Submitted by (edna.saturno@ufrpe.br) on 2016-11-09T11:59:40Z No. of bitstreams: 1 Wagnner Jose Nascimento Porto.pdf: 485977 bytes, checksum: 38cc1a2dbc36f847dab429353687fd56 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-09T11:59:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Wagnner Jose Nascimento Porto.pdf: 485977 bytes, checksum: 38cc1a2dbc36f847dab429353687fd56 (MD5) Previous issue date: 2007-02-09 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The prevalence of serum antibodies to Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale infections were investigated in cattle farming herds from three regions called Sertão, Agreste and Leste of Alagoas State, Brazil. Sera samples from 1,155 cattle raised in 26 farms were evaluated by enzyme immunoassay (indirect ELISA). At the same time a questionnaire survey was conducted in the data were also analyzed. According to the results, 70.22% (811/1155) of the animals were positive for B. Bovis and 77.40% (894/1155) for B. bigemina and 27.45% (317/1155) of the animals were positive for antibodies against A. marginale The seroprevalence showed that the State of Alagoas is considered enzootically unstable for B. bovis and A. marginale enzootically stable for B. bigemina. The prevalence of Babesia sp infection was higher (p<0.05) in beef cattle than for dairy cattle and mixed herds. Regarding the infection by A. marginale, antibodies levels were more elevated in dairy cattle than others kind of rearing, but this difference was not significant. It is concluded that preventive measures should be adopted especially unstable areas. / A prevalência de anticorpos séricos para infecções por Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale foram investigados em bovinos das Mesorregiões do Agreste, Leste e Sertão do Estado de Alagoas, Brasil. Amostras de soro de 1155 bovinos provenientes de 26 propriedades foram analisadas pelo ensaio imunoenzimático (ELISA). Os resultados mostraram que 70,22% (811/1155) dos animais foram sororreagentes para B. bovis, 77,40% (894/1155) para B. bigemina e 27,45% (317/1155) foram positivos à infecção por A. marginale, o que evidencia que o Estado de Alagoas pode ser classificado como área de instabilidade enzoótica para B. bovis e A. marginale, e estabilidade enzoótica para B. bigemina. A prevalência da infecção por Babesia sp foi mais alta (p<0,05) em rebanhos de corte do que nos rebanhos leiteiros ou de aptidão mista. Com relação à infecção por Anaplasma marginale houve diferença não significativa. Conclui-se que medidas preventivas devem ser adotadas especialmente nas áreas de instabilidade enzoótica.

Philosophiae Doctor - PhD / Bionomics of vector-borne pathogens (VBPs) is a complex phenomenon that involves understanding the ecology of arthropod borne pathogens and vertebrate hosts potentially involved in their transmission cycles. Investigations into the bionomics of viral and bacterial VBPs circulating in Baringo and Homa Bay Counties of Kenya were carried out. Specifically, vertebrate hosts represented in mosquito bloodmeals, presence of arboviruses in blood fed mosquitoes and patients presenting with acute undiagnosed febrile illnesses in rural health facilities, and tick borne pathogens (TBPs) diversity in ticks of animals were identified. Mosquitoes were trapped by BG sentinel and CDC light traps, while ticks were sampled directly from domestic animals and tortoises close to human habitation along the shores and adjacent islands of Lakes Victoria and Baringo in Kenya. Blood and sera were also sampled from patients presenting with acute febrile illnesses visiting four rural health facilities in Homa Bay County. Mosquitoes and ticks were sorted and identified to species using standard morphological taxonomic keys. All the biological samples (blood-fed mosquitoes, ticks and blood/sera) were processed using molecular and culture procedures for detection of VBPs (arboviruses, Ehrlichia, Anaplasma, Rickettsia and protozoa). Among 445 blood-fed Aedeomyia, Aedes, Anopheles, Culex, Mansonia, and Mimomyia mosquitoes, 33 bloodmeal hosts were identified including humans, eight domestic animal species, six peridomestic animal species and 18 wildlife species. Further detection of Sindbis and Bunyamwera viruses was done on blood-fed mosquito homogenates by Vero cell culture and RTPCR in Culex, Aedeomyia, Anopheles and Mansonia mosquitoes from Baringo that had fed on humans and livestock. In TBPs assay, 585 tick pools were analysed consisting of 4,126 ticks collected in both study areas. More ticks were sampled in Baringo (80.5%), compared to Homa Bay (19.5%). In Baringo, agents of ehrlichiosis were detected from Amblyomma and Rhipicephalus ticks including Ehrlichia ruminantium (12.3%), Ehrichia canis (10.5%) and Paracoccus sp. (4.4%). Agents of anaplasmosis included Anaplasma ovis (7.2%), Anaplasma platys (4.4%) and Anaplasma bovis (4.0%), all from Hyalomma, Amblyomma and Rhipicephalus ticks, as well as agents of rickettsiosis, including Rickettsia africae, Rickettsia aeschlimannii, Rickettsia rhipicephali, Rickettsia montanensis and a Rickettsia sp. that was not conclusively characterized. Babesia caballi, Theileria sp. and Hepatozoon fitzsimonsi were also detected from both Rhipicephalus ticks and Amblyomma ticks. In Homa Bay, Ehrichia ruminantium (17.5%) and Ehrichia canis (9.3%) were isolated from Amblyomma latum and Rhipicephalus pulchellus, as well as Anaplasma platys (14.4%) and Anaplasma ovis (14.4%) from Amblyomma and Rhipicephalus species. In determination of the occurrence of arboviruses among patients presenting with acute febrile illnesses, acute Bunyamwera 3 (0.9%) and Sindbis 2 (0.6%) infections were detected by RT-PCR and cell culture and Sindbis seroprevalence was determined by plaque assay. Though a significant proportion of these patients tested positive for low Plasmodium parasitemia, none were co-infected with Plasmodium parasites and arboviruses. This study highlights the presence and relative importance of zoonotic VBPs in both study areas.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) são essenciais na resposta imune dos artrópodes aos microrganismos. Este estudo teve como objetivo a caracterização do estresse oxidativo das células embrionárias BME26 do carrapato R. microplus em resposta à infecção por A. marginale. Mostrou-se que A. marginale invade as células BME26 durante a primeira hora. No perfil de expressão de diversos genes codificadores de proteínas que estão envolvidas na produção e destoxificação de ERO e ERN após desafios com A. marginale e R. rickettsii, foi observado que A. marginale inibiu os transcritos das enzimas oxidantes 72 horas após a infecção. Em contrapartida os genes codificadores das enzimas antioxidantes foram todos induzidos. O perfil de expressão gênica pela infecção por R. rickettsii foi diferente do obtido com A. marginale uma vez que se detectou uma maior indução dos genes oxidantes e repressão dos antioxidantes. O silenciamento de quatro genes antioxidantes por RNAi indicaram o envolvimento da resposta redox no controle da infecção por A. marginale. Com isto se demonstra que o estresse oxidativo é importante no controle da infecção pela bactéria nas células BME26 podendo afetar a capacidade vetorial do carrapato na transmissão desse patógeno. / The production of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (ERN) is essential in the immune response of the arthropods. The aim of this study was the characterization of the oxidative stress of the embryonic cell line BME26 from the cattle tick R. microplus in response to A. marginale infection. It was shown that A. marginale invade BME26 cells during the first 1 hour. The expression profile of sixteen genes encoding proteins involved in either production or detoxification of ROS and RNS in response to A. marginale e R. rickettsii, was shown A. marginale caused a down-regulation of the genes encoding the oxidant enzymes in 72 hours after infection. In contrast the genes encoding the antioxidant were induced. The gene expression pattern in response to R. rickettsii was different from that triggered by A. marginale challenge, with induction of oxidant genes and down-regulation of antioxidant genes. The knockdown of four genes encoding the antioxidant enzymes by RNAi suggests that redox response play a role in the control of infection by A. marginale. Our dataset have shown the importance of the oxidative stress to control A. marginale infection by BME26 cells and might have implications on the vectorial capacity of R. microplus in transmission of this pathogen.

Made available in DSpace on 2016-04-28T20:18:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2006-Daniel da Silva Guedes Junior.pdf: 6474539 bytes, checksum: feffc8f41781fb68d79aa3969d5d9651 (MD5) Previous issue date: 2006-02-23 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Babesiosis, anaplasmosis, trypanosomosis and borreliosis are relevant diseases, potentially causing morbidity in cattle, leading to economic losses. The objective of this study was to determine, through indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), the prevalence of Babesia bigemina, Babesia bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax and Borrelia sp. antibodies in cattle to estabilish the risk of outbreaks. Sera samples of 246 female adult cattle from Castanhal and S?o Miguel do Guam?, northeastern Par? counties (areas with recorded copper and cobalt deficiency) were used. Crude antigen was used in the serologic technique to detect antibodies against B. bigemina, B. bovis, T. vivax and Borrelia sp. For the detection of A. marginale antibodies, recombinant major surface 1a protein (MSP1a) was used as antigen for indirect ELISA. The serum samples showed a prevalence of 99.2% (B. bigemina), 98.8% (B. bovis), 68.3% (A. marginale), 93.1% (T. vivax) and 54.9% (Borrelia sp). The municipalities were considered stable enzootic areas for B. bigemina, B. bovis and T. vivax, but unstable ones for A. marginale and Borrelia sp. In spite of the stability determined for some studied areas, babesiosis, anaplasmosis and trypanosomosis cases with severe clinical signs were seen on the studied region, possibly due to the mineral deficiency that decreases the immune response and immunoreativity of the animals. / A babesiose e a anaplasmose juntamente com a tripanossomose e borreliose s?o doen?as de import?ncia por causarem, potencialmente, morbidade no rebanho bovino, causando preju?zos ? economia. O presente trabalho teve como objetivo investigar, atrav?s do teste ELISA indireto, a preval?ncia de anticorpos para Babesia bigemina, B. bovis, Anaplasma marginale, Trypanosoma vivax e Borrelia burgdorferi em bovinos, avaliando o risco de surtos de doen?a. Foram utilizadas amostras de soro de 246 bovinos f?meas, adultas, provenientes dos munic?pios de Castanhal e S?o Miguel do Guam?, regi?o nordeste do estado do Par? com registros de defici?ncias de Cobre e Cobalto. Foi feita sorologia atrav?s do ensaio imunoenzim?tico ELISA indireto, utilizando-se ant?genos brutos para os agentes: B. bigemina, B. bovis, T. vivax e B. burgdorferi. Em rela??o a A. marginale, foi utilizada a prote?na recombinante MSP1a como ant?geno. A an?lise dos soros revelou a preval?ncia para B. bigemina de 99,2%, B. bovis 98,8 %, A. marginale 68,3%, T. vivax 93,1% e Borrelia sp 54,9%. Os munic?pios estudados foram caracterizados como enzooticamente est?veis para B. bigemina, B. bovis e T. vivax, e enzooticamente inst?veis para A. marginale e Borrelia sp. Apesar da estabilidade prevista para alguns agentes na ?rea do estudo, casos cl?nicos de babesiose, anaplasmose e tripanossomose ocorrem na regi?o, possivelmente devido ? defici?ncia mineral, que leva a diminui??o da resposta imune e da imunorreatividade org?nica dos animais.

Babesiosis and anaplasmosis are part of the complex called Bovine Parasitic Sadness (TPB), a disease that causes high morbidity and mortality in susceptible cattle. It is caused by infection of Babesia bovis and Babesia bigemina protozoa and by the bacterium Anaplasma marginale. The objective of this study was to evaluate oxidative stress parameters in cattle experimentally infected with B. bovis and B. bigemina and the activities of cholinesterase in asymptomatic B. bigemina well as interference of splenectomy in the oxidative balance of cattle infected with A. marginale. For this, three experiments were performed, using 24 young cattle divided into three groups, each consisting of eight animals which: in the first experiment, four control and four infected with attenuated strain of B. bovis, which were observed decrease in erythrocytes count and activities of catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) in addition to increased levels of thiobarbituric acid reactive substances (TBARS). In Experiment II, we used four cattle control and four infected with attenuated strain of B. bigemina, observed decrease in the activities of acetylcholinesterase (AChE), butyrylcholinesterase (BChE) and CAT, and increased levels of TBARS and SOD in infected cattle. And, in Experiment III, four splenectomized cattle and four intact, both groups infected with A. marginale, with no difference between groups in the hematological and enzymatic profile, only observed drop in hematocrit, red blood cell count and hemoglobin concentration, and increased total leukocyte count due to lymphocytosis in both groups. Positive correlations were found between TBARS versus bacteremia and negative between NPSH versus bacteremia in both groups, but the correlations were higher in splenectomized group. From the results it can be inferred that infection with B. bovis causes oxidative balance, in the same way B. bigemina infection induces an oxidative stress condition and changes the atividase cholinesterase even in asymptomatic animals and bacteremia by A. marginale influences lipid peroxidation in independent splenectomy cattle. This study may suggest that oxidative stress and low-grade inflammation markers can be used as auxiliary tool in the early diagnosis of this disease as well as the basis for studies on the use of antioxidants in the diet of cattle to prevent infection and / or reduce the severity of injuries caused by these parasites. / A Tristeza Parasitária Bovina (TPB) é uma doença que causa alta morbidade e mortalidade em bovinos suscetíveis, causada pela infecção dos protozoários Babesia bovis e Babesia bigemina e pela bactéria Anaplasma marginale. O objetivo deste estudo foi avaliar parâmetros de estresse oxidativo em bovinos experimentalmente infectados com B. bovis e B. bigemina e as atividades das colinesterases na infecção assintomática por B. bigemina assim como a interferência da esplenectomia no equilíbrio oxidativo de bovinos infectados com A. marginale. Para tanto, foram realizados três experimentos, sendo utilizados 24 bovinos jovens divididos em três grupos experimentais, cada um composto por oito animais sendo: no Experimento I, quatro controles e quatro infectados com cepa atenuada de B. bovis, onde foram observados decréscimo na contagem de hemácias e nas atividades das enzimas catalase (CAT) e superóxido dismutase (SOD) concomitantes com aumento nos níveis das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). No experimento II, foram usados quatro bovinos controles e quatro infectados com cepa atenuada de B. bigemina, sendo observados decréscimo nas atividades das enzimas acetilcolinesterase (AChE), butirilcolinesterase (BChE) e CAT e aumento nos níveis de TBARS e SOD nos bovinos infectados. E, no Experimento III, quatro bovinos esplenectomizados e quatro intactos, ambos os grupos infectados com A. marginale, não havendo diferença entre os grupos no perfil hematológico e enzimático, apenas observada queda no hematócrito, contagem de hemácias e concentração de hemoglobina e aumento na contagem total de leucócitos devido a um aumento na contagem de linfócitos em ambos os grupos. Foram evidenciadas correlações positiva entre TBARS e a bacteremia e negativa entre NPSH e a bacteremia em ambos os grupos, porém as correlações foram maiores no grupo esplenectomizado. A partir dos resultados pode-se inferir que a infecção por B. bovis causa desequilíbrio oxidativo, da mesma forma que a infecção por B. bigemina induz a uma condição de estresse oxidativo e altera a atividade das colinesterases mesmo em animais assintomáticos e que a bacteremia por A. marginale influencia na peroxidação lipídica em bovinos independente da esplenectomia. Com este estudo, pode-se sugerir que marcadores de estresse oxidativo e de inflamação de baixo grau podem ser utilizados como ferramenta no auxílio do diagnóstico precoce desta enfermidade assim como servir de base para estudos referentes ao uso de antioxidantes na alimentação de bovinos para prevenir a infecção e/ou reduzir a gravidade das lesões causadas por estes parasitas.

As espécies reativas de oxigênio (ERO) e de nitrogênio (ERN) são essenciais na resposta imune dos artrópodes aos microrganismos. Este estudo teve como objetivo a caracterização do estresse oxidativo das células embrionárias BME26 do carrapato R. microplus em resposta à infecção por A. marginale. Mostrou-se que A. marginale invade as células BME26 durante a primeira hora. No perfil de expressão de diversos genes codificadores de proteínas que estão envolvidas na produção e destoxificação de ERO e ERN após desafios com A. marginale e R. rickettsii, foi observado que A. marginale inibiu os transcritos das enzimas oxidantes 72 horas após a infecção. Em contrapartida os genes codificadores das enzimas antioxidantes foram todos induzidos. O perfil de expressão gênica pela infecção por R. rickettsii foi diferente do obtido com A. marginale uma vez que se detectou uma maior indução dos genes oxidantes e repressão dos antioxidantes. O silenciamento de quatro genes antioxidantes por RNAi indicaram o envolvimento da resposta redox no controle da infecção por A. marginale. Com isto se demonstra que o estresse oxidativo é importante no controle da infecção pela bactéria nas células BME26 podendo afetar a capacidade vetorial do carrapato na transmissão desse patógeno. / The production of reactive oxygen species (ROS) and nitrogen (ERN) is essential in the immune response of the arthropods. The aim of this study was the characterization of the oxidative stress of the embryonic cell line BME26 from the cattle tick R. microplus in response to A. marginale infection. It was shown that A. marginale invade BME26 cells during the first 1 hour. The expression profile of sixteen genes encoding proteins involved in either production or detoxification of ROS and RNS in response to A. marginale e R. rickettsii, was shown A. marginale caused a down-regulation of the genes encoding the oxidant enzymes in 72 hours after infection. In contrast the genes encoding the antioxidant were induced. The gene expression pattern in response to R. rickettsii was different from that triggered by A. marginale challenge, with induction of oxidant genes and down-regulation of antioxidant genes. The knockdown of four genes encoding the antioxidant enzymes by RNAi suggests that redox response play a role in the control of infection by A. marginale. Our dataset have shown the importance of the oxidative stress to control A. marginale infection by BME26 cells and might have implications on the vectorial capacity of R. microplus in transmission of this pathogen.

Submitted by Sandra Pereira (srpereira@ufrrj.br) on 2018-05-09T13:59:39Z No. of bitstreams: 1 2010 - Marcos Pinheiro Franque.pdf: 14895648 bytes, checksum: 175b19f715efd4282c83347a6d0ce674 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-09T13:59:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2010 - Marcos Pinheiro Franque.pdf: 14895648 bytes, checksum: 175b19f715efd4282c83347a6d0ce674 (MD5) Previous issue date: 2010-03-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico, CNPq, Brasil. / This work describes the dairy farms profile and of its owners, as well as the epidemiological condition of the herd to Babesia bovis, Babesia bigemina and Anaplasma marginale infection in the south mesorregi?o Espirito-santense, with base in a serologic study. Owners or manager of 38 dairy farms were interviewed with a semi-structured questionnaire and the data analyzed by descriptive statistics. In 97% of the dairy farms, the herd was formed by animals with different degrees of blood girolando. Of all producers, 61% were exclusively dairy farms owners and 34% were also coffee producer. The extensive creation system is used in 61% of dairy farms. The dairy farms management, in 89% and 11% of the cases were accomplished by the owners and administrators, respectively. The serologic study was accomplished using indirect ELISA of 756 samples of bovine serum, 380 of dairy cows and 376 of calves in breast feeding phase. The mesorregi?o studied was classified in situation of stability for B. bovis (98,4%), B. bigemina (96,7%) and A. marginale (96,6%) to dairy cows. In relation to the calves was observed prevalence of 75,5% to Babesia bovis, 78,5% to B. bigemina and 69,2% to A. marginale. In general, the results demonstrated that is possible to increase the production and productivity of these dairy farms, but is necessary the owners adapts to the current competitive productive milk system, mainly about the managerial aspect. In the south mesorregi?o Esp?rito-santense the risk of occurrence of outbreaks of babesiosis or anaplasmosis in adult animals is low. However, preventive measured should be adopted for the calves, mainly for those with less to three months of age. / Este trabalho descreve o perfil de propriedades leiteiras e dos produtores, bem como a situa??o epidemiol?gica do rebanho da mesorregi?o sul Esp?rito-santense em rela??o ? Babesia bovis, Babesia bigemina e Anaplasma marginale, com base em um estudo sorol?gico. Propriet?rios ou administradores de 38 estabelecimentos produtores foram entrevistados com uso de um question?rio semi-estruturado e os dados analisados atrav?s de estat?stica descritiva. Em 97% das propriedades visitadas, o rebanho leiteiro era formado por animais com diferentes graus de sangue girolando. Dentre os produtores, 61% se dedicavam exclusivamente a produ??o leiteira e 34% tamb?m se dedicavam ? cafeicultura. O sistema de cria??o extensiva foi utilizado em 61% das propriedades. Foi observado que o gerenciamento, em 89% e 11% dos casos era realizado pelos propriet?rios e administradores, respectivamente. O estudo sorol?gico foi realizado utilizando o m?todo de ELISA indireto a partir de 756 amostras de soro bovino, dos quais 380 de vacas em lacta??o e 376 de bovinos jovens em fase de aleitamento. Para vacas em lacta??o, a mesorregi?o foi classificada em situa??o de estabilidade para B. bovis (98,4%), B. bigemina (96,7%) e A. marginale (96,6%). Em rela??o aos bovinos jovens foi observada preval?ncia de 75,5% para Babesia bovis, 78,5% para B. bigemina e 69,2% para A. marginale. Os resultados demonstraram que, em geral, as propriedades possuem potencial para aumentar sua produ??o e produtividade, mas os produtores precisam se adequar ao competitivo sistema de produ??o de leite, principalmente no aspecto gerencial. Na mesorregi?o sul Esp?rito-santense o risco de ocorr?ncia de surtos das doen?as do Complexo Tristeza Parasit?ria Bovina ? baixo para os animais adultos. Contudo, medidas preventivas devem ser adotadas para os bezerros, principalmente para aqueles com menos de tr?s meses de idade.

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:47:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1156387 bytes, checksum: 78ed9fe351974511a2d1393bbd68273a (MD5) Previous issue date: 2003-02-28 / Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The immune response against the pathogen Anaplasma marginale was evaluated after the inoculation, in calves, with the strain AUFV1 2nd passage. For this, routine coloration techniques and immunohistochemistry techniques were performed in slides of superficial limph nodes. In the first week post inoculation, a proliferative response was observed in the paracortical areas and, in the third week, a great number of germinal centers. With the TUNEL technique, many cells in apoptosis were observed, in a number statistically significant six and 13 days post inoculation. Antigens of A. marginale presented by dendritic cells were detected with the Indirect Immunoperoxidase technique six days post inoculation, and these were not observed in the limph node of the negative control animal. The same technique was also performed with the purpose of identifying the surface antigens CD4, CD8 and WC1, and a little augment was observed only on the population of lymphocytes CD4+. Another experiment evolved the isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), wich were isolated in the same days the limph nodes were coleted, for studies of proliferation and production of cytokines after reestimulation ex vivo. The mitogen Con A and initial bodies of A. marginale were utilized as positive controls. The PBMCs were estimulated wiht two synthetic peptides based on the structure of the surface protein of A. marginale MSP-2, named 13590 and 13591. A negative control was also utilized, were was added incomplete medium only. On the proliferative tests, only six days post inoculation the peptides were better than the negative control, with numbers statistically significants (p<0,05). On this way, we could conclude that the inoculated animals developed an adaptative immune response against A. marginale, probably evolving T helper cells. In relation to the synthetic peptides tested, we can only afirm that they are good candidates for the development of a vaccine against bovine anaplasmosis, but more studies have to be performed in this area. / Foi avaliada a resposta imune contra o patógeno Anaplasma marginale através da inoculação, em bezerros, da amostra AUFV1 2a passagem. Para tanto, foram realizadas técnicas de coloração de rotina e técnicas imunohistoquímicas em cortes de linfonodos superficiais. Inicialmente, foi observada uma resposta proliferativa na área paracortical e, a partir da terceira semana pós-inoculação, grande reatividade de centros germinais. Através da técnica de TUNEL, foram observadas inúmeras células em apoptose, em número estatisticamente significativo aos seis e 13 dias pós-inoculação. Antígenos de A. marginale apresentados por células dendríticas foram detectados pela técnica da Imunoperoxidase Indireta já aos seis dias pós-inoculação, não sendo observados no linfonodo do animal controle negativo. A técnica da Imunoperoxidase Indireta também foi utilizada para a detecção de antígenos CD4, CD8 e WC1, sendo observado um pequeno aumento apenas de linfócitos CD4+. Paralelamente a estes estudos, foram isoladas células mononucleares de sangue periférico (PBMCs), nos mesmos dias em que eram feitas as coletas de linfonodos, para estudos de proliferação e de produção de citocinas após reestimulação ex vivo. Como controle positivo, foi utilizado o mitógeno celular Concanavalina A, além de corpúsculos iniciais de A. marginale. As PBMCs foram estimuladas com dois peptídeos sintéticos baseados na estrutura da proteína de superfície de A. marginale MSP-2, os peptídeos 13590 e 13591. Também foi feito um controle negativo, onde era adicionado apenas meio de cultivo incompleto. Nos testes proliferativos, apenas aos seis dias pós-inoculação os peptídeos tiveram desempenho melhor, estatisticamente significativo (p<0,05), com relação ao controle negativo. Dessa forma, pode-se concluir que os animais inoculados desenvolveram uma resposta imune adaptativa contra o A. marginale, provavelmente envolvendo células T auxiliares. Quanto aos peptídeos sintéticos testados, serão necessários mais estudos, podendo-se afirmar apenas que eles são candidatos ao desenvolvimento de uma vacina eficaz contra o A. marginale.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The biossensores constitute analytical important devices for the clinical diagnosis of many diseases, enabling real-time analysis, with high specificity and sensitivity. Accordingly, the aim of this study was to develop a platform functionalized with the poly (3- hydroxybenzoic acid), to detection of nitrogenous bases, oligonucleotides and antibodies against the surface protein (Am1) of Anaplasma marginale.These biological recognition elements were immobilized on the functionalized platform and the biosensor was characterized by electrochemical and spectroscopic techniques. The detections of the antigen-antibody interaction were conducted using the signal obtained from the oxidation of protein interleaver, 4- aminoantipyrine (4 -AAP), using voltammetry technique of differential pulse.Theoretical chemistry studies were employed to analyze the Am1 interactions with the sensor platform and the web server model RaptorX to infer three-dimensional structure of the membrane proteins of A. marginale.The molecular modeling was conducted from methods semi- empirical, DFT and molecular mechanics.The transitions redoxes of polymer were classified as almost reversible, with band gap of 1.2 V, characteristic of semiconductor materials.The detections of poly CT and antibodies of A. marginale, using the graphite electrode functionalized with the probes, poly GA and Am1 respectivamente, were 66% higher than the graphite electrode not functionalized.The protein of superfice Am1 presented a structure stable in beta-sheet, while Am2 presented an unstable structure in &#945; -helix.In electrochemical impedance spectroscopy was possible qualitatively differentiate the functionalized platform with: Am1, IgG+, IgG- and interfering. The time of storage of the immunosensor was satisfactory, with reduced peak current by 35%, after 90 days. These results demonstrate the excelent applicability of functionalized platform for the development of immunosensor for diagnosis of bovine anaplasmosis, leaving only the economic feasibility studies for commercial deployment of the said immunosensor. / Os biossensores constituem-se como dispositivos analíticos importantes para o diagnóstico clínico de inúmeras doenças, por permitirem uma análise em tempo real, além de suas altas especificidades e sensibilidades. Nesse sentido, o objetivo desse estudo foi desenvolver uma plataforma funcionalizada com o poli (ácido 3-hidroxibenzóico), para a detecção de bases nitrogenadas, oligonucleotídeos e anticorpos contra a proteína de superfície (Am1) da Anaplasma marginale. Esses elementos de reconhecimento biológico foram imobilizados na plataforma funcionalizada e o biossensor foi caracterizado por técnicas eletroquímicas e espectroscópicas. As detecções da interação antígeno-anticorpo foram realizadas através do sinal obtido da oxidação do intercalador de proteína, 4-aminoantipirina (4-AAP), utilizando a técnica de voltametria de pulso diferencial. Estudos de química teórica foram empregados para análise das interações da Am1 com a plataforma sensora e o modelo web server RaptorX para inferência da estrutura tridimensional das proteínas de membrana da A. marginale. A modelagem molecular foi realizada a partir de métodos semi-empíricos, DFT e mecânica molecular. As transições redoxes do polímero foram classificadas como quase reversíveis, com band gap de 1,2 V característico de materiais semicondutores. As detecções de poli CT e anticorpos da A. marginale, empregando o eletrodo de grafite funcionalizado com as sondas, poli GA e Am1 respectivamente, foram 66 % superior a do eletrodo de grafite não funcionalizado. A proteína de superfície Am1 apresentou uma estrutura estável em folha-beta e a Am2 uma estrutura instável em &#945;-hélice. Na espectroscopia de impedância eletroquímica foi possível diferenciar qualitativamente a plataforma funcionalizada com: Am1, IgG+, IgG- e interferente. O tempo de estocagem do imunossensor mostrou-se satisfatório, com redução do pico de corrente em 35 %, após 90 dias. Esses resultados demonstraram a excelente aplicabilidade da plataforma funcionalizada para o desenvolvimento de imunossensor para diagnóstico da anaplasmose bovina, restando apenas os estudos de viabilidade econômica para implantação comercial do referido imunossensor. / Doutor em Química

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / In this study we investigated the electropolymerization isomers hydroxyphenylacetic acid, for their application in the construction of polymeric systems, by immobilizing synthetics molecules for development of biological sensors. The graphite electrodes electrochemically modified were characterized for morphology and electrochemical behavior showing that the poly(2-hydroxyphenylacetic acid), poly(3-hydroxyphenylacetic acid) and poly(4-hydroxyphenylacetic) are electroactive, and the latter showed a lower yield in electrosynthesis in agreement with the images of atomic force microscopy showed that the surface of graphite electrodes were changed less with this material compared to its isomers. The electrochemical impedance spectra of poly (4-hydroxyphenylacetic acid) showed that this material is more resistive with respect to its other isomers which are more conductive in accordance with the values of current and voltage shown by tests ion exchange the probes positive and negative. The ratio between the masses electrodeposited and the loads required to carry out the redox process these materials remained constant demonstrating that the same number of electrons are involved in reduction and oxidation of these materials according to the diagnostic reversibility applied by cyclic voltammetry are unanimously reversible systems, however poly(3-hydroxyphenylacetic acid) was more stable during repeated cycling electrochemically in perchloric acid. The optimized tridimensional structures justify the electrochemical and morphologic behavior of these three platforms, wherein the poly(2-hydroxyphenylacetic acid) and poly(3-hydroxyphenylacetic acid) have structures with a more ordered arrangement, unlike poly(4-hydroxyphenylacetic acid), which has a rather more disordered structure and therefore more resistive, while isomers are more conductors. The mechanistic proposal begins with the anodic oxidation of monomers whose square wave voltammetry experiments showed the loss of an electron. The couplings between cation radicals promote a formation of ether leaving the acetate groups exposed on the structure. The pairing occurs between the phenolic oxygen and carbon of the aromatic ring whose potential were studied by spin density and consistent with the resonance structures of the cation-radical that are in the suggested mechanisms. In tests incorporation of nitrogenous bases found that poly(3-hydroxyphenylacetic acid) also proved more effective in the retention of the same and for this reason associated with their better electrochemical behavior described above, it was selected among others for applying isomers polimeric systems by immobilizing synthetics molecules by physical adsorption. In the first system froze synthetic oligonucleotides that mimic fragments of DNA from the bacterium Neisseria meningitidis able to recognize their genomic DNA in samples of pure cultures by differential pulse voltammetry and electrochemical impedance spectroscopy, and this latter showed a better response sensitivity signal in relation to the increasing concentration of the target. In the second system, there immobilization of synthetic peptides compatible to the cell membrane of Anaplasma marginale able to selectively recognize antibodies in their sera samples from cattle. The images made by atomic force microscopy of the two procedures backing the effective recognition of both polimeric systems developed for the detection of Neisseria meningitidis and Anaplasma marginale bacteria causing bacterial meningitis and bovine anaplasmosis, respectively. / Neste trabalho foi investigada a eletropolimerização dos isômeros do ácido hidroxifenilacético, visando sua aplicação na construção de sistemas poliméricos, através da imobilização de moléculas sintéticas para o desenvolvimento de sensores biológicos. Os eletrodos de grafite eletroquimicamente modificados foram caracterizados quanto à morfologia e o comportamento eletroquímico, evidenciando que o poli(ácido 2-hidroxifenilacético), poli(ácido 3-hidroxifenilacético) e poli(ácido 4-hidroxifenilacético) são eletroativos, sendo que este último apresentou um menor rendimento em massa na eletrossíntese, em concordância com as imagens de microscopia de força atômica, que mostraram que a superfície dos eletrodos de grafite foram menos alteradas com este material em relação aos seus isômeros. Os espectros de impedância eletroquímica do poli(ácido 4-hidroxifenilacético), mostraram que esse material é mais resistivo em relação aos seus outros isômeros que são mais condutores em concordância com os valores de corrente e potencial evidenciados nos ensaios de troca iônica nas sondas positiva e negativa. A relação entre as massas eletrodepositadas e as cargas necessárias para realizar o processo redox nestes materiais foi constante, indicando que o mesmo número de elétrons está envolvido na oxidação e redução destes materiais, que se comportaram como sistemas reversíveis segundo os diagnósticos de reversibilidade aplicados por voltametria cíclica, todavia o poli(ácido 3-hidroxifenilacético) mostrou-se mais estável eletroquimicamente durante sucessivas ciclagens em ácido perclórico. As estruturas tridimensionais otimizadas justificam o comportamento eletroquímico e morfológico destas três plataformas, em que os poli(ácido 2-hidroxifenilacético) e poli(ácido 3-hidroxifenilacético) apresentam estruturas com um arranjo mais ordenado e por isso são mais condutores ao contrário do poli(ácido 4-hidroxifenilacético) que tem uma estrutura mais desordenada, e por isso mais resistiva. A proposta mecanística inicia-se com a eletrooxidação dos monômeros, cujas investigações experimentais por voltametria de onda quadrada, mostraram a perda de um elétron. Os acoplamentos entre os cátions radicais promovem uma formação de éter deixando os grupos acetato expostos na estrutura. O emparelhamento ocorre entre o oxigênio fenólico e carbonos do anel aromático, cujas possibilidades foram estudadas pela densidade de spin e concordantes com as estruturas de ressonância dos cátions-radicais que estão nos mecanismos sugeridos. Nos testes de incorporação de bases nitrogenadas, verificou-se que o poli(ácido 3-hidroxifenilacético) mostrou-se mais eficiente na retenção das mesmas e por este motivo associado ao seu melhor comportamento eletroquímico, foi selecionado dentre os outros isômeros como o sistema polimérico mais adequado para aplicação nas detecções, através da imobilização por adsorção física de moléculas sintéticas de reconhecimento. No primeiro sistema, imobilizou-se oligonucleotídeos sintéticos compatíveis a fragmentos de DNA da bactéria Neisseria meningitidis, capazes de reconhecer seu DNA genômico em amostras por voltametria de pulso diferencial e espectroscopia de impedância eletroquímica, sendo que esta última mostrou uma melhor sensibilidade de resposta de sinal em relação ao aumento de concentração do alvo. No segundo sistema, ocorreu a imobilização de peptídeos sintéticos compatíveis à membrana celular da Anaplasma marginale, capazes de reconhecer seletivamente seus anticorpos em amostras de soros sanguíneos bovinos. As imagens feitas por microscopia de força atômica, respaldam o reconhecimento eficaz de ambos os sistemas poliméricos desenvolvidos para detecção das bactérias Neisseria meningitidis e Anaplasma marginale, causadores de meningite bacteriana e anaplasmose bovina, respectivamente. / Doutor em Química