Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Alzheimer's disease (AD) is considered the main cause of dementia in elderly people worldwide. This disease affects the central nervous system (CNS), especially the cerebral cortex and hippocampus, areas that are responsible for the processes of learning and memory, for this the search for new therapies to treat this condition is constant. Studies indicate that Vitamin D3 (VD3) may be involved in the functions of neurotransmission, neuroprotection and neuroimmunomodulation in different brain processes, in addition to being involved in the homeostasis of calcium (Ca2+). Thus, the aim of this study was to investigate the effects of VD3 on memory and in the activity of enzymes AChE, NTPDase and 5'-Nucleotidase in the hippocampus of rats submitted to a model of sporadic dementia of the Alzheimer type (DETA) in rats. For this, a total of 40 male Wistar rats were used, weighing between 350-400g were divided into 8 groups: control, Vitamin D3 12.5 μg/kg, Vitamin D3 42 μg/kg, Vitamin D3 125 μg/kg streptozotocin (STZ), streptozotocin + Vitamin D3 12.5 μg/kg streptozotocin + Vitamin D3 42 μg/kg streptozotocin + Vitamin D3 125 μg/kg. The animals were anesthetized with ketamine and xylazine (0.5 mg/kg) and received a bilateral injection of streptozotocin (3mg/kg) intracerebroventicular (icv). After surgery the animals was submitted a recovery period for 72 hours. Then the animals were treated with VD3 orally for 21 days. Behavioral tests of open field and object recognition were realized from 21st to 24th day after surgery. After the 24th day the animals were anesthetized with isoflurane and euthanized. In relation to VD3 levels in serum, a significant increase (P<0.05) was observed in the groups that received the highest doses. A memory deficits in STZ group has been found, however, the treatment with VD3 shown to be effective in the preventing of loss of memory (P<0.05). Regarding the AChE activity was found increased in the hippocampus in STZ group, and this increase was attenuated by administration of VD3 (P<0.05). Animals of group with Dementia also showed a reduction in ATP hydrolysis and VD3 was able to prevent this effect (P<0.05). Furthermore, VD3 was able to reverse the increase in the hydrolysis to ADP and the decrease in AMP hydrolysis by STZ-icv. Thus, this study showed that administration of VD3 is capable of maintaining cholinergic neurotransmission, the homeostasis of the purinergic system as well as improve memory in animals with SDAT. / A Doença de Alzheimer (DA) é considerada a principal causa de demência em idosos no mundo. Essa doença afeta o Sistema Nervoso Central (SNC), principalmente o córtex cerebral e o hipocampo, que são áreas responsáveis pelos processos de aprendizagem e memória, por isso a busca por novas terapias para o tratamento dessa patologia é constante. Estudos indicam que a Vitamina D3 (VD3) pode estar envolvida nas funções de neurotransmissão, neuroproteção, neuroimunomodulação e diversos processos cerebrais, além de estar envolvida na homeostase do cálcio (Ca2+). Sendo assim, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da VD3 sobre a memória e na atividade das enzimas AChE, NTPDase e 5 Nucleotidase em hipocampo de ratos submetidos a um modelo de Demência Esporádica do Tipo Alzheimer (DETA) em ratos. Para isso, foram utilizados um total de 40 ratos machos Wistar, pesando entre 350- 400g, divididos em 8 grupos: controle, Vitamina D3 12,5 μg/kg, Vitamina D3 42 μg/kg, Vitamina D3 125 μg/kg, estreptozotocina (STZ), estreptozotocina + Vitamina D3 12,5 μg/kg, estreptozotocina + Vitamina D3 42 μg/kg, estreptozotocina + Vitamina D3 125 μg/kg. Os animais foram anestesiados com Ketamina e Xilazina (0.5 mg/kg) e receberam uma injeção bilateral de estreptozotocina (3mg/kg) intracerebroventicular (icv). Após o procedimento cirúrgico os animais passaram por um período de recuperação de 72 horas. Em seguida os animais foram tratados com VD3, via oral, durante 21 dias. Os testes comportamentais de campo aberto e reconhecimento de objetos foram realizados do 21º ao 24º dia após a cirurgia. Logo após o 24º dia os animais foram anestesiados com isoflurano e eutanasiados. Em relação os níveis de VD3 em soro, foi observado um aumento significativo (P<0.05) nos grupos que receberam as maiores doses. Um déficit de memória foi encontrado no grupo STZ, no entanto, o tratamento com VD3 mostrou-se eficiente em prevenir esta perda de memória (P<0,05). Quanto à atividade da AChE, foi encontrado um aumento em hipocampo no grupo STZ, sendo que esse aumento foi atenuado pela administração de VD3 (P<0,05). Os animais do grupo com Demência também apresentaram uma redução na hidrólise de ATP e a VD3 foi capaz de prevenir este efeito (P<0,05). Além disso, a VD3 foi capaz de reverter o aumento na hidrólise de ADP e a diminuição da hidrólise de AMP causada pela injeção icv-STZ. Desta forma, este estudo mostrou que a administração de VD3 é capaz de manter a neurotransmissão colinérgica, a homeostase do sistema purinérgico, bem como melhorar a memória em animais com DETA.

Submitted by Simone Souza (simonecgsouza@hotmail.com) on 2017-08-23T14:00:22Z No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Emanuele Brusamarelo.pdf: 1193853 bytes, checksum: ed950682d57e5c216154b030d0087cae (MD5) / Approved for entry into archive by Jordan (jordanbiblio@gmail.com) on 2017-08-24T15:13:12Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Emanuele Brusamarelo.pdf: 1193853 bytes, checksum: ed950682d57e5c216154b030d0087cae (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-24T15:13:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISS_2014_Emanuele Brusamarelo.pdf: 1193853 bytes, checksum: ed950682d57e5c216154b030d0087cae (MD5) Previous issue date: 2014-03-11 / A nutrição vitamínica e mineral interfere no desempenho e nas características ósseas das aves. O suplemento de vitamina D utilizado sem restrição nas rações para frangos de corte é o colecalciferol inativo e o 25-hidroxicolecalciferol. O objetivo foi avaliar o desempenho, o rendimento de cortes comerciais e de carcaça e os parâmetros ósseos de frangos de corte machos suplementados com 1,25-dihidroxicolecalciferol e redução de cálcio e fósforo disponível nas rações. Um total de 648 machos foi distribuído, em delineamento em blocos ao acaso, com seis tratamentos: dieta controle - atendendo a exigência nutricional; dieta controle negativo - com redução em 15% dos níveis de cálcio e de fósforo disponível; dieta controle negativo suplementada com: 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 μg de vitamina D3 ativa/kg ração respectivamente, com seis repetições (boxes). O desempenho foi avaliado pelo ganho de peso (kg), consumo de ração (kg/ave) e conversão alimentar. As aves foram pesadas com um dia e aos 42 dias de idade, para obtenção do ganho de peso. O consumo de ração foi obtido pela diferença entre a quantidade de ração fornecida, descontando-se as sobras em cada fase da criação. A razão entre o consumo de ração corrigido e o ganho de peso originou a conversão alimentar. Quatro aves/unidade experimental foram amostradas, pesadas e sacrificadas por deslocamento cervical para avaliação dos rendimentos de carcaça e de cortes comerciais no 42º dia de idade. Uma ave/unidade experimental foi amostrada, pesada e sacrificada para a remoção dos tibiotarsos utilizados na avaliação dos parâmetros ósseos no 21º e 33º dias de idade. As características ósseas avaliadas foram: o peso (mg) e comprimento (mg) do osso, índice de Seedor (mg/mm), cinzas ósseas (%) e resistência à quebra (kgf). O suplemento de vitamina D3 ativa com redução de cálcio e de fósforo disponível nas rações não influenciou o desempenho e os rendimentos de carcaça e cortes comerciais (peito, coxa + sobrecoxa e asa) das aves. A redução em 15% dos níveis de cálcio e de fósforo disponível e o suplemento de vitamina D3 ativa nas rações não afetou o peso e o comprimento do osso, o índice de Seedor e a resistência à quebra. O percentual de deposição de cinzas em ossos de frangos de corte aos 21 e 33 dias de idade foi diferente entre tratamentos. Os menores valores para cinzas, sem interferência na resistência à quebra dos tibiotarsos, demonstra a possibilidade de reduzir em 15% os níveis de cálcio e de fósforo disponível nas dietas sem compromoter a estrutura óssea das aves. / The vitamin and mineral nutrition interferes with the production performance and bone characteristics of birds. The vitamin D supplement used without restriction in the feed for broilers is inactive cholecalciferol and 25-hydroxycholecalciferol. The objective of this study was to evaluate the performance, and yields of carcass and commercial cuts and bone parameters of male broilers supplemented with 1,25-dihydroxycholecalciferol and reduction of calcium and available phosphorus in feed. A total of six hundred and forty-eight males, was used in a randomized-block design, with six treatments: control diet - meeting nutritional requirement; negative control diet - with 15% reduction in the levels of calcium and available phosphorus; negative control diet supplemented with: 0.5; 1.0; 1.5 and 2.0 μg of vitamin D3 active/kg diet respectively, with six replicates (boxes). The performance was evaluated by weight gain (kg), feed intake (kg/bird) and feed conversion. The broilers were weighed one day and at 42 days of age, for obtaining the weight gain. Feed intake was calculated as the difference between the amount of feed, discounting the leftovers at each stage of creation. The ratio between feed intake and weight gain corrected feed conversion originated. Later, four broilers of each experimental unit were sampled, weighed and slaughtered by cervical dislocation to evaluate carcass yield and commercial cuts yield at 42 days of age. Later, a one bird of each experimental unit was sampled, weighed and sacrificed for removal of tibiotarsos for the assessment of bone parameters at 21 and 33 days of age. The bones were identified and cleaned of all adhering tissue and frozen (-20°C) until analysis begins. The bone parameters were evaluated weight (mg) and length (mg) of the bone Seedor index (mg/mm) bone ash (%) and breaking strength (kgf). The active vitamin D3 supplement with reduced calcium and available phosphorus in the diets did not influence performance and carcass and commercial cuts (breast, thigh + drumsticks and wing) of poultry. A 15% reduction in the levels of calcium and available phosphorus and vitamin D3 supplement active in the diets did not affect the weight and length of the bone, the index Seedor and resistance to breakage. The percentage of bone ash deposition in bones of broilers at 21 and 33 days of age was different between treatments. The lowest values for ash, without interference in breaking resistance force of tibiotarsos, demonstrates the possibility of reducing in the 15% levels of calcium and available phosphorus in diets without compromising the bone structure of birds.

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, multisystem inflammatory disease characterized by symmetric and erosive synovitis. The purinergic signaling system plays an important role in the modulation of inflammatory and immune responses through extracellular biomolecules as nucleotides adenine and its adenosine nucleoside derivative, whose extracellular concentrations are controlled by ectoenzymes action as ecto-nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (E-NTPDase) and ecto-adenosine deaminase (E-ADA) present on the surface of various cells. The deficiency of vitamin D, a hormone known to play an important role in calcium homeostasis, has been related the several autoimmune diseases, including RA. This fact is due to its immunomodulatory role, where it inhibits the proliferation of T lymphocytes, especially Th1 lymphocytes as well as in the production and action of cytokines. Due to high doses of vitamin D can lead to hypercalcemia and intoxication it was tested the use of a nanoencapsulation system able to release in a controlled and sustainable manner, a reduced dose on site of action. Based on these principles, the effect of vitamin D3 free and nanoencapsulated was evaluated in the score for arthritis, thermal hyperalgesia and paw edema as well as histological analyzes and in the activity of the E-NTPDase and E-ADA enzyme lymphocytes from animals with arthritis induced by complete Freud‟s adjuvant (CFA). Hematological and biochemical parameters, including serum concentrations of vitamin D, were determined. Adult Wistar rats were divided into ten groups: I: control (CN); II: adjuvant-induced arthritis (AR); III: control vehicle (CV); IV: AR+V; V: vitamin D3 free at a dose of 120 IU/day (VD3); VI: AR+VD3 (120 IU/day); VII: control of white formulation (CF); VIII: AR+F; IX: vitamin D3 lipid-core nanocapsules formulation at a dose of 15.84 IU/day (LNC-D3) and X: AR+LNC-D3 (15.84 IU/day). The initiation of treatment was 15 days after the induction of arthritis in a period of 15 days. The results of this study demonstrated that VD3 was able to reduce arthritis score, thermal hyperalgesia and paw edema in rats with AR. At the same time, treatment with LNC-D3 only reduced thermal hyperalgesia and paw edema. The histological analyzes showed that both formulations were able to reduce inflammatory changes induced by CFA. The levels AST showed an increased in the CN group compared to the others. In the group treated with VD3 it was observed an increase in the levels of 25 (OH)D. The activity of the E-NTPDase in lymphocytes from rats that developed AR was higher in comparison with the control group, whereas the activity of E-ADA was lower. This effect was reversed after 15 days of treatment with VD3 and LNC-D3. In addition, both vitamin D3 formulations did not alter the activity of E-NTPDase and E-ADA enzymes in healthy animals. Data from this study indicate that vitamin D3, either in free or nanoencapsulated forms, seems to contribute mitigating the inflammatory process induced by CFA, possibly by modulating the activities of ectonucleotidases, can be used, after further studies, as a complementary therapeutic agent for the treatment of rheumatoid arthritis. / A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, multissistêmica, caracterizada por sinovite simétrica e erosiva. O sistema de sinalização purinérgica desempenha um papel importante na modulação das respostas inflamatórias e imunes, através de biomoléculas extracelulares, como os nucleotídeos de adenina e seu derivado nucleosídeo adenosina, cujas concentrações extracelulares são controladas por ação de ectoenzimas, como ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-adenosina desaminase (E-ADA) presentes na superfície de diversas células. A deficiência da vitamina D, um hormônio conhecido por desempenhar importante papel na homeostase do cálcio, vem sendo relacionada a diversas doenças autoimunes, entre elas a AR. Este fato deve-se a seu papel imunomodulador, onde atua na inibição da proliferação de linfócitos T, especialmente linfócitos Th1, bem como na produção e na ação de citocinas. Como altas doses podem levar à hipercalcemia e à intoxicação, foi testada a utilização de um sistema de nanoencapsulação capaz de liberar, de forma controlada e sustentada, uma dose reduzida no local de ação. Com base nestes princípios, foi avaliado o efeito da vitamina D3 livre e nanoencapsulada no escore de artrite, na hiperalgesia termal e no edema de pata, bem como em análises histológicas e na atividade das enzimas E-NTPDases e E-ADA de linfócitos de animais com artrite induzida por adjuvante Completo de Freund (CFA). Parâmetros hematológicos e bioquímicos, entre eles a concentração sérica de vitamina D, foram determinados. Ratas adultas Wistar foram divididas em dez grupos: I: controle (CN); II: artrite (AR); III: controle veículo (CV); IV: AR+V; V: vitamina D3 livre na dose de 120 UI/dia (VD3); VI: AR+VD3 (120 UI/dia); VII: controle da formulação branca (CF); VIII: AR+F; IX: vitamina D3 nanoencapsulada na dose de 15,84 UI/dia (LNC-D3) e X: AR+LNC-D3 (15,84 UI/dia). O início do tratamento foi após 15 dias da indução da artrite, em um período de 15 dias. Os resultados do presente estudo demonstraram que VD3 foi capaz de reduzir escore de artrite, hiperalgesia térmica e edema da pata em ratos com AR. Ao mesmo tempo, o tratamento com LNC-D3 reduziu apenas a hiperalgesia térmica e o edema da pata. As análises histológicas mostraram que ambas as formulações foram capazes de reduzir as alterações inflamatórias induzidas por CFA. Os níveis de AST apresentaram um aumento no grupo AR em comparação com os demais. No grupo tratado com a VD3 observou-se um aumento nos níveis de 25(OH)D. A atividade da E-NTPDase em linfócitos de ratos que desenvolveram AR foi maior em comparação ao grupo controle, ao passo que a atividade da E-ADA foi menor. Este efeito foi revertido após 15 dias de tratamento com VD3 e LNC-D3. Além disso, ambas as formulações de vitamina D3 não alteraram a atividade das enzimas E-NTPDase e E-ADA em animais saudáveis. Os dados do presente estudo apontam que a vitamina D3, tanto na forma livre quanto nanoencapsulada, parece contribuir amenizando o processo inflamatório induzido pelo CFA, possivelmente por modular as atividades das ectonucleotidases, podendo após estudos adicionais ser utilizada como um agente terapêutico complementar para o tratamento da artrite reumatoide.

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Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus

Bakgrund: Vitamin D finns i två olika former, det animaliska D3 (kolekalciferol) och det vegetabiliska D2 (ergokalciferol). Det har rått olika åsikter bland läkarkåren och allmänheten om vilken av de två formerna som är mest potent för att höja 25(OH)D-statusen i blodet, det värde som mäts för att avgöra vitamin D-halten i kroppen. Då vitamin D-brist är vanligt förekommande bland befolkningen i Norden är det viktigt att veta vilken form som har bäst effekt och som därför bör användas för att behandla och förebygga vitamin D-brist. Det har även betydelse för veganer som inte äter det animaliska D3, där rekommendationen kanske behöver ändras. Syfte: Syftet med studien var att ta reda på om det finns någon skillnad i potensen av D2 respektive D3 för att höja 25(OH)D-statusen i blodet och i så fall, att hitta möjliga orsaker till denna skillnad. Metod: Sex relevanta vetenskapliga originalartiklar, som har undersökt effekten av D2 vs. D3 på 25(OH)D-statusen i blodet, hittades i databasen PubMed. Studierna genomfördes mellan 2008 och 2017. Studiedeltagarna var vuxna friska människor. Resultat: Fyra av studierna pekade på att D3 var mer effektivt än D2 för att höja 25(OH)D-statusen. En studie kom fram till att det inte fanns någon skillnad i potensen mellan D2 och D3 och en studie visade att D2 var mer effektivt jämfört med D3 när det gällde daglig behandling med låga doser men att D3 uppvisade bättre effekt vid behandling med höga doser med två eller fyra veckors avstånd. Slutsats: Majoriteten av studierna visade en bättre effekt av D3 än D2 för att höja 25(OH)D-nivåer i blodet. De blandade resultaten samt det begränsade antalet studier och deltagare gör att det inte är möjligt att kunna komma fram till en tydlig slutsats. / Background: Vitamin D comes in two different forms, D3 from animals (cholecalciferol) and D2 from plants (ergocalciferol). There has been different opinions among physicians and the general public about which of the calciferols is more potent to raise 25(OH)D-levels in the blood, which is the value that is measured to determine the vitamin D-status in the body. Since vitamin D deficiency is common among the people of the Nordic countries it is important to know which form has the best effect and should be used to treat and prevent vitamin D deficiency. Furthermore, it is relevant for vegans who do not eat the animalic D3, where recommendations might have to be changed. Aim: The aim of the study was to find out if there were differences in potency of D2 vs. D3 to raise 25(OH)D status in the blood and if so, to find possible explanations for those differences. Methods: Six relevant original articles that examined the effect of D2 vs. D3 on 25(OH)D status in the blood, were found in the database PubMed. The studies where published between the years 2008 and 2017. The participants were healthy adults. Results: Four of the studies suggested that D3 is more effective than D2 in order to raise the 25(OH)D status. One study concluded that there is no difference in the effectiveness of D2 vs D3 and one study showed that D2 is more effective than D3 when it comes to daily treatment but that D3 has a better effect than D2 when treatment happens on a two or four weekly basis with large doses. Conclusion: Most of the articles suggested a better effectiveness of D3 than D2 to raise 25(OH)D levels in the blood. However, besides the mixed results, the number of studies and participants was too small to come to a clear conclusion.

Há dados na literatura indicando que as células que saem do timo com o fenótipo CD4+CD25+ são desenvolvidas continuamente como uma linhagem independente e possuem um papel importante no processo de regulação da resposta imune. Essas células são chamadas células T reguladoras naturais. Várias questões sobre estas células permanecem em aberto, como por exemplo, como elas são geradas, o que é determinante na sua atividade reguladora e que marcadores específicos podem ser usados para identificá-las? Dentro deste contexto, o nosso objetivo neste trabalho foi identificar no timo e em timócitos CD4+/CD25+ humanos, novas moléculas potencialmente importantes no desenvolvimento e/ou na atividade supressora das células T reguladoras naturais. Para este objetivo, utilizamos a abordagem de phage display, com uma biblioteca de fagos de peptídeos, e timos humanos obtidos de pacientes portadores de cardiopatias congênitas, submetidos a cirurgias cardíacas realizadas no InCor. A busca dessas moléculas foi feita, separadamente, em 3 tipos de material biológico: timócitos totais, fragmento do tecido tímico e timócitos CD4+/CD25+. Antes da incubação da biblioteca de fagos com os timócitos totais e timócitos CD4+/CD25+ (separação em FACS), foi realizada uma etapa de preclearing, incubando-se a biblioteca de fagos com um pool de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) ou timócitos CD4+/CD25-, respectivamente. Os fagos não ligantes, recuperados desta etapa, foram então incubados com as células de interesse. Para o tecido tímico não foi feita etapa de pre-clearing. Os fagos obtidos com os diferentes materiais biológicos foram recuperados em cultura de bactérias e usados em ciclos posteriores de seleção. Após três ciclos de seleção, os fagos foram seqüenciados e identificados quanto à expressão de peptídeos ligantes para timócitos totais, timo e timócitos CD4+/CD25+, e analisados em bancos de dados no BLAST. Os fagos selecionados para validação um ligante de tecido tímico: M2C e um ligante de timócitos CD4+/CD25+: R2A fazem similaridade a duas proteínas associadas ao metabolismo da Vitamina D3, molécula envolvida em imunorregulação e indução de tolerância, em diversos modelos experimentais. Porém, não há dados na literatura a respeito do seu papel em células T reg naturais. Na validação molecular desses fagos, apesar de certa variabilidade entre os diferentes ensaios, verificamos, por ELISA, que os fagos se ligam preferencialmente a 1,25 diidroxivitamina D3, forma ativa da Vitamina D3. Entretanto, nos ensaios de validação funcional, a influência da vitamina D na diferenciação dessas células não foi confirmada de forma consistente, uma vez que só tivemos aumento no número de células CD4+/CD25+, em cultura com Vitamina D, em poucos experimentos. As moléculas identificadas no presente estudo podem ter implicações relevantes no processo de diferenciação e na atividade de células T CD4+CD25+ reguladoras e serão mais investigadas na continuidade deste trabalho. / There are consistent data in literature indicating that thymic CD4+CD25+ cells play an important role in immune regulation and are continuously developed as an independent lineage in the thymus. These cells are known as natural regulatory T cells. Several questions about these cells remain unanswered, such as how they are generated, what is determinant in their regulatory function and which specific molecular markers can be used to identify them. Taking this into consideration, our aim was to identify new potentially important molecules in the development and/or supressive function of natural regulatory T cells, both in the thymus and in CD4+CD25+ thymocytes. For this, the phage display technique was employed, with a peptide phage library and thymic specimens obtained from children who underwent corrective cardiac surgery at the Heart Institute (InCor), in São Paulo. The search for these molecules was separately performed in 3 types of biological material: thymic tissue, thymocytes and CD4+CD25+ thymic cells. In the first stage, the phage peptide-library was incubated with a pool of PBMC (peripheral blood mononuclear cells). After the incubation, phages bound to PBMC were discarded (pre-clearing). In the second stage, unbound phages were incubated with either total thymocytes or CD4+CD25+ thymic cells. The pre-clearing stage was not perfomed in the thymic tissue. The phages obtained with after incubation with the different biological materials were recovered in E. coli culture and used in additional cycles of selection. After three rounds of selection, the recovered phages from the total thymocytes, from thymic tissue and thymocytes CD4+CD25+ were sequenced and their ligands identified. Among the phages selected for validation one ligand of thymic tissue: M2C and one ligand of CD4+CD25+ thymocytes: R2A present similarity to two proteins associated to the metabolism of Vitamin D3, a molecule involved in imunoregulation and toelrance induction in several experimental models. However, there are no data in the literature concerning the possible role of this moelcule in natural regulatory T cells. In the molecular validation of theses phages, although some variability between the diffeterent assays we have verified by ELISA, that the phages present preferential binding to the 1,25 dhydroxyvitamin D3, the active form of Vitamin D3. However, in the functional validation assays, the influence of the Vitamin D3 in the differentiation of these cells could not be consistently confirmed since we could observe an increase in the number of CD4+CD25+ cells cultured with vitamin D in only a few experiments. The ligand-receptor molecules we have defined in this study may have relevant implications in the development of CD4+CD25+ regulatory T cells in the thymus

Submitted by PPG Odontologia (odontologia-pg@pucrs.br) on 2018-06-04T18:05:30Z No. of bitstreams: 1 NATALIA_PRADELLA_CIGNACHI_TES.pdf: 6840858 bytes, checksum: 8e5f3ae6a98395bf09135b6770903f35 (MD5) / Rejected by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br), reason: Devolvido devido ? falta da capa institucional no arquivo em PDF. on 2018-06-14T14:34:13Z (GMT) / Submitted by PPG Odontologia (odontologia-pg@pucrs.br) on 2018-06-19T13:28:41Z No. of bitstreams: 1 NAT?LIA_PREDELLA_CIGNACHI_TES.pdf: 11102267 bytes, checksum: 121fbf4d2b9ae1c4a36e21d23ab3140d (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-06-27T14:32:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 NAT?LIA_PREDELLA_CIGNACHI_TES.pdf: 11102267 bytes, checksum: 121fbf4d2b9ae1c4a36e21d23ab3140d (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-27T14:43:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 NAT?LIA_PREDELLA_CIGNACHI_TES.pdf: 11102267 bytes, checksum: 121fbf4d2b9ae1c4a36e21d23ab3140d (MD5) Previous issue date: 2018-01-25 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior - CAPES / This thesis encompasses two parts: firstly, we compared the bone healing in female and male mice, after induction of type 1 diabetes (T1D); secondly, the bone regeneration was evaluated in a menopause model induced by bilateral ovariectomy (OVX), with or without T1D induction. For the part I, the animals (female and male) were initially assigned into two groups, namely control or T1D (elicited by streptozotocin; STZ). In the part II, the females were divided into four experimental groups: sham-operated or OVX, with or without STZ T1D induction. After T1D induction, a monocortical femoral defect was created. In either parts of the present study, we evaluated the effects of supplementation with vitamin D3 and/or insulin. In the second part, the effects of estrogen replacement were also analyzed. Following 21 days of bone defect creation, the animals were euthanized; the femurs and blood were collected for posterior analysis. Both T1D females and males presented a reduction in body weight gain, associated with hyperglycemia. There were no changes in the serum levels of the pro-inflammatory cytokines [interleukin-1? (IL-1?), tumor necrosis factor (TNF) and interferon-? (IFN-?)] in all the evaluated groups. T1D mice of both sexes presented a delayed bone regeneration, according to the histological and micro-CT assessment. The supplementation with vitamin D3 restored the bone healing in female and male T1D mice, reaching values close to controls. The insulin therapy improved the bone remodeling in T1D mice of both sexes, but the effects of this hormone were superior in males. The evaluation of osteoclast activity did not reveal significant differences among the experimental groups. Real time PCR revealed slight differences in the mRNA expression of two transcription factors related to osteoblast differentiation, namely runx2 and osterix, as measured in the area into the bone defect. A higher upregulation of both factors was seen in T1D males treated with vitamin D3. Conversely, vitamin D3-treated T1D females displayed an upregulation of insulin-like growth factor 1 (IGF-1), further indication sex-related differences for the treatments. Besides the experimental protocols described for the 12 part I of this thesis, in the part II, we also evaluated some behavioral locomotor parameters and serum levels of calcium and alkaline phosphatase. OVX animals presented increased body weight gain, accompanied by uterus atrophy. Otherwise, T1D induction elicited a reduction of body weight gain, which was more pronounced in OVX-T1D animals. Serum levels of alkaline phosphatase were divergent in the non-diabetic and T1D OVX animals. Calcium or cytokine levels were similar in all the experimental groups. The sham-operated T1D, the non-diabetic OVX and the OVX-T1D groups presented a delayed bone regeneration, as indicated by histological and micro-CT analysis. Estrogen replacement improved the bone healing in all OVX groups. There was a trend toward an upregulation of IGF-1 mRNA in non-diabetic OVX animals, which was not mirrored in OVX-T1D mice. Locomotor parameters remained unaltered, except by a general reduction of rearing numbers in T1D animals. / A presente tese est? dividida em duas partes: na parte I, comparou-se a regenera??o ?ssea em camundongos f?meas e machos, com diabetes do tipo 1 (T1D). Na parte II, foi avaliada a regenera??o ?ssea no modelo de menopausa experimental induzido por ovariectomia (OVX), com ou sem T1D. Na parte I, os animais (machos e f?meas) foram divididos em dois grandes grupos: controle e T1D (induzido por estreptozotocina; STZ). Na parte II, os animais foram divididos em quatro grandes grupos: f?meas falso-operadas e OVX, com ou sem T1D. Ap?s a indu??o do T1D, foi criado um defeito ?sseo monocortical no f?mur. Nas duas partes do trabalho, foram avaliados os efeitos da suplementa??o com vitamina D3 e/ou insulina. Na segunda parte, tamb?m se avaliou o efeito da reposi??o hormonal com estradiol. Decorridos 21 dias do procedimento da cria??o do defeito, os animais foram eutanasiados; o f?mur e o sangue foram coletados para an?lises posteriores. Tanto as f?meas, quanto os machos T1D, apresentaram uma redu??o do ganho de peso corporal, associado ? hiperglicemia. N?o houve altera??es nos n?veis s?ricos das citocinas pr?-inflamat?rias interleucina-1? (IL-1?), fator de necrose tumoral (TNF) ou interferon-? (IFN?). Os animais T1D, de ambos os sexos, apresentaram um comprometimento na regenera??o ?ssea, como demonstrado pelas an?lises histol?gicas e de micro-CT. A suplementa??o com vitamina D3 reestabeleceu a regenera??o ?ssea em f?meas e machos T1D, apresentando valores pr?ximos aos encontrados nos animais do grupo controle. A terapia com insulina melhorou a remodela??o ?ssea nas f?meas e machos T1D; por?m, os efeitos foram mais pronunciados nos machos. A avalia??o da atividade osteocl?stica n?o revelou diferen?as significativas entre os grupos experimentais, ap?s a indu??o de T1D, em machos ou f?meas. Os resultados do PCR em tempo real para runx2 e osterix (dois fatores de transcri??o relacionados aos osteoblastos), no tecido ?sseo, n?o demonstraram nenhuma diferen?a significativa, exceto por um aumento nos n?veis de RNAm dos dois fatores nos camundongos machos T1D, que receberam suplementa??o com vitamina 10 D3. Por outro lado, f?meas T1D que receberam vitamina D3 apresentaram um aumento na express?o dos n?veis de RNAm para o fator de crescimento semelhante ? insulina do tipo 1 (IGF-1), quando comparado com os machos que tiveram o mesmo tratamento, sugerindo assim, diferen?as relacionadas ao sexo. Al?m das an?lises j? mencionadas anteriormente, na parte II da tese, par?metros comportamentais e n?veis s?ricos de c?lcio e fosfatase alcalina tamb?m foram analisados. Os resultados da segunda parte do trabalho demonstraram que os animais submetidos a OVX tiveram um aumento do peso corporal, com atrofia uterina. Em contrapartida, quando foi induzido T1D, houve uma diminui??o do peso corporal mais acentuada no grupo OVX que no grupo falso-operado. Os animais falso-operados e OVX T1D apresentaram hiperglicemia, confirmando o desenvolvimento do diabetes. Os n?veis s?ricos de fosfatase alcalina foram divergentes entre os grupos n?o-diab?ticos OVX e OVX T1D. N?o houve varia??es dos n?veis de c?lcio. Os animais falso-operados T1D, n?o diab?ticos OVX e OVX T1D apresentaram preju?zos similares na regenera??o ?ssea, como observado pelas an?lises histol?gicas e imagens de micro-CT. A reposi??o com estradiol melhorou a cicatriza??o ?ssea nos animais n?o-diab?ticos OVX e OVX T1D. Houve uma tend?ncia ao aumento nos n?veis de RNAm de IGF-1 no grupo OVX, o que n?o foi observado quando da associa??o de T1D e menopausa. N?o foram observadas diferen?as na atividade locomotora dos animais com T1D e/ou OVX, a n?o ser por uma diminui??o no n?mero de rearings no grupo falso-operado T1D, independente do tratamento com vitamina D3, insulina e estradiol, de forma isolada ou em associa??o.

A maciez da carne bovina é o resultado do processo de proteólise miofibrilar influenciado pelas calpaínas (CAPN), enzimas ativadas pelo cálcio. A calpastatina (CAST) constitui um regulador das calpaínas, atuando como substrato e degradando-se pela ação da própria calpaína. A suplementação com vitamina D3 na dieta dos animais tem alterado positivamente a maciez da carne, por obter maior absorção e deposição de cálcio nos músculos. Tendo em vista a importância desses genes para a maciez da carne em bovinos e o metabolismo de vitamina D3, o objetivo deste estudo foi verificar a expressão gênica de 1-HYD, 24-HYD, CAPN1 e CAST (Isoformas). Foram utilizados 42 machos castrados da raça Nelore que foram divididos em 6 tratamentos (7 animais por tratamento). Os animais foram alojados em baias individuais e os tratamentos foram: T1) sem suplementação de Vitamina D3 + sem sombrite; T2) sem suplementação de Vitamina D3 + com sombrite filtração de 50% de UV; T3) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; T4) com 2x106UI de vitamina D3 por dois dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV; T5) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + sem sombrite; 6) com 2x106UI de vitamina D3 por oito dias consecutivos pré-abate + com sombrite filtração de 50% de UV. A expressão gênica foi analisada por PCR quantitativa em tempo real. O gene 1-HYD foi mais expresso nos tratamentos com 2 e 8 dias de suplementação com vitamina D3, independente da exposição diferenciada aos raios ultravioleta. O gene 24-HYD foi mais expresso no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate quando comparado ao tratamento controle, não diferindo do tratamento com suplementação por 2 dias consecutivos pré-abate. Portanto os resultados não corroboram com o mecanismo de regulação das atividades das enzimas modulada de forma oposta para regular os níveis circulantes de 1,25-di-hidroxi-vitamina D3 (1,25 D). Quando a concentração de 1,25 D atinge níveis elevados um mecanismo de regulação inativa a 1,25 D e promove a diminuição da expressão de 1-HYD. Assim pode-se inferir que neste estudo esses fatores não exerceram influência sobre o gene 1-HYD que teve um aumento da expressão. A única possibilidade de verificar o aumento da expressão do gene da enzima 1-HYD parece envolver um hiperparatireoidismo secundário decorrente de hipocalcemia em algum momento do experimento. A suplementação com vitamina D3 não exerceu influência na expressão de RNAm da CAPN1, isoforma I e isoforma total da CAST. A isoforma II do gene da calpastatina foi mais expressa no tratamento com 8 dias de suplementação pré-abate, onde parece que o aumento da expressão é devido a uma sinalização intracelular indicando que a calpastatina está sendo degradada pela ativação prolongada das calpaínas, em decorrência do aumento do influxo de cálcio. As análises de associação apontam para um possível descompasso entre abundância de RNAm e atividade da protease do sistema das calpaínas no processo de amaciamento da carne. / The tenderness of beef is the result of the process of myofibrillar proteolysis influenced by calpains (CAPN), enzymes activated by calcium. The calpastatin (CAST) is a regulator of calpains, acting as a substrate and degraded by the action of calpain itself. Supplementation with vitamin D3 in the diet has changed positively on meat tenderness, to obtain greater absorption and calcium deposition in muscle. Given the importance of these genes for meat tenderness in cattle and metabolism of vitamin D3, the objective of this study was to investigate the gene expression of 1-HYD, HYD-24, CAPN1, CAST (isoforms). We used 42 Nellore steers were divided into 6 treatments (seven animals per treatment). The animals were housed in individual pens and treatments were: T1) without vitamin D3 feeding + without shadow; T2) without vitamin D3 feeding + with black - 50% filtration of UV; T3) with 2x106UI of vitamin D3 for two days consecutive slaughter + without shadow; T4) with 2x106UI vitamin D3 for two days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV; T5) with 2x106UI vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + without shading; T6) 2x106UI with vitamin D3 for eight days consecutive slaughter + with black - 50% filtration of UV. Gene expression was analyzed by quantitative real-time. The 1-HYD gene was more expressed in the treatments with 2 and 8 days of supplementation with vitamin D3, independent of differential exposure to ultraviolet rays. The 24-HYD gene was more expressed in the treatment with 8 days of pre-slaughter supplementation compared to control treatment, the treatment did not differ with supplementation for 2 consecutive days pre-slaughter. These findings do not corroborate the mechanism for regulating the activities of enzymes modulated so diametrically opposite to regulate the circulating levels of 1,25- dihydroxy vitamin D3 (1,25 D). When there is an overproduction of 1,25 D regulation mechanism inactivates 1.25 D and promotes the reduction of the expression of 1-HYD. Thus we can infer that in this study, these factors did not influence the 1-HYD gene that had increased expression. The only way to verify the increase of gene expression of the enzyme 1-HYD seems to involve a secondary hyperparathyroidism due to hypocalcemia sometime in the experiment. Supplementation with vitamin D3 did not influence the mRNA expression of CAPN1, isoform I and isoform total of CAST. The isoform II of the calpastatin gene expression was higher in treatment with 8-day preslaughter supplementation, where it appears that increased expression is due to an intracellular signaling indicating that calpastatin is degraded by prolonged activation of calpain as a result of increased influx of calcium. The association analysis point to a possible mismatch between mRNA abundance and activity of the calpain system components in these physiological conditions.

Fibroblast growth factor-23 (FGF23) is a novel, bone-produced hormone that regulates renal phosphate (Pi) reabsorption and calcitriol metabolism. Disorders of mineral and bone metabolism, such as autosomal dominant hypophosphatemic rickets (ADHR) and hyperostosis-hyperphosphatemia syndrome (HHS), witness the importance of well-balanced serum levels of FGF23. Patients with chronic kidney disease (CKD) are highly morbid due to Pi retention/hyperphosphatemia and calcitriol deficiency, which lead to elevated serum levels of parathyroid hormone (PTH) and secondary hyperparathyroidism (sHPT). As a response to hyperphosphatemia, CKD patients have also remarkably high serum FGF23 levels, which are associated with cardiovascular risk factors and increased mortality in CKD. The overall aim of this dissertation was to discern a possible role of FGF23 in parathyroid biology. Our in vitro experiments on isolated bovine parathyroid cells demonstrate that FGF23 directly and dose-dependently suppresses the PTH production and secretion, while increasing the expression of the 25-hydroxyvitamin D3-activating enzyme 1α-hydroxylase. We investigated possible expressional changes in the FGF23 receptor co-factor Klotho in hyperparathyroid disorders and found that Klotho expression is decreased or absent and inversely correlated to serum calcium (Ca) in adenomas of primary HPT (pHPT). In the hyperplastic parathyroid glands of sHPT, Klotho expression declines in parallel with the kidney function and correlates with the glomerular filtration rate. Moreover, Klotho expression is suppressed by Ca and FGF23, increased by calcitriol, but unaffected by Pi and PTH in vitro. Finally, we identified a novel missense mutation in the gene encoding GALNT3, which is normally involved in the post-translational glycosylation of FGF23, as the cause of aberrant FGF23 processing in a patient with HHS. In summary, we provide evidence for a novel bone/parathyroid axis in which FGF23 functions as a direct, negative regulator of the PTH production. High extracellular Ca is a major determinant of the Klotho expression in pHPT, whereas the Klotho levels in sHPT may be attributed to a combination of the high FGF23 and Ca, and low calcitriol levels associated with CKD. Hence, the decreased Klotho expression in sHPT could explain the concomitantly high FGF23 and PTH levels, as well as the failure of FGF23 to prevent or mitigate the development of sHPT in CKD.