Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2009. / Submitted by Allan Wanick Motta (allan_wanick@hotmail.com) on 2010-04-15T13:27:21Z No. of bitstreams: 1 2009_RitadeCassiaPereiraCarvalho.pdf: 2361769 bytes, checksum: ee31b12b9ddcc84d89f8251635fde1d1 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-05-05T19:12:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_RitadeCassiaPereiraCarvalho.pdf: 2361769 bytes, checksum: ee31b12b9ddcc84d89f8251635fde1d1 (MD5) / Made available in DSpace on 2010-05-05T19:12:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_RitadeCassiaPereiraCarvalho.pdf: 2361769 bytes, checksum: ee31b12b9ddcc84d89f8251635fde1d1 (MD5) Previous issue date: 2009-04 / O tomateiro é uma das hortaliças mais importantes no Brasil tanto em área cultivada como pela importância sócio-econômica, entretanto o seu cultivo no país e no mundo tem sido severamente afetado por espécies de Begomovirus (família Geminiviridae). Estes vírus são transmitidos eficientemente pela mosca-branca (Bemisia tabaci), importante insetopraga, responsável por perdas quantitativas e qualitativas nesta cultura. Espécies de Begomovirus podem apresentar o genoma constituído por um ou dois componentes genômicos (DNA-A e DNA-B), sendo denominados monopartidos e bipartidos respectivamente. A maioria das espécies do complexo viral conhecido como Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) apresenta genoma monopartido, entretanto, espécies relatadas no Brasil são de begomovírus bipartidos, cuja incidência e severidade foram significativamente ampliadas com a introdução no país do biótipo B de B. tabaci, que contribuiu também para o aumento da diversidade de espécies destes vírus no país. Devido a essa grande diversidade de espécies virais, aliada à desvantagens de controle químico do vetor, a melhor opção para o controle de begomovírus vem sendo o emprego de cultivares resistentes ao vírus e/ou ao vetor. Programas de melhoramento tem se baseado na introgressão de genes de resistência presentes em espécies silvestres de Solanum para a espécie cultivada S. lycopersicum. Recentemente foi identificada no Brasil (Embrapa Hortaliças) uma fonte de resistência recessiva monogênica (gene tcm-1) na linhagem de tomate TX-468-RG de S. lycopersicum, derivada do híbrido Tyking, frente à begomovírus monopartidos e bipartidos. Esta resistência se caracteriza pela ausência de sintomas de infecções virais e limitação da acumulação sistêmica de vírus nos tecidos infectados. TX-468-RG constitui uma fonte promissora para programas de melhoramento, no entanto, marcadores moleculares para esse gene ainda não estão disponíveis limitando a incorporação deste locus tcm-1 em linhagens de tomateiro via melhoramento assistido. Neste contexto, este trabalho visou aprofundar a caracterização da resistência presente em TX-468-RG. Inicialmente, avaliou-se o comportamento de cinco híbridos comerciais de tomate para indústria, amplamente cultivados no Brasil Central, e do híbrido HEI-036 (contendo o gene Ty-1 em heterozigose) em diferentes épocas de infecção por Tomato severe rugose virus (ToSRV). Diferenças significativas para a maioria dos componentes analisados foram detectadas entre grupos contrastantes de inoculação. O híbrido HEI-036 mostrou-se promissor exibindo resistência ao ToSRV, além de alto potencial produtivo. Observou-se também que plantas expostas a pressões elevadas de moscas-brancas virulíferas até os 36 dias após semeadura apresentaram perdas severas de produtividade, podendo esse dano ser atenuado via utilização de técnicas adequadas de manejo em combinação com a adoção de cultivares com resistência genética (ex. gene Ty-1) (Capítulo 2). No Capítulo 3, acessos de Solanum (seção Lycopersicon) foram avaliados em busca de resistência simultânea a begomovírus e nematóides, dois dos principais grupos de patógenos que causam prejuízo `a cultura do tomateiro. Considerando que genes de resistência a begomovírus podem estar ligados em repulsão com o gene que confere resistência a Meloidogyne spp., buscou-se obter resistência simultânea a esses patógenos. O begomovírus bipartido Tomato rugose mosaic virus, ToRMV, os monopartidos Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV e Tomato yellow leaf curl Sardinia virus, TYLCSV, bem como as espécies Meloidogyne incognita e M. javanica foram usados na avaliação de resistência. Alguns acessos combinaram alto nível de resistência a begomovírus e também a nematóides. Para begomovírus, observou-se uma diversidade de fatores de resistência mediando a reação dos acessos testados frente à infecção de begomovírus bipartidos e monopartidos no gênero Solanum (Seção Lycopersicon). Neste trabalho, fontes de resistência à mosca-branca também foram avaliadas usando como critério de seleção a redução do número de ovos e pupas presentes em amostras foliares. O acesso LA 716 apresentou elevados níveis de resistência à mosca-branca (Capítulo 4). Aspectos epidemiológicos e possíveis mecanismos envolvidos na infecção por begomovírus foram avaliados estudando o efeito de uma linhagem resistente de tomate na dispersão do vírus pelo vetor e na translocação viral nos tecidos infectados de plantas resistentes. Estudos foram conduzidos com a linhagem TX- 468-RG, resistente a begomovírus monopartidos e bipartidos. A resistência de TX-468- RG a Tomato yellow leaf curl virus-Israel (TYLCV-IL) resultou na restrição da acumulação viral, inclusive em condições de fluxo contínuo de vírus, bem como resultou na redução da dispersão primária e secundária do vírus. Os resultados permitem concluir que a incorporação e o uso desta fonte de resistência poderão ter impactos epidemiológicos positivos no manejo das espécies virais limitando a dispersão dos vírus em condições de campo (Capítulo 5). Como TX-468-RG também demonstrou ser resistente a espécies de begomovírus bipartidos devido a não manifestação de sintomas e redução da acumulação viral, o mesmo impacto epidemiológico é esperado no manejo de begomovírus bipartidos empregando-se essa fonte de resistência. Para determinar se o (s) mesmo (s) fator (es) genético (s) presente em TX-468-RG controla (m) resistência à espécies de Begomovirus monopartidos e bipartidos, avaliaram-se famílias F2:3 frente ao TYLCV-IL. Os resultados confirmaram uma herança monogênica recessiva mediando a resistência a monopartidos, e esses dados serão posteriormente, comparados com a avaliação das mesmas famílias F2:3 frente a begomovírus bipartidos, que será realizada no Brasil sob condições controladas (Capítulo 6). O Capítulo 7 apresenta os dados sobre a identificação de marcadores do tipo RAPD associados com resistência a begomovírus bipartido encontrada na linhagem TX- 468-RG (locus tcm-1). Foram testados 520 primers da OPERON nos parentais suscetível e resistente e na população segregante F2 proveniente do cruzamento Ohio 8245 x TX-468-RG. Após avaliações sucessivas desse conjunto de primers, sete marcadores RAPD foram identificados ligados em associação e em repulsão com a região genômica contendo locus tcm-1. A informação de sequências destes amplicons RAPD poderá ser utilizada na síntese de primers para convertê-los em outra classe de marcadores mais estáveis (SCARs) para serem utilizados em uma plataforma de seleção assistida visando monitorar a incorporação da resistência derivada de TX-468-RG em linhagens elite de tomate. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Tomato represents of one of the most an important horticultural crops cultivated in Brazil. This crop has been drastically affected by Begomovirus (family Geminiviridae) infection. These viruses are efficiently transmitted by the whiteflys (Bemisia tabaci) causing severe damages to the crop. The Begomovirus comprises viruses with a circular ssDNA genome, and could be divided in monopartite and bipartite species according to their genome composition (DNA-A and/or DNA-B). The Tomato yellow leaf curl disease (TYLCD) complex comprises several species of monopartite begomoviruses and Tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) is considered the prevalent and the most severe begomovirus species in tomatoes growing areas. In Brazil, so far, only bipartite begomoviruses have been reported. Their incidence and severity in the country has drastically increased after the introduction of the biotype B of B. tabaci. This new vector also contributed for increasing diversity of begomovirus species. Due to begomovirus diversity and the difficulties to control their vector, breeding strategies aiming to introgress resistance to begomoviruses from wild species of Solanum to cultivated S. lycopersicum has been considered the best control measure. Recently, a recessive resistance to monopartite and bipartite begomoviruses found in the Brazilian line TX-468-RG conferred by the tcm-1 gene derived from the hybrid Tyking was identified. This resistance is characterized by absence of symptoms and restriction of virus accumulation in infected tissues. Therefore, TX-468-RG represents an important source of begomovirus resistance. However, no molecular markers are available to be used in assisted breeding for introgression of the tcm-1 locus into elite tomato lines. In this context, this work aimed to further characterize the resistance present in the line TX-468-RG comparing this gene with other resistance genes available in commercial lines of tomato. Firstly, the performance of five commercial hybrids for tomato processing largely cultivated in Central Brazil and the hybrid HEI-036 (harboring the Ty-1 gene) were compared at different times of infection by Tomato severe rugose virus (ToSRV) before and after transplanting to the field. Significant differences in all agronomical parameters analyzed were observed among the materials. The hybrid HEI- 036 demonstrated the best performance showing resistance to ToSRV, in addition, to high fruit yield. The plants exposed to high population of viruliferous whiteflies until 36 days after sowing showed a drastic reduction in tomato production; however, a correct management by adopting cultivation measures and genetic resistance (eg. Ty-1 gene) could reduce these losses (Capítulo 2). In Chapter 3, Solanum accessions were evaluated for simultaneous resistance to begomoviruses and nematodes, considering that resistance genes to these two pathogen groups seem to be present in a repulsion-linkage phase. Monopartites (Tomato yellow leaf curl virus - TYLCV and Tomato yellow leaf curl Sardinia virus - TYLCSV) and bipartites (Tomato rugose mosaic virus- ToRMV) begomoviruses and Meloidogyne (M. incognita and M. javanica) species were employed for screening for simultaneous resistance. Few accessions combined high resistance levels to begomoviruses and nematodes. The performance of the accessions challenged with begomoviruses, indicated the possible existence of several host determinants driven the resistance to monopartite and bipartite begomoviruses in these accessions of Solanum (Section Lycopersicon) tested. In this work, resistance to the whiteflies were also assayed, based on reduction of the insect colonization (measured by the amount of eggs and pupae found in infested leafs). The accession LA 716 presented high levels of resistance to the whiteflies (Chapter 4). The effects on virus epidemiology and the possible mechanisms involved in virus resistance were studied by using the resistance line TX-468-RG harboring the tcm-1 gene. The resistance of TX-468-RG to the monopartite Tomato yellow leaf curl virus - Israel (TYLCV-IL) resulted in restriction of virus accumulation in infected tissues even under a constant virus supply (by grafting of infected tissues). Also, the use of this resistant line reduced primarily and secondary virus dispersion by the vector. These results suggest that the use of resistant lines could have a positive impact by reducing virus spread under field conditions. (Capítulo 5). Since TX-468-RG also showed resistance to bipartite begomoviruses, similar epidemiological impact could be expected by using this resistance line to control these viruses. Aiming to determine if the same genetic determinants are responsible for the resistance to monopartite and bipartite begomoviruses, F2:3 families derived from Ohio 8245 x TX-468-RG were challenged with TYLCV-IL. The results confirmed the recessive monogenic genetic control of this resistance and these results will be compared with the same experiments that will be performed in Brazil with the bipartite begomoviruses (Capítulo 6). The Chapter 7 presented the data obtained after evaluation of 520 primers (OPERON family) using a segregant F2 population originated from the crossing between Ohio 8245 and TX-468-RG. After a massive RAPD evaluation, a set of seven primers found in association or repulsion with the genomic region potentially hosting the loci of tcm-1 was selected. Further sequencing information of these amplicons, will allow the these conversion RAPD by markers to SCAR markers, which are much more stable and useful for introgressing the resistant determinants derived from TX-468-RG into elite tomato lines.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2010. / Submitted by Jaqueline Ferreira de Souza (jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:23:41Z No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Approved for entry into archive by Jaqueline Ferreira de Souza(jaquefs.braz@gmail.com) on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-04-16T23:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_BrunaCarolinaCastroBatista.pdf: 4362150 bytes, checksum: 854cb36bf2a23c796b0a170ab50d7866 (MD5) / O vírus causador da febre amarela (YFV) é um membro da família Flaviviridae e importante arbovírus patogênico ao homem. O diagnóstico da febre amarela é importante tanto para medidas de saúde pública como também para o tratamento adequado dos pacientes, já que os sintomas iniciais são típicos de outras doenças virais infecciosas. A glicoproteína do envelope (E) desse vírus é a maior determinante da imunogenicidade viral e da resposta imunológica do hospedeiro. Neste trabalho, a proteína do envelope do vírus da febre amarela foi expressa fusionada com a proteína poliedrina (POLH) dos corpos de oclusão do baculovírus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) em células de inseto pela infecção com um baculovírus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinante. Primeiramente, foi construído um vetor baculoviral modificado para expressão de proteínas heterólogas fusionadas à POLH, o pFastAgPol. O fragmento de DNA contendo o gene da poliedrina (polh) do AgMNPV foi amplificado e, em seguida, transferido para o plasmídeo comercial pFASTBac1¿ (Invitrogen). Utilizando o sistema Bac-to-Bac (Invitrogen), o AcMNPV recombinante contendo o gene polh de AgMNPV foi construído (vAcPolAg). Células de inseto foram infectadas pelo vAcPolAg, e a expressão da proteína recombinante analisada por microscopia de luz, SDS-PAGE e Western blot. A proteína foi detectada por Western-blot, mas não houve a formação de corpos de oclusão. Um fragmento de DNA contendo o gene do envelope do YFV foi clonado no vetor de transferência pFastAgPol, em fase com o gene polh, para ser expresso como uma proteína de fusão e inserido no genoma do AcMNPV. Células de inseto também foram infectadas com o AcMNPV recombinante (vAcPolAgEnv) e a expressão da proteína recombinante foi analisada por SDS-PAGE e Western blot, que detectou um polipeptídeo de aproximadamente 88 kDa, correspondente à fusão da proteína E do vírus amarílico com a POLH de AgMNPV. Entretanto, também não ocorreu a formação de corpos de oclusão. As células infectadas com os dois recombinantes também foram analisadas por microscopia de luz, de transmissão e pelo microscópio confocal. A não formação de corpos de oclusão pode ter sido causada, no caso do vAcPolAg, pela substituição do sítio de terminação do gene polh por um sítio de clonagem para a fusão do gene E, o que resultou na introdução de 41 amino ácidos no C-terminal da POLH. No caso do vírus contendo a proteína de fusão, POLHENV, a própria fusão pode ter resultado na formação de uma proteína incapaz de formar corpos de oclusão pelas mudanças conformacionais. A construção dos vírus recombinantes, vAcPolAg e vAcPolAgEnv, e a expressão das proteínas fusionadas foram bem sucedidas demostrando o potencial do sistema baculoviral para o desenvolvimento de técnicas alternativas de diagnóstico e produção de vacinas utilizando partes virais. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yellow fever virus (YFV), a member of the family Flaviviridae, is an important arbovirus pathogenic to humans. The yellow fever diagnosis its important not only to public health measures but also to patients proper treatment, once the initial symptoms are similar to others viral infectious diseases. The envelope glycoprotein (E) of this virus is the major imunogenicity and host immune response determinant. In this work, the yellow fever virus envelope protein was expresse fused to the protein polyhedrin (POLH) of the baculovirus Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus (AgMNPV) occluded bodies in insect cells by the infection of a baculovirus Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) recombinant. First, was constructed a modified baculoviral vector (pFastAgPol) for heterologous protein expression fused to POLH. The DNA fragment containing the AgMNPV polyhedrin gene (polh) was amplified and then transferred to a commercial plasmid pFASTBac1™ (Invitrogen).Using the Bac-to-Bac system (Invitrogen), the AcMNPV recombinant containg the AgMNPV polh gene was constructed (vAcPolAg). Insect cells were infected with vAcPolAg and the protein expressed was analyzed by light microscopy, SDS-PAGE and Western blot. The protein was detected by Western-blot but was not capable of forming occlued bodies. A DNA fragment containing the envelope gene of YFV was cloned into the transfer vector pFastAgPol, in frame with the polh gene, in order to be expressed as a protein fusion, and inserted into the AcMNPV genome. Insect cells were also infected with the AcMNPV recombinant (vAcPolAgEnv) and recombinant protein expression was analyzed by SDS-PAGE and Western-blot which detected a polypeptide around 88kDa, corresponding to the fusion of the yellow fever virus protein E with the AgMNPV POLH. However, threre were no formation of occlusion bodies either. Infected cells with the two recombinants also were analyzed by light, electron and confocal microscopy. The lack of occlusion body formation, in the case of vAcPolAg, could have been due to the substitution of the stop codon of the polh gene by a restriction site for the fusion with the E gene which resulted in the introduction of 41 amino acids to the C-terminal end of POLH. In the case of virus containing the fusion protein POLHF, the fusion itself could be responsible for the formation of a protein uncapable of forming occlusion bodies due to conformational changes. The construction of recombinant viruses, vAcPolAg vAcPolAgEnv, and expression of fused proteins were successful, demonstrating the potential of the baculoviral system for the development of alternative techniques of diagnosis and production of viral vaccines using parts of it.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2009. / Submitted by Elna Araújo (elna@bce.unb.br) on 2011-05-30T22:18:31Z No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Approved for entry into archive by Luanna Maia(luanna@bce.unb.br) on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Made available in DSpace on 2011-06-05T18:39:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_SandraElisadeSousaCarvalho.pdf: 2803738 bytes, checksum: 3efd571bb5405a3e71ba15228b2dcc0f (MD5) / Dengue é uma importante arbovirose causada pelo vírus do dengue (DENV; Família Flaviviridae, Gênero Flavivirus). Notável aumento no número de casos de dengue e dengue hemorrágica foi registrado nas Américas. Neste estudo foi descrito a diversidade de sequências de diferentes genomas completos de DENV-1 e a inferência filogenética de vírus isolados na América. Dois isolados brasilienses (Distrito Federal, Brasil) de DENV-1 foram identificados em testes utilizando anticorpo policlonal e monoclonal. Os vírus foram amplificados in vitro em células C6/36 de Aedes albopictus. O RNA genômico desses isolados (DF01 e DF02) foram amplificados usando pares de oligonucleotídeos específicos para DENV-1 por RT-PCR. O genoma foi dividido em três fragmentos de cDNA que se sobrepõem e os cDNA amplificados foram clonados em pCR4-TOPO. O DNA plasmidial foi purificado e a sequência de nucleotídeos determinada. DF01 e DF02 foram completamente sequenciados e suas sequências comparadas a um grupo de dados representativo da diversidade genotípica americana de DENV-1 e a um isolado de Singapura, geneticamente distinto dos genótipos de circulação americana. Embora sejam observadas consideráveis diferenças em sequências de aminoácidos presentes em regiões importantes, vários elementos chaves (sítios de glicosilação, pontes disulfeto e sequências características a domínios funcionais de proteínas) foram completamente conservados. Análises filogenéticas indicaram a existência de um grupo monofilético dividido em dois sub-grupos na população de DENV-1 circulante na América Latina, relacionando a sua distribuição geográfica. Foram descritos três potenciais eventos de recombinação entre os isolados analisados, um destes ocorreu no novo vírus identificado DF01. Nossas análises de sequências genômicas completas de populações geograficamente estruturadas e com baixa diversidade na América Latina produziram forte evidência de recombinações relativamente difundidas. Os clones obtidos com fragmentos genômicos de DENV-1 utilizados no estudo, foram transferidos para um vetor modificado para o possível desenvolvimento de cDNA infeccioso. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Dengue is an important arboviral disease caused by dengue viruses (DENV; Family Flaviviridae, Genus Flavivirus). A dramatic increase in the number of dengue fever and hemorrhagic dengue cases had been reported in the American continent. In this work we describe the diversity found in full-length DENV-1 sequences and phylogenetic inference of dengue virus isolated in Americas. Two DENV-1 isolates form Brasília (Federal District, Brazil), were identified using polyclonal and monoclonal antibody-assay. The viruses were amplified in vitro in an Aedes albopictus C6/36 cell line. Genomic RNA of those isolates (DF01 e DF02) were amplified using specific primer pairs for DENV-1 by RT-PCR. The genome was divided into three overlapping cDNA fragments, and amplified cDNA was linked into pCR4-TOPO. Plasmid DNA was purified and nucleotide sequences were determined. DF01 and DF02 were completely sequenced and compared to a data set of full genomic sequence of DENV-1, that represent the genotypic diversity of this serotype, and one sequence from Singapura, used as outgroup. Although our genetic analyses revealed considerable differences at protein levels, several key elements (i.e. disulfide bridges, glycosylation sites and protein functional domains) were fully conserved. Phylogenetic analysis indicated the existence of one monophyletic Latin American cluster (LA) which could in turn be divided into two major sub-clusters, characterized by a geographical subdivision. We found three recombination events among all DENV examined sequences, one of the new full length genome described here was apparently recombinant. Our analysis of full genome sequences samples of DENV-1 population geographically structured and with low-diversity in Latin American has yielded strong evidence of relatively pervasive recombination. The clones obtained with DENV-1 subgenomic fragments used in this study, were transferred into lowcopy plasmid modified for the possible construction of an infectious cDNA clone.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Luiza Moreira Camargo (luizaamc@gmail.com) on 2011-07-04T17:47:09Z No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Approved for entry into archive by Elna Araújo(elna@bce.unb.br) on 2011-07-08T00:40:42Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-07-08T00:40:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NidayAllineNunesFernandes.pdf: 4304016 bytes, checksum: 19ab08c8d2743f9b7e0e0637e8bf1295 (MD5) / Até o inicio da década de 1990 as begomoviroses apresentavam ocorrência esporádica e sem importância econômica no tomateiro (Solanum lycopersicum L.). No entanto, um complexo de espécies de Begomovirus foi identificado no Brasil após a introdução no país de Bemisia tabaci biótipo B. Um elevado grau de relacionamento genético tem sido observado entre algumas espécies de Begomovirus reportadas em tomateiro e aquelas registradas em plantas invasoras associadas com o cultivo desta hortaliça. Desta forma, existem fortes evidências de transferência natural de segmentos genômicos entre as espécies virais presentes nestas diferentes plantas hospedeiras. O cultivo de tomateiro para consumo in natura no Brasil é conduzido em uma grande amplitude de condições agroclimáticas incluindo a região Amazônica, a Zona da Mata e o Semi-árido nordestino, a região do „Cerrado‟ (no Centro-Oeste) e, principalmente, as condições subtropicais do Sudeste e Sul do país. O objetivo deste trabalho foi prospectar e caracterizar a variabilidade genética das espécies de Begomovirus registradas na cultura do tomateiro para consumo in natura no Brasil (no período entre 2001 e 2010) e em duas plantas daninhas dos gêneros Cleome (presente em regiões de clima quente) e Leonurus (presente em regiões subtropicais). Os isolados foram caracterizados via PCR com primers universais para segmentos conservados do DNA-A e DNA-B e via sequenciamento de um segmento do DNA-A. Estes „primers‟ foram desenhados para anelar com sequencias conservadas presentes na região 5‟-terminal do gene AV1 (CP) e na região 3‟-terminal do gene AC1 (Rep), englobando uma região com 1100 pares de base. Duzentas e cinquenta e duas amostras foliares de tomateiro foram coletadas nas principais áreas produtoras nas cinco regiões do Brasil. Os resultados indicaram que todos os isolados de tomateiro apresentam genoma bipartido, não havendo ainda nenhum registro de espécies de genoma monopartido. Existe uma aparente regionalização das espécies virais, com algumas sendo predominantes em condições de clima mais quente e outras em condições de clima subtropical. As espécies Tomato golden mosaic virus (descrita antes do ingresso do biótipo B no Brasil) e Tomato yellow spot virus não foram detectadas neste levantamento. Sete potenciais novas espécies, ainda não descritas anteriormente, estão emergindo no país, sendo que algumas já apresentam ampla distribuição geográfica enquanto que outras ainda vêm se mantendo de maneira endêmica. Existem algumas estirpes que estão divergindo dos isolados das espécies originais a ponto de representarem potenciais novas espécies. Estirpes de espécies de Begomovirus reportadas inicialmente em outras plantas cultivadas e/ou plantas daninhas estão aparentemente se adaptando e infectando tomateiro. No gênero Cleome foi identificado um complexo de isolados contendo pelo menos três novas espécies filogeneticamente relacionadas com vírus presentes infectando plantas do gênero Sida (Malvaceae) e com a espécie Tomato yellow spot virus (ToYSV). Os isolados de L. sibiricus apresentaram elevada identidade (95,1 a 97,1%) com estirpes de ToYSV (previamente descritas infectando tomateiro e feijoeiro). Desta forma, L. sibiricus é uma hospedeira de isolados de begomovírus que apresentam estreita relação genética com espécies infectando plantas cultivadas no Brasil. De modo geral, os resultados obtidos confirmam a extraordinária variabilidade de Begomovirus de genoma bipartido do Novo Mundo e o complexo cenário que ainda permanece na etiologia das begomoviroses do tomateiro. Este estudo ainda reforça a importância das plantas daninhas e nativas da flora como fontes de material genético viral necessário para a emergência de novas espécies com diferentes características biológicas, ecológicas e moleculares. _________________________________________________________________________________ ABSTRACT / In Brazil, the begomoviruses in tomatoes (Solanum lycopersicum L.) were minor diseases up to the 1990´s. However, an extremely diverse complex of Begomovirus species has arised after the introduction into the country of the whitefly Bemisia tabaci biotype B. The high degree of relationship of some tomato and weed-infecting begomoviruses suggests a natural transfer of genetic material among these viral isolates. In Brazil, fresh-market tomatoes are grown under a wide array of agroclimatic conditions ranging from warm and humid equatorial area in the Amazon River Basin to the semi-arid Northeast region. It is also cultivated in the dry and mild climates of the Brazilian Savannah (“Cerrado”) in Center-West region and mainly in the subtropical mild climates of Southeast and South regions. The main objective of the present work was to evaluate the nation-wide genetic variability of Begomovirus species infecting fresh-market tomatoes during the years 2001 and 2010 and also in two genera of weed plants: Cleome (present in warm regions) and Leonurus (present in subtropical areas). This survey was done via PCR with universal primers targeting conserved regions of both DNA-A and DNA-B components and via sequencing analysis of a PCR amplicon of 1100 base pairs encompassing a region of the DNA-A component between the 5‟-end of the AV1 (CP) gene and the 3‟-end of the AC1 (Rep) gene. Two-hundred-fifty two leaf samples were collected in the main tomato production areas in all Five Brazilian regions. All isolates had bipartite genome with no report of monopartite species. Some viral species formely described in Brazil were not detected in this survey, including Tomato golden mosaic virus (described before the entrace of the biotype B) and Tomato yellow spot virus. There is a geographic distribution of some viral species displayed a regional pattern, with one group of species being prevalent in warm conditions and other group being prevalent in subtropical areas. Seven potential new viral species are emerging in tomatoes, with some of them already showing a wide geographic distribution, whereas others are yet endemic and restricted to some specific areas. A group of strains are diverging from the original viral species and many isolates might represent new species according to the current taxonomic rules. Strains of Begomovirus species originally reported on other cultivated plant species and weeds are also moving into tomatoes. A complex of at least three viral species was characterized in the genus Cleome with species genetically related to Tomato yellow spot virus (ToYSV) and with viruses reported infecting the genus Sida (Malvaceae). Leonurus sibiricus isolates displayed high identity levels (from 95.1 a 97.1%) with ToYSV strains previously reported infecting tomatoes and beans. Therefore, L. sibiricus is an alternative host of viral species closely related to viruses able to infect cultivated crops in Brazil. In general, the results indicated the extraordinary diversity of the bipartite Begomovirus species from the New World area. The scenario of tomato-infecting begomoviruses remains extremely diverse in Brazil, difficulting the precise diagnosis of particular members within this species complex. The present study also reinforces the importance of native flora and weed species as sources of viral genetic material necessary for the intense upsurge of new species with distinct biological, ecological, and molecular properties.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2011. / Submitted by Shayane Marques Zica (marquacizh@uol.com.br) on 2011-10-17T11:57:12Z No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / Approved for entry into archive by Leila Fernandes (leilabiblio@yahoo.com.br) on 2011-10-17T13:22:56Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-10-17T13:22:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_MikaelAraujoGuimaraesLemos.pdf: 25221855 bytes, checksum: f7f4a4d0e6a3d9806b4cc224ebdda964 (MD5) / A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV - Human immunodeficiencyVirus) caracteriza-se por uma imunossupressão progressiva e aumento da infectividade e replicação viral. Apesar dos exatos mecanismos moleculares envolvidos na patogênesedo HIV não terem sido completamente elucidados, diversos fatores genéticos do hospedeiro e do vírus foram descritos. Dentre os fatores virais, encontram-se alterações em domínios protéicos de regiões biologicamente ativas de várias proteínas virais. As proteínas acessórias Vif e Vpr participam de diversos mecanismos patogênicos. Dentro deste contexto este projeto teve como principal objetivo caracterizar o pool de seqüências dos genes vif e vpr presentes em amostras de DNA genômico de células de sangue periférico de oito pacientes, sendo três deles em dois estágios da infecção (inicial etardio). Foram obtidas 115 sequências, sendo 57 do gene vif e 58 do gene vpr. A salterações presentes nos diferentes domínios foram correlacionadas com as principais funções biológicas, com a progressão à doença (modelo de regressão linear simples) e com as estruturas terciárias das proteínas. Finalmente foram realizadas análises filognéticas de ambos os genes . Dentre as principais mudanças detectadas para os alelos de vif e vpr, podemos destacar : Em Vpr, L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K ,G75R, nos alelos presentes no estágio inicial e S94G, F72L, W54 por stop codon, presentes nos dois estágios de infecção. No caso de Vif as principais mudanças detectadas foram: W38L, W21 por stop codon, W38 por stop codon, nos alelos do estágio inicial e D101G e D101N em ambos os momentos. A análise da correlação entre as alterações presentes nos alelos de vpr e vif e os diferentes estágios clínicos da infecção pelo HIV-1, revelou que o score influencia a contagem de células CD4+. É possivel notar uma tendência no gráfico de regressão, onde quanto maior é o score, menor é o número de células CD4+. Há portanto uma forte correlação (r = -0,826 [Vpr] e r = -0,840 [Vif])entre as mudanças nas proteínas acessórias Vpr (score 1) e Vif (score 2) e a diminuição das células CD4+. As arvóres filogenéticas geradas com base nas sequências dos alelos de vif e vpr indicam uma tendência de agrupamento entre os alelos dos mesmos pacientes nos estágios iniciais de finais. Não houve significativa mudança estrutural nas sequências analisadas, quando comparadas com a estrutura terciária do consenso do subtipo B. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Human immunodeficiency virus (HIV) is caracterized by a progressive immunossupression and infectivity and viral replication increase. Although the exact molecular mechanisms involved in HIV pathogenesis have not been totally elucidated, several genetic factors of both host and vírus have been described. Among some viralf actors, there are alterations in protein domains of biologically active regions of several viral proteins. The accessory proteins Vif and Vpr participate of many pathogenic mechanisms. Taking this these ideas into consideration, this Project aimed at caracterizing the pool of sequences of vif and vpr genes present in genomic DNA samples of peripheral blood from eight patients, three of them from two different infection stages (early and late). Total of 115 sequences, 57 from vif gene and 58 from vpr gene were obtained. The alterations present at the different domains were correlated to the main biological functions, within the desease progression context (simple linear regression model), and with the protein’s terciary structure. Finally, filogenetic analysis were made for both genes. Among all detected mutations in vif and vpr aleles, we may highlight: in Vpr: L5P, S10P, R73G, R85P, R87K, V57A, G75K , G75R, ate the alleles present in the initiasl state and S94G, F72L, W54 for a stop cod on, present at both infection stages. In the Vif paradigm, the main detected changes were: W38L, W21 for a stop codon, in the early stage aleles and D101G e D101N in both moments. The correlation analysis of changes in vif and vpr aleles and the different clinical stages of HIV-1 infection showed that the influence score affect the CD4+ cells count. It is clearly possible to note a tendency in the regression graphic, being noticeable that when the score increases, CD4+ cells number decreases. Furthermore, there is a strong correlation between the changes in the accessory proteins Vpr (score 1) and Vif (score 2) and the diminish in the CD4+ cells count (r = -0,826 [Vpr] and r = -0,840 [Vif]). The filogenetic trees generated with regard to the sequence of the vif and vpr aleles indicate that there isa tendency in the gathering of the aleles of the same patients in the early and late stages. There hás not been noticed significant changes in the structure of the analysed sequences, when compared to the 3D consensus structure of the subtype B.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Fitopatologia, 2010. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2011-04-19T13:46:22Z No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / Made available in DSpace on 2011-05-25T00:23:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010_NataliaLucinda.pdf: 1450579 bytes, checksum: c6ffe1b291f24b75bbf847a37c4df803 (MD5) / O vírus Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) foi isolado da solanácea Brugmansia suaveolens (conhecida como trombeteira, saia-branca) da coleção de plantas medicinais do Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brasil, sendo o isolado nomeado Bs-Campinas. Um trabalho anterior mostrou que o isolado Bs-Campinas foi transmitido por afídeos, induziu sintomas visíveis em algumas solanáceas e em duas espécies de Chenopodium sob condições experimentais, apresentando partículas e inclusões típicas de potyvírus em folhas sintomáticas, quando observadas por microscopia eletrônica de transmissão. Apenas parte do genoma do vírus era conhecida, uma região compreendendo a extremidade 3‟, o que o distinguiu suficientemente dos outros vírus para ser classificado como uma espécie nova de potyvírus. O vírus apresenta características distintas de outros potyvírus conhecidos, induzindo uma alta severidade de sintomas em diversas plantas susceptíveis, além da capacidade de infectar o tomateiro, uma cultura de alta importância econômica e social no Brasil. Essas características o tornam um excelente alvo para estudo dos genes relacionados à patogenicidade e para o desenvolvimento futuro de vetores virais. Neste sentido, o objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular do isolado Bs-Campinas através da determinação de sua sequência genômica completa e determinar o seu relacionamento filogenético com os diferentes potyvírus já relatados no mundo. Para tanto, procedeu-se o emprego de várias técnicas para o completo resgate do genoma viral e posterior determinação de sua sequência. O RNA total foi extraído e o cDNA sintetizado foi obtido pela técnica de 3‟ RACE usando primers universais para potyvírus, resultando na amplificação de um fragmento de 8,3kb. A tentativa de clonagem deste fragmento, contudo, resultou em clones que apresentavam uma deleção interna neste fragmento. Dessa forma, o segundo fragmento obtido resultou da amplificação por RT-PCR utilizando-se primers específicos desenhados com base nas sequências das extremidades do fragmento de 8,3kb com o intuito de resgatar a região interna do genoma gerando um fragmento de aproximadamente 4,7kb. Primers específicos foram também desenhados baseados na sequência da extremidade 5‟ do clone de 8kb obtido e a estratégia 5‟ RACE foi usada para amplificar e clonar a extremidade 5‟ do genoma do vírus, um fragmento de 1,8kb. As amplificações por PCR resultaram no resgate de três fragmentos de cDNA, os quais totalizam a sequência completa do genoma do BsMoV. O RNA genômico consistiu de 9870 nt sem a cauda de poli-A, codificando uma poliproteína típica dos potyvírus de 3090 aa. As análises da sequência de aminoácidos possibilitaram a dedução dos sítios de clivagem, bem como, a identificação das sequências e motivos conservados dentro da sequência de cada proteína, tendo o isolado Bs-Campinas exibido perfil típico de potyvírus. As análises filogenéticas, assim como, comparações com outras espécies de Potyvirus do banco de dados online revelaram que esta sequência tem uma identidade nucleotídica de 63,7% com Pepper mottle virus (PepMoV), a qual foi a sequência de potyvírus de maior identidade e, portanto, o mais estreitamente relacionado. Uma vez que este valor de identidade é inferior ao limiar (76% de identidade nucleotídica) atualmente usado para discriminar espécies de Potyvirus, foi confirmado que Brugmansia suaveolens mottle virus representa uma nova espécie dentro do gênero Potyvirus. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Brugmansia suaveolens mottle virus (BsMoV) was isolated from a Brugmansia suaveolens plant (known as "angel trumpet") in the collection of medicinal plants of the Instituto Agronômico, Campinas-SP, Brazil, being the isolate named Bs-Campinas. A previous study showed that the isolate Bs- Campinas was transmitted by aphids and induced visible symptom on some Solanaceous plants and two Chenopodium species under the experimental conditions, showing typical potyvirus particles and inclusions in symptomatic leaves, when observed by transmission electron microscopy. Only part of the virus genome was known, a region comprising the 3' terminal region of the genome, which distinguished it sufficiently from other viruses to be classified as a new potvvirus species. The virus showed characteristics that were distinct from other known potyviruses, such as the high symptom severity in many plants and the ability to infect tomato plants, a crop of high economic and social importance in Brazil. These findings showed that it can be an excellent target for the study of genes related to pathogenicity and for the future development of viral vectors. Therefore, the objective of this study was the molecular characterization of the isolate Bs-Campinas through the determination of its complete genomic sequence and its phylogenetic analysis, when compared with different potyviruses previously reported in the world. For this purpose, some techniques were attempted to enable the rescue of the viral genome and subsequent determination of its sequence. Total RNA was extracted and cDNA synthesis was done by 3 'RACE using universal primers for potyviruses, resulting in the amplification of a fragment of ca. 8,3 kb. However, the cloning of this fragment resulted in clones that presented an internal deletion in this fragment. Therefore, a second fragment using specific primers designed based on the sequence ends of the deleted clones, was amplified by PCR and cloned in order to rescue inner region of the genome by generating a fragment of approximately 4.7 kb. Specific primers were also designed based on the 5‟ end region of the 8,3 kb clone to enable cloning of the 5‟ terminal region of the genome by 5' RACE, a fragment of 1.8 kb. PCR amplifications resulted in three cDNA fragments, comprising the complete genome of BsMoV. The RNA genome consisted of 9870 nt without a poly-A tail, encoding a putative typical potyviral polyprotein of 3090 aa. Analysis of the amino acid sequence allowed the deduction of the cleavage sites, as well as the identification of conserved sequences and motifs within the sequence of each protein, in which the Bs-Campinas isolate displayed typical potyvirus genome strategy. Phylogenetic analysis, as well as comparisons with other species of the Potyvirus genus obtained on online databases revealed that this BsMoV sequence shared 63.7% nucleotide sequence with Pepper mottle virus (PepMoV), which was the best matched potyvirus sequence and, thus the most closely related species. Since this identity value is below the threshold of 76% nt identity presently used to discriminate Potyvirus species, it was confirmed that Brugmansia suaveolens mottle virus represents a new Potyvirus species.

Orientador: Pablo Agustin Vargas / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-10T01:33:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leon_JorgeEsquiche_D.pdf: 14373006 bytes, checksum: 92ef59d2c370853b3a5a566177688788 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: Os objetivos do presente estudo foram descrever as características histopatológicas, immunoistoquímicas e de hibridização "in situ" (HIS) das lesões encontradas nas glândulas submandibular e sublingual de pacientes autopsiados com AIDS entre 1996 e 1999 no Serviço de Verificação de Óbitos da Capital (SVOC) - Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP). Dados referentes ao gênero, idade, contagem de células TCD4 e história clínica foram obtidos dos prontuários clínicos de 105 pacientes, destes 103 casos corresponderam às glândulas submandibulares e 92 casos às sublinguais. Todas as glândulas foram examinadas macroscopicamente e no estudo histopatológico utilizamos colorações de H&E, Gomori-Grocott; Ziehl-Neelsen e Mucicarmin. Análise imunoistoquímica foi realizada para detectar os agentes infecciosos (CMV, LMP-EBV, HSV-l, HSV-2, p24-HIV e BCG) e caracterizar as sialadenites (CD3, CD4, CD8, CD20 e CD68), já a HIS analizou a presença do VEB (EBER1/2). A média de idade dos pacientes e o nível de células TCD4 nos casos das glândulas submandibular e sublingual foi de 36,62 '+ ou ¿ ¿ 11,18 anos e 74,37 '+ ou ¿ ¿ 112,82 células/¿mu'L, e 35,93 '+ ou ¿ ¿ 0,2 anos e 78,75 '+ ou ¿ ¿ 118,98 células/¿mu'L, respectivamente. Foram considerados microscopicamente normais .51 (49,5%) casos da glândula submandibular e 54 (58,7%) casos da sublingual. As lesões infecciosas foram as mais freqüentes na glândula submandibular (n=35), seguida pela sialadenite crônica inespecífica em ambas as glândulas (n=25). Micobacteriose (11 e 07 casos nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente), citomegalovirose (14 e 02 casos nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente) e criptococose (03 e 04 casos nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente) foram freqüentemente detectadas. A análise imunoistoquímica mostrou que todos os casos em ambas as glândulas foram negativos para LMP-EBV, HSV-l e HSV-2, enquanto BCG mostrou intensa imunopositividade somente nos casos de micobacteriose com padrão macrofágico difuso (n=2). Dos 16 casos de citomegalovirose, apenas 06 casos (05 e 01 caso nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente) foram detectados pela imunoistoquímica. A proteína p24-HIV (02 e 01 caso nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente) e EBER1/2 (09 e 04 casos nas glândulas submandibular e sublingual, respectivamente), este último avaliado somente nos casos de sialadenités, foram expressas somente em escassos histiócitos e linfócitos, respectivamente, indicando que a participação destes vírus na etiopatogênese das sialadenites é pouco provável e precisa ser ainda melhor definida. As sialadenites crônicas inespecíficas foram principalmente compostas por linfócitos TCD8 (p=0,323); enquanto as sialadenites granulomatosas, as sialadenites macrofágicas difusas associada com micobacteriose e as sialadenites macrofágicas difusas inespecíficas apresentaram grande quantidade de macrófagos CD68+ (p=0,99) permeados por numerosos linfócitos TCD8, em ambas as glândulas. Além disso, um caso de linfoma não-Hodgkin difuso de grandes células B afetou ambas as glândulas. Estes resultados mostram que as glândulas submandibular e sublingual foram principalmente acometidas por lesões infecciosas disseminadas e sialadenite crônica inespecífica. Similarmente, as glândulas parótidas, num estudo previamente publicado por nossa equipe, foram acometidas por lesões infecciosas sistêmicas. Sendo assim, os clínicos devem estar atentos à ocorrência destas lesões em glândulas salivares maiores de pacientes com AIDS em fase avançada / Abstract: This study describes the histopathological, immunohistochemical (lHC), and in situ hybridization (ISH) features found in the submandibular (n=103) and sublingual (n=92) glands of autopsied patients who died with AIDS between 1996 and 1999 in the SVOC FMUSP (Medical School of São Paulo University). Sex, age, CD4 cell count, and clinical history were obtained from the clinical records of 105 patients, of them 103 cases corresponded to the submandibular glands and 92 cases to the sublingual glands. All glands were examined for macroscopical alterations and stained using H&E, Gomori-Grocott, Ziehl-Neelsen, and Mucicarmine. IHC analysis to detect infectious agents (CMV, LMP-EBV, HSV-l, HSV-2, HIV-p24, and BCG) and to characterize the sialadenitis (CD3, CD4, CD8, CD20, and CD68) was performed, while the ISH assessed the presence of EBV (EBERl/2). The mean age of the patients and CD4 cell count of the cases of the submandibular and sublingual glands were 36,62 '+ or ¿ ¿ 11,18 years and 74,37 '+ or ¿ ¿ 112,82 cells¿mu¿L POT .-1¿, and 35,93 '+ or ¿ ¿ 10,2 years and 78,75 '+ or ¿ ¿ 118,98 cells¿mu¿¿L POT .-1¿, respectively. There were no histological alterations in 51 (49,5%) and 54 (58,7%) cases of the submandibular and sublingual glands, respectively. The infection conditions were the most common in the submandibular gland (n=35), followed by chronic non-specific sialadenitis in both glands (n=25). Mycobacteriosis (11 and 07 cases of the submandibular and sublingual glands, respectively), cytomegalovirosis (14 and 02 cases of the submandibular and sublingual glands, respectively), and cryptococcosis (03 and 04 cases of the submandibular and sublingual glands, respectively) were found frequently. The IHC analysis did not show immunoreactivity for LMP-EBV, HSV-l, and HSV-2; while BCG displayed strong immunopositivity only in cases of chronic diffuse macrophagic infiltrate associated to mycobacteriosis (n=2). Six out of 16 cases of cytomegalovirosis (05 and 01 case of the submandibular and sublingual glands, respectively) were detected for IHC analysis only. The p24-HIV protein (02 and 01 case of the submandibular and sublingual glands, respectively) and EBERl/2 (09 and 04 cases of the submandibular and sublingual glands, respectively), this latter evaluated only in the sialadenitis cases, were expressed only in macrophages and lymphocytes, respectively, indicating that the participation of these viruses in the etiopathogenesis of the sialadenitis is still unc1ear. Chronic non-specific sialadenitis revealed CD8+ T-lymphocytes predominance (p=0,323), hile the granulomatous, diffuse macrophagic associated to mycobacteriosis, and chronic non-specific diffuse macrophagic sialadenitis showed great amount of CD68+ macrophages (p=0,99) surrounded by numerous CD8+ T-lymphocytes, in both glands. Moreover, one case of diffuse large B-celllymphoma affected both glands. These results indicate that both submandibular and sublingual glands were affected mainly by infectious diseases and chronic non-specific sialadenitis. Similarly, the parotid glands in a study previously published by our team, were mainly affected for systemic infectious diseases. Therefore, c1inicians should consider more carefully the occurrence of these lesions in major salivary glands of patients with advanced AIDS / Doutorado / Patologia / Doutor em Estomatopatologia

O enrolamento do arroz é uma doença viral emergente no Brasil causada pelo Rice stripe necrosis virus (RSNV) que é transmitido pelo protozoário Polymyxa graminis. RSNV é um membro do gênero Benyvirus com genoma dividido em 4 RNAs de fita simples no sentido positivo (ssRNA +). Em função da falta de conhecimento sobre a seqüência de nucleotídeos do seu genoma, a detecção de RSNV através de métodos moleculares não é utilizada. O objetivo deste trabalho foi identificar seqüências do genoma de RSNV que possibilitassem sua detecção em plantas de arroz através da técnica de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR). As seqüências do genoma foram identificadas a partir de clones de uma biblioteca de cDNAs obtidos de uma amostra do vírus parcialmente purificado. Os clones que hibridizaram com sondas sintetizadas a partir de RNA de plantas infectadas com RSNV foram seqüenciados e comparados às seqüências do GenBank. Um fragmento de 957 nt da extremidade 3’ da fita de um dos 4 RNAs genômicos de RSNV foi obtido. A análise da seqüência nucleotídeos desse fragmento não revelou qualquer similaridade com seqüências conhecidas, tampouco indicou uma possível função. Um par de oligonucleotídeos iniciadores foi desenhado a partir de um clone que potencialmente contém uma seqüência de RSNV. A especificidade e a sensibilidade da RT-PCR utilizando esse par de oligonucleotídeos iniciadores, bem como sua eficiência na detecção do vírus em diferentes partes da planta de arroz, foram avaliadas. Os resultados indicam que a RT-PCR é específica para RSNV e pode detectar o vírus em tecido oriundo das raízes, do colo e de folhas com distorção. Comparada ao diagnóstico da doença através da observação de sintomas e de estruturas do vetor, a RT-PCR é uma ferramenta confiável para a diagnose do enrolamento do arroz.

O vírus da Cinomose Canina é uma doença multisistêmica cosmopolita com altos índices de mortalidade que afeta cães domésticos e diversos animais selvagens. Desde a década de 1960 tem sido controlado através de campanhas de vacinação porém, atualmente tem ocorrido o surgimento de diversos casos, em todo o mundo, de cães vacinados que desenvolveram a doença. O diagnóstico da Cinomose Canina é difícil e tem sido feito habitualmente através dos sinais clínicos da doença. No Brasil, bem como no Rio Grande do Sul somos carentes de dados sobre a epidemiologia e distribuição da Cinomose Canina. O objetivo deste estudo foi o desenvolvimento de uma técnica de RT-PCR para o diagnóstico do vírus da Cinomose Canina e a caracterização de amostras selvagens. Foram realizados testes de sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade para padronizar a técnica de RT-PCR. Foram analisadas 4 amostras suspeitas, 3 amostras vacinais e 3 amostras selvagens. As amostras suspeitas submetidas à técnica de RT-PCR não amplificaram, entretanto as 3 amostras selvagens e vacinais tiveram sua identidade confirmada sendo posteriormente caracterizadas. A enzima PvuII e EcoRV revelaram-se importantes na diferenciação das amostras selvagens e vacinais. Este estudo forneceu informações que devem ser melhor estudadas para se alcançar uma ferramenta abrangente no diagnóstico e caracterização do Vírus da Cinomose Canina em nossa região.

O presente trabalho aborda como questão central o desfecho das gestações expostas ao vírus Influenza A (H1N1) e, consequentemente, ao seu tratamento com o fármaco oseltamivir durante a pandemia do ano 2009. O vírus influenza A H1N1 é produto de vários rearranjos genéticos entre cepas dos vírus influenza previamente circulantes, alguns destes exclusivos de suínos ou de aves, e que se tornaram capazes de infectar humanos. A epidemia de influenza A (H1N1) teve início no México, e expandiu-se rapidamente para países do mundo inteiro, sendo declarada pandemia pela Organização Mundial da Saúde (OMS), aproximadamente dois meses após o aparecimento dos primeiros casos. As gestantes são consideradas um grupo de risco para complicações graves relacionadas ao vírus influenza H1N1, com grande morbidade e mortalidade observadas em epidemias anteriores do vírus Influenza. Quanto aos efeitos sobre o embrião-feto, os estudos a respeito do potencial teratogênico do vírus influenza ainda são limitados. A literatura não demonstrou, até o momento, efeitos adversos desse vírus sobre o embrião-feto. O tratamento específico consiste no uso de inibidores da neuraminidase, zanamivir e oseltamivir, dos quais apenas o último está disponível no Brasil. O objetivo geral da tese é avaliar as gestações expostas ao vírus H1N1 e submetidas ao tratamento com Fosfato de Oseltamivir. Os objetivos específicos são comparar gestantes expostas e não-expostas ao vírus Influenza A H1N1 quanto aos desfechos maternos e perinatais; avaliar os potenciais efeitos adversos da medicação em gestantes expostas ao oseltamivir; e avaliar a saúde e o desenvolvimento neuropsicomotor das crianças expostas durante a gravidez ao oseltamivir. Foi realizado um estudo de coorte prospectivo não controlado que avaliou gestantes com exposição ao vírus H1N1 e ao tratamento com Fosfato de Oseltamivir. A amostra consistiu nas 589 gestantes com sintomas suspeitos de Influenza A notificadas no Sistema de Informação de Agravos de Notificação - Influenza (SINAN-Influenza banco de dados do estado do Rio Grande do Sul). Os seguimentos de 424 gestantes foram realizados por contato telefônico, visita domiciliar, dados de prontuário médico ou Declaração de Nascido Vivo, por uma equipe treinada. . Foram obtidos 243 resultados de exames de PCR (polymerase chain reaction). Houve 163 (67%) casos confirmados de H1N1 e 80 (33%) Influenza não-H1N1. Houve 24 óbitos maternos, sendo 18 em H1N1. Houve 8 natimortos, sendo 5 filhos de gestantes expostas ao H1N1. Não houve diferença nos desfechos perinatais. Apenas um caso de malformação congênita (fenda palatina) foi observado em um bebe não exposto ao oseltamivir. Uso de oseltamivir foi identificado em 221 pacientes. Dessas, 86 gestantes apresentaram PCR positivo para Influenza A (H1N1) e 51 estavam no grupo não- H1N1. Reações adversas foram relatadas em 92 (42%) gestantes. Houve um maior número de reações adversas relatadas em pacientes não-H1N1 após o uso do oseltamivir. Ocorreram menos óbitos maternos (7,2%) nas que receberam oseltamivir comparativamente a 34,7% das mulheres que não foram tratadas (OR: 0,14, IC95%: 0,04-0,42, p=0,0003). Da mesma forma a frequência de natimortos foi menor (2,2%) nas tratadas, em comparação a 13,0% das não tratadas (OR: 0,15, IC95%: 0,03-0,89, p=0,03). Atrasos afetando dois ou mais marcos do desenvolvimento foram relatados em 10 (19,2%) de 52 crianças expostas ao oseltamivir durante o período gestacional e seguidas por no mínimo 36 meses. Essa frequência está acima do esperado para a população brasileira (15%). Em conclusão, espera-se que o presente trabalho seja capaz de contribuir para um melhor entendimento a respeito do potencial teratogênico do vírus Influenza A (H1N1) e de seu tratamento com o fármaco oseltamivir. Estudos futuros serão decisivos no estabelecimento de condutas clínicas no que diz respeito ao tratamento e manejo geral dessa condição nesse grupo específico de pacientes. / The present investigation approaches as central issue the outcomes of pregnancies exposed to the Influenza A (H1N1) virus and, consequently, to its treatment with the drug oseltamivir during the pandemic in the year 2009. The Influenza A H1N1 virus is the product of multiple genetic rearrangements among strains of influenza that had previously been circulating. Some of these were unique to swine and birds and became capable of infecting humans. The influenza A (H1N1) epidemic began in Mexico and rapidly spread to other countries around the world and was declared a pandemic by the World Health Organization (WHO) approximately two months after the first cases appeared. Pregnant women are considered to be a group at risk of serious complications related to the H1N1 influenza virus, with high morbidity and mortality observed in previous Influenza virus epidemics. As for effects on the embryo/fetus, there are still few studies on the teratogenic potential of the influenza virus. The literature has not demonstrated, so far, adverse effects of this virus on the embryo/fetus. The specific treatment is the use of the neuraminidase inhibitors, zanamivir and oseltamivir, of which only the latter is available in Brazil. The general aim of this work is to evaluate pregnancies exposed to the Influenza A (H1N1) virus and submitted to treatment with Oseltamivir Phosphate. Specific objectives are to compare pregnant women exposed and not exposed to the Influenza A H1N1 virus as on maternal and perinatal outcomes; evaluate potential adverse effects of medication in pregnant women exposed to oseltamivir; and evaluate the health and neurodevelopment in children exposed during pregnancy to oseltamivir. We performed an uncontrolled prospective cohort study that evaluated pregnancies with exposure to the H1N1 Influenza virus and its treatment with Oseltamivir Phosphate. The sample consisted of 589 pregnant women with suspected symptoms of Influenza A who were reported in the Information System for Notifiable Diseases - Influenza (SINAN-Influenza, Rio Grande do Sul Database). Follow-up of 424 pregnancies was conducted via telephone, home visit, medical records or Live Birth Certificate, by a trained team. PCR (polymerase chain reaction) was performed in 243 individuals. There were 163 (67%) confirmed cases of H1N1 and 80 (33%) non-H1N1 Influenza virus. There were twenty-four maternal deaths, 18 of these were H1N1+ patients. Eight stillbirths were reported, five of these were for H1N1+ pregnant women. There were no differences in perinatal outcomes. Only one cleft palate was reported in a newborn whose mother did not use oseltamivir. Use of oseltamivir phosphate was identified in 221 patients. Of this, there were 86 confirmed cases of Influenza A (H1N1) and 51 non-H1N1 Influenza virus. Adverse reactions were reported in 92 (42%) pregnancies. There were a higher number of adverse effects reported in non-H1N1 patients after the use of oseltamivir. There were fewer maternal deaths (7.2%) in those who received oseltamivir compared to 34.7% of women who were not treated (OR: 0.14, CI95%: 0.04-0.42, p=0.0003). Similarly, the frequency of stillbirth was lower (2.2%) in treated as compared to 13.0% of the untreated women (OR: 0.15, CI95%: 0.03- 0.89, p=0.03). Developmental delay in two or more skills was reported in 10 (19.2%) of 52 children exposed prenatally to oseltamivir and followed for at least 36 months. This rate is above of expected for the Brazilian population (15%). In conclusion, it is expected that this work can contribute to a better understanding towards the potential teratogenic effect of Influenza A (H1N1) virus and its treatment with oseltamivir. Future studies will be decisive to the establishment of clinical practices about treatment and general management of this condition in this specific group of patients.