of TrxR1 and Trx1 in renal HEK 293 culture cells exposed to Pb; II) in vivo, the effects of Pb exposure in rats and in occupationally-exposed humans on renal (only in rats) and blood TrxR1 activity (both rats and humans), comparing these effects to oxidative stress parameters, as well as to classical bioindicators of Pb effect and exposure. The results of the in vitro study showed that lead is a less potent inhibitor of the purified TrxR1 activity (IC50 = 0.27 TM) than its structural homologous glutathione reductase (IC50 = 0.048 TM). TrxR1 inhibition was independent on the selenocysteine residue of the active site and was reversible by bovine serum albumin and by the EDTA chelating. TrxR1 inhibition also occurred in HEK 293 cells exposed to the highest Pb acetate concentration (60 TM), without alterations in protein expression. However, under glutathione (GSH) depletion after pre-incubation of cells with L-buthionine-[S,R]-sulfoximine (BSO) and further exposure to Pb, the activity and expression of both TrxR1 and Trx1 increased in the absence of cytotoxicity and of changes in GR and glutathione S-transferase activities, which indicates Trx system as an important protective mechanism against Pb toxic effects in GSH-depleted cells. On the other hand, blood TrxR1 activity did not change either after acute exposure of rats or long-term exposure of humans to Pb. However, the increase of renal TrxR1 activity in rats exposed to the highest dose of Pb acetate (25 mg/kg) occurred concomitantly with the increase of blood and renal Pb levels over time (6, 24 e 48 h), whereas the erythrocyte δ-ALA-D inhibition, which is a classical indicator of Pb effects, occurred after 6 h of exposure and the activity was further recovered (at 24 and 48 h). Moreover, the increase of renal TrxR1 activity occurred without renal histopathologycal damage, which corroborates the increase of this enzyme as an early event of Pb toxicity. Overall, the results of the current study point out the thioredoxin system as a target for Pb, but mainly as a protective mechanism against Pb toxicity. However, the absence of changes in blood TrxR1 activity in Pb-exposed animals and humans indicates that this enzyme is not an appropriate bioindicator of the toxic effects of Pb in exposed populations. / O estresse oxidativo é um importante mecanismo molecular da toxicidade do chumbo (Pb). O sistema da tiorredoxina (selenoenzima tiorredoxina redutase -TrxR, proteína tiorredoxina -Trx e NADPH) é essencial na defesa antioxidante e no controle redox celular. Em nosso estudo prévio, foi demonstrado que a atividade da enzima TrxR1 (citosólica) renal de ratos aumentou na exposição aguda e prolongada ao Pb, sendo o único parâmetro alterado em ambas exposições a doses baixas de Pb. Assim, foi sugerido que a TrxR1 atuaria precocemente na defesa contra a toxicidade do metal, podendo também ser utilizada como um bioindicador dos efeitos precoces do Pb. Assim, o objetivo geral desta tese foi investigar o papel do sistema da tiorredoxina nas alterações induzidas pelo Pb, avaliando: I) in vitro a atividade da TrxR1 purificada, bem como a atividade e expressão protéica da TrxR1 e Trx1 em culturas de células renais HEK 293 expostas ao Pb e II) in vivo, os efeitos do Pb em ratos e em humanos ocupacionalmente expostos ao Pb sobre a atividade da TrxR1 renal (somente em ratos) e sanguínea (ratos e humanos), comparando esses efeitos com parâmetros de estresse oxidativo, bem como com indicadores clássicos de efeito e de exposição ao Pb. Os resultados do estudo in vitro mostraram que a atividade da enzima TrxR1 purificada foi inibida pelo Pb (IC50 = 0.27 TM) de forma menos potente que a sua homóloga estrutural glutationa redutase (IC50 = 0.048 TM). Essa inibição foi independente do resíduo de selenocisteína do sítio ativo da TrxR1 e foi revertida pela albumina sérica bovina e pelo quelante EDTA. A inibição da TrxR1 também ocorreu em células HEK 293 expostas à maior concentração de acetato de Pb (60 TM), sem alterações na expressão protéica. Entretanto, quando os níveis celulares de glutationa (GSH) foram depletados por pré incubação das células com L-butionina-[S,R]-sulfoximina (BSO) e posterior exposição ao Pb, a atividade e a expressão da TrxR1 e da Trx1 aumentaram na ausência de citotoxicidade e de alterações nas atividades da GR e glutationa S-transferase, apontando esse sistema como um importante mecanismo contra a toxicidade do Pb em células sob depleção de GSH. Por outro lado, a atividade da TrxR1 sanguínea não alterou na exposição aguda de ratos e prolongada de humanos ao Pb. No entanto, o aumento da atividade da TrxR1 renal em ratos expostos à maior dose de acetato de Pb (25 mg/kg) foi concomitante com o aumento dos níveis sanguíneos e renais de Pb ao longo do tempo (6, 24 e 48 h), enquanto que a inibição da enzima δ-ALA-D eritrocitária, um indicador clássico de efeito do Pb, ocorreu após 6 h de exposição, sendo sua atividade restabelecida posteriormente (24 e 48 h). Além disso, o aumento da atividade da TrxR1 renal ocorreu sem danos histopatológicos renais, confirmando essa alteração como um evento precoce da toxicidade do Pb. Em geral, os resultados do presente estudo apontam o sistema da tiorredoxina como alvo do Pb, mas principalmente como um mecanismo de proteção contra o metal. Entretanto, a ausência de alterações na atividade da TrxR1 sanguínea em animais e humanos expostos ao Pb, indica que essa enzima não é um bioindicador adequado dos efeitos tóxicos do Pb em populações expostas.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Muitas das proteínas de valor biomédico relevante são encontradas em baixas concentrações em suas fontes nativas. O alto nível de expressão de proteínas recombinantes em E. coli, muitas vezes gera o acúmulo de proteínas como agregados insolúveis no citoplasma e/ou periplasma da bactéria, denominados de corpos de inclusão (CI). A alta pressão tem sido amplamente utilizada no estudo da conformação das proteínas,ela modula as interações proteína-proteína e proteína-solvente através de mudanças no volume das mesmas, promovendo a entrada de água nas cavidades não expostas da molécula e promovendo hidratação e solubilização dos agregados. O presente trabalho teve como objetivo a renaturação de proteínas recombinantes expressas como CI em Escherichia coli usando alta pressão hidrostática como condição branda de dissociação dos agregados. As tiorredoxinas TsnC e TrxA, a proteína YbbN e a proteína comigratória com bacterioferritina (Bcp), todas de Xylella fastidiosa, foram estudadas neste trabalho. As condições de renaturação foram otimizadas, utilizando-se diferentes proporções do par redox, concentrações de GdnHCl, presença de aditivos e esquemas de descompressão. Para a quantificação e análise da eficácia do processo de renaturação das proteínas sob pressão foram utilizadas as técnicas de microscopia eletrônica de varredura dos CI e de SDS-PAGE, e ensaios de atividade enzimática das proteínas. A TsnC foi renaturada em Tris HCl 50 mM com proporção de 10GSH:1GSSG em concentração final de 10 mM, 0,75 M GdnHCl, na presença de 0,5 M de Triton-X e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. O rendimento final de obtenção de TsnC solúvel foi altíssimo, de até 89,9%. A renaturação de proteína YbbN, nunca antes descrita, foi obtida em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, na presença de 0,5 M de L-Arginina e a pressão utilizada foi de 2,4 kbar por 1 hora e 30 minutos seguida de descompressão direta e incubação por 16 horas em pressão atmosférica. A proteína YbbN, que apresentou atividade de tioredoxina, foi renaturada com rendimento de até 98% a partir da proteína insolúvel nos CI. Foi possível a solubilização da tiorredoxina TrxA e Bcp sob alta pressão hidrostática em tampão de renaturação Tris HCl 50 mM, utilizando diferentes proporções do par redox na concentração final de 10 mM e 1,5 M de GdnHCl, porém não foi possível obter a atividade biológicas destas proteínas. Mostramos também que a L-Arginina apresenta efeito auxiliar na solubilização dos CI induzida pela alta pressão, e ao mesmo tempo se mostrou altamente protetora contra a inativação da atividade da YbbN promovida pela incubação em altas temperaturas, o que sugere que a presença deste aminoácido pode ter alta aplicabilidade juntamente com a aplicação de altas pressões para elevar os rendimentos de renaturação de proteínas recombinantes a partir de CI. / Many of the relevant proteins are found in low concentrations in their native sources. The high level expression of recombinant heterologous proteins in Escherichia coli often causes their accumulation as insoluble aggregates in the cytoplasm or periplasm of bacteria in a mainly inactive form, known as inclusion bodies (IB). The high pressure has been widely used to study the conformational states of proteins. It modulates the protein-protein and protein-solvent interactions by changing the volume of the system, promoting the entrance of water into the cavities unexposed to water, exposing hydrophobic regions and promoting solubilization of the aggregates. The present study aimed to refold recombinant proteins expressed in E. coli as IB using high hydrostatic pressure as a mild condition for IB dissociation. The thioredoxins TsnC, TrxA and Ybbn and the protein comigratory with bacterioferritin (Bcp) of Xylella fastidiosa were studied in this work. The conditions for refolding were optimized for proportions of the redox pair, GdnHCl concentration, presence of additives and schemes for decompression. To analyze the effectiveness of the process of refolding under pressure we have used, scanning electron microscopy of the IB and SDS-PAGE and enzymatic activity assays for quantification and analysis of the solubilized proteins. The TsnC was renatured in 50 mM TrisHCl at a ratio of 10GSH: 1GSSG in 10 mM final concentration, 0.75 M GdnHCl in the presence of 0.5M Trito X-100 and application of 2.4 kbar for 1.5 hours, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. The final yield of soluble and biological active TsnC was very high, up to 89,9%. The refolding of protein YbbN was obtained by application of 2.4 kbar for 1.5 h to an IB suspension in buffer 50 mM Tris HCl, in the presence of 0.5 M L-arginine, followed by direct decompression and incubation for 16 h at atmospheric pressure. We also show that L-arginine had a highly protective effect on the inactivation of biological activity of YbbN promoted by incubation at high temperatures.The final yield of refolded YbbN, that present thioredoxin activity, was also very high: 98%. TrxA and Bcp thioredoxins were solubilized at 2.4 kbar and step decompression. However, these proteins did not present biological activity. We also show that L-arginine has an auxiliary effect on the solubilization of IB induced by high pressure, while its presence proved highly protective against inactivation of the enzymatic activity promoted by incubation at high temperatures. These results suggest that the presence of this amino acid can have high applicability to increase the yield of refolding of recombinant proteins from the IC at high pressure.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methylmercury (MeHg) is an important environmental toxicant that may cause irreversible neurobehavioral and neuropsychological disorders in humans and experimental animals. The major mechanisms of MeHg-induced toxicity currently being explored are the disruption of intracellular calcium homeostasis, the induction of oxidative stress, inhibition of neuronal Na+/K+ -ATPase activity and change the status of antioxidant systems. In addition, recent data reported the involvement of MeHg toxicity with damage in thioredoxin system. On the other hand, flavonoids have been reported to possess divalent metal chelating properties, antioxidant activities and to readily permeate the blood brain barrier. They can also provide neuroprotection in a wide array of cellular and animal models of neurological diseases, including protection against MeHg toxicity. However, the exact mechanism of MeHg toxicity remain unclear and limited data on the interaction of MeHg with flavonoids are avaliable in literature. In view of this, our study evaluated the mechanisms of MeHg toxicity in vivo and in vitro models and evaluated the performance of different flavonoids: quercetin, quercitrin and rutin in diferent models of MeHg toxicity. Our study showed that MeHg (100 μM) caused lipid peroxidation and reactive oxygen species (ROS) generation in brain cortical slices. Quercitrin and quercetin protected against this toxicity and mitochondria from MeHg (5 μM)-induced ROS generation. In contrast, rutin did not afford a significant protective effect against MeHg (100 μM)-induced lipid peroxidation and ROS production in cortical brain slices. MeHg-generated ROS in cortical slices was dependent upon an increase in intracellular calcium levels. In vivo studies with mice treated during 30 days with MeHg (5mg/Kg) orally, presented a marked increase in toxicity parameters (loss in body weight gain, increased in micronucleis frequencies, nefrotoxicity), decrease in motor system performance (locomotor activity and motor coordination) and spatial memory deficiency as well as alteration in some biochemical parameters (decrease in glutathione peroxidase and Na+/K+ ATPase activity, increase in lipid peroxidation). The co-treatment with quercitrin (10mg/kg) intraperitoneally, decreased the behavior alterations manly by decreased lipid peroxidation levels, maintained the Na+/K+ ATPase and GPx activities. In addition, our study demonstrated, for the first time, that MeHg inhibited the activity of thioredoxin reductase. A single oral MeHg administration (1, 5 and 10 mg/Kg) caused a marked inhibition of kidney TrxR, while in liver a significant inhibition was observed after exposure to 5 and 10 mg/Kg of MeHg (TrxR was determined 24 hours after MeHg). In brain, MeHg did not inhibit TrxR. In vitro results demonstrated that MeHg inhibited brain (0.05 1 μM) , liver (0.05 1 μM) and kidney (0.025 1 μM) TrxR in a dose dependent manner Here, we have extended the characterization of mechanisms associated with the neuroprotective effects of flavonoids quercetin and quercitrin against MeHg-induced toxicity. In addition, we provided novel data establishing that (1) calcium plays a central role in MeHg toxicity, (2) in brain slices MeHg induces mitochondrial oxidative stress both via direct interaction with mitochondria as well as via mitochondria- indirect mechanisms. In addition (3) MeHg (5mg/kg) caused a number of behavioural alterations that are related with an inhibition of cerebelar and cerebral GPx and Na+/K+ ATPase activities and (4) increased in lipid peroxidation.The higly affinity of MeHg to selenol groups of endogenous molecules can lead to (5) inhibition of thioredoxin reductase that can contribute to MeHg toxicity. We conclude that MeHg lead to increase in mitochondria ROS generation that contributes to increase in lipid peroxidation. In addition, the inhibition of important antioxidant enzymes such as GPx ans TrxR can contribute to oxidative damage that can be related to development of behavioral damage. In this view the antioxidant activity of flavonoids quercetin and quercitrin seems to be direct associate with the capacity of flavonoids to confere protection against MeHg toxicity. / O metilmercúrio (MeHg) é um importante agente tóxico ambiental que pode causar desordens neurocomportamentais e neurofisiológicas irreversíveis em humanos e animais experimentais. Os principais mecanismos pelos quais o MeHg induz toxicidade são: a ruptura na homeostase do cálcio intracelular, a indução de estresse oxidativo, a inibição da atividade da Na+/K+ ATPase neuronal e mudanças nos níveis das enzimas antioxidantes. Adicionalmente, dados recentes relatam o envolvimento do sistema da tiorredoxina como um dos alvos de toxicidade do MeHg. Por outro lado, os flavonóides possuem propriedades quelantes para metal divalente, atividade antioxidante e são permeáveis a barreira cérebro-sangue. Além disso, eles podem oferecer neuroproteção a uma variedade de modelos animais e celulares de doenças neurológicas, incluindo proteção contra a toxicidade do MeHg. Considerando que o exato mecanismo pelo qual o MeHg exerce toxicidade permanece desconhecido e que poucos e controversos dados sobre a interação do MeHg com flavonóides são encontrados na literatura, este estudo avaliou os mecanismos de toxicidade do MeHg em modelos in vitro e in vivo bem como, o desempenho de diferentes flavonóides: quercetina, quercitrina e rutina em diferentes modelos de toxicidade induzidos pelo MeHg. Nosso estudo mostrou que o MeHg (100μM) causou aumento na peroxidação lipídica e na produção de espécies reativas de oxigênio (EROs) em fatias de córtex de ratos. Os flavonóides quercitrina (25 μg/mL) e quercetina (5, 10 e 25 μg/mL) protegeram contra esta toxicidade, e contra o aumento de ERO produzidas pelo MeHg (5μM) nas mitocôndrias. Diferentemente, o flavonóide rutina não obteve efeito protetor contra a indução da peroxidação lipídica e produção de ERO induzidas pelo MeHg em fatias corticais de cérebro. O aumento na produção de ERO, geradas pelo MeHg, foi dependente do aumento dos níveis intracelulares de cálcio (artigo 1). Já, estudos in vivo com camundongos tratados oralmente com MeHg (5mg/kg), durante 30 dias, mostraram um marcado aumento nos parâmetros de toxicidade (diminuição no ganho de peso, aumento na freqüência de micronúcleos e nefrotoxicidade), diminuição no desempenho do sistema motor (atividade locomotora e coordenação motora), e deficiência na memória espacial, bem como alterações em vários parâmetros bioquímicos (diminuição na atividade da glutationa peroxidase (GPx) e Na+/K+ ATPase e aumento na peroxidação lipídica). O co-tratamento com quercitrina (10mg/kg) pela via intraperitoneal, diminuiu as alterações comportamentais principalmente por diminuir os níveis de peroxidação lipídica e manter a atividade da GPx e da Na+/K+ ATPase iguais aos níveis do controle (manuscrito 1). Além disso, nosso estudo demonstrou, pela primeira vez, que o MeHg inibe a atividade da tiorredoxina redutase (TrxR). Uma única administração oral de MeHg (1, 5, 10 mg/kg), causou uma marcada inibição na atividade da TrxR renal, enquanto no fígad observou-se uma inibição significativa após exposição a 5 e 10 mg/kg (a atividade da TrxR foi determinada 24 horas após a administração de MeHg). No cérebro, o MeHg não inibiu a atividade da TrxR in vivo (artigo 2). Já os resultados in vitro revelaram que o MeHg causou uma inibição concentração dependente na atividade da enzima TrxR isolada de cérebro (0,05 1 μM) fígado (0,05 - 1 μM) e rim (0,025 1 μM). Assim, nós ampliamos a caracterização dos mecanismos associados com os efeitos neuroprotetores dos flavonóides quercetina e quercitrina na toxicidade induzida pelo MeHg. Adicionalmente, outros dados sobre a toxicidade do MeHg, foram obtidos, tais como: (1) o cálcio desempenha um papel central na toxicidade do MeHg, (2) em fatias de cérebro de ratos o MeHg induz estresse oxidativo mitocondrial via interação direta com as mitocôndrias, bem como via mecanismos mitocondriais indiretos. Além disso, (3) o MeHg (5mg/kg) pode levar a inúmeras alterações comportamentais que podem estar relacionadas à inibição da atividade das enzimas GPx e Na+/K+ ATPase e (4) aumento na peroxidação lipídica. A alta afinidade do MeHg por grupos selenóis das moléculas endógenas pode levar (5) a inibição da TrxR o que pode contribuir para a toxicidade do MeHg. Podemos concluir que o MeHg leva a um aumento na produção de ERO pelas mitocôndrias, o que contribui para um aumento na peroxidação lipídica induzida pelo MeHg. Além disso, a inibição de importantes enzimas antioxidantes como a GPx e a TrxR podem contribuir para aumentar o dano oxidativo, que parece estar relacionado com o aparecimento dedanos comportamentais. Desta forma a atividade antioxidante dos flavonóides quercetina e quercitrina parece estar diretamente associada à capacidade destes compostos emproteger contra a toxicidade do MeHg.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The antioxidant properties of selenium organic compounds have been largely investigated in the last decades, especially because the oxidative stress is directly related to various chronic-degenerative deseases. However, a few studies verify the action of nucleophlilic or electrophilic radicals on the protective activity of selenium compounds. In this work, it was evaluated the influence of different substituent radicals on the antioxidant activities of β-selenoamines. The capacity of β-selenoaminas in mimicry the glutathione peroxidase (GPx) activity and/or be substrate to the hepatic thioredoxinereductase (TrxR) enzyme were also investigated in experimental modelsin vitro.In DPPH assay, the β-selenoamines tested did not show antioxidant activity when compared to acorbic acid (AA). However, similar to compound (PhSe)2, the β-selenoamines with p-methoxy and tosylradicals were effective in preventing the lipid peroxidation induced by Fe2SO4. The compounds with other radicals did not exhibit the same activity. The β-selenoamine with the substituent group p-methoxy also showed mimetic activity to GPx and was reduced by hepatic TrxR. Furthermore, a positive correlation was observed among these parameters to β-selenoamines, which was not found in the results obtained with (PhSe)2. The data of this work show the influence of different substituent radicals on activity of organic selenium compounds and point the use of β-selenoaminas as pharmacological promissor compounds in in vivo experimental models. / As propriedades antioxidantes de compostos orgânicos de selênio têm sido amplamente investigadas nas últimas décadas, especialmente pelo fato do estresse oxidativo estar diretamente relacionado a uma grande variedade de doenças crônico-degenerativas. Contudo, poucos estudos têm verificado a ação exercida por radicais nucleofílicos ou eletrofílicos na atividade protetora de compostos de selênio. Neste trabalho foi avaliada a influência de diferentes radicais substituintes sobre a atividade antioxidante de β-selenoaminas. A capacidade das β-selenoaminas em mimetizar a atividade da glutationa peroxidase (GPx) e/ou serem substratos para a enzima tiorredoxina redutase hepática (TrxR) também foram investigadas em modelos experimentais in vitro. No ensaio de DPPH , as β-selenoaminas testadas não apresentaram atividade antioxidante quando comparadas ao ácido ascórbico (AA). Contudo, assim como o composto disseleneto de difenila (PhSe)2, as β-selenoaminas com grupos p-metóxi e tosil na estrutura foram efetivas em prevenir a peroxidação lipídica induzida por Fe2SO4. Os compostos com outros radicais não apresentaram a mesma atividade. A β-selenoamina com o grupo substituinte p-metóxi também apresentou atividade mimética à GPx e foi reduzida pela TrxR hepática. Além disso, uma correlação positiva foi encontrada entre estes parâmetros para as β-selenoaminas; o que não foi observado quando considerados os resultados obtidos com o composto (PhSe)2. Os dados do presente trabalho mostram a influência de diferentes radicais substituintes na atividade de compostos orgânicos de selênio, bem como, aponta o uso de β-selenoaminas como compostos promissores farmacologicamente em modelos experimentais in vivo.

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Os compostos foram avaliados quanto à citotoxicidade em três linhagens de células tumorais e uma linhagem normal, sendo determinada a concentração inibitória de cinquenta por cento da viabilidade celular (CI50) e o índice de seletividade (IS). Uma das mais importantes aplicações de complexos metálicos na clínica médica é no tratamento do câncer como é o caso da Cisplatina [(cis-diamindicloroplatina(II)] e seus derivados. Entretanto, existem problemas associados ao seu uso, especialmente a resistência celular desenvolvida por alguns tipos de tumor e os graves efeitos colaterais, que geram uma demanda por compostos mais ativos contra o câncer e menos tóxicos para o paciente. Dentro deste contexto, a busca por complexos contendo diferentes metais que possibilitem novos alvos celulares surgiu como forma de contornar tais problemas. A ação de complexos com platina ocorre preferencialmente sobre o DNA enquanto a ação do ouro está relacionada à inibição da enzima TrxR que participa do balanço redox intracelular. Com o intuito de potencializar a ação dos complexos de ouro(I) selecionamos os ligantes derivados do adamantano com anel heterocíclico oxadiazol ou tiazolidina e fosfinas (alifáticas ou aromáticas) que estão presentes em substâncias bioativas. Os compostos sintetizados foram caracterizados por CHN, RMN 1H e 13C, IV, Raman, TG além de difração de raios X por monocristal no caso dos ligantes e do complexo 1 {trifenilfosfino[5-adamantil-1,3,4-oxadiazol-2-tiolato(κS)]ouro(I)}. Todos os complexos foram mais ativos sobre as células tumorais que os ligantes livres e foram mais eficientes e seletivos do que a Cisplatina para a linhagem de células de melanoma (B16-F10). O complexo 4 {Cloreto de trietilfosfino[(metil-1-adamantano)1,3-tiazolidina-2- tiona(κS)]ouro(I)} apresentou valores de CI50 próximos a Auranofina [2,3,4,6-tetra-o-acetil-1- tio-β-D-glicopiranosato-trietilfosfinouro(I)] e maior seletividade. Quanto a capacidade de inibição da enzima TrxR, os complexos com trietilfosfina foram mais eficientes, alcançando porcentagem de inibição próxima a da Auranofina. Notamos uma relação entre a capacidade de inibição da TrxR e a citotoxicidade, o que sugere o mecanismo de ação destes compostos de ouro via inativação da enzima. Dessa forma, o presente trabalho apresenta uma importante contribuição para a química de coordenação dos complexos de ouro(I). / This work describes the synthesis, characterization, cytotoxic activity and potential inhibition of thioredoxin reductase (TrxR) of four new gold (I) complexes with novel ligands derived from adamantine, 1,3,4-oxadiazole or 1,3-thiazolidine-2-thionering and alkyl or aryl phosphines. The cytotoxicity of compounds was investigated in three tumor cell lines and one normal cell to determine the inhibitory concentration of fifty percent of cell viability (IC50) and selectivity index (SI). One of the most important applications for metal complexes such as Cisplatin [cis-diamindichloroplatinum(II)] and derivatives is in cancer treatment. However, there are several problems associated with their use, especially cellular resistance, developed by some tumor cells, and serious side effects. Those problems create a demand for new compounds more active against cancer and less toxic to patient. In this context, the search for complexes with other metals that present different cellular targets appeared to circumvent such problems. The action of platinum complexes occurs preferentially on DNA while the gold action is related to the inhibition of the enzyme TrxR which participates in intracellular redox balance. To enhance biological activity of gold complexes we prepared ligands containing adamantane with heterocyclic ring oxadiazole or thiazolidine and phosphines (trimethyl or triphenyl) which are present in bioactive substances. The synthesized compounds were characterized by CHN, 1H and 13C NMR, IR, Raman, TG and X-ray diffraction for ligands and complex 1 {triphenylphosphin[5-adamantyl-1,3,4-oxadiazole-2- thiolate(κS)]gold(I)}. All complexes were more active against tumor cells compared to the free ligands and more efficient and selective than cisplatin for melanoma cell line (B16-F10). The complex 4 {Triethylphosphine chloride[(metyl-1-adamantane)1,3-thiazolidine-2- thione(κS)]gold(I)} showed IC50 values near Auranofin [2,3,4,6-tetra-o-acetyl-1-thio-β-Dglycopyranosate- trietylphosphingold(I)] and higher selectivity. The ability to inhibit TrxR was most relevant for the complexes with ethyl phosphine reaching the inhibition promoted by Auranofin. We have observed a relationship among the capacity to inhibit TrxR, structure and cytotoxicity which contributes to confirm the mechanism of action for gold compounds. Thus, this study is an important contribution to the coordination chemistry of gold(I) complexes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The diphenyl ditelluride (PhTe)2 is one of the most toxic organic compounds of tellurium which can make their use unsafe. The mechanism(s) involved in (PhTe)2 toxicity is(are) elusive, but thiol oxidation of critical proteins are important targets. Consequently, the possible remedy of its toxicity by thiol-containing compounds is of experimental and clinical interest. Therefore, this study aimed to evaluate the toxicity of in vivo exposure to (PhTe)2 from oxidative stress biomarkers and behavioral parameters in adult mice and the possible protective effect of N-acetylcysteine (NAC). They evaluated parameters of oxidative stress and behavior in mice. In order to alleviate the toxicity, NAC was administered before (3 days) and simultaneously (PhTe)2 (7 days). Mice were separated into six groups receiving daily injections of (1) Potassium phosphate buffer (TFK) (2.5 ml/kg, intraperitonealy (i.p.)) plus canola oil (10 ml/kg, subcutaneously (s.c.)), (2) NAC (100 mg/kg, i.p.) plus canola oil s.c., (3) TFK i.p. plus (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), (4) TFK i.p. plus (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.), (5) NAC plus (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), and (6) NAC plus (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.). Treatment with (PhtE) started on day 2 of treatment with NAC. The results demonstrate that (PhTe)2 induced behavioral changes in locomotor activity at a concentration of 50 μmol/kg and NAC did not change the effect of (PhTe)2. Motor coordination and lift the bar were compromised and both showed severe motor abnormalities in test animals independent of concentration of (PhTe)2 . The (PhTe)2 also inhibited important selenoenzymes, thioredoxin reductase (at concentrations of 10 μmol/kg and 50 μmol/kg) and glutathione peroxidase (at concentration of 10 μmol/kg) but produced little or no effect on the antioxidant activity of catalase and glutathione reductase. Contrary to expectation, the co-administration of NAC did not protect against deleterious effects (PhTe)2. It was possible to establish high sensitivity of brain tissue compared to the damage (PhTe)2. Other low molecular weight thiols must be investigated to determine whether they may or may not be effective against ditellurides. / O ditelureto de difenila (PhTe)2 é um dos compostos orgânicos de telúrio mais tóxicos, o que pode tornar seu emprego pouco seguro. O mecanismo envolvido na toxicidade do (PhTe)2 ainda é incerto, mas a oxidação de tióis em proteínas são alvos importantes. A partir disso, compostos contendo tiol possívelmente poderiam solucionar ou minimizar a sua toxicidade. Portanto, este estudo teve como objetivo avaliar a toxicidade da exposição in vivo ao (PhTe)2 a partir de biomarcadores de estresse oxidativo e parâmetros comportamentais em camundongos adultos e o possível efeito protetor da N-acetilcisteína (NAC). Foram avaliados parâmetros de estresse oxidativo e comportamentais em camundongos. A fim de mitigar a toxicidade, foi administrado NAC antes (3 dias) e, simultaneamente ao (PhTe)2 (7 dias). Os camundongos foram separados em seis grupos que receberam injeções diárias de (1) Tampão fosfato de potássio (TFK) (2.5 ml/kg, intraperitonealmente (i.p.)) mais óleo de canola (10 ml/kg, subcutaneamente (s.c.)), (2) NAC (100 mg/kg, i.p.) mais óleo de canola s.c., (3) TFK i.p. mais (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), (4) TFK i.p. mais (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.), (5) NAC mais (PhTe)2 (10 μmol/kg, s.c.), e (6) NAC mais (PhTe)2 (50 μmol/kg, s.c.). O tratamento com (PhTe)2 começou no quarto dia de tratamento com NAC. Os resultados demonstram que (PhTe)2 induziu alterações comportamentais na atividade locomotora na concentração de 50 μmol/kg e a NAC não modificou o efeito do (PhTe)2. A coordenação motora e a força de sustentação na barra foram comprometidas e ambas revelaram alterações motoras graves nos animais testados independente da concentração de (PhTe)2. O (PhTe)2 também inibiu selenoenzimas importantes, tiorredoxina redutase (nas concentrações de 10 μmol/kg e 50 μmol/kg) e glutationa peroxidase (na concentração de 10 μmol/kg), mas produziu mínimo ou nenhum efeito sobre a atividade antioxidante da catalase e glutationa redutase. Contrariamente ao esperado, a co-administração com NAC não protegeu contra os efeitos deletérios do (PhTe)2. Foi possível estabelecer grande sensibilidade do tecido cerebral frente aos danos causados pelo (PhTe)2. Outros tióis de baixo peso molecular devem ser investigados para determinar se eles podem ou não ser eficazes contra diteluretos.