O transporte de iodo para tireóide é mediado pelo simportador sódio-iodo (NIS), glicoproteína de 643 aminoácidos localizada na região basolateral da célula folicular que acopla a entrada de sódio e iodo para o interior da célula. A clonagem do gene NIS em 1996 foi o primeiro passo na investigação dos mecanismos moleculares responsáveis pela diminuição da captação do radioiodo nos tumores benignos e malignos da tireóide. Estudos prévios sobre a expressão do gene NIS baseados em quantificação do transcrito e/ou análise imuno-histoquímica da proteína, mostraram resultados bastante divergentes. A maioria dos estudos com RT-PCR mostrou redução ou até ausência do transcrito do NIS. Os estudos mais recentes de imunohistoquímica, no entanto, mostraram aumento da expressão da proteína NIS, ao invés de diminuição. Poucos foram os estudos que fizeram análise do transcrito e da proteína concomitantemente nas mesmas amostras. Este estudo teve como objetivo quantificar o RNAm do gene NIS e avaliar a expressão e localização celular da proteína NIS, através das técnicas de RT-PCR em tempo real e exame imunohistoquímico, respectivamente. Foram estudadas 30 amostras de nódulos de tireóide, sendo 14 nódulos benignos e 16 nódulos malignos, sempre pareados com o tecido não-tumoral do mesmo paciente. Através de exame cintilográfico, verificouse que 100% dos nódulos malignos e 85,7% dos benignos eram hipocaptantes. Houve diminuição da expressão gênica do NIS em 78,6% dos nódulos benignos, em 81,2% dos carcinomas utilizando o gene PSMC6 como controle interno e em 100% dos carcinomas com o gene GAPDH como controle interno. O exame imunohistoquímico da proteína NIS revelou positividade da proteína NIS no citoplasma em 100% dos tecidos não-tumorais, 100% dos nódulos benignos e 93,75% dos nódulos malignos, não sendo estatisticamente diferentes entre si. A positividade na membrana basolateral ocorreu em 23,3% das amostras não-tumorais, em 14,3% dos nódulos benignos e em 12,5% dos nódulos malignos, não se detectando diferença significativa entre os grupos. A comparação da intensidade da imunoexpressão do NIS no citoplasma entre os nódulos versus os tecidos não-nodulares mostrou que esta foi maior em 64,3% dos nódulos benignos e em 87,5% dos malignos. Houve associação entre diminuição da quantificação gênica do NIS tumoral e aumento da imuno-expressão da proteína NIS no citoplasma tumoral em 50% dos nódulos benignos, 87,5% dos nódulos malignos, quando se utilizou o GAPDH como controle interno e, em 68,75% dos nódulos malignos quando se utilizou o PSMC6. A diminuição da expressão gênica do NIS associada a maior imuno-positividade intracitoplasmática da proteína NIS se deve a provável incapacidade de migração da proteína para a membrana plasmática. / The iodide uptake by epithelial thyroid cells requires the expression of sodium iodide symporter (NIS), a transmembrane glycoprotein of 643 amino acids. NIS is located at basolateral plasma membrane of the thyroid follicular cells and couples the transport of iodide and sodium to this cells. NIS gene was cloned in 1996, being the first step of investigation of the mechanisms responsible for the lower uptake of radioiodide by benign and malignant thyroid tumors. Previous studies about expression of NIS gene based in quantification by RT-PCR and/or immunohistochemistry analysis showed divergent data. The majority of RT-PCR studies showed reduction or even absence of transcript of NIS in malignant tumors. Recent studies of immunostaining showed that many tumors overexpress rather than under express NIS. Only a few studies have made the analysis of the transcript and the protein at the same time in the same samples. The objective of this study was to investigate NIS transcript levels and the presence and location of NIS protein, using real time RT-PCR and immunohistochemistry, respectively. It was included 30 samples of thyroid tumors, 14 benign and 16 malignant ones, always compared to adjacent non-tumoral samples. Scintigraphic findings showed that 100% of malignant tumors and 87.5% of benign ones were ?cold?. RT-PCR data revealed lower gene expression in 78.6% of the benign tumors, 81.2% of the carcinomas using PSMC6 as a housekeeping gene and 100% of the carcinomas using GHPDH as a housekeeping gene, when paired to the normal tissue samples. Immunohistochemical staining revealed presence of NIS protein in 100% of the nontumoral samples, 100% of the benign tumors and 93.75% of the malignant tumors. No statistical differences were detect in this data. NIS protein was identified at basolateral membrane in 23.3% of non-tumoral samples, 14.3% of benign tumors and 12.5% of malignant tumors. No statistical differences were detect in this data. Higher quantities of intracytoplasmatic NIS protein were detect in 64.3% of benign tumors and in 87.5% of malignant tumors when compared to non-tumoral samples. Association between lower gene expression and higher presence of intracytoplasmatic NIS protein was found in 50% of benign tumors, 87.5% of malignant tumors using GHPDH as a housekeeping gene and 68.75% of malignant tumors using PSMC6 as a housekeeping gene. The reduced gene expression of NIS in thyroid tumors with strong intracytoplasmatic staining may be due to his incapacity in migrating to cellular membrane.

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-08T16:15:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alberto_FernandoLopes_D.pdf: 5633645 bytes, checksum: 7354434461195623d47c6efe24126229 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: Câncer é o resultado de anomalias no genoma acumuladas ao longo do tempo e corresponde a doença genética mais freqüente na população humana. Os últimos anos têm presenciado enormes avanços tecnológicos que facilitaram o desenvolvimento de técnicas para análise em larga escala do conjunto dos genes expressos nos diferentes tecidos, sendo responsável pela explosão do conhecimento em medicina molecular. No presente trabalho avaliamos o transcriptoma da leucemia mielóide crônica através da técnica de ORESTES (Open Reading Frame Expressed Sequence Tags). As seqüências geradas foram agrupadas de acordo com sua homologia através do pacote de bioinformática Phrap. Essa estratégia aumentou o grau de cobertura genômica, já que as seqüências originais apresentavam tamanho máximo de 500 a 700 bases. Após a retirada dos contaminantes, obtivemos 2933 agrupamentos de seqüências (contigs) e 11568 seqüências isoladas. Cada contig representa um gene em potencial e o seu conjunto foi submetido a comparação com o banco de dados público nr para possibilitar a anotação e classificação funcional. Os agrupamentos ORESTES foram classificados em comunicação celular (19%); crescimento, desenvolvimento e manutenção celular (9%); metabolismo celular (30%); estrutura, motilidade e transporte celular (15%); função desconhecida (28%). Adicionalmente, estabelecemos o mapeamento cromossômico dos contigs obtidos, observando distribuição relativamente homogênea e proporcional representada em todos os cromossomos humanos. O mapeamento dos contigs gerados por ORESTES apresentou-se com padrão de distribuição semelhante ao observado por Venter e colaborasores, 2001. Comparamos o padrão de expressão obtido com o transcriptoma de medula óssea de paciente portador de anemia hemolítica hereditária (doença hematológica não neoplásica) gerado por SAGE (Serial Analysis of Gene Expression). Os genes encontrados foram ordenados de acordo com sua representatividade ou nível de expressão. Não houve correlação entre os padrões de expressão observados pos SAGE e por ORESTES. Do conjunto dos 100 genes mais representados nos ORESTES, dez foram selecionados para validação da expressão por PCR quantitativo em tempo real, utilizando o agente fluorescente SybrGreen I. Identificamos e confirmamos o aumento da expressão em nove genes na LMC. Destes, sete tinham aumento superior a 10 vezes o controle (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3), com dois deles (DEFA3 e ABR) com aumento de cerca de 50 vezes ou mais. A análise funcional particularizada para cada um deste genes em LMC tem o potencial de identicar possíveis alvos para novas intervenções terapeuticas. O método mostrou-se poderoso para evidenciar e validar as diferenças de expressão gênica observadas pelas técnicas de seqüenciamento utilizadas anteriormente. Os dados deste trabalho constituem a primeira descrição do transcriptoma da leucemia mielóide crônica / Abstract: The complete collection of transcripts generated from the human genome cannot be predicted from the genome sequence, but should be directly determined for each tissue, due to variations of gene expression in different tissues and disease states, and because genes can encode multiple transcripts derived from alternate splicing and polyadenylation sites. As part of larger project that produced up to 1.2 million ORESTES (open reading frames expressed sequence tags) from different cancer tissues, we constructed a set of cDNAs obtained from bone marrow cells of patients with CML, that represented partial expressed gene sequences that are biased toward the central coding regions of the resulting transcripts (Dias-Neto E et al, Proc Nat Acad Sci USA 97:3491, 2000). The 27,361 ESTs were assembled into contigs using the Phrap package producing 2933 clusters containing 2 to 210 ESTs (leaving 11568 isolated sequences). Functional categories were attributed to the contigs on the basis of the annotation of the matched sequences in nr, into 5 major functional categories and 22 subcategories (cell communication (19%); cell growth, development and m contigs formed by the larger number of EST in bone marrow cells was co mpared with a control bone marrow sample obtained from a non-neoplastic hematologic condition (hereditary hemolytic anemia) and evaluated with SAGE (serial analysis of gene expression). Ten out of 100 most representative contigs had their expression data evaluated further by realtime quantitative PCR with Sybr Green I reagent, confirming the ORESTES data. Seven out of the 10 genes were more than 10-fold upregulated (CAMP, ABR, DEFA3, CSF3R, MLL2, S100A8 e MS4A3) and two additional genes were 50-fold or higher upregulated in CML (DEFA3 e ABR). The wealthy of information provided by this approach demonstrates its usefulness for the analysis of gene expression in specific hematopoietic tissues and diseases / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

O câncer de mama é a doença maligna mais comum e a principal causa de morte entre as mulheres. Sua complexa etiologia envolve múltiplos fatores de risco, a maioria deles relacionada aos níveis cumulativos de exposição da mama aos estrógenos. A maioria de suas ações é mediada pela ligação a seus receptores ER e ER que são fatores de transcrição. Outro fator que exerce um controle extraordinário no comportamento celular, regulando a transcrição gênica e influenciando diversos processos biológicos, e que, quando alterado, é associado ao processo de tumorigênese da mama é a matriz extracelular. A laminina, um dos principais componentes da matriz extracelular, interage com as células através das integrinas e está relacionada ao fenótipo maligno, atuando na adesão, migração, proliferação, diferenciação e sobrevivência celular. Nosso grupo identificou diversos genes diferencialmente expressos em células de câncer de mama ER+ na presença ou ausência de uma monocamada de laminina utilizando a técnica DDRT-PCR. Dois dos genes identificados, DDEF2 e PHLDA1, estão associados à adesão; DDEF2 envolvido na sinalização das integrinas e PHLDA1 relacionado com apoptose por perda de adesão. Nosso objetivo foi investigar os efeitos do 17-estradiol e da laminina na regulação da expressão dos genes DDEF2 e PHLDA1 nas linhagens celulares MCF-7, MDA-MB-231 e posteriormente S30, utilizando a técnica RT-PCR em tempo real. O gene PHLDA1 foi induzido pelo E2 via ER nas células MCF-7 e pela laminina nas células S30, e o gene DDEF2 foi reprimido pelo E2 e induzido pela laminina nas células S30 / The breast cancer is the most common malignant disease and the leading cause of death among women. Its complex etiology involves multiple risk factors, most of them related to the levels of cumulative breast exposure to estrogen. Most of its actions is mediated by binding to its receptor ER and ER that are transcription factors. Another factor that has a tremendous control in cell behavior, regulating the gene transcription and influencing various biological processes, which when altered, is attached to the process of tumorigênese of the breast is the extracellular matrix (ECM). The laminin, one of the main components of the ECM, interacts with the cells through integrins and is related to the malignant phenotype, acting in adhesion, migration, proliferation, differentiation and cell survival. Our group identified several genes diferentialy expressed in breast cancer cells ER + in the presence or absence of a laminin monolayer using the technique DDRT-PCR. Two of the genes identified, DDEF2 and PHLDA1, are associated with adhesion; DDEF2 is involved in the integrins signaling and PHLDA1 is related with apoptosis by loss of adhesion. Our goal was to investigate the effects of 17-estradiol and laminin in regulating the expression of the genes DDEF2 and PHLDA1 in MCF-7, MDA-MB-231 and later S30 cell lines, using the real time RT-PCR technique. The gene PHLDA1 was induced by E2 via ER in MCF-7 cells and the laminin in S30 cells, and the gene DDEF2 was suppressed by E2 and induced by laminin in S30 cells

O câncer de mama em mulheres jovens (idade igual ou abaixo de 35 anos) apresenta-se de forma mais avançada ao diagnóstico, possuindo grau histopatológico menos diferenciado. Além disso, as pacientes apresentam maior taxa de mortalidade e menor sobrevida livre de doença quando comparadas às pacientes menopausadas. Dentre os cânceres de mama em mulheres jovens, apenas 8 a 10% dos casos familiais estão relacionados a mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 e esta frequência nos casos esporádicos é ainda menor (3- 10%). Assim, os fatores relacionados à desregulação oncogênica em mulheres jovens com ou sem antecedentes familiares que apresentam testes genéticos negativos para essas mutações não estão suficientemente esclarecidos. Tais evidências sugerem que o câncer em mulheres muito jovens apresenta características biológicas especificas. Considerando que a expressão gênica é regulada em múltiplos níveis, alguns estudos recentes tem referido a importância dos microRNAs neste processo tanto na degradação de RNAs mensageiros como na repressão da tradução. A análise da expressão dos microRNAs em câncer de mama tem revelado perfis característicos de determinados níveis de progressão da doença. No presente trabalho, nosso objetivo foi determinar o perfil de expressão de microRNAs em tumores de mama de mulheres jovens (idade igual ou abaixo de 35 anos) não-portadoras de mutações nos genes BRCA1/2. As pacientes foram subdivididas em 2 grupos [familial (n=8) e não-familial (n=20)] e, em seguida, os dados de expressão foram comparados aos obtidos em amostras normais de mamoplastia. A quantificação da expressão dos microRNAs foi realizada pela reação de RT-PCR em tempo real, utilizando o sistema TaqMan microRNA Assay. As análises estatísticas mostraram 246 miRNAs de expressão diferencial entre os 3 grupos (normal, familial e não-familial) sendo que, destes, encontramos 137 miRNAs diferencialmente expressos entre os grupos familial e normal; 44 miRNAs entre os grupos não-familial e normal e 4 miRNAs entre os grupos familial e não-familial. Nossos dados demonstram que os tumores do grupo de pacientes familiais quando comparados aos normais apresentam um perfil de miRNAs globalmente reduzido. O perfil de expressão de miRNAs no grupo de pacientes com câncer de mama esporádico é pouco distinto do grupo com história familial. Muitos dos miRNAs com expressão reduzida estavam envolvidos, de acordo com a literatura, numa sinalização comum relacionada a mecanismos de proliferação, apoptose e invasão celular. Os 4 miRNAs identificados como diferencialmente expressos entre os grupos familial e nãofamilial embora relacionados com outros tipos de cancer precisam de uma melhor caracterização em cancer de mama / A rise in the incidence of breast cancer among young adult women (with age 35) was observed in recent decades. Breast cancer incidence in young woman has been correlated to poor survival and aggressive features. Due to different type of breast cancers in young woman, 8- 10% with familial history appears with mutation in BRCA1/2 genes, and similar proportion occurs in cases without familial history (3- 10%). However, early onset breast cancer patients with or without familial history, non carriers of BRCA1/BRCA2 mutations is not well elucidated. The deregulation by microRNAs has recently emerged as a major determinant of tumorigenesis. Because miRNAs function by targeting functionally important protein-conding genes, it is of outstanding interest to identify miRNAs involved in the molecular mechanism underlying aggressiveness in tumors of young patients that might represent biomarkers and therapeutic targets. This evidence suggests that breast cancer in young woman has specific biological characteristics. Understanding the patterns of miRNAs expression that potentially alter the regulation of key breast cancer genes we could give a better treatment to these patients. Thirty-two patients were selected: 8 with familial history of breast and ovarian suggestive of hereditary condition according to NCCN criteria and 20 without familial history. Patients of both groups were of non carriers of BRCA1/BRCA2 mutations. The determination of microRNA expression network between those 2 groups was performed by TaqMan microRNA Assay (Applied Biosystems) using as control 3 normal mamoplastia samples from wealthy young women. Data were normalized using endogenous miRNA presented in each array. Statistical comparisons were done using ANOVA and Student T test with adjusted FDR (5%). It was found that 246 miRNAs were differently expressed between the 3 groups. From the comparison of familial group against normal group it was found 137 miRNAs differently expressed. In the comparison between non familial and normal group it was found 44 miRNAs differently expressed. Finally the comparison between familial group and non familial group it was found 4 miRNAs differently expressed. Among these miRNAs are some which was well characterized in breast cancer with down-regulation such as: miR-125b, miR-126 and miR-100. Our findings suggested that tumors from familial or sporadic cases presented discrete differences of microRNA expression patterns. A global downregulation of 137 miRNAs in tumors from familial group of patients when compared to normal group was observed. Based on the literature, most of these miRNAs are related to mechanisms of proliferation, cells migration and apoptosis. To our knowledge, this is the first evidence of miRNA expression in tumors of early onset Breast Cancer patients, non carries BRCA1/2 mutation, providing insights that may lead to the detection of new conducts of treatment

Orientadores: Marcos Antonio Machado, Juliana de Freitas Astúa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-19T08:50:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Kubo_KarenSumire_D.pdf: 11235043 bytes, checksum: fb3c7d7e7af4e5fc35ef4a27c3364fda (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: O Citrus leprosis virus C (CiLV-C) é o agente causal da leprose dos citros, uma doença incomum transmitida pelo ácaro Brevipalpus phoenicis. Uma vez que o CiLV-C permanece confinado em lesões localizadas nas folhas, ramos e frutos sem causar infecção sistêmica, o vetor precisa se alimentar nestas lesões para adquirir o vírus. O objetivo deste trabalho foi analisar os perfis de expressão diferencial entre um genótipo resistente (tangor 'Murcott') e um suscetível (laranja 'Pera') em resposta à leprose dos citros e identificar os possíveis mecanismos de resistência envolvidos na resistência à doença. Por esse motivo, antes da instalação dos experimentos biológicos, nós aperfeiçoamos a detecção do CiLV-C em seu vetor, para certificação da aquisição viral. O experimento biológico incluiu quatro grupos: genótipo resistente ou suscetível infestados com ácaros virulíferos ou avirulíferos para CiLV-C. Com o intuito de se identificar genes diferencialmente expressos, nós utilizamos lâminas de microarranjo com sondas baseadas na base de dados do Citrus EST (CitEST). As análises estatísticas foram realizadas por two-way ANOVA considerando os fatores genótipo e a infecção pelo CiLV-C, de maneira a se encontrar respostas envolvidas na resistência ao CiLV-C. Os resultados foram interpretados por Gene Set Enrichment Analysis (GSEA). Os resultados sugerem que existem receptor-like proteins (RLP) e receptor-like kinase (RLK) que podem reconhecer o vírus ou o ácaro, ativando uma resposta de defesa baseada na assinatura de 'Ca POT.2+' e ativação da via do ácido salicílico. Estudos adicionais ainda são necessários para verificar se a resposta de defesa pode estar relacionada à resistência sistêmica adquirida (SAR) / Abstract: Citrus leprosis virus C (CiLV-C) is the causal agent of citrus leprosis, an unusual disease transmitted by the mite Brevipalpus phoenicis. Since CiLV-C remains confined in localized lesions in leaves, stems and fruits without causing systemic infection, the vector needs to feed in these lesions to acquire the virus. The aim of this work was to analyze the differential gene expression profiles between resistant ('Murcott' tangor) and susceptible ('Pera' sweet orange) citrus genotypes in response to CiLV-C, and to identify possible mechanisms involved in disease resistance. For this reason, before the biological experiments were set, we improved the detection of CiLV-C in the mite vector to ensure virus acquisition. The biological experiment consisted in four groups: susceptible or resistant genotype infested with CiLV-C viruliferous or nonviruliferous mites. In order to identify differentially expressed genes, we used microarray chips designed using the Citrus EST database (CitEST). The statistical analysis was performed by two-way ANOVA considering the genotype and the infection by CiLV-C, aiming to find defense responses against CiLV-C. The results were interpreted by Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) and led to the hypothesis that receptor-like proteins (RLP) and receptor-like kinase (RLK) may recognize the virus or the mite triggering a defense response based on 'Ca POT.2+' signature and activation of Salicylic acid pathway (SA). Further studies are necessary to evaluate if the defense response could be related to the development of systemic acquired resistance (SAR) / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Pacientes com câncer de mama apresentam menores níveis de 1,25(OH)2D3 ou 25(OH)D3 em relação às mulheres sem a doença. Embora linhagens de câncer de mama apresentem inibição do crescimento em concentrações supra-fisiológicas de 1,25(OH)2D3, forma ativa da vitamina D, ainda não se demonstrou se o hormônio exerce efeito antiproliferativo, em concentrações fisiológicas, em tumores de seres humanos. A suplementação de calcitriol pode ser indica a mulheres pós-menopausadas para prevenir a perda óssea. Nosso objetivo foi avaliar em pacientes com câncer de mama, pós menopausadas, a dimensão do tumor, taxa de proliferação (expressão de Ki67), concentração sérica de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3, expressão gênica tumoral do receptor de vitamina D (VDR) e alguns genes alvos como, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, antes a após um mês de suplementação oral de calcitriol. Foram estudadas 24 pacientes com doença operável, idade mediana de 57 anos. As primeiras 10 pacientes e as 14 seguintes receberam 0,25 e 0,50g/dia de calcitriol, respectivamente, por um período mediano de 31 dias. Três quartos das pacientes apresentavam nível sérico de insuficiência de 25(OH)D3 ou insuficiência relativa (<30ng/ml) e após a suplementação, nenhuma paciente apresentou elevação dos níveis séricos de 1,25(OH)2D3 e 25(OH)D3. Embora a dimensão tumoral, mensurada por ultrasonografia, não apresentasse variação, a imuno-expressão de Ki67 sofreu um redução relativa mediana de 40%. A expressão relativa de VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 não se alterou com a suplementação. Nossos dados indicam que tumores de mama expressam VDR, e que após suplementação oral de calcitriol, ocorre uma redução da proliferação. Este efeito merece ser elucidado, desde que genes alvo clássicos da 1,25(OH)2D3 não parecem ser mediadores do efeito anti-proliferativo, em amostras de câncer de mama de pacientes pós menopausadas. / Breast cancer patients present lower 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum levels than unaffected women. Although breast cancer cell lines are growth inhibited by vitamin D supra-physiological concentrations, there is much uncertainty about the anti-proliferative effect of physiological concentrations of 1,25(OH)2D3, the active form of vitamin D, in breast cancer specimens in vivo. Vitamin D supplementation to post-menopausal women may be indicated to reduce bone loss. Our aim was to evaluate tumor dimension, proliferation rate (Ki67 expression), 25(OH)D3 and 1,25(OH)2D3 serum concentration, and tumor expression of vitamin D receptor (VDR), and of some target genes as CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2, before and after a one month calcitriol supplementation to post-menopausal breast cancer patients. Twenty four patients with operable disease, median age 57 years, were enrolled. The first tem patients were supplemented with calcitriol 0.25g/d and the next 14 patients, with 0.50g/d, for a median period of 31 days. Three fourths of the patients presented 25(OH)D3 insufficiency or relative insufficiency (<30 ng/mL) and after calcitriol supplementation, none of them presented an elevation of 1,25(OH)2D3 or 25(OH)D3 serum concentration. Although tumor dimension, evaluated by ultrasonography, did not vary, a median relative reduction of 40% in Ki67 immuno-expression, was observed. No differences in VDR, CYP24A1, CYP27B1, IGFBP3, PHB, TGFB2, CDKN1A, CDKN1B, CYP27B1, MYC, CAMP, TXNRD2 mRNA relative expression were detected between pre and post-supplementation samples. No differences in VDR, CYP27B1 and CYP24A1 tumor relative expression were detected following supplementation. Our data indicate that VDR expression is detected in breast cancer samples and that growth inhibition takes place after calcitriol oral supplementation. This anti-proliferative effect deserves further investigation, as classical target genes do not seem to be involved.

A epilepsia é um transtorno do funcionamento cerebral caracterizado por crises epilépticas recorrentes que acomete cerca de 1 a 2% da população mundial. A epilepsia do lobo temporal (ELT) é o subtipo mais prevalente. A refratariedade aos medicamentos é comum e cerca de 40 % destes pacientes apresentam transtornos psiquiátricos. Neste trabalho utilizamos o método de TacMan real time PCR para quantificar o mRNA de subtipos dos receptores de noradrenalina, dopamina, serotonina e substância P em hipocampos cirurgicamente removidos de pacientes com ELT para conhecer o papel destes na ELT com ou sem comorbidade psiquiátrica (depressão ou psicose). Nossa amostra foi de 48 pacientes com ELT sem (Epilepsia - 24) ou com comorbidade psicótica (Psicose - 10) ou depressiva (Depressão - 14) e 8 Controles (necrópsias). O receptor adrenérgico-&#945;2A (AD2A) apresentou diferença entre os grupos (p = 0,0059) com significância para a variável Antiepiléptico (p = 0,0374) e pós-teste significante de maior expressão do mRNA de AD2A no grupo Epilepsia comparado com Controle e com Psicose. A ativação dos receptores &#945;2A no hipocampo pelos antiepilépticos pode explicar nossos achados do grupo Epilepsia comparado ao Controle, corroborando a literatura acerca do AD2A na epilepsia e em relação aos antiepilépticos. O AD2C mostrou diferença entre os grupos (p = 0,0016), sem significância nas variáveis de controle e significante maior expressão do mRNA de AD2C no grupo Epilepsia comparado ao Controle e Psicose. O AD2C é encontrado em áreas que processam informações sensoriais e controlam atividades motoras e emocionais relacionadas, o que pode explicar nossos resultados. Parece ser importante na patologia relacionada à ELT e merece ser estudado. A não diferença entre Epilepsia e Depressão para AD2A e AD2C, parecem confirmar uma relação bi-direcional ou um mecanismo patogênico comum entre epilepsia e depressão, enquanto a menor expressão de AD2A e AD2C nos psicóticos parece indicar diferenças nos mecanismos adrenérgicos ligados a psicose e epilepsia. D2 mostrou diferença entre os grupos (p = 0,0125) com resultado significativo para a variável Subtipo de Diagnóstico Psiquiátrico (p = 0,0239), provavelmente devido a cronicidade da doença e a quantidade de episódios depressivos apresentados pelos sujeitos. Quanto maior a freqüência das crises (p = 0,0381) maior a expressão do D2 no grupo Epilepsia e no Depressão comparados ao Controle. Estes achados sugerem a participação deste receptor na depressão comórbida na ELT; corroboram que o monitoramento dopaminérgico límbico pode ser útil para desenvolver novos antidepressivos e propõem pesquisas futuras sobre D2 em epilépticos. A participação de 5-HT2A na ELT é indicada, pois, sua maior expressão no grupo Epilepsia em relação ao Controle foi significativa (p = 0,0273). Quanto maior a freqüência das crises epilépticas maior a expressão do 5-HT2A (p = 0, 0433). Não encontramos resultados significativos referentes aos receptores D4, 5-HT1A, 5-HT2C e NK1. Nossos resultados mostraram a possibilidade da aplicação do TacMan real time PCR no estudo de receptores de neurotransmissores, sugeriu a importância dos receptores estudados na ELT e comorbidades psiquiátricas, e que outras estruturas límbicas, como a amígdala, sejam focos de investigação. / Epilepsy is a mental functional disorder characterized by recurrent seizures that affect about 1 to 2% of world population. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most prevalent subtype. The refractory to medication is common and about 40% of these patients have psychiatric disorders. This study used the TacMan real time PCR method to quantify noradrenergic, dopaminergic, serotoninergic and substance P receptors subtypes mRNA expression in hippocampus surgically removed from patients with TLE to know their role in TLE with or without psychiatric commorbity (depression or psychosis). Our sample consisted of 48 TLE patients without (Epilepsy - 24) or with psychotic (Psychosis - 10) or depressive (Depression - 14) commorbity and 8 Controls (necropsies). The &#945;2A adrenergic receptor (AD2A) showed difference between groups (p = 0.0059) with significance for Antiepileptic Medication variable (p = 0.0374) and post-hoc test significantly greater AD2A mRNA expression of Epilepsy group compared with Control and Psychosis. The activation of hippocampus &#945;2A receptors by antiepileptic drugs can explain our findings of the Epilepsy group compared with Control, corroborating the literature about the AD2A in epilepsy and for antiepileptic drugs. The AD2C showed differences between groups (p = 0.0016) without significance in the variables of control and significantly greater AD2C mRNA expression of the Epilepsy group compared to Control and Psychosis. The AD2C is found in areas that process sensory information and control motor and emotional related activities, which may explain our results. It seems to be important in the pathology related to TLE and deserves to be studied. No differences between Epilepsy and Depression to AD2A and AD2C seem to confirm a bi-directional relation or a common pathogenic mechanism between epilepsy and depression, while the lowest AD2A and AD2C expression within psychotics seem suggests differences in adrenergic mechanisms linked to psychosis and epilepsy. D2 showed differences between groups (p = 0.0125) with significant results for the variable Subtype of Psychiatric Diagnosis (p = 0.0239), probably due to chronic disease and the number of depressive episodes presented by subjects. The higher the frequency of seizures (p = 0.0381) the higher was the D2 expression within Epilepsy group compared with Control and Depression compared to Control. These findings suggest the involvement of this receptor in TLE commorbid depression; corroborate that limbic dopaminergic monitoring may be useful in developing new antidepressants and propose future research on D2 in epileptics. The participation of 5-HT2A in TLE is indicated, therefore its significant higher expression in the Epilepsy group in relation to Control (p = 0.0273). The higher the frequency of seizures the higher was the 5-HT2A expression (p = 0.0433). We found no significant results for the D4, 5-HT1A, 5-HT2C and NK1 receptors. Our results showed the possibility of TacMan real time PCR method application in TLE neurotransmission receptors study, suggested the importance of the studied receptors in TLE and psychiatric commorbities and that other limbic structures, as the amygdala, should be investigation targets.

O carcinoma diferenciado de tireóide (CDT) abrange 95% de todas as doenças malignas da tireóide. Nos EUA, aumentou em 2,4 vezes nos últimos anos (1973-2002). O seu tratamento inclui tireoidectomia total, seguido por terapia com radioiodo e supressão do TSH com L-tiroxina. A doença pode recidivar em ~20% dos casos, sendo necessária avaliação periódica através de exames de imagens e dosagem de tireoglobulina sérica (TGs). Os Anticorpos (Acs) anti-TG podem ser detectados em 15 a 25% dos pacientes, comprometendo, parcialmente, o uso da TGs como marcador de recidiva do câncer. Um método alternativo proposto para monitorar os pacientes é a detecção de células tireoidianas em sangue periférico, através da mensuração do RNA mensageiro de TG (RNAm-TG) pela técnica de RTPCR em tempo real. Esta nova metodologia aumenta a sensibilidade da detecção desta molécula. O objetivo deste estudo é verificar a significância da quantificação do RNAm-TG, como método diagnóstico complementar no acompanhamento a longo prazo de pacientes com CDT. Amostras de sangue de 45 pacientes (25 sem metástase, 14 com metástase ganglionar e 6 com metástase à distância) foram coletadas nos tempos: antes e 24, 48, 72 horas, 7 dias, 1, 3, 6, 9 meses, 1, 2, 4, 5, 6 e 7 anos após a dose ablativa de radioiodo. Foi realizada extensiva padronização da técnica com a finalidade de excluir interferências metodológicas, empregando dois genes controles interno (GAPDH e HPRT1) para o cálculo da concentração do RNAm-TG. Concomitantemente foi realizada a mensuração de TGs, perfil hormonal e de anticorpos anti-TG. A pesquisa de corpo inteiro, realizada 7 dias após a dose terapêutica, estabeleceu o estadio clínico inicial dos pacientes. Não foi possível estabelecer um valor de corte para o RNAm-TG. O RNAm-TG não diferenciou os estadios clínicos da doença ao longo do tempo, independente do gene controle interno utilizado, e tampouco quando analisaram-se os dados na presença de Acs anti-TG e TSH30ng/mL. A TGs diferenciou os estadios clínicos ao longo do tempo. Concluiu-se que, o RNAm-TG não é um bom marcador de recidiva do CDT, mesmo quando considerou-se critérios de padronização da técnica, avaliação em longo prazo e presença de Acs anti-TG, sendo assim não poderia ser utilizado como método diagnóstico complementar no acompanhamento de pacientes com CDT. Este estudo demonstra que a técnica de RT-PCR em tempo real é muito sensível perdendo especificidade, inviabilizando sua utilização no acompanhamento dos pacientes com CDT / The differentiated thyroid carcinoma (DTC) encloses 95% of all thyroid malignant disease. In USA, it increased 2,4 times in recent years (1973- 2002). The treatment includes total thyroidectomy, ablation with radioiodine (RAI) followed by TSH suppression with L-Thyroxine. The cancer recurrence occurs in 20% of the cases. Periodic evaluation through imaging examinations and serum thyroglobulin (TG) measurements by imunoassays method is recommended for careful follow-up of these patients. The anti-TG antibodies prevalence is 15-25% and would impair, partially, the serum TG use as a tumor marker. An alternative method to identify the recurrence of the tumor is the thyroid cells detection in peripheral blood, through the TG messenger RNA quantification (mRNA-TG) by real time RT-PCR. This new methodology increases the sensitivity detection for this molecule. The objective of this study was to verify the mRNA-TG peripheral blood quantification significance, as a complementary diagnostic method in the long term follow up of patients with DTC. Fourty five blood samples from patients with DTC have been collected before and 24, 48, 72 hours, 7 days, 1, 3, 6, 9 months, 1, 2, 4, 5, 6 and 7 years after the ablation therapy. Extensive technique standardization for mRNA-TG measurements was carried out to exclude methodological interventions and two housekeeping genes (GAPDH and HPRT1) were used to calculate the mRNA-TG concentrations. Concomitantly, serum TG measurements, hormonal profile and antibodies anti-TG assays were performed. The whole body scan was performed 7 days after RAI ablation to determine the stage of the disease. It was not possible to establish a cut-point value for mRNA-TG. The mRNA-TG did not differentiated the clinical stage of the disease in the long term follow-up and neither in the presence of anti-TG antibodies and TSH30ng/mL. Serum TG was able to differentiate the clinical stage of the patients during the follow-up. In conclusion mRNA-TG is not a good marker for the DCT recurrence, even when technical standardization, long term evaluation and the presence of antibodies anti-TG were considered. Thus it could not be used as a complementary diagnostic method in the DTC patients follow-up. This study confirmed the high sensivity of the real time RT-PCR whereas with very low specificity, consequently is unviable to be used in the DTC patients follow-up

Estudos sugerem que a presença de células metastáticas ocultas em medula óssea pode ser fator prognóstico em câncer de mama. Além disso, é possível que um perfil gênico tumoral específico, caracterizado por repressão da expressão gênica, esteja associado à detecção de células tumorais na medula óssea. O silenciamento de genes é controlado pela desacetilação de histonas e metilação de DNA, esta última catalisada por enzimas DNA metil transferases. Outro alvo de metil-transferases são as histonas, e histona H3 quando sofre metilação em lisina 9, gera sítio de ligação a proteínas HP1 (Heterocromatin protein-1 ou cromobox). Membros da família HP1 (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1HsY) participam da formação da heterocromatina e da regulação da expressão de genes. Logo, nosso objetivo foi determinar no tumor primário de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy , que participam da repressão gênica, em relação à presença ou ausência de células metastáticas ocultas na medula óssea. Neste estudo foram incluídas 37 pacientes de forma prospectiva, atendidas no Instituto Brasileiro de Controle do Câncer (IBCC) no período de junho de 2004 a julho de 2005, com diagnóstico histopatológico de carcinoma invasivo de mama, estádio clínico (EC) I (16,2%), II (51,4%) ou III (32,4%), segundo a classificação patológica. A idade mediana das pacientes foi 63 anos (41 a 90) e 62.2% delas encontravam-se na pós-menopausa, sendo que 24.3% relatava história familiar para câncer de mama. O tipo histológico predominante foi carcinoma ductal invasivo (89.2% dos casos), sendo, o restante, representado por carcinoma lobular invasivo (10.8%). Foram coletadas amostras de tumor primário de mama e de aspirado de medula óssea de cada paciente. A presença de células metastáticas ocultas (CMO) na medula óssea (MO) foi detectada através da expressão de citoqueratina 19 (CK19) pelo método de nested RT-PCR. A expressão relativa dos genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy foi determinada no tumor primário, usando-se a técnica de RT-PCR em tempo real. Presença de CMO foi detectada na MO de 20 pacientes (54.1%). Não observamos diferença na expressão de HP1Hs? (1,93 ± 2,25 MO- vs 3,84 ± 5,53 MO+), HP1Hs? (6,74 ± 6,31 MO- vs 6,49 ± 5,86 MO+) e HP1Hs? (24,58 ± 11,14 MO- vs 24,91 ± 15,88 MO+) entre as amostras tumorais de pacientes com presença (MO+) ou ausência (MO-) de micrometástase medular. Também não observamos variação da expressão de genes HP1 em relação ao comprometimento linfonodal, dimensão e grau histológico do tumor, expressão tumoral de receptores de estrógeno e estado menopausal da paciente. A expressão de HP1Hsalfa em tumores de pacientes com câncer de mama ERBB2 negativos, entretanto, foi maior do que em tumores ERBB2 positivos. Nossos dados indicam que em tumores de mama, a expressão de HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy não parece se associar à presença de células ocultas em medula óssea / Studies suggest that the presence of occult metastatic cells (OMC) in the bone marrow (BM) may be a prognostic factor in breast cancer. Besides, it is possible that a specific tumor gene profile, characterized by repression of gene expression, may be associated to the presence of tumoral cells in the bone marrow. Gene silencing is controlled by histone deacetylation and DNA methylation, the last one catalized by enzymes DNA methyltransferases (DNMTs). Histones are another target of methyltransferases, and methylation of histone H3 on lysine-9 generate a binding site for HP1 proteins (Heterocromatin protein-1 or chromobox). Members of the HP1 family (HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy) take part in heterochromatin formation and gene expression regulation. Hence, our aim was to determine in the primary tumor of the breast, the expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy, which participate in gene repression, in the presence or absence of occult metastatic cells in the bone marrow. In this study, 37 patients treated at Instituto Brasileiro de Controle do Câncer, from June 2004 to July 2005, with invasive breast cancer histopathologically confirmed, pathological clinical stages I (16,2%), II (51,4%) or III (32,4), were included. The median age of the patients was 63 years (41 to 90), 62.2% were post-menopausal and 24.3% reported family history of breast cancer. Invasive ductal carcinoma was diagnosed in most patients (89.2%), and invasive lobular carcinoma was detected in the other patients (10.8%). Tumor samples and bone marrow aspirates were obtained from each patient. The presence of CMO in BM was detected by keratin-19 (CK19) expression by nested RT-PCR. The relative expression of the genes HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy was determined by real-time RT-PCR. Occult metastatic cells (OMC) in BM were detected in 20 patients (54.1%). No differences were observed in the expression of HP1Hs? (1,93 ± 2,25 BM- vs 3,84 ± 5,53 BM+), HP1Hsalfa (6,74 ± 6,31 BM- vs 6,49 ± 5,86 BM+) and HP1Hsbeta (24,58 ± 11,14 BM- vs 24,91 ± 15,88 BM+) between tumor samples of BM+ patients and BM- patients. Variations of HP1 gene expression were neither observed according to lymph node involvement, tumor size, histological grade, estrogen receptor status and menopausal status. However, HP1Hsbeta expression in ERBB2-negative tumors was higher than in ERBB2-positive tumors. Our data indicate that in breast cancer tumors, expression of HP1Hsalfa, HP1Hsbeta e HP1Hsy does not seem to be associated with the presence of occult metastatic cells in the bone marrow

Pacientes com câncer de mama localmente avançado são submetidas à quimioterapia neoadjuvante na tentativa de reduzir a dimensão do tumor e aumentar a possibilidade da realização de uma cirurgia conservadora. Nosso grupo identificou previamente através da tecnologia de cDNA microarray, trios de genes, incluindo BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 e XLHSRF-1, cuja expressão era capaz de predizer a resposta à quimioterapia neoadjuvante com doxorrubicina e ciclofosfamida em pacientes com câncer de mama. No presente estudo, avaliamos se a expressão destes genes é reprodutível na identificação de pacientes responsivas e não-responsivas através de RT-PCR em tempo real, que representa uma técnica mais acessível. Avaliamos inicialmente amostras de 28 pacientes anteriormente estudadas (grupo de validação técnica = 23 responsivas e cinco não-responsivas) e a seguir um grupo de 14 novas pacientes (grupo de validação biológica = 11 responsivas e três não-responsivas). Dentre os trios de genes inicialmente identificados, a expressão de RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 e RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 classificou corretamente 86% (24/28) das amostras do grupo de validação técnica e 71% (10/14) das amostras do grupo de validação biológica, através de análise de classificação discriminante. Desse modo, esses trios não demonstraram a mesma precisão em comparação com resultados de cDNA microarray. Uma nova análise combinatória foi realizada na procura do melhor modelo preditivo utilizando valores de expressão obtidos por RT-PCR em tempo real. Identificamos então um novo trio, composto pelos genes RPL37A, SMYD2 e MTSS1, cuja expressão classificou corretamente 93% das amostras do grupo de validação técnica (22/23 responsivas e 4/5 não-responsivas) e 79% do grupo de validação biológica (8/11 responsivas e 3/3 não-responsivas). Portanto, o teste apresentou 88% de sensibilidade e especificidade em detectar pacientes responsivas para o total de amostras analisadas. Ao verificarmos o poder de classificação do mesmo grupo de genes, utilizando os valores de expressão pela análise de cDNA microarray, observamos um resultado semelhante (91% de sensibilidade e especificidade em reconhecer as amostras responsivas). Dessa forma, demonstramos que o perfil de expressão gênica obtido com cDNA microarray é reprodutível através do uso de RT-PCR em tempo real. Um estudo integrando um maior número de pacientes e uma plataforma de cDNA microarray mais abrangente pode auxiliar na identificação de um modelo preditivo baseado em grupos de genes mais acurado para antever a resposta ao tratamento com quimioterapia baseada em doxorrubicina. / Patients with locally advanced breast cancer are submitted to primary chemotherapy as an attempt to reduce tumor dimension and increase breast conserving surgery rates. Our group has previously identified through cDNA microarray technology gene trios, including BZRP, CLPTM1, MTSS1, NOTCH1, NUP210, PRSS11, RPL37A, SMYD2 and XLHSRF-1, whose expression was capable of predicting response to neoadjuvant chemotherapy with doxorubicin and cyclophosphamide in breast cancer patients. In the current study, it was evaluated whether expression of these genes is reproducible in the identification of responsive and non-responsive patients by real time RT-PCR, which represents a more accessible technique. We initially evaluated samples from 28 patients earlier studied (technical validation group = 23 responsive and 5 non-responsive) and subsequent to a new 14 patients set (biological validation group = 11 responsive and three non-responsive). Among the initially identified gene trios, RPL37A + XLHSRF-1 + NOTCH1 and RPL37A + XLHSRF-1 + NUP210 expression correctly classify 86% (24/28) samples from the technical validation group and 71% (10/14) samples from the biological validation group, through discriminant classification analysis. Therefore, these trios didnt demonstrate the same precision as compared with cDNA microarray results. A new combinatorial analysis was also performed in search of the best predictive model using real time RT-PCR expression values. A new trio was identified, represented by RPL37A, SMYD2 and MTSS1 genes, whose expression correctly classified 93% samples from technical validation group (22/23 responsive and 4/5 non-responsive) and 79% samples from biological validation group (8/11 responsive samples and 3/3 non-responsive samples). Therefore, the test presented 88% sensibility and specificity in identifying responsive patients for all samples analyzed. By means of verifying the classification strength of the same gene group, using cDNA microarray expression values, we observed a similar result (91% sensibility and specificity in recognizing responsive samples). Thus, we demonstrated that gene expression profile obtained by cDNA microarray is reproducible through real time RT-PCR. A study integrating a larger number of patients and a more comprehensive cDNA microarray platform may help the identification of a more accurate predictive model based on gene groups to foresee response to doxorubicin-based chemotherapy treatment.