La nefropatia diabètica és una complicació secundària greu de la diabetis i es desenvolupa en el 35% d'aquests pacients. Estudis d'agrupació familiar han suggerit que aquesta malaltia podria estar subjecta a un component genètic.Aquesta tesi s'ha centrat en l'estudi de la influència de 6 polimorfismes de gens del sistema renina-angiotensina amb la progressió de la nefropatia, i amb la mortalitat en diàlisi de pacients diabètics de tipus 2. També s'ha inclòs un estudi preliminar que explora la relació entre els polimorfismes i la instauració de la nefropatia.La classificació genotípica dels pacients s'ha dut a terme mitjançant la tècnica de PCR-RFLP o bé PCR a temps real. S'han genotipat els següents polimorfismes: I/D del gen que codifica per l'enzim convertidor d'angiotensina I (ACE1), p.M235T del gen que codifica per l'angiotensinogen (AGT), g.1166A>C del gen que codifica pel receptor d'angiotensina II de tipus 1 (AGTR1), c.186+2053G>A, c.439+4C>T i c.1542-361C>G del gen que codifica per l'enzim convertidor d'angiotensina I de tipus 2 (ACE2).La influència dels polimorfismes sobre la mortalitat en diàlisi s'ha estudiat mitjançant una anàlisi de la supervivència amb models de regressió de Cox multivariant amb 100 pacients diabètics de tipus 2 que havien iniciat tractament amb diàlisi al nostre centre hospitalari. A la regressió de Cox individual de cada polimorfisme, l'I/D de l'ACE1 i el p.M235T de l'AGT van presentar efectes significatius sobre la mortalitat. Concretament el genotip DD va explicar un augment del risc de mortalitat de 3,5 (1,3 - 9,9) vegades el dels pacients II, i el genotip MM al seu torn va explicar un augment del risc de mortalitat de 3,8 (1,2 - 12,4) vegades el dels pacients TT. En l'estudi conjunt dels polimorfismes es va observar que el nombre d'al·lels D (I/D), M (p.M235T) i G (c.186+2053G>A) que tenia un pacient determinava de forma estadísticament significativa un increment del risc de morir (p=0,002) de tal forma que els pacients amb els sis al·lels de risc tenien una probabilitat de morir 11 vegades superior als que no en tenien cap. La influència dels polimorfismes sobre la progressió de la nefropatia una vegada ja establerta es va estudiar mitjançant models de Cox i de regressió lineal multivariant amb 320 pacients diabètics de tipus 2 diagnosticats d'insuficiència renal crònica d'estadis 1-3. Pel que fa a l'estudi individual dels polimorfismes, es va observar una relació estadísticament significativa entre el pendent de disminució d'MDRD i els polimorfismes p.M235T de l'AGT, c.186+2053G>A i c.1542-361C>G de l'ACE2 -els dos darrers únicament en els homes-. Aquesta relació va ser encara més intensa amb els pacients amb velocitat de filtració glomerular encara conservada (> 60 mL/min/1,73 m2) a la primera visita. L'estudi conjunt dels polimorfismes va mostrar que la combinació d'al·lels que millor estimava la progressió de la nefropatia (p=0,0005) era la formada per D (I/D), M (p.M235T) i A (c.186+2053G>A). El fet de tenir els 6 al·lels de risc respecte no tenir-ne cap, explicava una pèrdua anual de la velocitat de filtració glomerular de -5,2 mL/min/1,73 m2.Finalment, la influència dels polimorfismes sobre l'establiment de la nefropatia es va estudiar mitjançant models de regressió logística multivariant amb 227 casos i 69 controls. No es va poder evidenciar cap efecte genètic en la instauració de la nefropatia.Els resultats presentats en aquesta tesi posen de manifest que els polimorfismes I/D, p.M235T, c.186+2053G>A i en menor importància c.1542-361C>G actuen conjuntament influint en la mortalitat dels pacients diabètics de tipus 2 en diàlisi i en la progressió de la nefropatia. Per contra, no hem pogut demostrar que estiguin relacionats en la susceptibilitat a desenvolupar la nefropatia. / Diabetic nephropathy is a severe secondary complication of diabetes that is developed in 35% of these patients. Studies of family association have suggested that this illness could be subject to a genetic component.This thesis studies the influence of 6 polymorphisms of the renin-angiotensin system genes on the progression of the nephropathy, and mortality in dialysis of type 2 diabetic patients. It has also been included a preliminary study that explores the relationship between these polymorphisms and the development of nephropathy.The genotypic classification of the patients has been carried out through PCR-RFLP or real time PCR. The following polymorphisms have been genotyped: I/D of the angiotensin-converting enzyme gene (ACE1), p.M235T of the angiotensinogen gene (AGT), g.1166A>C of the type1 angiotensin II receptor type 1 gene (AGTR1) and c.186+2053G>A, c.439+4C>T and c.1542-361C>G of the angiotensin-converting enzyme 2 gene (ACE2).The influence of these polymorphisms on mortality in dialysis has been studied through Cox regression analysis with 100 type 2 diabetic patients that began dialysis in our Hospital. The individual Cox regressions of each polymorphism, I/D (ACE1) and p.M235T (AGT) showed significant effects on mortality. Specifically, DD genotype explained an increased mortality risk of 3,5 (1,3 - 9,9) times that of II patients, and MM genotype explained an increased mortality risk of 3,8 (1,2 - 12,4) times that of TT patients. In the combined study of polymorphisms it was observed that the number of D (I/D), M (p.M235T) and G (c.186+2053G>A) alleles that a patient carries determined the mortality risk (p=0,002): patients with the six risk-alleles had a probability of death 11 times that of those patients without any risk-allele.The influence of the polymorphisms on nephropathy progression was studied through Cox and linear regression multivariate analysis with 320 type 2 diabetic patients diagnosed of chronic kidney disease from stages 1 to 3. Regarding the individual study of polymorphisms, a statistically significant relationship was observed between the glomerular filtration rate slope decrease and p.M235T (AGT), c.186+2053G>A and c.1542-361C>G (ACE 2). This relationship was still more intense with patients that presented with a preserved glomerular filtration rate (> 60 mL/min/1,73 m2) in their first visit. The combined study of polymorphisms showed that the combination of D (I/D), M (p.M235T) and T (c.186+2053G>A) alleles best predicted progression (p=0,0005): patients with the six risk alleles had an annual loss of glomerular filtration rate of -5,2 mL/min/1,73 m2 with respect to those patients without any risk-allele.Finally, the influence of the polymorphism on the development of nephropathy was studied through multivariate logistical regression analysis with 227 cases and 69 controls. No genetic effect was found.The results presented in this thesis bring to light that I/D, p.M235T, c.186+2053G>A and c.1542-361C>G polymorphisms act together influencing on the mortality of type 2 diabetic patients in dialysis and in nephropathy progression. In return, we have not been able to prove their relationship with the development of nephropathy.

La diabetis tipus 1 (DT1) és una malaltia autoimmunitària produïda per una destrucció selectiva de les cèl.lules β dels illots de Langerhans pancreàtics, productores d'insulina. La seva etiologia és desconeguda, però se sap que hi intervenen factors de susceptibilitat genètica, factors ambientals i estocàstics. En els darrers anys s'han identificat algunes alteracions immunològiques en pàncrees de pacients amb DT1, com la presència d'un infiltrat leucocitari als illots. L'estudi d'aquests processos ha estat dificultat per la manca d'accés al teixit pancreàtic i per tant, les característiques de l'autoimmunitat en la DT1 es basen en un nombre limitat d'observacions. En aquesta Tesi Doctoral es descriuen els perfils d'expressió gènica d'una col.lecció generada pel nostre grup de mostres pancreàtiques de pacients en diferents fases de progressió de la malaltia -inici clínic, inici recent i cronificació-. Els perfils descrits mitjançant microarrays demostren l'augment d'expressió de gens del sistema immunitari, destacant les vies de presentació antigènica, molècules d'adhesió, resposta humoral, factors inflamatoris i de la immunitat innata i gens amb funció immunoreguladora. Les dades posen de manifest la persistència de la resposta inflamatòria i immunitària al llarg dels anys, essent més prominent en pàncrees total que en illots purificats. El teixit exocrí presenta una reducció de trànscrits a l'inici clínic i una afectació inflamatòria. Als illots, a més de la reducció de trànscrits propis de cèl.lules β, destaca la reducció de trànscrits del sistema nerviós i la sobreexpressió de factors que reflexen un intent de regeneració insular. Per la caracterització del pàncrees en la DT1 s'ha estudiat també el microquimerisme matern, com a fenòmen associat a l'autoimmunitat. La presència de cèl.lules d'origen matern, capaces de travessar la barrera fetoplacentària durant l'embaràs i d'implantar-se en teixits de l'hoste, s'ha associat a diverses malalties autoimmunitàries. Tot i que és una hipòtesi encara per demostrar, les cèl.lules maternes podrien ser cèl.lules potencialment autoreactives, cèl.lules diana de l'autoimmunitat -per la seva semial.logenicitat- o bé cèl.lules amb funció reparadora o de regeneració. En aquest estudi s'identifica la presència de cèl.lules β d'origen matern. Les cèl.lules pancreàtiques d'origen matern es detecten en major freqüència en pacients que en controls.Una alternativa a la manca d'accés al teixit diana en la DT1 són els models experimentals de la malaltia. El ratolí no obès diabètic (NOD) és un model espontani de diabetis autoimmunitària àmpliament estudiat que desenvolupa una patogènesi amb característiques similars a la DT1 humana. En aquesta Tesi Doctoral es defineixen alteracions a l'òrgan diana del model derivat NOD RIP-IFNβ, ratolins transgènics que expressen la citocina antiviral i proinflamatòria IFNβ a les cèl.lules β. Aquests ratolins desenvolupen una DT1 agressiva amb un alt component d'immunitat innata i característiques més semblants a la DT1 humana, com l'edat d'inici prematura i la mateixa incidència entre sexes. En la diabetis mediada per IFNβ s'observa un augment d'expressió de citocines i quimiocines proinflamatòries en pàncrees, contribuïnt a la DT1 prematura amb un alt component d'immunitat innata. Paral.lelament, també es detecta un augment de Reg2 -factor de regeneració β i autoantigen en DT1- a les cèl.lules β, concordant amb la inflamació, amb una hiperplàsia insular i amb l'acceleració de la malaltia. Les alteracions immunològiques identificades i descrites en aquesta Tesi Doctoral demostren que l'autoimmunitat a l'òrgan diana de la DT1 és un procés extraordinàriament més complex del que s'havia descrit fins l'actualitat. Els resultats obtinguts indiquen que l'autoimmunitat contra les cèl.lules β és un procés crònic en el que hi intervenen factors inflamatoris i de la immunitat innata, i que progressa malgrat els intents d'immunoregulació i regeneració als illots pancreàtics. / Type 1 diabetes (T1D) is an autoimmune disease caused by the selective destruction of insulin- producing pancreatic β cells. T1D aetiology is unknown, although genetic, enviromental and stochastic susceptibility factors are involved in the disease. During the last years, few immunological alterations have been identified in the pancreases from T1D patients, such as the presence of a leukocytic infiltrate in the islets. The study of these processes has been difficulted by the lack of access to the pancreatic tissue. Therefore, the features of autoimmunity in T1D are based on a limited number of observations.In this Doctoral Thesis, gene expression profiles for a collection of pancreatic samples generated by our group at different disease checkpoints -clinical onset, recent onset and longstanding- have been defined. It has been established a comparison between total pancreas and its purified endocrine component (target). The profiles described by microarray analysis demonstrate the gene expression increase of immune system genes, highlighting pathways such as antigen presentation, adhesion molecules, humoral response, inflammation, innate immunity and immunoregulation. These data evidence the persistence of inflammatory and immune response at chronic stages, being more prominent in the total pancreas than in purified islets. Exocrine tissue shows a reduction of transcripts at the clinical onset and a production of inflammatory factors. In the islets, besides the reduction of β cell transcripts, there is a downregulation of nervous system genes and an overexpression of genes that suggest an attempt of islet regeneration. During the caractherization of T1D pancreases, maternal microchimerism has also been studied, as a phenomenon associated to autoimmunity. The presence of cells of maternal origin, able to cross the placental barrier during pregnancy and to implant in the host tissues, has been associated to many autoimmune diseases. Hypothetically, but not still demonstrated, cells of maternal origin could be potentially autoreactive cells, target cells of the autoimmune response -because of their semiallogenicity- or cells with a repair/regeneration function. In this study, the presence of β cells of maternal origin has been identified. Pancreatic cells of maternal origin are found in a higher frequency in patients than in controls. An alternative to the lack of access to the target tissue in T1D is the study of experimental models of the disease. Nonobese diabetic (NOD) mouse is a spontaneous model of autoimmune diabetes widely studied that develops a pathogenesis with similar features to human T1D. In this Doctoral Thesis, many alterations have been defined in the target organ of the NOD-derived model NOD RIP-IFNβ, a mice model expressing transgenically the antiviral and proinflammatory cytokine IFNβ in the β cells. These mice develop an agressive T1D with a strong innate immunity component and show features more similar to human T1D such as the juvenile onset and the equal sex incidence. In T1D mediated by IFNβ, an increase in pancreatic proinflammatory cytokines and chemokines has been found, contributing to the premature onset with a strong innate immunity component. In parallel, an increase in Reg2 expression -regeneration factor and T1D autoantigen- has been found in β cells, according to the inflammatory response, the insular hyperplasia and the acceleration of the disease.The immunological alterations identified and described in this Doctoral Thesis demonstrate that autoimmunity in the target organ of T1D is a process extraordinarily more complex than previously described. The data obtained indicate that autoimmunity against β cells is a chronic process, in which inflammatory and innate immunity factors participate and that progresses instead of the attempts of immunoregulation and islet regeneration.

El trasplantament d'illots pancreàtics pot ser una bona teràpia per els malalts amb diabetis mellitus de tipus 1, però hi ha alguns problemes que cal solventar abans que sigui un tractament estès. Un d'aquests problemes bàsics és la limitada disponibilitat d'òrgans, així com la pèrdua de teixit trasplantat, que es produeix tant per el rebuig com per la fallida del trasplantament. Se sap que en els primers dies posteriors al trasplantament hi ha una pèrdua d'aproximadament el 60% de la massa beta trasplantada. També es coneix que en el primer moment després del trasplantament es produeix una reposta inflamatòria inespecífica que podria ser la responsable parcial d'aquesta pèrdua. L'objectiu de l'estudi ha estat el de descriure els fenòmens inflamatoris que es produeixen en l'empelt en aquests primers dies. Més en concret, l'expressió de citocines inflamatòries i si l'expressió d'aquestes citocines estava condicionada per l'estat metabòlic del receptor, així com l'efecte de la inhibició de l'apoptosi de les cel·lules beta trasplantades. Per això, es van trasplantar animals singènics amb una massa beta insuficient per a restablir la normoglucèmia i es va mesurar l'expressió de diferents citocines inflamatòries en l'empelt. El primer dia després del trasplantament es produeix una resposta inflamatòria que dóna lloc a una elevada expressió dels gens de les citocines IL-1beta, IL-6, TNF-alfa i IL-10, i es manté, tot i que a nivells més baixos, durant la primera setmana del trasplantament. En aquests primers dies també es detecta en l'empelt la presència de les proteïnes de IL-1beta i iNOS (principal mediador de l'acció citotòxica d'IL-1beta), que principalment són expressades per els macròfags de l'empelt. La hiperglucèmia del receptor modifica de manera parcial la resposta inflamatòria, augmentant l'expressió de TNF-alfa, IL-6 i IL-10. Per a examinar l'efecte de la inhibició de l'apoptosi, es va trasplantar una massa subòptima d'illots tractats amb l'inhibidor de les caspases z-VAD.fmk a animals hiperglucèmics. Es va poder observar com aquest tractament reduïa de manera parcial l'apoptosi de les cèl·lules beta trasplantades i feia que la massa beta trasplantada es mantingués a llarg termini, la qual cosa es reflexava en una millor evolució metabòlica dels animals diabètics trasplantats. / Islet transplantation is limited by the insufficient supply of islet tissue, a problem that is further aggravated by the high number of islets required for successful transplantation. Islets are particularly vulnerable in the initial days after transplantation, when more than half of the islet tissue may be lost due to increased beta-cell apoptosis and necrosis. Non-specific inflammation at the grafted site could play a role in the initial fate of transplanted islets. The aims of the study were to determine the expression of pro- and anti-inflammatory cytokine genes in the initial days after syngeneic islet transplantation, whether blood glucose modulates their expression in islet grafts, and the effect of initial apoptosis inhibition in transplanted beta cells. The inflammatory response in islet grafts was maximal on day 1 after transplantation when cytokine genes of IL-1beta, TNF-alfa, IL-6 and IL-10 were detected. It was sustained, although at lower levels, on days 3 and 7, and it was partly enhanced by hyperglycemia. At this moment, IL-1beta and iNOS proteins were also detected in, mainly, macrophages of the graft. To study the effect of apoptosis inhibition, a subobtimal beta cell mass were transplanted to hyperglycemic animals. Islets were previously incubated with caspase inhibitor, z-VAD.fmk. The treatment of freshly isolated islets with the caspase inhibitor educed the subsequent apoptosis of the islets once they were transplanted and improved the outcome of the graft.

L'obesitat i la diabetis de tipus 2 són dos de les malalties més prevalents a les societats occidentals. L'obesitat és el principal factor de risc per l'aparició de diabetis de tipus 2. Totes dues sovint s'associen a altres patologies com hipertensió, malaltia cardíaca crónica, dislipidèmia...etc. incrementant el risc d'infart i embolia. En conjunt representen un percentatge força elevat de la despesa sanitària en els païssos del nostre entorn. És un tret comú d'ambdues l'aparició de resistència a insulina en múscul, éssent aquesta una de les primeres manifestacions de la diabetis de tipus 2. Tot i que es coneixen alguns gens implicats en l'obesitat i la diabetis de tipus 2 encara sabem poc de les causes moleculars d'aquestes malalties. Per això ens vam propossar identificar gens diferencialment expressats en múscul en condicions de resistència a la insulina i descriure la funció d'aquests gens. Això ho vam fer mitjançant les tècniques de "differential display" i d'hibridació sostractiva ("PCR Select cDNA Substraction") sobre múscul de rates obeses Zucker. Vam identificar el gen anomenat Mitofusina-2 i vam comprovar que la seva expressió estava disminuïda en individus obesos. Mitofusina-2 s'expressa específicament en múscul i teixit adipós i s'indueix durant el procés d'adipogènesi i termogènesi. La sobreexpressió de Mitofusina-2 en fibroblastes 10T1/2 provoca un colapse de la xarxa mitocondrial, mentre que la seva repressió per transfecció estable antisentit impedeix la correcta recuperació de la xarxa mitocondrial després d'un xoc osmòtic. En aquestes condicions les cèl.lules mostren una menor oxidació de glucosa, un menor consum d'oxigen total i una disminuïda termogènesi. La Mitofusina-2 incrementa la seva expressió en múscul de rata en resposta al fred. També vam identificar els gens DOR ("Diabetes and Obesity Regulated gene") i P311, l'expressió dels quals es troba reprimida en múscul esquelètic d'individus obesos i diabètics de tipus 2.

A la primera part de l'estudi s'avaluen els defectes metabòlics de secreció i sensibilitat ala insulina presents en una població d'alt risc per desenvolupar diabetis mellitus tipus 2com són els familiars dels pacients diabètics. A la segona part de l'estudi es realitza unassaig clínic doble cec controlat amb placebo amb un dels fàrmacs utilitzats per laprevenció de la diabetis tipus 2 com és la metformina a pacients amb tolerància alteradaa la glucosa. S'analitzen els seus efectes metabòlics i antiinflamatoris.S'estudia la sensibilitat a la insulina i la secreció amb el mètode HOMA i CIGMA javalidats per aquests estudis tant a la primera part com la segona part de l'estudi. Ladeterminació dels paràmetres inflamatoris es realitzaren amb mètodes d'enzimimmunoassaig d'alta sensitivitat. L'anàlisi estadística de les dades de l'assaig es realitzaamb el model general lineal d'anàlisis de la variància per a mesures repetides.Els familiars dels pacients diabètics manifesten defectes de la sensibilitat i la secreciód'insulina. La metformina a etapes prediabètiques millora la hiperglucèmia i lasensibilitat a la insulina. Millora el perfil bioquímic hepàtic i és probable que tingui propietats antiinflamatòries al augmentar les concentracions de la proteïna bactericida incrementadora de la permeabilitat (BPI). / "Study of insulin resistance in first-degree relatives of type 2 diabetic patients andthe effects of metformin"First part of the study analyzes the metabolic defects of insulin secretion and action in ahigh risk population, the first degree relatives of type 2 diabetic patients. On the secondpart of the study we performed a randomized double blind study with metformin versusplacebo in impaired glucose tolerant patients. We analyzed the metabolic and antinflammatory effects.We studied insulin sensitivity and secretion with HOMA and CIGMA tests in both studies. Inflammatory determinations were performed with high sensitivity immunoassay. Statistical analysis were done with general lineal model of variance for repeated measurements.First degree relatives manifest insulin secretion and sensitivity defects. Metformin improves hyperglycaemia an insulin resistance. It also improves hepatic biochemicaltests and it could have antinflammatory properties due to the increase in bactericidal increasing permeability protein (BPI)levels.

DELIMITACIÓN DE OBJETIVOS E HIPÓTESIS DE TRABAJO: La hipótesis es doble en relación a los dos aspectos clínicamente más relevantes de la nefropatía diabética inicial en la diabetes tipo 2: el riesgo cardiovascular y la progresión a nefropatía avanzada.1- La nefropatía diabética inicial (micro y macroalbuminuria) en pacientes con diabetes tipo 2 se asocia con un riesgo de enfermedad cardiovascular superior al de la población diabética sin nefropatía, también en una comunidad de bajo riesgo cardiovascular mediterránea como la nuestra. 2- En pacientes con diabetes tipo 2 y microalbuminuria el tratamiento hipotensor combinado entre un inhibidor del ECA y un antagonista del calcio no dihidropiridínico es superior a la monoterapia con el inhibidor del ECA en cuanto a la progresión de la enfermedad renal.Los objetivos básicos para probar estas hipótesis son:1- Analizar, en pacientes con diabetes tipo 2 y nefropatía diabética inicial (micro o macroalbuminuria con función renal conservada) de una población mediterránea, el perfil y las características del riesgo cardiovascular (prevalencia de enfermedad cardiovascular, presencia de factores de riesgo incluyendo registro de presión arterial de 24 horas, y grado de control de estos factores de riesgo).2- Analizar en los pacientes que presentan microalbuminuria persistente tras como mínimo un año de tratamiento con un inhibidor del ECA, si la adición de un antagonista del calcio no dihidropiridínico como el diltiazem al tratamiento logra un efecto renoprotector superior a la monoterapia con el inhibidor del ECA.ADECUACIÓN DEL MÉTODO A LOS OBJETIVOS PLANTEADOS: se realizaron dos estudios de forma secuencial en pacientes de nuestra área geográfica con diabetes tipo 2 y nefropatía diabética en estadio inicial. El primero fue un estudio observacional transversal de los pacientes con nefropatía diabética inicial (micro/macroalbuminuria) de nuestra población en el que se analizó el perfil de riesgo cardiovascular. En concreto se estudió la prevalencia de enfermedad cardiovascular conocida, la presencia de factores de riesgo como la hipertensión arterial y la dislipemia, y el grado de control de estos en condiciones de práctica clínica habitual y en función de las recomendaciones internacionalmente aceptadas. A los pacientes con normotensión y microalbuminuria se les practicó una monitorización tensional de 24 horas con el objetivo de detectar alteraciones sutiles en el perfil tensional tales como la disminución o ausencia del descenso fisiológico nocturno. El segundo fue un estudio de intervención abierto, prospectivo y randomizado, de 2 años de duración, en el que se incluyó un subgrupo de la población del primer estudio, concretamente aquellos pacientes con hipertensión y microalbuminuria persistente tras como mínimo un año de tratamiento con un inhibidor del ECA. En ellos se evaluó si la adición de diltiazem producía un efecto renoprotector superior al tratamiento con el inhibidor del ECA y si ese efecto beneficioso era independiente o no del mero efecto hipotensor.Juicio ponderado de las aportaciones de la tesis: La primera conclusión fundamental de esta tesis es que en una población mediterránea de bajo riesgo cardiovascular global como la nuestra, la presencia de nefropatía diabética inicial en la diabetes tipo 2 se asocia a un riesgo cardiovascular muy superior al presente en la población diabética sin nefropatía, tal y como ocurre en otras poblaciones más estudiadas como las nórdicas y anglosajonas. Eso ocurre en gran medida debido a que estos pacientes presentan una alta prevalencia y tendencia al agrupamiento de factores de riesgo cardiovascular clásicos. Es destacable la elevada presencia de hipertensión arterial, e incluso en los escasos pacientes normotensos hay una elevada prevalencia de disminución o ausencia del descenso fisiológico nocturno de la presión arterial, lo que hace que prácticamente todos los pacientes de nuestra población de estudio tengan anomalías tensionales. A pesar del alto riesgo cardiovascular de estos pacientes, el grado de tratamiento y control de los factores de riesgo, especialmente hipertensión arterial y dislipemia, es claramente deficiente. Por tanto, un mejor y más intensivo tratamiento debería ser una medida a implementar en el cuidado habitual de esta población de cara a reducir su morbimortalidad.La segunda conclusión importante es que en pacientes con diabetes mellitus tipo 2, hipertensión arterial, y microalbuminuria persistente tras como mínimo un año de tratamiento con un inhibidor del ECA, la adición de diltiazem a la terapia se asocia con una menor progresión de la enfermedad renal que la monoterapia con el inhibidor del ECA. Este efecto beneficioso es además independiente de la presión arterial y del control metabólico. Por tanto la asociación entre un inhibidor del ECA y un antagonista del calcio no dihidropiridínico se muestra más eficaz que la monoterapia en la microalbuminuria, tal como se ha demostrado ya en fases avanzadas de la nefropatía y a diferencia de lo que se ha observado en la prevención de la microalbuminuria en los pacientes con diabetes tipo 2 e hipertensión arterial.PUBLICACIONES:- Nefropatía diabética inicial y enfermedad cardiovascular en una población mediterránea: factores de riesgo y grado de tratamiento. M Pérez-Maraver, MªJ Carrera, G Vinzia, T Micalo, N Gómez, M Sahún, J Soler, E Montanya. Revista Clínica Española 2004; 204: 255-259.- Renoprotective effect of diltiazem in hypertensive type 2 diabetic patients with persistent microalbuminuria despite ACE inhibitor treatment. M Pérez-Maraver, MªJ Carrera, T Micalo, M Sahun, G Vinzia, J Soler, E Montanya. Diabetes Res Clin Pract 2005; 70:13-19.

Amb l'objectiu d'identificar gens potencialment involucrats en la fisiopatologia de la diabetis mellitus de tipus 2 i l'obesitat es va realitzar al nostre laboratori un experiment d'hibridació sostractiva amb músculs de rates Zucker ZDF obeses i diabètiques i rates. Un dels gens identificats en aquest estudi no havia estat descrit anteriorment; se'l va anomenar DOR, de l'anglès "Diabetes and Obesity Regulated gene". La manca absoluta d'informació prèvia a la literatura sobre DOR fa que la finalitat general d'aquesta tesi sigui identificar i caracteritzar la seva funció a nivell cel·lular. Per aquest motiu primerament es va analitzar la seqüència de la proteïna en busca de senyals o dominis que poguessin aportar informació sobre la seva funció. Diversos indicis indicaven que DOR podia ser una proteïna implicada en la regulació de la transcripció. Concretament, la presència d'una putativa caixa LxxLL, típica de coactivadors de receptors nuclears, indicaven que DOR podia ser un coactivador. Experiments amb vectors reporter van confirmar que la proteïna DOR exerceix de coactivador dels receptors nuclears TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. Posteriorment es va realitzar una fusió de la proteïna DOR amb el domini d'unió a DNA del factor de transcripció de llevat Gal4 (Gal4 DBD). D'aquesta manera es va demostrar que DOR té un domini d'activació de la transcripció, ja que aquesta proteïna de fusió és capaç d'activar l'expressió d'un reporter de Gal4. A més, través de fusions amb el Gal4 DBD de fragments de la proteïna DOR, es va poder mapar en quina regió de la proteïna es localitza aquest domini d'activació de la transcripció. La cerca a bases de dades va detectar diverses proteïnes de diferents espècies amb homologia amb DOR, que podien ser, per tant, ortòlegs de la proteïna. La fusió d'aquests possibles ortòlegs amb el Gal4 DBD també era capaç d'activar l'expressió del reporter de Gal4. En cèl·lules C2C12 en que s'havia reduït l'expressió de DOR per l'acció d'un siRNA específic, la capacitat dels receptors nuclears TRα i PPARγ d'activar l'expressió dels seus reporters es veia disminuïda, cosa que indica que la presència de DOR és important per a l'acció d'aquests receptors nuclears. Tot i contenir una putativa caixa LxxLL vam poder comprovar que aquesta no és el principal domini d'interacció de DOR amb els receptors nuclears, ja que la mutació de la caixa no aboleix la capacitat de DOR de coactivar aquests receptors. La caixa, en canvi, és important per al domini d'activació de la transcripció de DOR, ja que la versió mutada de la proteïna és menys potent a l'hora de coactivar els diferents receptors nuclears. Vam analitzar també la localització intracel·lular de la proteïna. Mitjançant estudis amb proteïnes de fusió de DOR amb la proteïna fluorescent GFP, així com amb estudis d'immunolocalització, vam poder comprovar que DOR es localitza al nucli, cosa que és coherent amb la seva funció com a coactivador. Tot i això en determinades condicions DOR es pot localitzar al citosol. En aquest sentit vam poder determinar a DOR les regions responsables de la seva localització nuclear i de la sortida del nucli de la proteïna que té lloc en determinades condicions. Per últim vam analitzar el paper de possibles modificacions post-traduccionals en l'activitat i la localització de DOR. A través de la mutació de llocs putatius de fosforilació per diferents cinases vam deduir que tant l'activitat com la vida mitja de DOR es veu afectada per fosforilacions per aquestes cinases. A més vam comprovar que DOR també es regula per modificacions en lisines, ja que la mutació de lisines de la proteïna també afecta a la seva localització i a la seva vida mitja. / To initially identify genes responsible for the alterations associated to diabetes, we screened genes differentially expressed in Zucker diabetic (ZDF) rats and non-diabetic lean rats by PCR-select cDNA subtraction. One of the genes differentially expressed had not been described before. We named it DOR for "Diabetes and Obesity Regulated gene". The study of the protein sequence suggested that DOR could be a nuclear protein that may participate in transcriptional regulation. To assess whether DRCoA regulates nuclear hormone receptor activity we performed reporter vector assays with several nuclear receptors. Our results confirmed that DOR is able to coactivate the nuclear receptors TRα, PPARγ, GRα, ERα i VDRα. We also constructed a fusion protein of DOR with the DNA binding domain of the yeast transcription factor Gal4 (Gal4 DBD). This allowed us to demonstrate that DOR has a transcription activation domain, as this fusion protein is able to activate the expression of a reporter vector for Gal4. The fusion of several fragments of the protein with the Gal4 DBD served us to delimitate the region of DOR responsible for the activation of the transcription. We also analyzed the cellular distribution of the protein. As could be expected, DOR localizes to the nucleus of the cells, although in certain conditions is localized in the cytoplasm. We determined the regions of the protein responsible for this nuclear localization, as well as the signals responsible for the exit of the protein to the cytoplasm in certain conditions. Lastly we analyzed the role of post-translational modifications in the activity, stability and localization of the protein.

La resistencia a la insulina es un estado patológico que se define como la incapacidad del organismo de responder normalmente a las acciones de la insulina. Este estado está ligado a la obesidad, al estilo sedentario de vida y es responsable en gran medida de la aparición de la diabetes de tipo 2. Aunque tradicionalmente el estudio de esta patología se había centrado en el metabolismo de carbohidratos, en las últimas décadas se ha producido un cambio hacia el estudio del metabolismo de ácidos grasos como principal promotor de esta enfermedad. De este modo, se ha demostrado una correlación entre la acumulación de lípidos en tejidos periféricos (hígado y músculo principalmente) y la aparición de resistencia a la insulina.El músculo es el responsable de la mayor parte del metabolismo de la glucosa en situaciones de estimulación por insulina. Esto confiere al músculo una vital importancia en el desarrollo de la resistencia a la insulina así como para el tratamiento de la diabetes de tipo 2. Numerosos estudios han descrito que la acumulación de especies derivadas de ácidos grasos en músculo, ya sea debido a un aporte excesivo de lípidos o a un fallo en su oxidación, conducen a una resistencia a la insulina. Estas especies derivadas de ácidos grasos actúan interfiriendo en la señalización de la insulina mediante la activación de una serie de proteínas, conduciendo a una desensibilización del músculo a las acciones de la insulina.En esta tesis se ha estudiado si un aumento en la oxidación de ácidos grasos en músculo es capaz de impedir la acumulación de sus derivados lipídicos y por lo tanto evitar la resistencia a la insulina ocasionada por ellos. Con este objetivo se han usado dos aproximaciones experimentales. En primer lugar, se ha evaluado el efecto de la sobreexpresión de la carnitina palmitoiltransferasa I (CPT I), que es la enzima responsable del control del transporte de ácidos grasos a la mitocondria, donde serán oxidados, y en segundo lugar, se ha estudiado el efecto del C75, un activador de la CPT I recientemente descrito. Además, también se ha estudiado el papel de otra proteína recientemente involucrada en el control de la oxidación de ácidos grasos en músculo, la FAT/CD36. Todo esto se ha llevado a cabo usando como modelo de estudio células de músculo esquelético de rata L6E9.Los resultados presentados en esta tesis demuestran que la sobreexpresión de CPT I ha resultado efectiva en el aumento de la oxidación de ácidos grasos, impidiendo su acumulación y por lo tanto protegiendo a la célula de la resistencia a la insulina. En cambio, se ha demostrado que el C75, a través de su activación a C75-CoA, se comporta como un inhibidor de la CPT I y por lo tanto de la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. Por último, no se ha podido demostrar que FAT/CD36 juegue un papel importante en la oxidación de ácidos grasos en las condiciones de estudio utilizadas. Estos resultados confirman la importancia del metabolismo lipídico en la resistencia a la insulina en músculo y describen la CPT I como una posible diana farmacológica para el tratamiento de la resistencia a la insulina y la diabetes de tipo 2. Por otro lado describen una nueva acción del C75 sobre la actividad CPT I y sugieren la necesidad de realizar más estudios para esclarecer el papel de FAT/CD36 en la oxidación de ácidos grasos en músculo esquelético. / Skeletal muscle is responsible for 70-80% of whole-body insulin-stimulated glucose uptake and is therefore generally considered the most important site of insulin resistance. Insulin resistance in skeletal muscle plays a major role in the pathogenesis of type 2 diabetes although the mechanism responsible remains unclear. Intramuscular lipid accumulation is evident in a wide set of experimental models, including humans, rodents and muscle cells in culture. These observations have promoted the so-called lipotoxic model of skeletal muscle insulin resistance, which proposes that high plasma fatty-acid levels observed in the obese or insulin-resistant state lead to muscle lipid accumulation, which in turn causes a predisposition towards decreased insulin sensitivity and worsening of the disease.In this thesis we have tested the hypothesis that increases in fatty-acid oxidation should protect from fatty acid induced-insulin resistance by reducing lipid accumulation in the muscle cell. For this purpose we have used two experimental approaches: a) the overexpression of carnitine palmitoyltransferase I (CPT I), the rate-limiting enzyme in fatty acid import into mitochondria for oxidation, and b) study the effect of C75, a recently described CPT I agonist, in fatty-acid oxidation in muscle cells. Moreover we have studied the role of FAT/CD36, a protein recently described to be involved in beta-oxidation in muscle, in the rat skeletal muscle cultured cell line L6E9.Overexpression of LCPT I in L6E9 myotubes increased CPT I activity and palmitate oxidation, preventing lipid accumulation. As a result insulin sensitivity was completely restored. In contrast, C75 acted as an inhibitor of CPT I activity and palmitate oxidation, instead of an activator, both in muscle cells and in mice muscle in vivo. Finally, FAT/CD36 had not an important role in the control of fatty-acid oxidation in L6E9 myoutbes under our experimental conditions. These data confirm the importance of lipid metabolism in muscle insulin resistance and describe CPT I as a possible pharmacologic target for the treatment of insulin resistance and type 2 diabetes. Moreover, we describe a new role of C75 over CPT I activity and fatty-acid oxidation in skeletal muscle.

Las mutaciones en el factor de transcripción HNF1a son la causa más frecuente de diabetes tipo MODY. HNF1a está implicado en una compleja red transcripcional responsable de la diferenciación y función de la célula beta. El estudio de modelos genéticos deficientes para HNF1a será pues de gran relevancia para la comprensión de las bases moleculares de la diabetes MODY y del programa transcripcional responsable del desarrollo de la célula beta, pero también de manera más general, para estudiar como un activador regula la transcripción. El objetivo de este trabajo de tesis es pues emplear diferentes modelos genéticos para comprender aspectos funcionales de HNF1a en un contexto celular in vivo.En una primera parte, nos planteamos responder dónde, cuándo y cúanto HNF1a es necesario para ejercer su función en la célula beta. Diseñamos un modelo de expresión de HNF1a específico de célula beta e inducible por tetraciclina. El sistema sobreexpresaba HNF1a en células beta, lo que inhibía el ciclo celular e inducía apoptosis reduciendo progresivamente la masa de célula beta que acababa derivando en diabetes. Como la inducción de HNF1a en células beta era heterogénea pudimos comprobar que la función de HNF1a tiene autonomía celular y es rescatable postnatalmente sólo en aquellas células deficientes para HNF1a que reexpresaban HNF1a a niveles casi fisiológicos. Concluyendo, en esta primera parte del proyecto se demostró que HNF1a puede ejercer su función en células beta expresándose sólo en células beta, que esta función no está restringida a un momento determinado del desarrollo embrionario y que es altamente dependiente de los niveles de expresión, puesto que tanto mutaciones en heterocigosidad como la sobreexpresión causan diabetes. Estos resultados tienen importantes implicaciones en el diseño de terapias génicas para la cura de la diabetes MODY y en el desarrollo de protocolos de diferenciación in vitro de células beta para su posterior transplante. Así mismo llama la atención sobre los peligros de sobreexpresar factores de transcripción en células beta.En la segunda parte, nos planteamos cómo regula HNF1a la transcripción. Un nuevo nivel de regulación de la transcripción está emergiendo, el posicionamiento génico en subdominios nucleares en fución de la actividad transcripcional. Por otro lado se sabe que HNF1a induce la acetilación de los promotores de sus genes diana. El objetivo de esta segunda parte es estudiar como HNF1a influye las modificaciones de histona a nivel local de cromatina y el reposicionamiento génico en el espacio nuclear para establecer así la relación entre estos dos niveles de regulación de la transcipción. Mediante el uso de un modelo deficiente para HNF1a, demostramos que HNF1a induce la metilación en H3-Lys4 e impide la metilación en H3-Lys27 de sus genes diana. Así mismo estas modificaciones de histona se distribuyen no aleatoriamente en el espacio nuclear formando subdominios. HNF1a induce el reposicionamiento selectivo de sus loci diana de dominios ricos en H3-trimetil Lys27 a dominios activadores ricos en RNA polimerasa II y H3-dimetil Lys4, en concordancia con los cambios observados localmente. Concluyendo, en esta segunda parte demostramos por primera vez que el posicionamiento génico puede ser dependiente de un activador y que afecta selectivamente al locus diana. También demostramos por primera vez que las modificaciones de histona que regulan la transcripción localmente a nivel de la cromatina también tienen una representación espacial en el núcleo de manera que los genes se posicionan en dominios ricos en determinadas modificaciones de histona en función de su actividad transcripcional. Este trabajo de tesis tiene importantes implicaciones en la comprensión de las bases moleculares de una enfermedad humana y añade nuevas perspectivas al estudio de la función de un activador transcripcional. / Mutations in the transcription factor HNF1a are the major cause of MODY type diabetes. HNF1a is implicated in a complex transcriptional network responsible for beta-cell development and function. The study of genetic models deficient for that activator would not only be useful for understanding the molecular bases of a human disease, but also for the study of the transcriptional network implicated in the differentiation of beta-cells and the study of how transcription is actually regulated.The aim of this project of thesis was to understand the function in vivo of HNF1a in beta-cells using genetic models.In the first part, we aimed to assess when, where and how much HNF1a is needed in the beta-cell to be functional. For that purpose, we used a conditional and cell-specific model that overexpressed HNF1a only in beta-cells and in the absence of tetracycline. We demonstrated that the function of HNF1a in beta-cells is cell-autonomous, can be rescued postnatally and is tightly dependent on its expression levels, since both mutations in heterozygosity and overexpression lead to diabetes. These results have important implications in the development of gene therapies for MODY3 patients and for the establishment of good protocols for beta-cell differentiation in vitro for transplantation. This study also highlights the risk of misexpressing transcriptions factors in beta-cells. In the second part, we aimed to understand how HNF1a regulates transcription using an HNF1a-deficient model. HNF1a induces changes locally at the chromatin level by preventing the methylation of H3-Lys27 and inducing the acetylation and methylation of H3-Lys4 of its targets nucleosomes. HNF1a also induces the repositionning of its target loci from H3-methyl Lys27 rich domains to active RNA polymerase II and H3-methyl Lys4 rich domains in the nuclear space, concordantly with the changes observed locally. Thus, for the first time we show that an activator can locus-selectively determine the subnuclear positioning of its targets and that histone modifications have a functional representation in the nuclear space. This thesis add novel insights to our understanding of the in vivo function of a transcriptional activator, and for the first time link subnuclear gene repositioning to a human transcriptional disease.

El campo de estudio centrado en los tipos de interés es muy amplio y ha merecido una gran atención, tanto por parte de los académicos como por parte de los profesionales. Esta afirmación queda avalada por la extensa bibliografía sobre el tema generada en los últimos años. Concretamente, el objetivo de esta tesis doctoral se centra en el planteamiento, desarrollo y contrastación de un modelo dinámico de la estructura temporal de tipos de interés, que incorpora tres variables de estado. El comportamiento temporal de estos factores se representa mediante ecuaciones diferenciales estocásticas. Aplicando el lema de Itò, la condición de inexistencia de posibilidades de arbitraje y una definición funcional de los precios que el mercado asigna al riesgo, se obtiene una ecuación cierta en derivadas parciales de segundo orden, para el precio de la obligación cupón cero, libre de riesgo de insolvencia. La ecuación que se obtiene en el modelo admite solución analítica, por separación de variables, por lo que es posible definir la función de descuento, para cualquier plazo, a partir de los valores de las tres variables de estado.Obtenida la función de descuento, la definición de la estructura de tipos al contado y la de tipos implícitos es inmediata. También se obtienen las expresiones correspondientes a la prima de riesgo y prima "forward" asociadas al modelo. Finalmente, se deducen las expresiones de duración y convexidad asociadas a cada factor estocástico del modelo.Esta tesis doctoral se ha estructurado en cuatro capítulos. El primer capítulo, de carácter introductorio, define el concepto de estructura temporal de tipos de interés. El segundo capítulo se centra en los modelos dinámicos de la curva de tipos. El tercer capítulo se inicia con el planteamiento del modelo propuesto de la dinámica de la estructura temporal, considerándose tres variables de estado: dos "spreads" y un tipo de interés al contado a largo plazo. En el cuarto y último capítulo se efectúa la contrastación empírica del modelo, mediante los datos proporcionados por el Servicio de Estudios del Banco de España. Finalmente, y a modo de resumen, se detallan las conclusiones de este trabajo.La tesis se completa con tres anexos. En el primero se presentan gráficamente las series temporales con las que se trabaja en el capítulo de aplicación empírica. En el anexo dos, se incluye el programa de Mathcad 2000 utilizado en la segunda fase de estimación del modelo. En el último anexo, se efectúa un análisis gráfico del modelo. Se comprueban, empíricamente, una serie de propiedades de la función de descuento obtenida y se analiza el comportamiento de la curva de tipos, cuando cambian los parámetros que la definen.