Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 2007. / Vita. Includes bibliographical references (leaves 112-123).

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Made available in DSpace on 2014-06-11T19:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-02-16Bitstream added on 2014-06-13T20:24:56Z : No. of bitstreams: 1 silva_gn_dr_botfm.pdf: 930540 bytes, checksum: a962c4249ea11de03e0a230a9d385efb (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os agentes químicos utilizados para o tratamento do câncer ativam vias de sinalização que levam ao bloqueio ou retardo no ciclo celular, ativação ou desativação de mecanismos de reparo do DNA e apoptose. Entretanto, os mecanismos moleculares responsáveis por tais atividades ainda não foram completamente elucidados. Nesse contexto, os estudos de expressão gênica tornaram-se ferramentas importantes para a obtenção de informações que podem contribuir para o entendimento das respostas celulares frente à exposição a agentes neoplásicos e os mecanismos envolvidos na gênese e regressão de neoplasias. Em relação ao câncer de bexiga, a combinação de cisplatina/gencitabina é considerada como protocolo quimioterapêutico padrão. Entretanto, o mecanismo exato de ação dessas drogas ainda não foi completamente elucidado, principalmente no que diz respeito ao status do gene TP53, uma das principais alterações encontradas em câncer de bexiga. Com base nessas premissas, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da cisplatina e da gencitabina sobre o índice apoptótico, ciclo celular e padrão de expressão gênica, em 3 linhagens de células de carcinoma transicional de bexiga (RT4, TP53 selvagem, grau 1; 5637, TP53 mutado, grau 2; T24, TP53 mutado, grau 3). Para avaliar tais respostas celulares foram utilizados os ensaios de citotoxicidade, sobrevivência celular e clonogência, análise do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo, e análise da expressão gênica usando microarranjos de cDNA. Os resultados mostraram: 1) que as células TP53 selvagem (RT4) foram mais sensíveis à apoptose do que células TP53 mutadas quando tratadas com cisplatina e gencitabina, ou com a combinação de ambas; 2) parada permanente do ciclo em G1, nas três linhagens celulares, após tratamento com a gencitabina e com a combinação cisplatina/gencitabina... / Background: currently, the combination cisplatin/gemcitabine is considered a (second) standard chemotherapeutical protocol for bladder cancer. However, the mechanism by which these drugs act on tumor cells is not completely understood. Therefore, the aim of the present was to investigate the effects of these two antineoplastic drugs on the apoptotic index and cell cycle distribution in urinary bladder transitional cell carcinoma (TCC) cell lines with different TP53 status (RT4, with wild type TP53; 5637 and T24, with mutated TP53). Methods: cytotoxicity, cell survival and clonogenic survival assays, and flow citometry analysis for cell cycle and apoptosis cells were done in the cell lines treated with different concentrations of cisplatin and gemcitabine. Results: wild type TP53 cells were more sensitive to apoptosis than mutated TP53 cells when treated with cisplatin or gemcitabine; permanent G1 cell-cycle arrest was observed in the three cell lines after treatment with gemcitabine or with the combination of both; significant cell death was detected in all the cell lines after treatments with cisplatin or gemcitabine. However, when drugs were given in combinations, lower percentage of survival occurred independent on TP53 status. Conclusions: it was demonstrated that the combination of cisplatin and gemcitabine can be effective despite of tumor-associated TP53 mutations. Thus, the synergism between low concentrations of cisplatin and gemcitabine may have clinical relevance, since the use of high concentrations of cisplatin is toxic to the whole organism.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-02-25Bitstream added on 2014-06-13T20:36:38Z : No. of bitstreams: 1 cardoso_apf_me_botfm.pdf: 463235 bytes, checksum: f5c3dd035d2b9e83db6356001aa70012 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Diuron [3-(3,4-dichlorophenyl)-1,1-dimethylurea] is a herbicide that in a previous longterm study with Wistar rats fed at 2,500 ppm concentration showed high incidence of urothelial tumors in both genders. Accordingly, USEPA categorized Diuron as a “known/likely” human carcinogen. The accepted non-genotoxic mode of action (MOA) of Diuron encompasses urothelial necrosis induced by direct cytotoxicity, followed by regenerative cell proliferation and sustained urothelial hyperplasia that may favor neoplasia development. Scanning electron microscopy (SEM), light microscopy and labeling index are essentials tools for identification and classification of cytotoxic and proliferative changes in the bladder. The present study evaluated the dose-response of Diuron regarding urothelial lesions. Sixty male Wistar rats were fed Diuron for 20 weeks mixed in the diet at 0, 60, 125, 500, 1,250, or 2,500 ppm. Simple hyperplasia was significantly increased in the Diuron 1,250 and 2,500 ppm groups, and the cell proliferation at 2,500 ppm group. By SEM, the incidences and severity of lesions were significantly greater in the 500 and 1,250 ppm. Although numerically increased, the incidence of lesions in the 2,500 ppm group did not differ significantly from the control. The present study documented a doseresponse influence of Diuron on the rat urothelium, with a no observed effect level (NOEL) of 125 ppm.

Orientador: Daisy Maria Fávero Salvadori / Banca: Maria Inês de Moura Campos Pardini / Banca: Katia Ramos Moreira Leite / Banca: Daniel Araki Ribeiro / Banca: Paulo Peitl Júnior / Resumo: Os agentes químicos utilizados para o tratamento do câncer ativam vias de sinalização que levam ao bloqueio ou retardo no ciclo celular, ativação ou desativação de mecanismos de reparo do DNA e apoptose. Entretanto, os mecanismos moleculares responsáveis por tais atividades ainda não foram completamente elucidados. Nesse contexto, os estudos de expressão gênica tornaram-se ferramentas importantes para a obtenção de informações que podem contribuir para o entendimento das respostas celulares frente à exposição a agentes neoplásicos e os mecanismos envolvidos na gênese e regressão de neoplasias. Em relação ao câncer de bexiga, a combinação de cisplatina/gencitabina é considerada como protocolo quimioterapêutico padrão. Entretanto, o mecanismo exato de ação dessas drogas ainda não foi completamente elucidado, principalmente no que diz respeito ao status do gene TP53, uma das principais alterações encontradas em câncer de bexiga. Com base nessas premissas, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da cisplatina e da gencitabina sobre o índice apoptótico, ciclo celular e padrão de expressão gênica, em 3 linhagens de células de carcinoma transicional de bexiga (RT4, TP53 selvagem, grau 1; 5637, TP53 mutado, grau 2; T24, TP53 mutado, grau 3). Para avaliar tais respostas celulares foram utilizados os ensaios de citotoxicidade, sobrevivência celular e clonogência, análise do ciclo celular e apoptose por citometria de fluxo, e análise da expressão gênica usando microarranjos de cDNA. Os resultados mostraram: 1) que as células TP53 selvagem (RT4) foram mais sensíveis à apoptose do que células TP53 mutadas quando tratadas com cisplatina e gencitabina, ou com a combinação de ambas; 2) parada permanente do ciclo em G1, nas três linhagens celulares, após tratamento com a gencitabina e com a combinação cisplatina/gencitabina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Background: currently, the combination cisplatin/gemcitabine is considered a (second) standard chemotherapeutical protocol for bladder cancer. However, the mechanism by which these drugs act on tumor cells is not completely understood. Therefore, the aim of the present was to investigate the effects of these two antineoplastic drugs on the apoptotic index and cell cycle distribution in urinary bladder transitional cell carcinoma (TCC) cell lines with different TP53 status (RT4, with wild type TP53; 5637 and T24, with mutated TP53). Methods: cytotoxicity, cell survival and clonogenic survival assays, and flow citometry analysis for cell cycle and apoptosis cells were done in the cell lines treated with different concentrations of cisplatin and gemcitabine. Results: wild type TP53 cells were more sensitive to apoptosis than mutated TP53 cells when treated with cisplatin or gemcitabine; permanent G1 cell-cycle arrest was observed in the three cell lines after treatment with gemcitabine or with the combination of both; significant cell death was detected in all the cell lines after treatments with cisplatin or gemcitabine. However, when drugs were given in combinations, lower percentage of survival occurred independent on TP53 status. Conclusions: it was demonstrated that the combination of cisplatin and gemcitabine can be effective despite of tumor-associated TP53 mutations. Thus, the synergism between low concentrations of cisplatin and gemcitabine may have clinical relevance, since the use of high concentrations of cisplatin is toxic to the whole organism. / Doutor

Lesões na inervação do trato urinário inferior ocasionado por traumatismo raquimedular afetam geralmente o músculo detrusor e o esfíncteres uretrais. Estas alterações acarretam problemas basicamente de incontinência urinária e aumento da pressão intravesical, decorrente deste traumatismo, trazendo consequências para o funcionamento do sistema urinário superior. Quantificar os elementos fibrosos da matriz extracelular e fibras musculares das bexigas neurogênicas hiper-reflexas comparando-as com bexigas normais. Foram utilizadas 6 amostras de bexigas neurogênicas de indivíduos que foram submetidos a cirurgia de reparação por cistoenteroplastia realizados pelo serviço de urologia do Hospital Municipal Souza Aguiar, estas amostras foram fixadas imediatamente em solução tamponada de formalina a 10%. O controle com amostras iguais as do estudo extraída de cadáveres cuja causa morte não relacionava-se ao sistema urogenital macroscópicamente. O material foi submetido as seguintes técnicas histoquímicas: H&E, van Gieson e Resorcina Fucsina resorcina de Weigert com prévia oxidação pela oxona. Imunohistoquímica: anti-elastina. A observação dos cortes corados pelo van Gieson demonstrou uma diminuição significativa do músculo liso de 13% e aumento do colágeno em 72% e as fibras do sistema elástico um aumento de 101%. Conclusão. Nas bexigas neurogênicas hiper-reflexas o músculo detrusor e os elementos fibrosos da matriz foram profundamente modificados. As fibras do sistema elástico foram as mais afetadas. / Lesions on lower urinary tract innervations caused by spinal cord injuries usually affect the detrusor muscle and urethral sphincter. Beside the smooth muscle fibers, the collagen fibers and elastic system fibers, fibrous components of the extracellular matrix of the bladder wall, are strongly related to vesicle bladder compliance. For this reason the aim of this work is to quantify the fibrous elements of the extracellular matrix and muscle fibers of the neurogenic bladder hyperreflexia. Samples of neurogenic bladder were obtained from six men who had previously undergone surgical repair. The control group samples (n=6) were similarly obtained from patients whose deaths were not related to the urogenital system. The samples were stained using the following histochemical techniques: H&E, Van Gieson, Weigert and Sirius Red. Sections stained with Sirius Red were observed under polarization light microscopy to characterize possible different kinds of collagen. Immunohistochemical technique was used to characterize and quantify the elastic system fibers. Quantification analysis was performed by stereological methods. An increase of 72% of the collagen was observed. Nevertheless, the most significant difference observed was the raising of 101% of the elastic system fibers. Contrary the smooth muscle fibers showed a decrease of 13%. In the neurogenic bladder with detrusor hyperreflexia the fibrous elements of the extracellular matrix and smooth muscle fibers were greatly modified. The elastic system fibers seem to be the most affected in this disease.

A radioterapia é frequentemente utilizada no tratamento de tumores da próstata, porém durante esse procedimento a bexiga sadia usualmente sofre efeitos colaterais. Através do uso de um modelo animal para irradiação pélvica, avaliamos se a suplementação nutricional com L-glutamina poderia prevenir possíveis danos na parede da bexiga, especialmente em suas camadas mais superficiais. Ratos Wistar adultos machos com idade entre 3 e 4 meses foram separados em grupos de 8 animais: grupo controle que não recebeu a irradiação; grupos somente irradiados que foram mortos 7 (R7) e 15 dias (R15) após a irradiação (dose única de 10 Gy na região pélvico-abdominal); grupos irradiados e suplementados com L-glutamina (0,65g/kg de peso por dia), que foram mortos 7 (RG7) ou 15 após a irradiação. Células e vasos sanguíneos da lâmina própria, bem como o urotélio, foram avaliados com métodos histológicos. No urotélio foram feitas análises da altura e densidade nuclear e na lâmina própria densidade celular, densidade vascular e o número de mastócitos. Os resultados mostraram que em R7, a altura e densidade nuclear do urotélio e a densidade celular da lâmina própria não foram alterados significativamente. Entretanto a densidade dos vasos sanguíneos foi reduzida em 48% (p<0,05) e essa alteração foi evitada pela glutamina (p <0,02). No grupo R15, a densidade celular do epitélio aumentou em 35% (p<0,02). A densidade celular da lâmina própria não apresentou diferença estatística entre os grupos. Os mastócitos na lâmina própria foram reduzidos em R7 e R15. Apesar de ainda reduzidos em RG7 em RG15 houve aumento no número desse tipo celular o que sugere uma ação positiva da glutamina. Células &#945;-actina positivas na lâmina própria formam uma camada suburotelial e foram identificadas como miofibroblastos. A espessura dessa camada aumentou em R7, mas foi semelhante ao controle em RG7, enquanto alterações em R15 e RG15 foram menos evidentes. Esses resultados mostraram que a utilização da L-glutamina antes e após a radioterapia deve ser considerada para uso humano na proteção da bexiga contra os efeitos da radiação. / Radiotherapy is often used to treat prostate tumors, but the normal bladder is usually adversely affected. Using an animal model of pelvic radiation, we investigated whether glutamine nutritional supplementation can prevent radiation-induced damage to the bladder, especially in its more superficial layers. Male rats aged 3 to 4 months were divided into groups of 8 animals each: controls, which consisted intact animals; radiated-only rats, which were sacrificed 7 (R7) or 15 (R15) days after a radiation session (10 Gy aimed at the pelvico-abdominal region); and radiated rats receiving L-glutamine supplementation (0.65 g/kg body weight/day), which were sacrificed 7 (RG7) or 15 (RG15) days after the radiation session. Morphological and morphometric analysis of the urothelium were made. Nuclear density, lamina propria cell density and mast cells numbers per area were counted. The results showed that, in R7, epithelial thickness, epithelial cell density, and cell density in the lamina propria were not significantly affected. However, density of blood vessels in R7 was reduced by 48% (p < 0.05) and this alteration was mostly prevented by glutamine (p < 0.02). In R15, density of blood vessels in the lamina propria was not significantly modified. However, epithelial thickness was reduced by 25% (p < 0.05) in R15, and this effect was prevented by glutamine (p < 0.01). In R15, epithelial cell density was increased by 35% (p < 0.02), but glutamine did not protect against this radiation-induced increase. Cell density in the lamina propria was likewise unaffected in R15. Density of mast cells in the lamina propria was markedly reduced in R7 and R15. The density was still reduced in RG7, but a higher density in RG15 suggested a glutamine-mediated recovery. Alpha-actin positive cells in the lamina propria formed a suburothelial layer and were identified as myofibroblasts. Thickness of this layer was increased in R7, but was similar to controls in RG7, while changes in R15 and RG15 were less evident. In conclusion, pelvic radiation leads to significant acute and post-acute alterations in the composition and structural features of the vesical lamina propria and epithelium. Most of these changes, however, can be prevented by glutamine nutritional supplementation. These results emphasize, therefore, the potential use of this aminoacid as a radioprotective drug.

Orientador: Edson Antunes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T02:28:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leiria_LuizOsorio_M.pdf: 1930744 bytes, checksum: 214d355861ca93277cceba03b993e869 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: As disfunções do baixo trato urinário estão entre as complicações mais comumente associadas ao diabetes mellitus, e incluem urgência miccional, alterações da freqüência e incontinência urinária, hiperatividade e hipertrofia da bexiga, tornando complexos os procedimentos diagnósticos e terapêuticos. O mediador primário para a contração do músculo liso detrusor é a acetilcolina (Ach), sendo suas ações mediadas, principalmente, pelos receptores muscarínicos do subtipo M3 e M2, principalmente o subtipo M3. O receptor P2X1, ativado pelo trifosfato de adenosina (ATP), também participa da contração do detrusor; porém, com menor importância. Ambos promovem a contração através da mobilização de Ca2+ citosólico, seja pela formação de inositol trifosfato (IP3), seja pelo influxo de Ca2+ extracelular via canais de Ca2+ tipo L. Além destes mecanismos, os receptores M3 podem desencadear resposta contrátil independente da concentração de Ca2+ citosólico, através da sensibilização ao mesmo, a qual ocorre, principalmente, pela ação da enzima Rho-kinase. A despeito de sua grande relevância na contração da bexiga, até o presente, poucos estudos abordaram as alterações na homeostase do Ca2+ celular resultantes do diabetes mellitus. Além disso, a contribuição da uretra para a cistopatia diabética ainda é pouco compreendida e estudada. O objetivo deste trabalho foi investigar as alterações funcionais, morfológicas e moleculares do baixo trato urinário em camundongos C57BL/6 com diabetes induzida por estreptozotocina, bem como compreender o papel da uretra na fisiopatologia desta desordem. Para tanto, realizamos os seguintes experimentos: 1) análise histomorfométrica da bexiga; 2) estudo cistométrico; 3) concentração-resposta ao agonista muscarínico carbacol (na ausência e na presença do Y27632 ou nifedipina), ao agonista purinérgico ?,?-metileno ATP, cloreto de potássio (KCl) e ao cloreto de cálcio (CaCl2), assim como curvas freqüência-resposta à estimulação elétrica (1-32 Hz, 80 V, 10 segundos) em detrusor isolado, e montado em banho para órgão preenchido com solução de Krebs Henseleit; 4) curvas concentração-resposta ao agonista ?1-adrenérgico fenilefrina, bem como de relaxamento ao nitroprussiato de sódio, tadalafil e Bay 41-2272, em anéis de músculo liso de uretra; 6) expressão de RNAm de receptores muscarínicos M2 e M3, purinérgicos P2X1 e canais de Ca2+ tipo L em detrusor. Os animais diabéticos apresentaram aumento do peso da bexiga, da espessura da parede e do volume da mesma em relação aos camundongos controle. A densidade de tecido neural também foi maior no grupo diabético, enquanto nenhuma alteração foi verificada em relação à densidade de músculo liso e de colágeno. O estudo cistométrico revelou aumento da capacidade e complacência da bexiga nos animais diabéticos, assim como maior amplitude das contrações de micção, aumento da freqüência de micção e de contrações involuntárias. Estes ainda exibiram aumento da pressão intravesical pós-miccional, evidenciando uma perda da eficiência da micção. A contratilidade do detrusor isolado de camundongos diabéticos se mostrou maior em resposta ao carbacol, ?,?-metileno ATP, KCl, CaCl2 e estímulo elétrico. Para avaliar o papel dos canais de Ca2+ tipo L e da rho-quinase no aumento da resposta contrátil ao carbacol, realizamos curvas ao carbacol na presença do bloqueador de canal de Ca2+ tipo L, nifedipina (3 nM) ou do inibidor da rho-quinase, Y27632 (1 µM). A pré-incubação com nifedipina preveniu o aumento da contração no grupo diabético, enquanto na presença do Y27632 não houve redução significativa das contrações em ambos os grupos. A expressão de RNAm de receptores M3 foi significativamente maior no grupo diabético em comparação com o grupo controle, enquanto não foram observadas alterações significativas na expressão de receptores M2 e P2X1. Os camundongos diabéticos exibiram aumento significativo da expressão de RNAm de canais de Ca2+ tipo L. As curvas concentração-resposta em músculo liso de uretra revelaram aumento da contração em resposta à fenilefrina e redução do relaxamento ao doador de óxido nítrico (NO), nitroprussiato de sódio (SNP), no grupo diabético. Em suma, nossos dados mostram que o aumento da contração do músculo detrusor em camundongos diabéticos é devido ao aumento do influxo de Ca2+ extracelular através dos canais de Ca2+ tipo L e ao aumento da expressão de receptores muscarínicos M3. Além disso, o aumento da resistência mecânica da uretra resultou em perda da eficiência do esvaziamento da bexiga associada à hiperatividade da mesma / Abstract: Bladder dysfunction is among the most common and incapacitating complications of diabetes mellitus. The diabetes related lower urinary tract symptoms (LUTS) include overactive bladder, incontinence, urgency, frequency increase and bladder hypertrophy. Acethylcholine (ACh) is the main neurotransmitter responsible for the detrusor smooth muscle contraction, acting mainly at the muscarinic M2 and M3 subtypes. P2X1, through ATP stimuli, also contribute to void contractions. Both M3 and P2X1 activation triggers citosolic Ca2+ mobilization by triphosphate inositol (IP3) formation or extracellular Ca2+ influx through L-type Ca2+ channels. Activation of M3 receptors can also elicit contractile response through Ca2+ concentration-independent pathways. Despite the great importance of Ca2+ handling/homeostases to receptor-mediated bladder contractions, its contribution to diabetic cistopathy has been little studied. In addition, the contribution of urethra in diabetic cistopathy remains poorly comprehended. The present study was designed to evaluate the functional, structural and molecular alterations of detrusor and urethral smooth muscles (DSM) in streptozotocin-induced diabetic mice. The following experiments were performed: 1) Hystomorfometric measurements; 2) Cystometric study; 3) Contractile responses to the muscarinic agonist carbachol (in the absence and in the presence of nifedipine or Y27632), purinergic agonist ?,?-methylene ATP, KCl, CaCl2 and electrical field stimulation (EFS, 1-32 Hz, 80 V, 10 sec) in detrusor strips mounted in organ baths containing Krebs-Henseleit solution; 4) Concentration-response curves to the ?1-adrenergic agonist phenylefrine were performed in isolated rings of urethral smooth muscle and relaxant curves to sodium nitroprusside (SNP), tadalafil and Bay 41-2272; 5) Expression of mRNA of muscarinic receptors M3 and M2, purinergic P2X1 receptors and L-type Ca2+ channels in detrusor by real-time RT-PCR. Histomorfometric analysis revealed increased bladder weight, volume and wall thickness. Neural tissue density was also higher in diabetic mice, whereas smooth muscle and collagen density were not modified in both groups. Cistometric study revealed increases in bladder capacity and compliance in diabetic group, as well as higher peak pressure, micturition frequency and frequency of non-void contractions. Diabetic mice exhibited enhanced post-void pressure, indicating a decrease in bladder emptying efficiency. Detrusor contractile responses to carbachol, ?,?-methylene ATP, KCl, CaCl2 and EFS were significantly higher in diabetic mice. In order to evaluate the role of L-type Ca2+ channels and rho-kinase in the detrusor hypercontractility, contraction curves to carbacol were performed in the presence of L-type Ca2+ channel blocker nifedipine (3 nM) or the rho-kinase inhibitor Y27632 (1 µM). Pre-incubation with nifedipine prevented the increased carbachol-induced detrusor contractions seen in the diabetic mice, while Y27632 did not significantly affect the detrusor contractions in both groups. Levels of mRNA of M3 receptor and L-type Ca2+ channels were significantly increased in diabetic animals, while M2 and P2X1 mRNA expression were not modified in both groups. Concentration-response curves in urethral smooth muscle revealed an increased contractile response to phenylefrine, and a reduction on the relaxant responses to nitric oxide donor, sodium nitroprusside (SNP), in diabetic group, indicating an enhanced urethral resistance by diabetes. In conclusion, our data shows that the overactive detrusor in diabetes is likely to be due an increase in extracellular Ca2+ influx through L-type Ca2+ channels and an enhanced M3 muscarinic expression. Moreover, the higher urethral mechanical resistance result in decrease of the bladder emptying efficiency in diabetic mice associated to detrusor overactivity / Mestrado / Mestre em Farmacologia