Child obesity is a significant health concern and treatment typically involves referral to child weight management services (CWM). Evidence suggests that preadolescent children may benefit from greater involvement in their treatment but the younger child can find it difficult to enter treatment discussions, and being overweight can negatively affect child self-esteem and capacity to communicate. Digital technology has the potential to provide scaffolding for child consultations with dietitians by presenting information in an accessible, engaging and interactive format. This research aimed to develop a theory driven, evidence-based interactive e-resource (Feed-back) and to explore the feasibility and acceptability of using Feed-back to facilitate communication between children aged 7 to 11 years and the dietitian within child weight management appointments.

Rhodopsin-Guanylylzyklasen (RhGC) sind einzigartige Photorezeptoren, die kürzlich in Pilzen der Abteilung Blastocladiomycota entdeckt wurden [1]. RhGCs gehören zu den Enzym-Rhodopsinen und die Licht-sensitive mikrobielle Rhodopsin Domäne ist kovalent mit einer Typ III Guanylylzyklase verbunden. Guanylylzyklasen bilden den sekundären Botenstoff cGMP, der zusammen mit cAMP eine Vielzahl biologischer Prozesse reguliert [2–12]. In der vorliegenden Arbeit wurden die fünf neu-entdeckten RhGCs mithilfe unterschiedlicher biochemischer und biophysikalischer Methoden charakterisiert. Elektrophysiologische Messungen erbrachten einen indirekten Nachweis für eine Grünlicht-aktivierte cGMP Synthese bei den RhGCs aus Blastocladiella emersonii (Be) und Catenaria anguillulae (Ca). Die Licht-aktivierte Guanylylzyklasen Funktion dieser RhGCs konnte durch ELISA Experimente und nach Aufreinigung der Photorezeptoren bestätigt werden. Belichtung führte zu einer 100-fachen oder 200-fachen Erhöhung von cGMP mit einem vmax von 1.8 oder 11.6 µmol/min/mg(Protein) bei BeRhGC oder CaRhGC. Im Dunkeln verblieb bei beiden Photorezeptoren die cGMP-Konzentration auf dem Niveau von Kontrollzellen. Durch eine enzymkinetische Analyse der isolierten Guanylylzyklase Domänen (Be/CaGC) konnte die konstitutive Aktivität der enzymatischen Einheit gezeigt werden, die im Vergleich zu den Volllängen Photorezeptoren 3-6x reduziert war. Weiterhin wurden die Photozyklen der isolierten Rhodopsin Domänen mithilfe spektroskopischer Methoden untersucht und Photointermediate identifiziert, die typisch für mikrobielle Rhodopsine sind. Die M-Intermediate zerfielen langsam mit τ ~ 100 ms bei BeRh und τ ~ 500 ms bei CaRh. Um die kinetischen und spektroskopischen Parameter der Photorezeptoren zu verändern, wurden die Be/Ca Rhodopsin Domänen mutiert. Zusätzlich wurde die Substratspezifität der RhGCs geändert und eine Doppelmutation (E497K/C566D) in der katalytischen Domäne erzeugte Rhodopsin-Adenylylzyklasen (RhACs). Die Licht-induzierte cAMP Synthese der RhACs wurde in Xenopus Oocyten getestet und im Vergleich zu BeRhAC zeigte CaRhAC eine erhöhte Licht-zu-Dunkel-Aktivität (6x) einhergehend mit einer verringerten Dunkelaktivität (5.5x). Um weitere Einblicke in die kürzlich entdeckten RhGCs zu erhalten, wurden die isolierten Zyklase Domänen, Be/CaGC und CaAC, in Gegenwart von NTP Analoga kristallisiert. Neben hochauflösenden monomeren GC Strukturen ohne Ligand wurde eine 2.25 Å Struktur der mutierten Zyklase, CaAC, mit dem ATP Analogon ATPαS gelöst. Die CaAC Struktur zeigt ein antiparalleles Arrangement der Dimer-Untereinheiten und die Bindung der Nukleotidbase durch die zuvor mutierten Reste. Aufgrund der Ähnlichkeit zu anderen Typ III Zyklasen kann auf einen klassischen Reaktionsablauf bei RhGCs rückgeschlossen werden. Abschließend wurde die Anwendbarkeit von Ca/BeRhGC sowie CaRhAC in hippokampalen Rattenneuronen und CHO Zellen getestet. Diese Experimente zeigen, dass sowohl RhGCs als auch YFP-CaRhAC als optogenetische Werkzeuge eingesetzt werden können, um die Zellbotenstoffe cGMP bzw. cAMP präzise mit Licht zu regulieren. / Rhodopsin-guanylyl cyclases (RhGC) are unique photoreceptors recently discovered in Blastocladiomycota fungi [1]. In RhGCs the light-sensitive microbial rhodopsin domain is covalently linked to a type III guanylyl cyclase. Guanylyl cyclases form the second messenger cGMP, which together with cAMP regulates a variety of biological processes [2–12]. Due to their architecture, RhGCs are classified as microbial enzyme rhodopsins. In the present work, the five newly discovered RhGCs were characterized using different biochemical and biophysical methods. Electrophysiological measurements provided indirect evidence for green light-activated cGMP synthesis of the RhGCs from Blastocladiella emersonii (Be) and Catenaria anguillulae (Ca). The light-activated guanylyl cyclase function could be confirmed by ELISA experiments and after purification of these photoreceptors. Green illumination led to a 100-fold or 200-fold increase in cGMP with a vmax of 1.8 or 11.6 µmol/min/mg(protein) for BeRhGC or CaRhGC. In the dark the cGMP concentration remained at the level of control cells for both photoreceptors. A kinetic analysis of the isolated guanylyl cyclase domains (Be/CaGC) revealed the constitutive activity of the enzymatic domain, which was 3-6x reduced compared to the full-length photoreceptors. A spectroscopic characterization of the Be/Ca rhodopsin domains allowed the identification of photocycle intermediates, which are typical for microbial rhodopsins. The M-intermediates decayed slowly with a τ ~ 100 ms for BeRh and τ ~ 500 ms for CaRh. The Be/Ca rhodopsin domains were mutated to change the kinetic and spectroscopic parameters of the photoreceptors. In addition, the substrate specificity of the RhGCs was switched to ATP by a double mutation (E497K/C566D) in the catalytic domain. The light-induced cAMP synthesis of the generated rhodopsin-adenylyl cyclases (Be/CaRhACs) was shown in Xenopus oocytes and after purification of the proteins. Compared to BeRhAC, CaRhAC showed an increased light-to-dark activity (6x) and a decreased activity in darkness (5.5x). To get further insight into the recently discovered RhGCs, the isolated cyclase domains, Be/CaGC and CaAC, were crystallized in the presence of NTP analogues. High-resolution monomeric GC structures without a bound ligand were produced. Additionally, a 2.25 Å structure of the mutated cyclase, CaAC, with the ATP analogue ATPαS was solved. The CaAC structure shows an antiparallel arrangement of the dimer subunits and the nucleotide base is bound by the previously mutated residues. Due to the similarity to other type III cyclases, a classical reaction sequence for RhGCs can be deduced. Finally, the applicability of Ca/BeRhGC and CaRhAC was tested in hippocampal rat neurons and CHO cells. These application-oriented approaches show that both RhGCs and YFP-CaRhAC can be used as optogenetic tools to precisely control cGMP and cAMP with light.

Phosphorylierung modulieren. Obwohl heute bereits Tausende von Phosphorylierungsstellen annotiert sind, sind entsprechende funktionelle Informationen begrenzt. Dies ist zum Teil darauf zurückzuführen, dass es keine Hochdurchsatzmethoden zur Erforschung der Funktion einer Phosphorylierungsstelle gibt. Um dieser Herausforderung zu begegnen, habe ich eine auf Shotgun-Proteomik basierende Strategie zur Messung der RNA-Bindungsaktivität von RBPs und ihren phosphorylierten Proteoformen entwickelt, die 'quantitative RNA-Interactome Capture (qRIC)' genannt wird. QRIC quantifiziert die Pull-Down-Effizienz von RBPs, die mit Oligo(dT)-Magnetbeads isoliert werden. Diese Effizienz korreliert mit der Anzahl der RNA-Bindungsstellen und der Spezifität der Motivbindung, und spiegelt so die RNA-Bindung in vivo wieder. In einer Gegenüberstellung der Pull-Down-Effizienz verschiedener Proteoformen in unbehandelten Zellen, habe ich qRIC als unvoreingenommenes Screening von regulatorischen Phosphorylierungsstellen in RBPs eingesetzt. Für jede einzelne Phosphorylierungsstelle wurde ein Delta-Effizienzwert berechnet, der den Einfluss auf die RNA-Bindung in vivo reflektiert. Die Effizienzunterschiede spiegelten das erwartete Verhalten von RBPs während der Phasentrennung von membranlosen Organellen und die Ladungsabstoßung zwischen Phosphorylierungsstellen und Nukleotiden bei physiologischem pH-Wert wider. Mithilfe des Delta-Effizienzwertes identifizierte ich mehrere bereits bekannte regulatorische Phosphorylierungsstellen in SF3B1, UPF1 und ELAVL1, sowie neue, bisher unbekannte und möglicherweise regulatorische Phosphorylierungsstellen in SERBP1, LARP1 und RBM20. Phosphomimetische Mutationsvarianten dieser Phosphorylierungsstellen wurden analysiert, um den molekularen Einfluss auf die Regulation der RBP-Funktion zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Phosphorylierung bestimmter Stellen im Spleißregulator RBM20 dessen nukleo-zytoplasmatische Lokalisierung, die Assoziation mit zytosolischen RNA-Granula und die Spleißfunktion beeinflusst. Diese Erkenntnisse könnten sich beispielsweise auf die Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit dysfunktionalen RBM20-Mutationen auswirken, die zu dilatativer Kardiomyopathie führen. QRIC kann als Hochdurchsatzverfahren dazu beitragen, unser Wissen über die Regulierung von Protein-RNA-Interaktionen durch Phosphorylierung zu erweitern. / Post-transcriptional regulation of gene expression is fundamental in health and disease. RNA-binding proteins (RBPs) directly bind and govern the fate of RNAs in cells. At the same time, cell signaling cascades control RBP functions by modulating their physicochemical properties through post-translational modifications, like phosphorylation. Although thousands of phosphorylation sites have been annotated, functional information is limited. This, in part, is due to the lack of high-throughput methods that measure function. To tackle this challenge I developed a shotgun proteomics-based strategy for measuring the RNA-binding activity of RBPs and their phosphorylated proteoforms, named quantitative RNA-interactome capture (qRIC). In qRIC, pull-down efficiency of RBPs isolation with oligo(dT) magnetic beads is quantified in cells at steady state and correlates with the number of RNA-binding sites and motif binding specificity, reflecting a link to RNA-binding in vivo. By contrasting pull-down efficiency of different proteoforms in the cells, I applied qRIC as an unbiased screening of regulatory phosphorylation sites in RBPs affecting pull-down efficiency. A delta efficiency score was calculated for each individual phosphorylation site to denote its influence on RNA-binding in vivo. Efficiency differences globally reflected the expected behavior of RBPs during phase separation of membraneless organelles and charge repulsion between phosphorylation sites and nucleotides in physiological pH. Using the delta efficiency score, I identified several previously known regulatory phosphorylation sites in SF3B1, UPF1 and ELAVL1, plus novel candidate regulatory sites in SERBP1, LARP1 and RBM20. Phosphomimetic mutant variants of these sites were analysed to investigate the molecular mechanism of regulation. Importantly, I show that phosphorylation of candidate sites in the splicing regulator RBM20 affects its nucleo-cytoplasmic localization, association with cytosolic RNA granules, and splicing function. These findings could have implications for the development of novel treatments based on kinase activity for patients with dysfunctional RBM20 mutations leading to congenital dilated cardiomyopathy. I anticipate that qRIC, as a high throughput approach, will help to expand our knowledge about the regulation of protein-RNA interactions and their regulation by phosphorylation.

Rhodopsin-Guanylyl-Zyklasen (RGCs) gehören zur Familie der Enzymrhodopsine, welche sich durch eine Lichtregulation ihrer Enzymaktivität durch ein Rhodopsin (Rh) auszeichnen. Das membranständige Rh ist hierbei mit einer Guanylylzyklase (GC) verbunden, welches nach Lichtaktivierung des Rh GTP zu zyklisiertem GMP (cGMP) umsetzt. Der sekundäre Botenstoff cGMP sowie das verwandte cAMP spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen. Die lichtgesteuerte Kontrolle dieser Botenstoffe bietet der Optogenetik somit eine Möglichkeit zur Erforschung ihrer Signalwege und könnte so den Weg zu medizinisch nutzbaren Erkenntnissen weisen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine RGC, gefunden im Genom des Pilzes Catenaria anguillulae aus der Abteilung der Blastocladiomycota, spektroskopisch untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein FTIR- und UV-Vis-spektroskopischer Messaufbau entwickelt, der eine parallele Aufzeichnung von UV-Vis- und FTIR-Spektren an derselben Proteinprobe erlaubt. Neben konventionellen Belichtungsmethoden, wurde ein durchstimmbarer Hochleistungspulslaser integriert, welcher den praktisch simultanen Umsatz der Proteinprobe erlaubt. Um auch früheste Prozesse spektroskopisch zu erfassen, wurde zusätzlich ein Hochdruck-Heliumkryostat integriert, der Messungen bis unterhalb des Siedepunkts von Helium ermöglicht (bis ~3 K). Nach der UV-Vis- und FTIR-spektroskopischen Charakterisierung der Photointermediate konnte ein Modell des Photozyklus abgeleitet werden, während Messungen an trunkierten Varianten eine aktive Rolle des N-Terminus in der Enzymregulation aufzeigten. Unter Verwendung eines photolabilen und nichtumsetzbaren GTP-Substrats konnte die Aktivität von RGC und freiem GC in Echtzeit spektroskopisch untersucht werden. Neben der Identifizierung des aktiven Zustands wurde entgegen bisheriger Annahmen gezeigt, dass GTP schon vor Lichtaktivierung an RGC bindet. Die Lichtregulation erfolgt demnach direkt über Modifikationen in der Bindetasche und nicht deren Zugänglichkeit. Ein Aktivierungsmechanismus wurde skizziert, der sowohl die hier vorgelegten Ergebnisse, als auch Ergebnisse vorhergehender Untersuchungen kombiniert. / Rhodopsin guanylyl cyclases (RGCs) belong to the family of enzymerhodopsins, which are characterized by light regulation of their enzyme activity by a rhodopsin (Rh). The embrane-bound Rh is linked to a type III guanylyl cyclase (GC). Upon light activation of Rh, inhibition of GC is abolished and conversion of GTP to cyclic GMP (cGMP) is initiated. The secondary messengers cGMP and the closely related cAMP play important roles in a variety of biological processes. Hence, light-controlled regulation of these messengers provides an opportunity to investigate their signaling pathways using optogenetics and could pave the way for medically useful findings. In this work, a RGC found in the genome of the fungus Catenaria anguillulae from the division of Blastocladiomycota was spectroscopically investigated. For this purpose, an FTIR and UV-Vis spectroscopic measurement setup was developed which supports parallel recording of UV-Vis and FTIR spectra of the same protein sample. In addition to conventional illumination methods, a tunable high-power pulse laser was integrated which allows virtually simultaneous turnover of the protein sample due to its pulse duration in the nanosecond and power in the megawatt range. To investigate the earliest molecular processes a high-pressure helium cryostat was integrated which allows measurements down to below the boiling point of helium (~3 K). Based upon the UV-Vis and FTIR spectroscopic characterization of the photointermediates, a model of the photocycle was derived, while experiments on truncated variants revealed an active role of the N-terminus in enzyme regulation. Using a photolabile and non-convertible GTP substrate, the activity of RGC and free GC could be investigated spectroscopically in real time. In addition to identifying the active state, it was shown, contrary to previous assumptions, that GTP binds to RGC even before light activation. Thus, light regulation occurs directly via modifications in the binding pocket rather than its accessibility. An activation mechanism was outlined that combines both the results presented here and results of previous studies.

Acetyl-CoA Synthase (ACS) katalysiert die Reaktion eines Methylkations, Kohlenstoffmonoxid und CoA zu Acetyl-CoA. Das aktive Zentrum von ACS ist ein Ni,Ni-[4Fe4S]-Cluster (A-cluster), in dem zwei Nickel-Ionen mit einem kubanen [4Fe4S]-Cluster verbrückt sind. An der Biosynthese von komplexen Metallclustern sind in der Regel mehrere akzessorische Proteine, auch Maturationsfaktoren genannt, beteiligt. Die Biosynthese des A-Clusters wurde bisher noch nicht genauer untersucht und es war nicht bekannt welche Proteine die Biosynthese des A-Clusters katalysieren. In dieser Arbeit wurde das Protein AcsF als Maturationsfaktor der ACS identifiziert und seine biochemischen und strukturellen Eigenschaften wurden charakterisiert. AcsF und apoACS aus Carboxydothermus hydrogenoformans bilden einen stabilen Komplex, der zwei Nickel-Ionen binden kann. ApoACS hingegen kann unter den gleichen Bedingungen im Durchschnitt nur weniger als ein Nickel-Ion binden. Der Ni-ACS-AcsF Komplex, an dem zwei Nickel-Ionen gebunden sind, ist katalytisch jedoch nicht aktiv. Erst durch Zugabe von Mg-ATP kann die inaktive Spezies in eine aktive Form überführt werden. AcsF-Proteine gehören zur gleichen Protein-Familie wie CooC-Proteine, die Maturationsfaktoren der Kohlenstoffmonoxid Dehydrogenase. Ein Sequenzähnlichkeitsnetzwerk konnte zeigen, dass AcsF- und CooC-Proteine jeweils eine eigene Untergruppe in dieser Familie bilden. Die AcsF-Proteine von C. hydrogenoformans und Archaeoglobus fulgidus wurden kristallisiert und deren Kristallstrukturen gelöst. Durch einen Vergleich der Strukturen von AcsF mit den Strukturen von zwei CooC-Proteinen konnte aufgedeckt werden, dass die größten strukturellen Unterschiede zwischen AcsF- und CooC-Proteinen zwischem dem Switch I Motif und dem CXC Motif zu finden sind. / Acetyl-CoA synthase (ACS) catalyzes the reaction of a methyl cation, carbon monoxide and CoA to acetyl-CoA. The active site of ACS is a Ni,Ni-[4Fe4S] cluster (A-cluster), in which two nickel ions are bridged to a cubane-type [4Fe4S] cluster. Usually, several accessory proteins are involved in the biosynthesis of such complex metal clusters. However, the biosynthesis of the A-cluster had not yet been investigated and it was not known which accessory proteins take part in its assembly. In this work, the protein AcsF was identified as a maturation factor of ACS, and its biochemical and structural properties were characterized. AcsF and apoACS from Carboxydothermus hydrogenoformans form a stabile complex, that can bind two nickel ions. ApoACS alone, on the other hand, binds on average only less than one nickel ion under the same conditions. The Ni-ACS-AcsF complex, that contains two nickel ions, is not active, but the addition of Mg-ATP converts the inactive species into an active form. AcsF proteins belong to the same protein family as CooC proteins, the maturation factors of carbon monoxide dehydrogenase. A sequence similarity network showed that AcsF and CooC proteins each form their own subgroup within this family. The AcsF proteins from C. hydrogenoformans and Archaeobglobus fulgidus were crystallized and their crystal structures were solved. A comparison of the crystal structures of AcsF proteins with the structures of two CooC proteins revealed that the main structural differences between AcsF and CooC proteins can be found between the switch I motif and the CXC motif.

Die DNA Methyltransferasen sind verantwortlich für die spezifische Methylierung von DNA-Basen. Mehrere DNA Methyltransferasen sind bekannt, wobei die Dnmt1 das hauptsächlich vorkommende Enzym ist. Bei Säugetieren korreliert die DNA-Methylierung mit der Genaktivität und ist essentiell für die Embryonalentwicklung. Eine beeinträchtigte Funktion oder Verfügbarkeit des Enzyms kann zu pathologisch veränderten Zuständen führen. Die Regulation der Dnmt1 und die damit verbundene Bedeutung bei der Entstehung von Krankheiten ist bisher nur unvollständig untersucht. In der Frühphase der Embryonalentwicklung von Säugetieren ändert sich das Methylierungsmuster des Genoms dramatisch. In zeitlich aufeinander folgenden Phasen wird die DNA demethyliert (Verlust der Methylgruppen) und neu methyliert (De-Novo Methylierung). Die Hypothese dieser Arbeit ist, dass verschiedene Isoformen der Dnmt1 in spezifischen Entwicklungsstadien exprimiert werden und zu Veränderungen des Methylierungsmusters der DNA beitragen. Um diese Regulation zu untersuchen, wurde die Struktur der Maus Dnmt1-Gens bestimmt. Außerdem wurde in verschiedenen Gewebetypen die Transkriptionsgröße und die Transkriptionsintensität der mRNA mit Hilfe von Northern-Blots quantifiziert. Mit diesen Experimenten konnte im Hoden- und Skelettmuskelgewebe ein längeres Dnmt1-Transkript als in anderen Geweben identifiziert werden. Dieses neue Dnmt1-Transkript wurde mit Hilfe von RT-PCR und RACE-Techniken kloniert und ist in beiden Geweben identisch. Es unterscheidet sich auf DNA-Ebene in der Sequenz des 5'-Endes von der bisher bekannten Form der Dnmt1 und besitzt einen anderen Startpunkt für die Transkription. Darüber hinaus besitzt das neue Dnmt1-Transkript ein 800 Basenpaar großes erstes Exon, welches sich von dem des bekannten Dnmt1-Transkripts unterscheidet. Die spezifische zelluläre Lokalisation des neuen Transkripts wurde mit Hilfe der In-Situ-Hybridisierung analysiert. Mit dieser Technik wurde das alternative Transkript in stärker spezialisierten, haploiden spermatogenen Zellen (Spermatiden) und zu einem geringen Maß im Skelettmuskel nachgewiesen. Während der Differenzierung von Muskelzellen wurde eine verminderte Expression des bereits bekannten mRNA-Transkripts und eine verstärkte Expression des neu identifizierten mRNA-Transkripts festgestellt. Obwohl die mRNA der alternativen Isoform verschiedene, kurze offene Leserahmen enthält, welche die Translation eines spezifischen Dnmt1 Proteins verhindern könnten, wurde durch Immunofluoreszenz- und Western-Blot Analysen ein Translationsprodukt nachgewiesen. Nach den hier aufgezeigten Ergebnissen werden alternative Dnmt1 Isoformen in vivo exprimiert, welche eine aktive Rolle bei der Regulation der DNA-Methylierung spielen könnten. / DNA methyltransferases (DNA MTases) are enzymes responsible for DNA methylation (transfer of methyl groups to a base in the DNA) and are vital for the development of mammals. Several MTases have been identified in eukaryotes but the most abundant is Dnmt1. Furthermore, many pathological conditions are often attributed to an altered availability or function of this enzyme, however the understanding of the regulation of Dnmt1 and the concomitant relationship to diseases is far from being complete. In mammals the methylation of DNA correlates with gene activity, and methylation patterns change dramatically during early development when the genome of the mammalian embryo undergoes consecutive waves of demethylation (loss of methylation) and de novo methylation (methylation of DNA sites that have not been previously methylated). The hypothesis of this study was that alternative Dnmt1 isoforms are expressed at specific developmental stages and thus contribute to changes in the DNA methylation pattern. To study this regulation the structure of the Dnmt1 gene was determined. In this work, the tissue distribution and abundance of Dnmt1 mRNA was analyzed by Northern blot and a new, longer transcript was identified that is present in testis and skeletal muscle tissue. The novel isoform was cloned by a combination of RT-PCR and RACE techniques and found to be identical in both tissues. This new isoform differs from the ubiquitous cDNA in the 5' end, utilizing a new transcriptional start site and an 800 bp long alternative first exon. The cellular localization of this new transcript was determined by in situ hybridization and found to be present in the more specialized haploid spermatogenic cells, spermatids and at lower level in skeletal muscle. During muscle differentiation, the ubiquitous isoform is downregulated while the alternative isoform is upregulated. Although this mRNA codes for several short upstream ORFs which could prevent translation of the Dnmt1-specific ORF, it was found by immunofluorescence and Western blot analyses that this transcript can be translated in vivo producing a shorter Dnmt1 protein. The results shown here indicate that alternative Dnmt1 isoforms are expressed in vivo and might play an active role in the regulation of DNA methylation.

Nos travaux sur 26 gènes de la famille des WDR a permis d’en identifier sept (Atg16l1, Coro1c, Dmxl2, Herc1, Kif21b, Wdr47, Wdr89) associés à des anomalies cérébrales majeures. Cette grande famille de protéines reste pourtant peu explorée quant à ses rôles dans le développement du système nerveux central. Nous avons choisi d’étudier WDR47, dont la fonction est totalement inconnue en dépit d’une très grande similarité structurale avec LIS1, protéine à l’origine de la lissencéphalie. En combinant trois modèles expérimentaux (souris, siRNA et levure), nous avons démontré que Wdr47 est essentiel pour la survie de l’organisme et est impliqué dans la coordination motrice et le maintien de l’homéostasie énergétique avec une origine probablement centrale. Au niveau cellulaire, Wdr47 assure un rôle clé dans la dynamique des microtubules et la stabilisation du cône de croissance au travers d’interaction protéiques avec Reelin et SCG10. En outre, Wdr47 est aussi impliqué dans la prolifération neuronale et la macroautophagie. Ces résultats ont permis d’établir un lien de causalité entre une duplication de 200 kb contenant Wdr47 et des troubles de coordination motrice et une obésité hyperphagique chez un jeune patient. / WD40-repeat (WDR) proteins are one of largest eukaryotic family, however little is known about their role in neurodevelopment. We investigated 26 WDR genes, and found 7 (Atg16l1, Coro1c, Dmxl2, Herc1, Kif21b, Wdr47, Wdr89) with a major impact in brain structure when inactivated in mice. We chose WDR47 for further investigation, as it is a completely unknown protein that shares striking domain similarity with LIS1. Using three independent model systems (mice, siRNA and yeast), we found an essential role of Wdr47 in survival, and key neuronal processes involving microtubule dynamics such as proliferation, autophagy and growth cone stabilization. Next we identified Reelin and superior cervical ganglion 10 (SCG10) as top interacting proteins of WDR47. Interestingly, a 200-kb duplication encompassing WDR47 was linked to poor coordination in one patient, recapitulating mouse behavioural anomalies. Together our data help unravel for the first time a key role of Wdr47 in brain.

Les lignines sont des hétéropolymères phénoliques de la paroi cellulaire, principalement à base de p-coumaryl, coniférylique et sinapylique alcools. Ces monolignols sont synthétisées dans le cytoplasme de la voie des phénylpropanoïdes, peut ensuite transportées vers les parois des cellules où ils sont polymérisés par oxydation en p-hydroxyphényl (H), guaiacyle (G) et syringyle (S) des unités de lignine. Cette étape de polymérisation par oxydation est conduite par les peroxydases dépendantes H₂O₂ et / ou laccases dépendantes O₂. Dans cette étude, nous avons signalé pour la première fois que les laccases sont également impliqués dans la lignification du les herbes. Un gène de laccase spécifique (BdLAC5) a été identifié parmi les 29 gènes de laccase non redondants dans Brachypodium génome, qui est responsable de la lignification dans les tiges de Brachypodium distachyon, une plante modèle pour les graminées. BdLAC5 gène a été retrouvé fortement exprimé dans les organes lignifiées (internodal, nœud et le pédoncule) et mal exprimé dans les organes avec faible niveau de lignine (jeunes feuilles et épillet), ni dans les tissus non-lignifiée (endosperme). Deux autres laccases BdLAC6 et BdLAC8 sont également trouvés coexprimés avec BdLAC5 et curieusement ils appartiennent à la même clade phylogénétique. BdLAC6 et BdLAC8 sont orthologues de Arabidopsis LAC4 et LAC2 respectivement. Dans les expériences d'hybridation in situ ont démontré le signal le plus intense dans les fibres interfasciculaires de l'entre-nœud a été détectée avec des sondes BdLAC5. En outre, des essais ont révélé que les protéines immunomarquages BdLAC5 pourraient être sécrétés dans la matrice de la paroi cellulaire, car nous avons détecté des particules fluorescentes dans ou à proximité de la paroi cellulaire. Le double mutant laccase touchée BdLAC5 et BdLAC8 a clairement montré que la lignification dans les fibres interfasciculaires impliqué différents gènes / protéines que la lignification dans les cellules métaxylème de Brachypodium. Métaxylème cellules ont été que faiblement affectés dans le double mutant lorsque les fibres interfasciculaires montré diminution dramatique de Wiesner coloration. Les différents mécanismes de lignification entre xylème et fibres est discutée. L'interaction physique et la synergie entre réglementation spécifique R2R3-MYB, bHLH et WDR protéines est bien étudiée dans la biosynthèse des flavonoïdes, racine des cheveux, trichomes et le développement en mucilage de graines de différentes espèces de plantes. Dans cette étude, nous avons essayé de comprendre les rôles de MYB-bHLH-WDR pour la régulation de la biosynthèse de la lignine. / Lignins are cell wall phenolic heteropolymers, mainly made from p-coumaryl, coniferyl, and sinapyl alcohols. These monolignols are synthesized in the cytoplasm from the phenylpropanoid pathway, then may transported to the cell walls where they are oxidatively-polymerized into p_hydroxyphenyl (H), guaiacyl (G) and syringyl (S) lignin units. This oxidative polymerization step is driven by H₂O₂-dependent peroxidases and/or O₂-dependent laccases. In this study we reported for the first time that laccases are also involved in lignification in grasses. A specific laccase gene (BdLAC5) was identified among 29 non-redundant laccase genes in Brachypodium genome, which is responsible for the lignification in stems of Brachypodium distachyon, a model plant for grasses. BdLAC5 gene was found highly expressed in lignified organs (internode, node and peduncle) and poorly expressed in organs with low lignin level (young leaf and spikelet) nor in non-lignified tissue (endosperm). Two other laccases BdLAC6 and BdLAC8 are also found coexpressed with BdLAC5 and interestingly enough they belong to the same phylogenetic clade. BdLAC6 and BdLAC8 are close orthologues of Arabidopsis LAC4 and LAC2 respectively. In situ hybridization experiments demonstrated the most intense signal in the interfascicular fibers of the internode was detected with BdLAC5 probes and then for BdLAC8 and BdLAC6 probes. Furthermore, immunolabelling assays revealed that BdLAC5 proteins might be secreted into the cell wall matrix because we detected some fluorescent particles close to or in the cell wall. The double laccase mutant affected in BdLAC5 and BdLAC8 (5ho8ho) clearly showed that the lignification in interfascicular fibers involved different genes/proteins than the lignification in metaxylem cells of Brachypodium. Metaxylem cells were only poorly affected in the double mutant when interfascicular fibers showed dramatic decrease of Wiesner staining. The different mechanisms of lignification between xylem and fibers is discussed. The physical interaction and regulatory synergy between specific R2R3-MYB, bHLH and WD repeat protein is well studied in the biosynthesis of flavonoids, root hair, trichome and seed mucilage development in different plant species. In this study, we were trying to figure out the roles of MYB- bHLH-WDR for the regulation of lignin biosynthesis.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtgesteuerte Ionenkanäle aus einzelligen Grünalgen, die in der Optogenetik verwendet werden. Photonabsorption führt zur Isomerisierung des Retinal-Kofaktors, was eine Reihe von Reaktionen auslöst, die als Photozyklus bezeichnet werden und die Bildung des leitenden Zustands umfassen. In dieser Arbeit wurde der Photozyklus-Mechanismus ausgewählter ChRs mittels FTIR (Fourier Transform Infrarot)- und UV-Vis-Spektroskopie, sowie Retinalextraktion und HPLC (Hochleistungsflüssigkeitschromatographie)-Analyse untersucht. Photorezeptoren sind dafür optimiert, Lichtenergie zu nutzen, um Konformationsänderungen des Proteins hervorzurufen. Dafür wird ein Teil der Lichtenergie durch eine transiente Verdrillung des Chromophors gespeichert. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass der Transfer der gespeicherten Energie zum Protein in ReaChR stark vom Protonierungszustand von Glu163 beeinflusst wird; er wird durch eine erhöhte Rigidität des aktiven Zentrums bei protoniertem Glu163 verlangsamt. In Chrimson hingegen relaxiert der Chromophor nach Photoisomerisierung, was auf einen verdrillten Chromophor im Dunkelzustand hinweist, was vermutlich für die bathochrome Verschiebung von Bedeutung ist. Zusätzlich zur Chromophorgeometrie beeinflusst der Protonierungszustand von Glu163 in ReaChR und dem homologen Glu165 in Chrimson die Stereoselektivität der Photoreaktion. Ein weiterer Faktor der Stereoselektivität ist Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2), welches im Photozyklus deprotoniert. Die Bildung des leitenden Zustands in C1C2 und ReaChR geht mit einem Wassereinstrom ins Protein einher, welcher den Transport größerer Kationen erleichtert. Die Deprotonierung von Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) verändert die Ionenselektivität des Kanals, wie aus elektrophysiologischen Messungen bekannt ist. In Chrimson ist das Ausmaß des Wassereinstroms deutlich reduziert, was – in Übereinstimmung mit elektrophysiologischen Experimenten – den Transport von Protonen begünstigt. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels found in single-cell algae and used in optogenetics. Photon absorption leads to isomerization of the retinal cofactor, initiating a number of reactions that are referred to as photocycle and involve formation of the ion-conducting state. In this thesis, the photocycle mechanism of selected ChRs was investigated using FTIR (Fourier Transform Infrared) and UV-Vis spectroscopy, as well as retinal extraction and subsequent HPLC (High Performance Liquid Chromatography) analysis. Photoreceptors are optimized to use photon energy to drive conformational changes of the protein. Therefore, a fraction of the photon energy is stored by a transient distortion of the chromophore. In this thesis, it is shown that in ReaChR the transfer of the stored energy to the protein is largely affected by the protonation state of Glu163, being decelerated by protonated Glu163 due to an enhanced rigidity of the active site. In contrast, the chromophore in Chrimson relaxes upon photoisomerization, hinting at a distorted retinal geometry in the dark state, which is probably essential for its unprecedented bathochromic absorption. In addition to the chromophore geometry, the protonation state of Glu163 in ReaChR and the homologue Glu165 in Chrimson affects the stereoselectivity of the photoreaction. Another factor for stereoselectivity is Asp196 in ReaChR (Asp195 in C1C2) which deprotonates in the photocycle. Formation of the ion-conducting state in C1C2 and ReaChR involves water influx into the protein, facilitating transport of larger cations. Deprotonation of Glu130 in ReaChR (Glu129 in C1C2) alters the ion selectivity of the channel as known from electrophysiological experiments. In Chrimson, the extent of water influx is drastically reduced which favors the conductance of protons in agreement with electrophysiological characterization.

QuasArs, eine neue Klasse von fluoreszierenden Membranspannungssensoren basierend auf Archaerhodopsin-3, wurde von Hochbaum et al. im Jahr 2014 beschrieben. Die neuen Konstrukte zeigen eine für mikrobielle Rhodopsine außergewöhnlich hohe Fluoreszenzquantenausbeute. Außerdem ist die Fluoreszenz spannungsabhängig, was für Membranspannungssensoren eine wünschenswerte Eigenschaft ist. Diese Sensoren bieten ein hohes räumliches und zeitliches Auflösungsvermögen, wodurch neuronale Aktivität verfolgt werden könnte. Obwohl mehrere Varianten vorgeschlagen wurden ist ihre Fluoreszenzquantenausbeute immer noch zu gering (<1%) für Anwendungen in lebenden Nagetieren und erfordert weitere Verbesserungen für bildgebende Anwendungen. Das rationale Design der Rhodopsin-basierten Fluoreszenzsensoren der nächsten Generation ist jedoch nur eingeschränkt möglich, da die derzeit verwendeten QuasArs mittels zufälliger Mutagenese gefunden wurden. Um verbesserte Konstrukte zu entwickeln, ist es wichtig die Funktionalität der spannungssensitiven Fluoreszenz und die Rolle der eingeführten Mutationen zu verstehen. In dieser Arbeit wurden die mikrobiellen Rhodopsin-basierten Spannungssensoren und der Ursprung ihrer spannungsmodulierten Fluoreszenz untersucht. Die Photodynamik dieser Spannungssensoren wurde mit UV/Vis-Steady-State und -transienter Spektroskopie untersucht. Die Archaerhodopsin-3 Varianten durchlaufen einen ungewöhnlichen Photozyklus mit verlängerter Lebensdauer des angeregten Zustands und ineffizienter Photoisomerisierung. Präresonanz-Raman-Spektroskopie und Hochdruckflüssigkeitschromatographie ermöglichten die direkte Untersuchung des Chromophors in diesen besonderen Rhodopsinen. Molekulardynamiksimulationen, unterstützt durch spektroskopische Studien, liefern ein Modell der Proteindynamik unter Einfluss der Membranspannung. Protein-Engineering ermöglichte die Identifizierung der Aminosäuren, die für die Erhöhung der Fluoreszenzquantenausbeute benötigt werden, und der Schlüsselreste, die an der Spannungsmessung beteiligt sind. Aussichtsreiche Konstrukte mit verbesserten Eigenschaften wurden vorgeschlagen und getestet. / Novel class of fluorescent membrane voltage sensors QuasArs, based on Archaerhodopsin-3, have been reported by Hochbaum et al. in 2014. The new constructs show unusually high fluorescence quantum yield for microbial rhodopsins. Furthermore the fluorescence is voltage-dependent, which is a desirable property for membrane voltage sensors. These tools would offer high spatiotemporal resolution allowing to track neuronal spiking. Although multiple constructs have been proposed, their fluorescence quantum yield is still too low (<1%) for applications in living rodents and requires further improvement for imaging applications. However, rational design of the next generation rhodopsin-based fluorescent sensors is restrained since the current constructs were found using random mutagenesis. To develop improved constructs it is essential to understand the functionality of the voltage-sensitive fluorescence and the role of the introduced mutations. In this thesis, the microbial rhodopsin based voltage sensors and the origin of their voltage-modulated fluorescence were studied. The photodynamics of microbial rhodopsin-based voltage sensors were studied with UV/Vis steady state and transient spectroscopy. The archaerhodopsin-3 variants undergo an unusual photocycle with extended excited state lifetime and inefficient photoisomerization. Pre-resonance Raman spectroscopy and high-pressure liquid chromatography allowed to directly study the chromophore composition in these peculiar rhodopsins. Molecular dynamics simulations, supported by spectroscopic studies, provide a model of protein dynamics taking place under different membrane voltage conditions. Protein engineering allowed to identify the residues needed for the increase of the fluorescence quantum yield and key residues involved in the voltage sensing. Promising constructs, with improved properties, were proposed and tested.