La transcriptase inverse (RT) est un hétéro-dimère p66/p51 avec des activités ADN polymérase et ribonucléase H qui jouent un rôle critique dans le cycle viral du VIH-1. La RT convertit l’ARN génomique viral simple brin en ADN proviral double brin dans le cytoplasme de la cellule infectée. L’efficacité de la RT est augmentée par la protéine de la nucléocapside (NC) grâce à son activité chaperonne vis-à-vis des acides nucléiques et/ou une coopération entre les deux protéines. Dans ce travail, nous avons étudié par la technique de smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) les effets de la NC sur l’interaction entre la RT et un substrat d’ADN au niveau de deux sites de pause de la synthèse de l’ADN(+). Nous avons d’abord réalisé et validé le montage de smFRET. Lors de la validation du montage avec des fluorophores Cy3 encapsulés dans des vésicules lipidiques, nous avons mis en évidence deux mécanismes différents entrainant le photoblanchiment du Cy3. Ensuite, après avoir déterminé les propriétés de liaison à l’équilibre de la RT et la NC sur différents substrats amorce/matrice à l’aide de mesures d’ensemble en solution, nous avons confirmé par smFRET que la RT adopte plusieurs conformations sur son substrat d’ADN, incluant celle qui conduit à la polymérisation de l’ADN. En présence de la NC, nous n’avons observé qu’une réorganisation modérée des différentes conformations du complexe RT/substrat. Par contre, une réorganisation beaucoup plus importante est induite par la NC en présence du dNTP, avec une très forte exaltation des conformations compétentes pour la polymérisation. Nous avons également montré que la NC augmente l’efficacité de synthèse de l’ADN au niveau de sites de pause en diminuant ou en augmentant le temps de dissociation du complexe RT/substrat/dNTP selon le type de site de pause. L’ensemble de ces données permet de mieux comprendre les mécanismes polyvalents par lesquels NC facilite l’activité de la RT. / The reverse transcriptase (RT) is a p66/p51 hetero-dimer with DNA polymerase and ribonuclease H activities which plays a critical role in the viral cycle of HIV-1. RT converts the viral genomic RNA to proviral DNA in the cytoplasm of infected cells. The efficiency of RT is increased by the nucleocapsid protein (NC) through its nucleic acids chaperone properties and/or via direct interaction with RT. In the present work, we investigated the effects of NC on the interaction between RT and its DNA substrate attwo pause sites during the synthesis of (+)DNA by using the smFRET (single molecule Fluorescence Resonance Energy Transfer) technique. In a first step, we implemented and validated the smFRET set-up. Within the validation step, using Cy3 fluorophores encapsulated, in lipid vesicles, we monitored the photobleaching of Cy3 dyes and found out that it was governed by two parallel mechanisms. In a second step, we determined the affinity of RT and NC to different primer/template substrates by using steady-state fluorescence. Then, we confirmed by smFRET that RT adopts different conformations on its DNA substrate, including the one that leads to DNA polymerization. In the presence of NC, we observed only a moderate reorganization of the different conformations of RT/substrate complex. However, NC was found to induce a more important reorganization in the presence of dNTP, with a very strong promotion of the polymerization-competent conformations. We also showed that NC increases the efficiency of DNA synthesis at pause sites by either decreasing or increasing the dissociation time of the RT/substrate/dNTP complex, depending on the type of pause site. Together, these data allow us to further elucidate the mechanisms by which NC facilitates the RT.

A situação da vulnerabilidade a que estão expostas as crianças que vivem com aids, leva a refletir como e qual a melhor forma de tentar compreender como são abordadas as questões relativas ao seu modo de viver. Conversar com as crianças afetadas, ouvindo-as, torna-se fundamental para a compreensão da situação de doença e também como percebem o seu cotidiano. Para tanto se desenvolveu um estudo exploratório descritivo, com abordagem qualitativa, cujo objetivo foi conhecer a partir da voz da criança que vive com HIV/aids as implicações no seu cotidiano. O estudo foi realizado no período entre novembro de 2012 e março de 2013 e contou com a participação de cinco crianças com HIV/aids, com idades entre 11 e 12 anos. Foi desenvolvido na Organização Não-Governamental (ONG) Mais Criança no município de Porto Alegre/RS. As informações foram coletadas por meio de uma entrevista semi estruturada após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da UFRGS (109.149) O material resultante das entrevistas foi submetido à análise temática de conteúdo que evidenciou as seguintes categorias: Temores: a tristeza inconstante e Experiências: o conhecimento vivido. Evidenciou-se que em relação ao seu cotidiano elas relatam que não tem uma vida diferente das demais crianças. Elas não deixam de fazer suas atividades diárias em virtude de ter que conviver com o HIV/aids ou ter que tomar as medicações, por mais que essa questão apareceu como uma implicação no seu modo de vida, além de manifestarem expectativas positivas no futuro. A interrupção ou mesmo a necessidade de adiar uma atividade em função de ter que tomar as medicações antirretrovirais, já está introjetada no seu viver, demonstrado pelo relato de um convívio de forma tranquila. A aproximação com essas crianças que vivem uma situação complexa e permeada de conflitos sérios, como seus medos, temores, esperanças, possibilitou conhecer as implicações do seu viver cotidiano. Ressalta-se a importância para os profissionais da saúde em geral, e em especial a enfermagem, de desenvolver estratégias para a criação de um vinculo que possibilite a criança e sua família expor sentimentos e situações que auxilie na condução do processo de viver com essa doença. / The vulnerable situation that children who live with AIDS are exposed to, leads to reflect about how and what is the best way to try to comprehend how the issues about their way of life are dealt with. Talking to affected children, and listening to them, becomes essential to understand the situation of the disease and it is also the way they notice their daily. For that was developed a descriptive exploratory study, with a qualitative approach whose objective learn from the voice of the child living with HIV / aids implications in their daily.The study was conducted between November 2012 and March 2013 and counted with the participation of five children with HIV / AIDS, aged between 11 and 12 years old. It was developed in the Non-Governmental Organization (NGO) More Child in Porto Alegre / RS. The data were collected through a semi-structured interview after approval of the Ethics Committee in Research of UFRGS (109 149). The resulting material was subjected to thematic content analysis interviews that showed the following categories: Fears: constant sadness and Experiences: lived knowledge. In relation to their day by day, they report that they do not have a different life from other children. They do not stop doing their daily activities as a result of having to live with HIV / AIDS or having to take the medications, even though this question appeared as an implication in their way of life, and to express positive expectations in their future. The interruption or even the need to postpone an activity due to having to take antiretroviral medications is already entrenched in their behavior, demonstrated by the report of a smoothly convivial. The approach to these children who live a complex situation, fraught with serious conflicts, such as fears, and hopes, helped understand the implications for the quality of their daily lives. Emphasizes the importance for health professionals in general, and particularly nursing, to develop strategies for creating a bond that allows the child and his family show feelings and situations to assist in driving the process of living with this disease. / La situación de vulnerabilidad a que están expuestos los niños que viven con el SIDA, lo que lleva a reflexionar cómo y qué mejor manera de tratar de entender la forma en que se tratan temas relacionados con su manera de vivir. Hable con los niños afectados, escuchándolos, es esencial para la comprensión de la enfermedad y también la forma en que perciben su diario. Para ello se desarrolló un estudio exploratorio descriptivo con abordaje cualitativo, cuyo objetivo fue aprender de la voz del niño que vive con las consecuencias del VIH / SIDA en su diario. El estudio se llevó a cabo entre noviembre de 2012 y marzo de 2013 y contó con la presencia de cinco niños con VIH / sida, con edades comprendidas entre los 11 y 12 años. Fue desarrollado en la Organización No Gubernamental (ONG) más Niños en Porto Alegre / RS. Los datos fueron recolectados a través de una entrevista semi-estructurada, con la aprobación del Comité de Ética en Investigación de la UFRGS (109 149). El material resultante se sometió a las entrevistas de análisis de contenido temático mostraron que las siguientes categorías: Los miedos: tristeza inconstante y Experiencias: conocimiento vivió. Era evidente que en relación con su informe diario que no tienen una vida diferente a los otros niños. No dejan de hacer sus actividades diarias como consecuencia de tener que vivir con el VIH / SIDA o el tener que tomar medicamentos, a pesar de que esta cuestión apareció como una consecuencia de su modo de vida, y para expresar expectativas positivas. La interrupción o la necesidad de posponer una actividad debido a tener que tomar medicamentos antirretrovirales, ya está arraigada en su comportamiento, como lo demuestra el informe de una convivencia sin problemas. El enfoque de estos niños que viven un proceso complejo y plagado de conflictos graves, como miedos, temores, esperanzas, ayudado entender las implicaciones para la calidad de su vida cotidiana. Hace hincapié en la importancia de que los profesionales de salud en general, y en especial de enfermería, el desarrollo de estrategias para la creación de un vínculo que le permite al niño y sus sentimientos y situaciones que muestran la familia para ayudar en la conducción del proceso de vivir con esta enfermedad.

Les traitements actuels dirigés contre le VIH ne sont que partiellement efficaces en raison de l'apparition de mutations qui confèrent au virus une grande capacité de résistance aux antirétroviraux existants. Un moyen d'améliorer la lutte contre le virus consiste par conséquent à trouver de nouvelles stratégies d'inhibition. Le complexe de reverse transcription est une des principales cibles pour le développement de traitement anti-SIDA, il catalyse une étape obligatoire du cycle de réplication du virus. Cependant, l'ensemble des inhibiteurs de la transcriptase inverse sont limités par l'apparition rapide de souches résistances. Dans ce contexte, mes travaux de thèse ont permis de développer des inhibiteurs ciblant spécifiquement la reverse transcriptase (RT) du VIH-1, basée sur des fragments d'anticorps dérivés des anticorps chaînes lourdes de dromadaire appelés VHHs ou encore Nanobodies. Associé à une stratégie de vectorisation non invasive basée sur l'utilisation de peptides vecteurs pénétrants, les Nanobodies ont été délivré efficacement dans les cellules et par conséquent ils présentent tous une forte activité antivirale de l'ordre du nanomolaire. L'étude du mécanisme d'action du Nanobody leader NbRT20 montre qu'il agit en tant qu'inhibiteur conformationnel. Il interagit avec la forme intermédiaire inactive de la RT et empêche la mobilité du sous-domaine thumb requis pour le positionnement correct de la matrice/amorce sur la RT et inhibant l'incorporation des nucléotides dans la chaîne d'ADN naissante déstabilisant l'enzyme dans une conformation inactive, non processive. Pris ensemble, ces résultats montrent que la plate-forme Nanobody peut être très efficace pour générer des intracorps extrêmement puissants et sélectifs pour neutraliser la RT et la réplication virale.Mots clés : HIV-1, RT, Nanobodies, peptide vecteur pénétrant / The rapid emergence of drug-resistant viruses against all approved HIV clinical drugs together with inaccessible latent virus reservoirs and side effects of currently used compounds have limited the potency of existing anti-HIV-1 therapeutics. Therefore, there is a critical need for new safer drugs, active against resistant viral strains. Reverse transcriptase (RT) plays an essential role in the replication of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) and remains a primary target of anti-HIV-1 drugs. To develop specific HIV inhibitors, we have elaborated a new strategy based on short antibody fragments derived from the unique Heavy-chain antibodies present in Camelidae called Nanobodies that targets RT-activation. The immunization of dromedaries with RT has lead to the isolation of a panel of Nanobodies that tightly bind the two subunits of RT and inhibit its DNA-dependent DNA polymerase activity at nanomolar range. From that screen we have elaborated an intrabody (cell penetrating anti-RT Nanobody) NbRT20 that constitutes a potential interesting anti-HIV compound.We demonstrated that NbRT20 inhibits RT polymerase activity and exhibiting a potent antiviral activity with a subnanomolar IC50. NbRT20 binds the thumb subdomain and restricts its flexibility and mobility resulting in an inactive/non processive dimeric conformation of the enzyme. From a mechanistic point of view, we have showed that NbRT20 is a conformational inhibitor. it prevents proper binding of primer/template and of dNTP and destabilizes the enzyme in an inactive/non processive dimeric conformation.Taken together, these results demonstrated that, the Nanobody platform may be highly effective at generating extremely potent and selective intrabody to neutralize RT and HIV proliferation.Key words: HIV-1, RT, Nanobodies, cell penetrating peptide

Le Virus de l’Immunodéficience Humaine de type I (VIH-I) est majoritairement dégradé dans les cellules dendritiques dès son entrée. Des travaux précédemment réalisés dans l’équipe montrent que le mécanisme de l’autophagie contribue à la dégradation virale (virophagie) et promeut les réponses immunitaires innées et adaptatives. Etant donné que cette virophagie est par la suite inhibée par le virus dans les cellules dendritiques, mieux comprendre la mise en place de cette autophagie antivirale est primordial afin de pouvoir favoriser et surtout stabiliser les défenses cellulaires. Nos résultats montrent que DC-SIGN, un récepteur lectine de type C (CLR) qui reconnait des carbohydrates mannosylés ou fucosylés, pourrait être impliqué dans la mise en place de cette autophagie antivirale. Ainsi, nous montrons qu’après reconnaissance du VIH, ce récepteur induit l’autophagie et interagit rapidement avec plusieurs protéines autophagiques dont certaines impliquées dans les voies endosomales. En effet, nous montrons pour la première fois l’association de la protéine Atg9 avec le récepteur DC-SIGN internalisé. La protéine Atg9 est un facteur essentiel de l’initiation de la voie autophagique régulant notamment l’apport de membranes issues de la membrane plasmique pour la nucléation de vésicules liées à la voie autophagique. D’autre part, après une étude par spectrométrie de masse de l’intéractome du récepteur DC-SIGN internalisé, nous montrons qu’une E3 ligase faisant partie de la famille des TRIM, TRIM25, est recrutée lors de l’endocytose du récepteur. Cette protéine a été rapportée comme étant impliquée dans la régulation des réponses innées antivirales issues du récepteur de reconnaissance de pathogène (PRR) RIG-I suggérant une fonction essentielle de TRIM25 dans les réponses immunes innées. De manière intéressante, certains membres de la famille TRIM ont été montrés récemment comme étant essentiels pour l’induction d’une forme d’autophagie sélective parfois antivirale, l’autophagie de précision. Dans ce sens, nous montrons qu’un complexe est formé entre le récepteur DC-SIGN, Atg9 et TRIM25, suggérant que l’autophagie mise en place très tôt lors de l’engagement du récepteur DC-SIGN pourrait s’avérer être sélective. L’ensemble de ces éléments constitue une première étape pour une meilleure compréhension des étapes précoces de l’entrée du VIH dans les cellules dendritiques avec la caractérisation d’une virophagie sélective induite lors de l’engagement d’un récepteur de l’immunité innée et qui représente une cible particulièrement intéressante afin d’améliorer certaines stratégies thérapeutiques développées actuellement. / The Human Immunodeficiency Virus type I (HIV-I) is mostly degraded in dendritic cells as soon as it enters. Previous work in the team shows that the mechanism of autophagy contributes to viral degradation (virophagy) and promotes innate and adaptive immune responses. Since this virophagy is subsequently inhibited by the virus in dendritic cells, a better understanding of the implementation of this antiviral autophagy is essential in order to promote and above all stabilize cellular defenses. Our results show that DC-SIGN, a C-type lectin receptor (CLR) that recognizes mannosylated or fucosylated carbohydrates, may be involved in the development of this antiviral autophagy. Thus, we show that after recognition of HIV, this receptor induces autophagy and interacts rapidly with several autophagic proteins, some of which are involved in the endosomal pathways. Indeed, we show for the first time the association of the protein Atg9 with the internalized DC-SIGN receptor. The Atg9 protein is an essential factor in the initiation of the autophagic pathway regulating in particular the supply of membranes originating from the plasma membrane for the nucleation of vesicles linked to the autophagic pathway. On the other hand, after a mass spectrometric study of the internalized DC-SIGN receptor interbody, we show that an E3 ligase belonging to the TRIM family, TRIM25, is recruited during endocytosis of the receptor. This protein has been reported to be involved in the regulation of antiviral innate responses from the RIG-I pathogen recognition receptor suggesting an essential function of TRIM25 in innate immune responses. Interestingly, some members of the TRIM family have recently been shown to be essential for the induction of a form of selective autophagy, sometimes antiviral, precision autophagy. In this sense, we show that a complex is formed between the DC-SIGN, Atg9 and TRIM25 receptors, suggesting that autophagy early on engagement of the DC-SIGN receptor could be selective. All these elements constitute a first step for a better understanding of the early stages of the entry of HIV into dendritic cells with the characterization of a selective virophagy induced when a receptor of the innate immunity And which represents a particularly interesting target in order to improve certain therapeutic strategies currently being developed.

Une étape importante du cycle viral du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) est l'export nucléaire de transcrits viraux incomplètement épissés, incluant le génome viral ARN. Ce processus fait intervenir la protéine virale de liaison à l'ARN Rev. Dans le noyau, Rev interagit avec les transcrits viraux non épissés et partiellement épissés en s'oligomérisant sur une séquence intronique de 350 nucléotides, appelée Element de Response à Rev (RRE). Rev recrute également le facteur d'export cellulaire CRM1 et la petite GTPase Ran pour former le complexe d'export RRE/Rev/CRM1/Ran. Connaître l'architecture 3D de ce complexe ribonucléoprotéique fournirait des informations utiles pour une meilleure compréhension de l'export des ARN du VIH incomplètement épissés. Cependant, les détails moléculaires de ce complexe sont mal connus ; en particulier, la stœchiométrie des molécules Rev et CRM1 liées au RRE est en discussion.Mon doctorat vise à étudier l'architecture du complexe RRE/Rev/CRM1/Ran. Dans le cadre de ce travail, j'ai utilisé des essais biochimiques et cellulaires pour caractériser les interactions entre CRM1 et Rev et entre Rev et RRE. La majorité de mes efforts ont porté sur l'étude de ces interactions par spectrométrie de masse (MS) en condition native, une méthode puissante pour déterminer la stœchiométrie de complexes macromoléculaires. J'ai mis en place des protocoles pour la préparation à grande échelle d'un fragment du RRE de 66 nucléotides (IIABC), portant un site de liaison Rev de haute affinité, protocoles que j'ai ensuite adaptés à l'analyse de IIABC par MS en condition native. Comme Rev a tendance à s'agréger et à précipiter en solution, j'ai également conçu une forme mutante de Rev (Rev*) permettant de contourner ces problèmes. L'analyse des complexes IIABC/Rev* par électrophorèse sur gel natif confirme l'oligomérisation de Rev* sur l'ARN. Après d'intenses optimisations, j'ai obtenu des spectres MS en condition native de haute qualité, révélant que IIABC lie jusqu'à 6 monomères Rev*. De plus, j'ai reconstitué un complexe à 4 partenaires IIABC/Rev*/CRM1/Ran et j'ai réussi à déterminer sa masse et sa stœchiométrie par MS en condition native, une tâche techniquement difficile. Des efforts supplémentaires pour analyser le RRE seul et en complexe avec Rev de type sauvage ont également généré des spectres informatifs, alors que l'analyse du complexe intact RRE/Rev/CRM1/Ran a été plus compliquée. Ces résultats illustrent les forces et les limites de la spectrométrie de masse en condition native et son potentiel pour son développement futur en tant qu'outil d'analyse des complexes de ribonucléoprotéines. / An important step in the life cycle of human immunodeficiency virus (HIV) is the nuclear export of incompletely spliced viral transcripts, including the replicated viral RNA genome. This process is mediated by the viral RNA-binding protein Rev. In the nucleus, Rev recognizes unspliced and partially spliced viral transcripts by multimerizing on a 350-nucleotide intron sequence, the Rev-response element (RRE). Rev then recruits the host cell export factor CRM1 and the small GTPase Ran to form the RRE/Rev/CRM1/Ran export complex. Knowledge of the 3D architecture of this ribonucleoprotein complex would provide important insights into how unspliced viral RNA export is achieved. However, the molecular details of this complex are poorly understood. In particular, the stoichiometry of Rev and CRM1 molecules bound to the RRE is under debate.My Ph.D. project aims to investigate the architecture of the RRE/Rev/CRM1/Ran complex. As part of this work, I used biochemical and cell-based assays to characterize the interactions between CRM1 and Rev and between Rev and the RRE. The majority of my efforts focused on investigating these interactions by native mass spectrometry (MS), a powerful method for determining the stoichiometry of macromolecular complexes. I set up protocols for the large-scale preparation of a 66-nucleotide RRE fragment (IIABC) bearing a high-affinity Rev binding site, and adapted these for compatibility with native MS analysis. Because Rev tends to aggregate and precipitate in solution, I engineered a mutant form of Rev (Rev*) to overcome this problem. Analysis of IIABC/Rev* complexes by native gel electrophoresis confirms multimerization of Rev on the RNA. After extensive optimization, I obtained high-quality native MS spectra of these complexes, revealing that IIABC binds up to 6 Rev* monomers. Furthermore, I reconstituted a 4-species complex, IIABC/Rev*/CRM1/Ran, and succeeded in determining its mass and stoichiometry by native MS – a technically challenging task. Additional efforts at analyzing the intact RRE and complexes with wild-type Rev have also yielded informative spectra, while analysis of the intact RRE/Rev/CRM1/Ran holo-complex has had more limited success. These results illustrate the strengths and limitations of native mass spectrometry and its potential for future development as a tool for analyzing ribonucleoprotein complexes.

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) induit une activation généralisée des réponses de l'hôte impliquant les lymphocytes T mais aussi les cellules du microenvironnement comme les cellules endothéliales. Les microvésicules (MV) sont des vésicules extracellulaires impliquées dans la communication intercellulaire décrites comme des vecteurs de microARNs (miARNs). Dans ce travail, nous avons émis l'hypothèse que l'infection par le VIH-1 induit l'expression de miARNs dans les lymphocytes T CD4 qui peuvent être vectorisés par les MV et transférés de manière paracrine aux CE. Ces MV joueraient un rôle important dans la pathogenèse de l’infection en contrôlant à distance l'homéostasie endothéliale. Nos résultats montrent que le miR-146-5p est uprégulé à la fois dans les lymphocytes T CD4 de patients infectés par le VIH-1, naïfs de traitement et dans les MV issues de ces lymphocytes. En utilisant un modèle de MV d’une lignée lymphocytaire T enrichie en miR-146-5p (miR-146b-MV), nous montrons que ces MV sont capables de : 1) de protéger leur contenu en miARNs de la dégradation par les RNases, 2) de transférer le miR-146b-5p mimic à des HUVEC et 3) réduire la réponse inflammatoire endothéliale in vitro et in vivo, dans les poumons de souris qui ont reçu une injection systémique de miR-146b-MV. Ce transfert est responsable d’une diminution de l’expression d’ICAM-1 et VCAM-1, à travers une down-régulation d’IRAK1 et de TRAF6. L’ensemble de ces résultats montre que le miR-146-5p transféré par des MV peut diminuer les réponses inflammatoires endothéliales et constituer ainsi un mécanisme de défense de l’hôte contre les altérations vasculaires induites par le VIH-1. / Human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) promotes a generalized activation of host responses that involves CD4 T cells, but also cells of the micro-environnement that are not directly infected such as endothelial cells. Microvesicles (MV), implicated in cell-to-cell communication, have been recently described as vectors of microRNAs (miRNAs). We hypothesized that HIV-1 infection induce cellular miRNAs expression in CD4 T cells which may be vectorized by MV and transferred in a paracrine manner to endothelial cells to regulate vascular homeostasis. Using a miRNome quantitative RT-PCR analysis, we showed that HIV-1 infection leads to a dysregulation of several miRNAs and identified miR-146b-5p as upregulated in both CD4 T cells and CD4 T cells derived-MV from antiretroviral therapy (ART)-naive HIV-1 infected patients, compared to age- and sex-matched healthy subjects. Using a CEM T cell line transfected with miR-146b-5p mimic, we demonstrated that MV from CEM overexpressing miR-146b-5p mimic (miR-146b-MV): 1/ protect their miRNA cargo from RNase degradation, 2/ transfer miR-146b-5p mimic into HUVEC, and 3/ reduce endothelial inflammatory response in vitro and in vivo, in lungs from mice injected with miR-146b-MV. This paracrine control of endothelial inflammatory response mediated by MV involved a decreased expression of NF-κB responsive molecules ICAM-1 and VCAM-1, through down-regulation of IRAK1 and TRAF6. Collectively, these findings demonstrate that miR-146b-5p transferred by MV counteract IRAK1- and TRAF6-mediated endothelial inflammatory responses in HIV-1 infection and could be considered as a host defence mechanism against HIV-1-associated vascular alterations.

Les technologies actuelles permettent d’explorer le génome entier pour y découvrir des variants génétiques associés aux maladies. Cela implique des outils bioinformatiques adaptés à l’interface de l’informatique, des statistiques et de la biologie. Ma thèse a porté sur l’exploitation bioinformatique des données génomiques issues de la cohorte GRIV du SIDA et du projet international IHAC (International HIV Acquisition Consortium). Posant les prémices de l'imputation, j’ai d’abord développé le logiciel SUBHAP. Notre équipe a montré que la région HLA était essentielle dans la non progression et le contrôle de la charge virale et cela m’a conduit à étudier le phénotype non-progresseur non « elite ». J’ai ainsi révélé un variant du gène CXCR6 qui, en dehors du HLA, est le seul résultat identifié par approche génome-entier et répliqué. L’imputation des données du projet IHAC (10000 patients infectés et 15000 contrôles) a été réalisée et des premières associations sont en cours d’exploration. / Nowadays with the newest technologies, the entire genome can be explored to uncover genetic variants which may be linked to diseases. This requires bioinformatics tools which are adequate for studies which are at the border between computing, statistics and biology. My thesis work focused on the bioinformatical analysis of genomic data from the GRIV AIDS cohort and from the IHAC (International HIV Acquisition Consortium) project. I first laid the foundation for imputation work by developing the SUBHAP software. Our team showed that the HLA region was essential in non-progression and viral charge control. This led me to study the non progressor non elite phenotype. Thus, I uncovered a variant of the CXCR6 gene which is, apart from HLA, the only result identified with a GWAS approach so far and which has been reproduced. The imputation of data from the IHAC project (10000 infected patients and 15000 control subjects) was also performed and the first associations are now being studied.

Avec un taux d’incidence cumulée de 56 cas pour 100 000 habitants, la Guadeloupe est la deuxième région de France la plus touchée par le VIH. La plupart des publications sur le VIH/Sida en Guadeloupe sont essentiellement descriptives, issues de rapports d’activité. La base hospitalière, alimentant la Base de données Hospitalière française sur l’infection à VIH, n’a été que très peu exploitée pour la recherche. L’objectif de ce travail est d’évaluer les aspects fondamentaux de la prise en charge de l’infection VIH. Ainsi le dépistage tardif, le retard à la prise en charge spécialisée, l’interruption du suivi, les infections opportunistes et les décès sont étudiés ainsi que leurs facteurs prédictifs.Dans ce travail articulé autour de six publications, nous avons mis en évidence les points suivants : tout d’abord, le diagnostic très tardif (CD4<200/mm3) concernait 40,12 % des adultes infectés par le VIH suivis en Guadeloupe. Comparé à la France métropolitaine, ce taux est encore très élevé et souligne l’importance de poursuivre les efforts de dépistage. Pour pouvoir bénéficier d’une prise en charge précoce, le patient doit être dirigé dans un centre de traitement de l’infection par le VIH sans tarder. Or, le retard dans cette prise en charge spécialisée touchait 36 % des patients. L’analyse des éléments associés à ce retard a permis d’en identifier les facteurs de risque.Pour optimiser les résultats thérapeutiques, les patients nécessitent un suivi régulier. Ainsi, le système de santé devrait avoir comme objectif, entre autres, la rétention des patients dans le circuit de soins. Or, plus de 22 % des patients de cette cohorte étaient perdus de vue et jamais revus. Les patients plus jeunes, ceux au stade B de la classification CDC et ceux non traités par TTARV étaient plus à risque d’interruption de suivi, dès la première année suivant le diagnostic de l’infection VIH.Bien que la proportion des patients suivis sous ARV soit proche de 100 %, il en existe toujours développant un Sida. La comparaison avec la Guyane et la France métropolitaine montre que les trois premières affections classantes en Guadeloupe étaient la candidose oesophagienne, le syndrome de cachexie liée au VIH et la pneumocystose. Il existait des différences notables avec la métropole, mais aussi avec la Guyane. Ce taux élevé de syndrome de cachexie liée au VIH pose question. Derrière ce diagnostic, pourraient se cacher d’autres maladies opportunistes non diagnostiquées, mais également des différences de codage. Le recul de la mortalité avec le temps a entraîné une modification qualitative des causes de décès. Celles rapportées dans la littérature étaient les mêmes que celles observées dans notre étude. Contrairement à la métropole où le cancer représentait la première cause de mortalité, en Guadeloupe, les infections liées au Sida constituaient la première cause de décès.Ce travail de thèse s’est donc efforcé de dégager, pour l’une des régions de France les plus affectées par le VIH, quelques grands indicateurs à partir de la Base Hospitalière FHDH. Cette base ne comportait pas toujours toutes les informations souhaitées, mais le nombre substantiel d’observations donnait une puissance importante aux variables étudiées. Ces résultats, bien que confirmant souvent les connaissances empiriques des cliniciens, aura pu aider à mieux appréhender l’épidémie du VIH en Guadeloupe. / With an accumulated incidence rate of 56 cases per 100 000 inhabitants, Guadeloupe is the second French region most affected by HIV. Most of the publications on HIV/AIDS were essentially descriptive, stemming from annual reports. The Guadeloupean Hospital Database on HIV was scarcely exploited for research. The objective of this work was to estimate the fundamental aspects of HIV/AIDS in Guadeloupe. So late presentation for care, delay between HIV diagnosis and first specialised consultation, follow-up interruption, incidence of depression, opportunistic infections and deaths were studied as well as their predictive factors. We were able to highlight the following points: first, the very late HIV diagnosis (CD4< 200 / mm3) concerned 40, 12 % of HIV- infected adults followed in Guadeloupe. 36 % of patients had delays between HIV diagnosis and first specialised consultation. However, more than 22 % of patients were permanently lost to follow-up and never seen again. The first three classifying affections were oesophageal candidiasis, HIV-wasting syndrome and pneumocystosis. The causes of deaths reported in the literature were similar to those observed in our study. AIDS-related infections were the first cause of deaths.This thesis work thus tried to generate, in one of the most HIV-affected French regions, some indicators from the French Hospital Database on HIV. This database often did not contain all the desired informations, but the important number of observations allowed to have high power for the studied variables. These results, although often confirming the clinicians' empirical knowledge, may help understand some aspects of the HIV epidemic in Guadeloupe.

Cette thèse cherche à savoir ce qui se joue psychiquement chez la femme en grossesse et séropositive dans l’après coup de l’annonce de sa contamination par le VIH. Nous partons du fait que la grossesse est une période particulière. Au cours de celle-ci, la femme est sujette à des transformations aussi bien physiques que psychiques. Ces dernières marquent le processus de parentalité. Nous nous interrogeons donc sur les processus psychiques de la femme qui découvre sa séropositivité au cours de la grossesse. La thèse s’appuie sur les approches clinique et anthropologique. La première citée nous permet de mettre en lumière les processus et mécanismes psychiques auxquels ont recours les femmes enceintes et séropositives que nous avons rencontrées. La seconde nous amène à comprendre l’importance de l’enfant et de la maternité au Gabon pour ensuite vérifier que la femme qui fait l’objet de ce travail se représente son bébé à naître comme cela est le cas dans le pays ci-dessus cité. La complémentarité des deux approches constitue un moyen intéressant pour la compréhension de ce que la femme met en place pour faire face au VIH et poursuivre sa maternité.Les outils utilisés pour le recueil des données sont :• Un entretien semi-directif inspiré du questionnaire du CREA sur l’étude des représentations maternelles.• Le deuxième est l’entretien cris et pleurs de B Lester. • Le troisième et dernier est le dessin du bébé. Les données obtenues grâce aux outils ci-dessus, sont complétées par celles des entretiens que nous avons eus avec les médiatrices qui, au quotidien, suivent les femmes enceintes et séropositives dans les SMI. Après obtention des résultats, leur interprétation et analyse, il ressort que la femme enceinte et séropositive qui reçoit l’annonce de sa séropositivité au cours de la grossesse crée et construit un enfant que nous appelons « le divin-enfant-grigri ». Cet enfant dans son imaginaire est un don de Dieu. Il restaure sa mère narcissiquement. La femme en grossesse et séropositive se représente son enfant et elle se projette avec lui imaginant pour ce dernier un avenir meilleur que le sien. Cependant, la situation n’est pas aussi simple que ces lignes peuvent le laisser croire. La femme en grossesse et séropositive est dans un état de détresse. Le matériel montre la difficile cohabitation du VIH et du fœtus, le premier venant parasiter la rêverie maternelle. C’est de ce dernier (VIH) que cherche à se défendre la femme séropositive, et pour y parvenir, elle crée le « divin-enfant-grigri ». / This thesis seeks to know what is playing psychologically in a pregnant HIV- positive woman after the announcement of her being HIV infected. We start from the fact that pregnancy is a special time during which a woman is open to both physical and psychological changes.The thesis is based on clinical and anthropological approaches. The first quoted approach enables us to highlight psychological processes and mechanisms that the surveyed pregnant HIV- positive women use. The second helps us understand concepts of motherhood and child in Gabon. Furthermore, it allows us to verify the representation by a woman of her unborn baby as is the case in Gabon. The complementarity of the two approaches is an attractive way to understand what a woman plans to cope with HIV and carries on being a mother.The tools we have used for data collection are:• A semi-structured interview based on the CREA questionnaire on the study of maternal representations.• The second is the shouting-and-crying interview by Lester B,• The third and the last one is the drawing of the baby.The data we have obtained from these tools are supplemented by interviews we had with the mediators who follows pregnant HIV-positive women in MCH centres.After obtaining the results, their interpretation and analysis show that a pregnant HIV-positive woman, informed of her HIV status during pregnancy, creates and builds up the "divine grigri child." In her imagination, this child is a gift from God, and cannot thereby be contaminated. The child is also a narcissistic generator to his mother as he restores her. The pregnant HIV-positive woman imagines being her child, and projects with him in a dream for the latter to have a better future, far better than her own. However, the situation is not as simple and easy as these lines can suggest. The pregnant HIV-positive woman is in distress. The material shows an unaccommodating cohabitation of the fetus and the HIV. HIV is parasitical upon the mother’s reverie. It is the latter that the woman seeks to escape by creating the "divine grigri child."

Le virus de l’immunodéficience humaine de type 1 (VIH-1) est l’agent étiologique du SIDA. Il pénètre dans les cellules cibles par fusion membranaire médiée par le complexe enveloppe (Env) exprimé à la surface du virion. Le complexe est constitué d’une sous-unité de surface (gp120), et d’une sous-unité transmembranaire (gp41), exprimées sous forme trimérique. La liaison de gp120 au récepteur CD4 induit un premier changement de conformation qui expose la boucle hypervariable V3. Cette dernière lie un corécepteur, CCR5 et/ou CXCR4, induisant de nouveaux changements conformationnels au niveau de gp41 qui aboutissent à l’insertion du peptide de fusion, situé à l’extrémité N-terminale de gp41, dans la membrane de la cellule cible. Suite à la liaison du corécepteur, la région « heptad repeat 1 » (HR1) de gp41 interagit avec la région « heptad repeat 2 » (HR2) du même monomère pour former une structure coiled-coil hexamérique. Ce repliement permet le rapprochement des membranes virale et cellulaire, conduisant à la fusion des membranes.<p>Le processus d’entrée constitue une cible de choix pour inhiber la propagation du virus et à l’heure actuelle, il existe deux classes d’inhibiteurs d’entrée utilisés en clinique :les inhibiteurs de fusion et les inhibiteurs du CCR5. Le but de ce travail de thèse est l’étude des déterminants de l’enveloppe virale impliqués dans l’échappement du VIH-1 au traitement avec des inhibiteurs de fusion et de l’entrée.<p>La première partie de ce travail de thèse a étudiée l’effet modulateur des déterminants de l’enveloppe virale sur le niveau de résistance et de l’infectivité des virus primaires porteurs de mutations de résistance à l’enfuvirtide dans HR1 et de mutations compensatrices dans HR2. Nous avons sélectionné 5 patients ayant reçu un traitement à long terme incluant de l’enfuvirtide. Les enveloppes de virus ont été clonées à partir d’échantillons plasmatiques séquentiels, prélevés avant le début du traitement et pendant le suivi du traitement à l’enfuvirtide. Les séquences ont été caractérisées génotypiquement et phénotypiquement à l’aide de tests viraux recombinants mis au point à cet effet, et ciblant soit la région HR1-HR2, soit l’enveloppe entière. Pour les échantillons pré-thérapeutiques, les virus recombinants Env exprimaient des taux de sensibilité à l’enfuvirtide plus variables que les virus recombinants HR1-HR2, et une sensibilité à l’enfuvirtide significativement moindre que les virus HR1-HR2, indiquant que le contexte génétique de l’enveloppe affecte directement le niveau de susceptibilité du virus envers l’enfuvirtide. Après échec virologique, l’analyse phénotypique comparative des virus résistants suggère que les régions HR1-HR2 contiennent, à elles seules, les déterminants qui régissent la résistance. Le seul facteur associé à une modulation significative de la résistance est le tropisme. L’infectivité des virus Env a augmenté au cours du temps, alors que pour les virus HR1-HR2, l’infectivité est restée stable. Nos résultats suggèrent donc que le niveau de résistance confère un avantage sélectif initial sous pression sélective par l’enfuvirtide, alors que, une fois le niveau de résistance optimisé, l’infectivité des virus résistants est le facteur qui détermine la sélection des virus sous pression de sélection prolongée.<p>La deuxième partie de notre travail a été consacrée au rôle des virus dans des sites sanctuaires tels que le système nerveux central, et au rôle de séquences archivées dans les PBMCs dans l’échappement aux inhibiteurs d’entrée.<p>Dans une première étude clinique, nous avons illustré le rôle direct de la suppression incomplète du virus dans le système nerveux central dans l’acquisition de mutations de résistance à l’enfuvirtide et dans l’échec virologique. Le génotypage des virus plasmatiques et des virus isolés du liquide céphalo-rachidien d’un patient en échec de traitement a montré que la mutation de résistance à l’enfuvirtide était apparue dans le liquide céphalo-rachidien avant qu’elle ne devienne détectable dans le plasma, au moment de l’échec virologique. Le virus plasmatique résistant était phylogénétiquement proche du virus résistant isolé à partir du LCR, suggérant que la mutation de résistance a émergé dans ce compartiment. Ainsi, la pénétration incomplète des antirétroviraux dans le système nerveux central a abouti à la sélection de virus résistants, qui ont ensuite traversé la barrière céphalo-rachidienne pour atteindre la circulation périphérique.<p>Dans une seconde étude clinique, la caractérisation génotypique et phénotypique du tropisme de virus plasmatiques et cellulaires de deux patients en échec de traitement par du maraviroc ainsi que l’analyse phylogénétique rétrospective nous a permis de mettre en évidence l’importance de la recombinaison génétique dans la diversification des populations virales et son importance dans l’échec thérapeutique au maraviroc par l’émergence de virus X4. Par cette étude nous avons également pu souligner l’importance de l’administration iatrogène d’interleukine-2 sur la distribution et la modulation des populations X4 et R5 au niveau des compartiments cellulaires et plasmatiques et son importance dans l’échec thérapeutique au maraviroc.<p>En conclusions, nos résultats ont permis de mettre en évidence le pouvoir adaptatif du VIH-1 dans l’échappement au traitement aux inhibiteurs de l’entrée ainsi que le rôle majeur des sites sanctuaires et des virus archivés.<p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished