Um total de 8.961 amostras fecais coletadas de pacientes com diarréia aguda, no período de 1996 a 2006, no Estado de São Paulo foi testado para rotavírus por EIE. Destas, 20,0% foram positivas e posteriormente realizadas a caracterização dos rotavírus em genótipos G e P por nested RT-PCR. O genótipo G1 de rotavírus foi o mais freqüente, detectado em 35,2% das amostras, seguidos dos tipos G9, G2, G3, G4, infecção mista e G12. A associação mais freqüente foi a P[8]G1 e P[8]G9. Foi realizada a sequencia nucleotídica do gene 9 (VP7) de 38 rotavirus genótipo G1. Duas cepas foram analisadas dos anos de 1997, 1998, 2001 e 2002, três cepas dos anos 1996, 1999 e 2003, quatro cepas em 2000, sete cepas em 2004 e 2005, e cinco em 2006. Os 38 rotavírus G1 foram classificados em duas linhagens distintas, linhagem G1-I e linhagem G1-II. A linhagem G1-I foi detectada durante seis anos, 1996-1997, 2001-2002 e 2004-2006, e a linhagem G1-II foi detectada durante os anos de 1998-2001, e 2003-2005. Análises preliminares mostraram que Rotarix ® foi eficiente contra estas linhagens G1. / Rotavirus (RV) infections are recognized as a major cause of severe gastroenteritis in children worldwide. In March 2006, a monovalente P[8]G1, human RV vaccine (Rotarix® GlaxoSmithKline Biologicals) was introduced in Brazil into the routine childhood immunization schedule. Therefore, the study of genetic diversity among rotavirus strains before and after the introduction of this vaccine may be important for the development of vaccination strategies. A total of 8,961 fecal samples collected from patients with acute diarrhea, during the 11-year period surveillance in São Paulo State (1996 to 2006) were tested for rotavirus by ELISA. One thousand seven hundred eighty- four (1,784, 20.0%) were positive, and the characterization of the G and P genotypes was performed on 1,300 rotavirus samples by nested RT-PCR. The G1 type was the most prevalent rotavirus strain (35.2%). The second most prevalente was the G9 type (31.2%), followed by G2 (4.0%), G3 (3.5%), G4 (2.2%), mix infection (1.8%) and G12 (0.5%). The more frequent association was P[8]G1 and P[8]G9. We performed a sequence analysis of 38 P[8]G1 rotavirus strains, selected from a total of 341 P[8]G1.Two strains from 1997, 1998, 2001, and 2002 were analyzed; three strains from 1996, 1999, and 2003; four strains from 2000; seven strains from 2004, and 2005; and five strains from 2006. All 38 rotavirus G1 sequence in this study were found to be classified into two distinct lineages, lineage I with 44.7% (17/38) and lineage II with 55.3% (21/38). The G1I lineages were detected during six rotavirus seasons 1996-1997, 2001- 2002, and 2004-2006 whereas and lineage G1- II was detected during 1998-2001, and 2003-2005. Preliminary analyses 4 demonstrated that Rotarix® has been efficacious against these G1 lineages.

Recentemente, o táxon Amblyomma cajennense sofreu uma divisão sistemática, através de estudos morfológicos, moleculares e biológicos. No Brasil, Amblyomma sculptum (pertencente ao complexo Amblyomma cajennense) tem sua importância em saúde pública relacionada à transmissão de Rickettsia rickettsii, agente etiológico da Febre Maculosa, doença esta considerada de maior importância dentre as enfermidades transmitidas por carrapatos na América Latina. A Febre Maculosa Brasileira (FMB) tem seu destaque de ocorrência na região sudeste do país, onde A. sculptum está bem estabelecido e quase sempre relacionado à presença de capivaras. Porém, nem todas as áreas da região sudeste com presença de carrapatos A. sculptum e capivaras tem notificações de transmissão de R. rickettsii para humanos. O intuito do presente estudo foi avaliar, em condições de laboratório, a susceptibilidade da infecção por R. rickettsii em seis populações geograficamente distintas de A. sculptum. Dessa forma, foi realizada a quantificação da perpetuação transestadial, da transmissão transovariana e de possíveis efeitos deletérios da infecção nos carrapatos. Além disso, tentou-se correlacionar a susceptibilidade à infecção das diferentes populações de carrapatos (de áreas endêmicas e não endêmicas para FMB) ao perfil genético das mesmas, através dos marcadores 16S rDNA mitocondrial e ITS2 nuclear. Com base nos resultados encontrados, pode-se constatar diferenças na susceptibilidade à infecção por R. rickettsii entre as seis populações de A. sculptum estudadas, muito embora todas elas se mostraram parcialmente refratárias à infecção por R. rickettsii. No entanto, não foi observado nenhum padrão específico de variabilidade nos parâmetros biológicos e reprodutivos de carrapatos infectados e não infectados. A partir dos resultados de caracterização molecular, não foi possível verificar divergências genéticas entre as diferentes populações para o marcador ITS2 nuclear. Da mesma forma, com a análise do marcador 16S rDNA mitocondrial não constatou-se divergências genéticas que pudessem ser atribuídas à maior susceptibilidade ou refratariedade dos carrapatos à infecção por R. rickettsii. Porém, vale ressaltar que variabilidade nucleotídica neste marcador foi observada entre algumas populações, que parece seguir padrões geográficos de origem. A exceção para este resultado foi a população de Belo Horizonte (Pampulha), que apresentou variabilidade intrapopulacional, com genótipo semelhante à população do Parque Nacional Grande Sertão Veredas (GSV), ambas do estado de Minas Gerais e um segundo genótipo idêntico ao de Itu, no estado de São Paulo / Recently, the taxon Amblyomma cajennense taxon resulted in a systematic division, through morphological, molecular and biological studies. In Brazil, Amblyomma sculptum (belonging to the Amblyomma cajennense complex) has its importance in public health related to Rickettsia rickettsii transmission, the etiologic agent of spotted fever, disease that is considered the most important among the tick-borne diseases in Latin America. Brazilian Spotted Fever (BSF) has its occurrence in the southeastern region of the country where A. sculptum is well established and is almost always related to presence of capybaras. However, not all areas of southeastern of Brazil with A. sculptum ticks and capybaras have notifications of transmission of R. rickettsii to humans. This study aimed to evaluate, under laboratory conditions, the R. rickettsii susceptibility among six geographically distinct populations of A. sculptum. To this purpose, the transestadial perpetuation, transovarial transmission and possible deleterious effects of R. rickettsii infection were quantified in the six tick populations. In addition, we attempted to correlate the susceptibility to infection of different populations of ticks (from BSF-endemic and BSF-non-endemic areas) to the genetic profile of them through the markers mitochondrial 16S rDNA and nuclear ITS2. The results show differences in the susceptibility to infection with R. rickettsii among the six A. sculptum populations, although all populations were partially refractory to R. rickettsii infection. However, it was not observed any specific pattern of variation in biological and reproductive parameters of infected and uninfected ticks. Results of molecular characterization did not indicate genetic divergence between the populations for nuclear ITS2 marker. In the same way, analysis of mitochondrial 16S rDNA marker found no genetic differences that could be attributed to increased susceptibility or refractory of ticks to infection by R. rickettsii. However, it is note worth that nucleotide variability in this marker was observed among some populations, which seems to follow geographical patterns of origin. The exception to this result was the Belo Horizonte (Pampulha) population, which showed intrapopulation variability, having a similar genotype to the Grande Sertão Veredas population (GSV), both from the state of Minas Gerais and a second identical genotype to the Itu, from the state of São Paulo

O gênero Pilumnus apresenta um total de 143 espécies válidas sendo representado por caranguejos distribuídos em oceanos tropicais e temperados. Estudos anteriores acerca da sistemática do gênero evidenciam um alto grau de incertezas quanto à sua classificação, provavelmente decorrente do pouco conhecimento sobre as espécies, somada a abundância de seus representantes. A classificação inicial do gênero foi baseada em caracteres morfológicos, compartilhados por diversos gêneros de Brachyura, inclusive posicionados em famílias distintas. A utilização de ferramentas moleculares tem se mostrado bastante eficaz, principalmente quando em conjunto com estudos morfológicos, no auxílio de trabalhos taxonômicos e contribuindo na construção de hipóteses filogenéticas mais robustas para os crustáceos decápodos. Além de uma análise comparativa empírica das espécies de Pilumnus do Atlântico ocidental, foram realizadas análises moleculares baseadas nos genes mitocondriais 16S rRNA e o Citocromo Oxidase I (COI) (mesma sequência do barcoding) que resultaram em 17 espécies distintas, incluíndo duas espécies novas. Foi observado uma possível estruturação genética entre populações de P. reticulatus provenientes de diferentes regiões zoogeográficas (Caribe e Brasil), e a ausência de estruturação nas espécies P. caribaeus, P. dasypodus, P. floridanus e P. vinaceus que apresentam uma ampla distribuição. Os dados morfológicos e moleculares permitiu a avaliar o status taxonômico de 21 espécies de ocorrência no Atlântico ocidental em que foi corroborada a proposição de P. brasiliensis como sinônimo júnior de P. caribaeus. Ademais, os nomes P. dasypodus e P. vinaceus devem ser considerados válidos, sendo necessário a ressurreição do último, considerado anteriormente sinônimo júnior de P. dasypodus. Com base na nossa revisão, 20 espécies são consideradas válidas e a distribuição reportada de P. diomedeae, P. longleyi e P. spinosissimus é restrita. / The genus Pilumnus has 143 valid species being represented by crabs distributed in tropical and temperate oceans. Previous studies about the systematics of the genus evidenced a high degree of uncertainty regarding its classification, probably due to the lack of knowledge about the species, in addition to the abundance of its representatives. The initial classification of the genus was based on morphological characters, shared by several genera of Brachyura, even in different families. The use of molecular tools has been shown to be very effective, especially when combined with morphological studies, in the aid of taxonomic works and contributing to the construction of more robust phylogenetic hypotheses for decapod crustaceans. In addition to an empirical comparative analysis of Pilumnus species from the western Atlantic, molecular analyzes based on mitochondrial 16S rRNA and Cytochrome Oxidase I (COI) genes were performed, resulting in 17 distinct species, including two new species. It was observed a possible genetic structuring between P. reticulatus populations from different zoogeographic regions (Caribbean and Brazil), and the absence of genetic structuring in the species P. caribaeus, P. dasypodus, P. floridanus and P. vinaceus that present a wide distribution. The morphological and molecular data allowed evaluating the taxonomic status of 21 species with occurrence in the western Atlantic in which the proposition of P. brasiliensis as a junior synonym of P. caribaeus was corroborated. In addition, the names P. dasypodus and P. vinaceus should be considered valid, being necessary the resurrection of the last, previously considered junior synonym of P. dasypodus. Based on our review, 20 species are considered valid and the reported distribution of P. diomedeae, P. longleyi and P. spinosissimus is restricted.

Este trabalho faz uma descrição detalhada da morfologia de Ceraeochrysa, mapas de distribuição, listas de ocorrência de espécies em cultivos agrícolas para o Brasil e um estudo das relações filogenéticas entre as espécies do gênero. A análise filogenética incluiu 62 espécies de Ceraeochrysa, quatro espécies de grupos externos ao gênero em vários níveis e 50 caracteres morfológicos. Um total de 11 espécies para as quais havia pouca informação sobre machos foram inseridas na matriz uma a uma em análises separadas, de modo a diminuir o efeito de informação ausente. Foi obtida uma única árvore mais parcimoniosa, que corrobora a hipótese de monofilia do gênero. Das características consideradas sinapomórficas para Ceraeochrysapresença de espermateca alongada e de gonapse, a primeira é plesiomórfica para C. placita e C. intacta (que têm a espermateca no formato pill-box), recuperadas como irmãs do restante de Ceraeochrysa, já a segunda característica está presente também nas espécies de Cryptochrysa. O estudo da morfologia gerou uma quantidade importante de caracteres que poderão ser utilizados em novas análises filogenéticas de Chrysopidae. A maioria das espécies brasileiras de Ceraeochrysa é de distribuição conhecida da Amazônia, da Mata Atlântica e do Cerrado, mas não há informação suficiente para um estudo biogeográfico do gênero. Entre as espécies brasileiras, C. cincta, C. cubana e C. claveri são as que têm maior distribuição geográfica e ocorrem em grande diversidade de plantações agrícolas. / This work has a detailed study of the morphology of Ceraeochrysa, distribution maps for the species of the genus, lists of occurrences in crops of the Brazilian species and a phylogenetic analysis of the relationships between the species of the genus. The phylogenetic study included 62 species of Ceraeochrysa, with four outgroup species and 50 morphological characters. A total of 11 species for which there is missing data for males were included in the matrix one by one and analysed independently, so negative effect of missing data in the analysis could be reduced. The monophyly of the genus was recovered, but no uniquely derived characters were found. Of the features often considered synapomorphies of Ceraeochrysathe presence of an elongated spermatheca and the presence of a gonapsisthe former of spermatheca is plesiomorphic for C. placita and C. intacta (which have pill-box format), recovered as sister species for the remaining of the genus, while a gonapsis was seen to also occur in Criptochrysa. The detailed morphological study resulted in a lot of information that can be used in robust phylogenetic studies of the Chrysopidae. Most of the Brazilian species of Ceraeochrysa are known from the Amazon, the Atlantic Forest and the Cerrado, but there is not information enough for a biogeographic study of the genus. Among the Brazilian species, C. cincta, C. cubana, and C. claveri are those that have most widely distributed and occur in great variety of agricultural crops.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-02-17T15:25:38Z No. of bitstreams: 1 Cleia Santos Cabral.pdf: 1106804 bytes, checksum: 14447df94770ff469bfc234136893b59 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-17T15:25:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cleia Santos Cabral.pdf: 1106804 bytes, checksum: 14447df94770ff469bfc234136893b59 (MD5) Previous issue date: 2012-02-17 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (FOLac), is an important disease of lettuce in the world. This disease was reported in Brazil, recently. From 2008 to 2011 the laboratories of Plant Pathology of Embrapa Hortaliças (Embrapa Vegetable Crops), Sakata Seeds Sudamerica and Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (INCAPER) collected some FOLac isolates in states from the Southern and the Southeastern regions of Brazil. The isolates were identified as F. oxysporum by the morphological characteristics of conidia and conidiophores. Isolates were inoculated on lettuce plants, cultivars Elisa, Vera, and Red Salad Bowl, conditions in a greenhouse. Isolates were also inoculated on plants of others Asteraceae species (Cichorium endivia, Cichorium intybus, Sonchus oleraceus, Emilia sonchifolia, Bidens pilosa e Tagetes erecta) and others botanical families as (Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Gossypium hirsutum, Phaseolus vulgaris e Ocimum basilicum). Lettuce cultivars Elisa and Vera were suscetible to all isolates while the cultivar Red Salad Bowl was resistant. All isolates were reisolated from diseased plants fulfilling the Koch‟s postulates. Others plant species were not susceptible to any isolate, proving that isolates belong to the species F. oxysporum f. sp. lactucae. The isolates were also inoculated in a differential set of cultivars comprising: „Patriot‟ (Susceptible to all races), „Costa Rica No. 4‟ (resistant to race 1) and „Banchu Red Fire‟ (resistant to race 2). Cultivars „Patriot‟ and „Banchu Red Fire‟ were susceptible while „Costa Rica No. 4‟ was resistant, confirming that all the isolates were race 1. Molecular analysis using a primer specific to race 1 isolates was performed using F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) raça 3 and a non-pathogenic isolate as negative controls. DNAs of FOLac isolates were amplified by PCR and those of the negative controls were not, confirming the specificity of the primers and the presence of only the race 1 of FOLac in Brazil. In addition, it was used the Translation elongation factor 1-α region (tef-1α) for phylogenetic analysis between FOLac isolates races 1 and 2 and isolates of F. oxysporum. Comparison of the sequences obtained with the tef-1α confirmed the polyphyletic origin of the forma specialis lactucae and also showed a greater genetic variability among Brazilian isolates of FOLac race 1compared with isolates of the same race available in GenBank. After the isolates characterization, it was made a screening of 102 accessions for resistance to the isolate Fus-173 and it was selected 47 as highly resistant. After this, the selected genotypes were evaluated for the stability of resistance in three additional assays, using different FOLac race 1 isolates. In all three assays it was used a highly susceptible cultivar (Regina) as susceptible control. In the first assay, carried out in October 2011, it were used the isolates Fus-202 and Fus-205. In the second assay, carried out in November 2011, it were used the isolates Fus-219 and Fus-222. In the third assay, carried out in December 2011, it were used the isolates (Fus-207, Fus-209 e Fus-220). Inoculation was performed on 25 days old seedlings on greenhouse conditions. Seedlings were inoculated by cutting their roots and emerging them in spore suspension of pathogen. Evaluation was carries out 30 days after inoculation, using a grade scale varying from 0 (heath plants) to 4 (dead plants). Data were transformed in Disease Index (DI) submitted to a variance analysis and the media were compared by the Tukey‟s test (5%). Thirty two accessions were identified as having broad spectrum of resistance to different pathogen isolates in the four inoculation seasons. / A murcha de fusário, causada pelo fungo Fusarium oxysporum f. sp. lactucae (FOLac) é uma das doenças mais importantes da alface. Esta doença foi relatada recentemente no Brasil. Nos anos de 2008 a 2011 foram coletados isolados de FOLac nos Laboratórios de Fitopatologia da Embrapa Hortaliças, Sakata Seed Sudamerica Ltda e do Instituto Capixaba de Pesquisa, Assistência Técnica e Extensão Rural (Incaper). Estes eram provenientes de todos os estados das Regiões Sul e Sudeste do Brasil. A identificação foi feita observando-se as características morfológicas de conídios e conidióforos. Os isolados foram inoculados em plantas das cultivares Elisa, Vera e Red Salad Bowl, em condições de casa de vegetação. Os mesmos também foram inoculados em plantas de outras espécies de Asteraceae (Cichorium endivia, Cichorium intybus, Sonchus oleraceus, Emilia sonchifolia, Bidens pilosa e Tagetes erecta) e de outras famílias (Solanum lycopersicum, Capsicum annuum, Nicotiana tabacum, Gossypium hirsutum, Phaseolus vulgaris e Ocimum basilicum). Os isolados foram identificados como Fusarium oxysporum. As cultivares Elisa e Vera foram suscetíveis a todos os isolados e a Red Salad Bowl foi resistente. Efetuou-se o re-isolamento do patógeno, completando-se assim os Postulados de Koch. Nenhuma outra espécie de planta foi suscetível ao patógeno, confirmando a identificação como F. oxysporum f. sp. lactucae. Em seguida, os isolados foram avaliados quanto a sua virulência numa série de cultivares diferenciadoras de raças: Patriot (suscetível), Costa Rica No. 4 (resistente à raça 1) e Banchu Red Fire (resistente à raça 2). As cultivares Patriot e Banchu Red Fire comportaram-se como suscetíveis a todos os isolados, enquanto a cultivar Costa Rica No. 4 comportou-se como resistente. Concluiu-se que os isolados avaliados são da raça 1 de FOLac. Adicionalmente, foi feito um teste com primers específicos para a raça 1 de FOLac, utilizando como controles um isolado de F. oxysporum f. sp. lycopersici (FOL) raça 3 e um isolado não patogênico de F. oxysporum. O fragmento de DNA foi amplificado por PCR para os isolados de FOLac e não foi amplificado para o isolado de FOL e nem para o isolado não patogênico de F. oxysporum. Este resultado confirma a especificidade desse par de primers e a presença apenas da raça 1 de FOLac no Brasil. Além disso, foi utilizada a região do fator de elongação da tradução (tef-1α) para análise filogenética entre os isolados FOLac raças 1 e 2 e isolados de F. oxysporum. Comparação das seqüências obtidas com o tef-1α confirmou a origem polifilética da forma specialis lactucae e também observou-se uma maior variabilidade genética entre os isolados brasileiros de FOLac raça 1 comparados com isolados da mesma raça disponíveis no GenbanK. Posteriormente, 102 acessos (cultivares comerciais ou linhagens) foram avaliados, visando identificar fontes de resistência a FOLac e analisar a estabilidade da resistência de acessos promissores a diferentes isolados do patógeno. Inicialmente foi feita uma seleção preliminar, utilizando um isolado do patógeno (Fus-173). Em seguida, quarenta e sete acessos altamente resistentes mais uma testemunha suscetível (Regina), identificados na seleção preliminar, foram reavaliados para estabilidade da resistência ao FOLac raça 1, utilizando os isolados (Fus-202 e Fus-205) no mês de Outubro de 2011; isolados (Fus-219 e Fus-222) no mês de Novembro de 2011 e isolados (Fus-207, Fus-209 e Fus-220) no mês de Dezembro de 2011. A inoculação foi realizada em condições de casa de vegetação, pelo método de corte das raízes e imersão na suspensão de conídios do patógeno. A avaliação foi realizada após 30 dias, com auxílio de escala de notas variando de 0 (planta sadia) a 4 (planta morta). Os dados obtidos foram transformados em índice de doença (ID) e submetidos a uma análise de variância e comparação de médias pelo teste de Tukey (5%). Foram identificados trinta e dois acessos apresentando amplo espectro de resistência aos diferentes isolados do patógeno nas quatro épocas de inoculação.

O vírus da imunodeficiência felina (FIV) é um lentivirus que infecta gatos domésticos (Felis catus), causando uma imunodeficiência progressiva análoga a AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida Humana). A ampla heterogeneidade molecular do FIV e a alta capacidade de promover mutações sob pressões imunológicas, farmacológicas ou ambientais são características inerentes aos lentivirus. A identificação do subtipo de vírus e o conhecimento da diversidade genética das cepas circulantes são fundamentais para o desenvolvimento estratégico de vacinas capazes de resultar na imunização do hospedeiro e no estabelecimento de testes diagnósticos. Objetivando isolar o material genético e realizar a caracterização molecular do vírus da imunodeficiência felina foram coletadas e analisadas amostras de sangue periférico de felinos portadores do FIV, co-habitantes de um abrigo aberto de felinos, em São Paulo, SP, em quatro momentos distintos, T0 (zero), no momento inicial da avaliação e seis, dez e quinze meses após a coleta inicial, correspondendo aos momentos T1, T2 e T3, respectivamente. Foram realizados testes hematológicos e bioquímicos nas quatro coletas com a finalidade de avaliar a evolução clínica da infecção. Adicionalmente foi realizado um estudo de variabilidade genética do FIV, com base no sequenciamento dos produtos amplificados dos gene env obtidos no estudo. Os envelopes clonados foram utilizados para transfectar células resultando na expressão das proteínas do envelope que possibilitaram estudos com os receptores celulares utilizados pelos isolados brasileiros. As análises das seqüências virais mostraram que todas as amostras, do abrigo, pertencem ao subtipo B. Foi observado um baixo percentual de mudança, da região estudada do vírus entre as quatro coletas. O fenômeno de "quasispecies" virais, bastante estudado no HIV, pode ser documentado em nossas amostras. Nos exames hematológicos e bioquímicos; hematócrito, hemoglobina, contagem total de leucócitos, proteína total e gamaglobulinas; dos animais infectados pelo FIV observou-se mudanças entre a primeira e quarta coleta demonstrando assim a importância dos testes utilizados no acompanhamento da infecção pelo FIV. Com relação aos dados com os receptores do FIV, os resultados apontam uma menor complexidade na interação entre os envelopes dos isolados do estudo com o receptor CD134 para proceder a infecção quando comparados com cepas virulentas do FIV. / FIV is an important viral pathogen that infects the domestic cat and causes a slow progressive degeneration of the immune system which eventually leads to a disease comparable to acquired immune deficiency syndrome (AIDS) in humans. Similar to all retroviruses, FIV has a relatively high evolutionary rate and genomic heterogeneity. The determination of subtype and the knowledge of genetic diversity of the current strains are very important to developing a protective vaccine and for the routine diagnosis of infection. The aim of this study was to isolate and characterize samples of feline immunodeficiency virus from cats from an open shelter in Sao Paulo, Brazil. All cats infected with FIV from this shelter were sampled on August 26th, 2007 (T0) and also six (T1), ten (T2) and fifteen (T3) months after the basal sampling (T0). In each sample, blood was analyzed for the following: complete hematology, clinical chemistry and serum protein electrophoresis. Hematological and clinical chemistry parameters were analyzed to determine laboratory parameters characteristic of disease progression which allow a better description of the chronic phase of the infection. Furthermore, analyses of the variants from each sample were performed in order to estimate the degree of divergence following infection with Brazilian strains. The FIV envelope glycoprotein gene from Brazilian FIV isolates cloned were transfected to investigate the receptor usage. The sequences of all virus of the study belong to subtype B. Little sequence variation was observed in circulating viruses between the samples from each infected cat. Quasispecies of FIV have been detected in this study. The following hematological and clinical chemistry parameters were changed in the FIV-infected cats between the first blood sampling and last blood sampling: packed cell volume (PCV), hemoglobin, total white blood cells (WBC), total protein and gamma globulin fractions. Monitoring of hematological and clinical chemistry parameters may prove useful for the evaluation of disease progress. Regarding receptors, our data are consistent with isolates of the study requiring a less complex interaction with CD134 for infection to proceed compared to the virulent FIV isolates.

Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-09-17T16:29:26Z No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-09-17T16:29:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Marcia de Doutorado DEFINITIVA - Para entregar no PGBP.pdf: 21978043 bytes, checksum: 1d029677a684e2e22915d3841a8206d3 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O dengue tem se apresentado como um grave problema de saúde pública no Brasil, razão pela qual, vários estudos têm sido realizados com o intuito de esclarecer aspectos da epidemiologia dessa doença em diferentes localidades, com histórias distintas de circulação dos diferentes sorotipos dos vírus dengue (DENV). A implantação de um Programa de vigilância entomológica e virológica e, que desde 1986 visa detectar e monitorar a circulação dos sorotipos e genótipos DENV, resultou em distintas oportunidades, no isolamento de amostras de DENV de vetores e de casos humanos permitindo a caracterização molecular e a análise filogenética, fornecendo informações relevantes para a compreensão da interação vetor- vírus- humanos. O entendimento da variação genética no vírus quando este replica em mosquitos, e como essas variações atuam durante a transmissão entre humanos e mosquitos permanecem desconhecidos. Portanto, visando contribuir para um melhor conhecimento dos DENV e sua interação com o mosquito vetor, realizamos neste trabalho, a caracterização molecular e análise filogenética de DENV isolados de mosquitos naturalmente infectados e de casos humanos, provenientes de epidemias ocorridas entre 1986 e 2011 no Brasil. Foi demonstrado que os métodos moleculares foram fundamentais por facilitarem a rápida identificação dos vírus e consequentemente o monitoramento dos genótipos circulantes. A RT-PCR para a triagem de DENV em vetores se mostrou uma ferramenta útil para a vigilância virológica, com taxas de detecção que variaram de 0,78% a 25% no período estudado. A análise filogenética dos DENV-1 isolados de mosquitos e humanos mostrou que o genótipo V (Américas/África) continua o mesmo circulante desde a sua introdução, porém foi demonstrada a co-circulação de duas novas linhagens (II e III) no período de 2009 a 2011. O sequenciamento do genoma completo de DENV-3 isolado a partir de Ae. aegypti naturalmente infectados no Rio de Janeiro (RJ), assim como a análise da região 3´NC de vírus isolados em mosquitos e humanos, caracterizou estes vírus como pertencentes ao GIII e revelou a presença de inserções e deleções na região 3´NC do genoma. As deleções observadas na região 3´NC resultaram em estruturas secundárias porém nem todas as cepas com inserções nesta região apresentaram estrutura similar substituições exclusivas à cepa de DENV-3 isolada em mosquito foram observadas no gene NS5, incluindo a substituição que resultou na formação de um códon de terminação. O teste comercial Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR, disponível recentemente, foi utilizado pela primeira vez para detecção dos DENV e se mostrou um método molecular alternativo para as vigilâncias entomológica e virológica. O RT-PCR em Tempo Real possibilitou, pela primeira vez, a quantificação de DENV-1 e DENV-4 em fêmeas individuais naturalmente infectadas (1,6 x 104 cópias/mL e 1,08 x 103 cópias/mL, respectivamente). Considerando-se o elevado índice de infestação por Ae. aegypti em todo o país, o estudo da caracterização dos DENV circulantes torna-se de grande importância no conhecimento da relação vírus-vetor pela análise da variabilidade genética, dispersão e persistência de genótipos durante a transmissão destes vírus / Dengue has been a major public health problem in Brazil with several studies performed aiming to elucidate the disease epidemiology in geographically distinct areas with different dengue viruses (DENV) circulation. The establishment of an entomological and virological program since 1986 with the objective of detecting and monitoring DENV serotypes and genotypes resulted in distinct opportunities in DENV isolation from vectors and human cases, allowing the molecular characterization and phylogenetic analysis, providing relevant information for the understanding of the vector-virus-humans interactions. The understanding of the virus genetic variability when it replicates on mosquitoes and how those variations act during the transmission between humans and mosquitoes is not fully understood. Therefore, aiming to contribute for a better understanding of DENV and its interactions with the mosquito vector, we performed in this study the molecular characterization and phylogenetic analysis of viruses isolated from naturally infected mosquitoes and human cases, from epidemics occurred between 1986 and 2011 in Brazil. It has been shown that the molecular techniques were essential for allowing the rapid identification of the viruses and consequently the monitoring of the circulating genotypes. The RT-PCR for DENV screening in vectors has shown to be a useful tool for the virological surveillance, with detection rates varying from 0.78% to 25% in the studied period. The phylogenetic analysis from DENV-1 isolated from mosquitoes and human cases showed that genptype V (America/Africa) is still the same genotype circulating since this serotype introduction, however it was demonstrated the co-circulation of two distinct new viral lineages (II and III) from 2009 to 2011. The complete genome sequencing of a DENV-3 isolated from naturally infected Ae. aegypti in Rio de Janeiro (RJ) and the analysis of the 3´UTR region from viruses isolated from mosquitoes and humans, has characterized those viruses as belonging to genotype III (GIII) and revealed the presence of insertions and deletions in the 3´UTR region of the genome. The deletions observed in the 3´UTR region resulted in similar secondary structures, however not all strains with insertions were similar in structure. Exclusive substitutions to the DENV-3 isolated from the mosquitoes were observed in NS5, including a substitution leading to a stop codon formation. The Simplexa™ Dengue Real Time RT-PCR commercial kit, recently available, was used for the first time for DENV detection and it has been shown to be an alternative molecular method for the entomological and virological surveillances, The Real Time RT-PCR has allowed, for the first time the DENV-1 and DENV-4 quantification in single Ae. aegypti naturally infected (1.6 x 104 copies/mL e 1.08 x 103 copies/mL, respectively). Considering the high Ae. aegypti infestation index in the country, the characterization of DENV circulating is very relevant for the understanding of the virus-vector relations by the analysis of the genetic variability, spread and persistence of genotypes during the transmission of those viruses

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-06-04T18:27:54Z No. of bitstreams: 1 ludmila_n_rocha_ioc_bp_0020_2010.pdf: 2174715 bytes, checksum: ebf8bfd1505512fa4a3904c3dc6b97f6 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-06-04T18:27:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ludmila_n_rocha_ioc_bp_0020_2010.pdf: 2174715 bytes, checksum: ebf8bfd1505512fa4a3904c3dc6b97f6 (MD5) Previous issue date: 2010 / Instituto Oswaldo Cruz, Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. / Em todo o mundo as gastroenterites infantis agudas causadas por rotavírus do grupo A (RV-A) estão associadas a cerca de 611.000 mortes por ano. RV-A pertencem à família Reoviridae, gênero Rotavirus, e são constituídos de onze segmentos de RNA dupla-fita que codificam para seis proteínas estruturais (VPs) e seis proteínas não-estruturais (NSPs). Os genótipos de RV-A são definidos por dois genes que codificam para as duas proteínas do capsídeo externo, VP4 (P) e VP7 (G). Estudos epidemiológicos demonstraram que mundialmente cinco genótipos G são mais frequentes: G1-G4 e G9; em associação com os genótipos P [8], P [4] ou P [6]. Em 2005 houve a re-emergência do genótipo G3 em crianças internadas em um hospital público no Rio de Janeiro, em concordância com a emergência desse genótipo em diversas partes do mundo, principalmente nos países asiáticos. O objetivo do presente estudo é determinar a relação entre os genes VP4, VP7 e NSP4 de RV-A genótipo G3 isoladas no Rio de Janeiro entre 1996 e 2009. A análise filogenética realizada a partir das seqüências de nucleotídeos dos genes do VP7, VP4 e NSP4 demonstrou que as amostras que circularam em 1996 e 1997 no Rio de Janeiro são distintas daquelas que foram isoladas em 2005 e 2006, sugerindo uma possível introdução deste genótipo no Rio de Janeiro. Em 2009, mais amostras de RV-A G3 foram detectadas no Rio Grande do Sul. A análise dos três genes estudados demonstrou estreita relação genética com as amostras isoladas em 2005. Recentemente, um novo sistema de classificação de rotavírus foi proposto, em que todos os 11 segmentos do genoma de RNA são utilizados e valores de cut-off foram determinados para diferenciar os genótipos. Segundo essa nova classificação, todas as amostras desse estudo foram classificadas como pertencentes aos genótipos G3 – P[8] – E1 para VP7, VP4 e NSP4, respectivamente. Em todos os genes estudados foram observadas mutações pontuais em regiões antigênicas, porém são necessários mais estudos para avaliar a importância na estrutura e função das proteínas. Foram evidenciados eventos de reestruturação genômica entre amostras humanas para o gene que codifica para VP4 (VP8*), os quais podem estar relacionados a uma vantagem adaptativa para o vírus. Os resultados do presente estudo confirmam a importância do monitoramento contínuo e da caracterização molecular das amostras de RV-A a fim de obter melhor entendimento da epidemiologia e a evolução dos RV-A genótipo G3. / Acute gastroenteritis caused by group A rotaviruses (RV-A) are associated to nearly 611,000 deaths of children worldwide per year. RV-A belong to the family Reoviridae, genus Rotavirus, and are characterized by having a segmented genome, composed of 11 segments of double-stranded RNA that encodes six structural proteins (VPs) and six non-structural proteins (NSPs). The genotypes of RV-A are defined by two genes that codify the two outer proteins, VP4 (P) and VP7 (G). Epidemiological studies in several parts of the world have indicated that there are five most common G genotypes: G1-G4 and G9; in association with P [8], P [4] or P [6] genotypes. In 2005, genotype G3 has emerged in hospitalized children in a public hospital in Rio de Janeiro, corroborating the global emergence of this genotype, especially in Asian countries. The present study aims to determine the relationship between the genes VP4, VP7 and NSP4 of stool samples positive for RV-A genotype G3 isolated in Rio de Janeiro between 1996 and 2006. Phylogenetic analyses carried out on the VP7, VP4 and NSP4 genes demonstrated that the samples that circulated in 1996 and 1997 in Rio de Janeiro are distinct from those that were detected in 2005 and 2006, which suggests a possible entering of a new G3 variant in Rio de Janeiro. In 2009, new samples of G3 were detected in Rio Grande do Sul. The analysis of the three studied genes demonstrated a straight genetic relation with the samples identified in 2005. A new rotavirus classification system has been recently proposed, in which all the 11 RNA genome segments are utilized and cut-off values were determinated to differ the genotypes. According to this new classification, all the samples in this study were characterized as genotypes G3 – P[8] – E1 to VP7, VP4 and NSP4, respectively. In all studied genes there were amino acids substitutions in antigenic regions, although more studies are necessary to evaluate the importance in the structure and protein functions. Genomic restructuration events in the VP4 (VP8*) codifying gene between human samples have been been described, which might be related to an adaptive advantage for the virus. The results of the current study confirm the importance of continuous monitoring and molecular characterization of RV-A samples with the purpose of a better understanding of RV epidemiology and evolution.

Um total de 8.961 amostras fecais coletadas de pacientes com diarréia aguda, no período de 1996 a 2006, no Estado de São Paulo foi testado para rotavírus por EIE. Destas, 20,0% foram positivas e posteriormente realizadas a caracterização dos rotavírus em genótipos G e P por nested RT-PCR. O genótipo G1 de rotavírus foi o mais freqüente, detectado em 35,2% das amostras, seguidos dos tipos G9, G2, G3, G4, infecção mista e G12. A associação mais freqüente foi a P[8]G1 e P[8]G9. Foi realizada a sequencia nucleotídica do gene 9 (VP7) de 38 rotavirus genótipo G1. Duas cepas foram analisadas dos anos de 1997, 1998, 2001 e 2002, três cepas dos anos 1996, 1999 e 2003, quatro cepas em 2000, sete cepas em 2004 e 2005, e cinco em 2006. Os 38 rotavírus G1 foram classificados em duas linhagens distintas, linhagem G1-I e linhagem G1-II. A linhagem G1-I foi detectada durante seis anos, 1996-1997, 2001-2002 e 2004-2006, e a linhagem G1-II foi detectada durante os anos de 1998-2001, e 2003-2005. Análises preliminares mostraram que Rotarix ® foi eficiente contra estas linhagens G1. / Rotavirus (RV) infections are recognized as a major cause of severe gastroenteritis in children worldwide. In March 2006, a monovalente P[8]G1, human RV vaccine (Rotarix® GlaxoSmithKline Biologicals) was introduced in Brazil into the routine childhood immunization schedule. Therefore, the study of genetic diversity among rotavirus strains before and after the introduction of this vaccine may be important for the development of vaccination strategies. A total of 8,961 fecal samples collected from patients with acute diarrhea, during the 11-year period surveillance in São Paulo State (1996 to 2006) were tested for rotavirus by ELISA. One thousand seven hundred eighty- four (1,784, 20.0%) were positive, and the characterization of the G and P genotypes was performed on 1,300 rotavirus samples by nested RT-PCR. The G1 type was the most prevalent rotavirus strain (35.2%). The second most prevalente was the G9 type (31.2%), followed by G2 (4.0%), G3 (3.5%), G4 (2.2%), mix infection (1.8%) and G12 (0.5%). The more frequent association was P[8]G1 and P[8]G9. We performed a sequence analysis of 38 P[8]G1 rotavirus strains, selected from a total of 341 P[8]G1.Two strains from 1997, 1998, 2001, and 2002 were analyzed; three strains from 1996, 1999, and 2003; four strains from 2000; seven strains from 2004, and 2005; and five strains from 2006. All 38 rotavirus G1 sequence in this study were found to be classified into two distinct lineages, lineage I with 44.7% (17/38) and lineage II with 55.3% (21/38). The G1I lineages were detected during six rotavirus seasons 1996-1997, 2001- 2002, and 2004-2006 whereas and lineage G1- II was detected during 1998-2001, and 2003-2005. Preliminary analyses 4 demonstrated that Rotarix® has been efficacious against these G1 lineages.

Rabies is an infectious disease of the central nervous system caused by the rabies virus (RABV), which affects all mammals. In Brazil the rabies has caused considerable losses to cattle herds in various regions. The official diagnosis is made by the fluorescent antibody technique (FAT) concomitantly with biological assay, usually the mouse inoculation tests (MIT). The MIT is considered a sensitive, specific and effective technique for rabies diagnosis, but has disadvantages such as long time to obtain the results and the need to use animals. The first paper of this dissertation describes a molecular and epidemiological investigation of outbreaks of bovine rabies occurring in the central region of Rio Grande do Sul state, Brazil, between May and August 2012. In this period, 45 cases suspected of rabies were reported in 22 small herds, located within a 4.7km range, in the county of Pinhal Grande. From these, 32 samples were submitted to rabies diagnosis and RabV and/or viral antigens were identified in 27 samples. Subsequently, 11 brain samples were submitted to reverse transcription/polymerase chain reaction (RT-PCR) for the nucleoprotein gene (N) followed by nucleotide sequencing and phylogenetic analysis. Seven out of 11 samples yielded identical sequences; one presented a synonymous, non-coding mutation, indicating a likely common origin of the virus. However, three other samples presented nucleotide mutations which resulted in amino acid changes, suggesting a different origin of the virus. In summary, these results suggest that RabV strains of different origin/lineages co-circulate in the region and were involved in the outbreaks. The second paper describes an evaluation of sensitivity for VI of Rabv in neuroblastoma cells (N2A) and baby hamster kidney cells (BHK-21). For this, thirty-six samples derived bovine brains of suspected rabies cases were initially submitted to the FAT and MIT test and subsequently to three protocols VI in each cell line: a single pass 24h and 72h, and three passes 48h. The average time to obtain final results at MIT was 12.3 days (8-21). The average time required for final MIT results was 12.3 days (8 21). The FAT and MIT combined detected 32/36 positive samples, these MIT detected 32 (100%) and the FAT detected 31 (96.8%). The isolation in BHK-21 cells resulted in 100% (32/32) positivity in the protocol of 72h and 96.9% (31/32) after three passages of 48h. The isolation in N2A cells resulted in 100% (32/32) positive for 72h and 30/32 (93.7%) samples 48h after three passages. A single 24h passage protocol (T1) in both cell lines performed poorly, detecting less than 40% of the positive samples. These results indicate that VI in either cell line, especially in BHK-21 cells that grow faster and are much easier to maintain than N2A cells, does represent an adequate alternative for MIT as a confirmatory test for rabies diagnostic in bovine specimens, yielding reliable results in reduced time. / A raiva é uma doença infecciosa do sistema nervoso central causada pelo vírus da raiva (RabV), que afeta todos os mamíferos. No Brasil a raiva tem causado consideráveis perdas a rebanhos bovinos em diversas regiões. O diagnóstico oficial é realizado pela técnica de imunofluorescência direta (FAT) de forma concomitante com a prova biológica, geralmente a inoculação intracerebral em camundongos (MIT). A MIT é considerada uma técnica sensível, específica e eficaz para o diagnóstico da raiva, porém apresenta desvantagens como o longo tempo para obtenção dos resultados e a necessidade de uso de animais. O primeiro artigo da presente dissertação descreve uma investigação epidemiológica e molecular de surtos de raiva ocorridos na região central do Rio Grande do Sul, entre maio e agosto de 2012. Nesse período, 45 casos suspeitos de raiva foram relatados em 22 rebanhos, localizados dentro de um raio de 4,7km, no município de Pinhal Grande. Desses, 32 amostras foram submetidas para diagnóstico da raiva, sendo que o RabV e/ou antígenos virais foram identificados em 27 amostras. Em um segundo momento, 11 amostras foram submetidas à transcrição reversa - - reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para o gene da nucleoproteína (N) do RabV, seguido de sequenciamento nucleotídico e análise filogenética. Sete das 11 amostras apresentaram sequências nucleotídicas idênticas e uma apresentou mutação sinônima, não-codificante, indicando uma provável origem comum dos vírus. Por outro lado, três amostras apresentaram mutações que resultaram em alterações de aminoácidos, sugerindo uma origem diferente do vírus. Esses resultados sugerem que RabV de diferentes origens/linhagens co-circulam na região e foram envolvidos nos surtos descritos. O segundo artigo descreve a avaliação da sensibilidade ao isolamento do RabV em linhagens de células de neuroblastoma murino (N2A) e rim de hamster neonato (BHK-21). Para isso, trinta e seis amostras de cérebros bovinos oriundos de casos suspeitos de raiva foram inicialmente submetidas ao teste de FAT e MIT e, subsequentemente, a três protocolos de VI em cada linhagem celular: uma única passagem de 24h e 72h, e três passagens de 48h. O tempo médio necessário para obtenção de resultados finais na MIT foi de 12,3 dias (8-21). A FAT e MIT combinadas detectaram 32/36 amostras positivas. Dessas, a MIT detectou 32 (100%) e a FAT detectou 31 (96,8%). O tempo médio necessário para obter os resultados conclusivos na MIT foi de 12,3 dias (8-21). O isolamento em células BHK-21 resultou em 100% (32/32) de positividade no protocolo de 72h e em 96,9% (31/32) após três passagens de 48h. Em células N2A o isolamento resultou em 100% (32/32) das amostras positivas em 72h e em 30/32 (93,7%) após três passagens de 48h. Uma única passagem de 24h em ambas as linhagens mostrou um baixo desempenho, detectando menos de 40% das amostras positivas. Estes resultados indicam que o isolamento viral em qualquer uma das linhagens representa uma boa alternativa para a MIT como um teste confirmatório para o diagnóstico da raiva em amostras de bovinos, produzindo resultados confiáveis em tempo reduzido.