漢厚朴酚是從木蘭科植物中萃取之天然化合物，已知具有抗氧化、抗發炎及神經保護之生理活性功能。先前的研究證明漢厚朴酚可以保護多巴胺神經元對抗6-OHDA所引起的細胞傷害，並且可以減緩6-OHDA 動物模式由apomorphine所誘發的旋轉行為，但漢厚朴酚對於神經保護之分子機制的相關研究尚未釐清。蛋白激酶CK2是具有多功能的絲氨酸/蘇氨酸激酶，高度表現在大腦紋狀體中，先前的研究證實蛋白激酶CK2參與調節神經系統功能和具有神經保護之作用。先前研究也指出轉錄因子Nrf1（Nuclear factor E2-related factor 1）是蛋白激酶CK2下游磷酸化受質，會調控小鼠胚胎纖維細胞中蛋白酶體基因的表現。抗細胞凋亡蛋白Mcl-1 (myeloid cell leukemia 1) 屬於Bcl-2蛋白家族的成員之一，在細胞凋亡的過程中，其蛋白含量減少與細胞凋亡有密切關聯性，抑制Mcl-1蛋白的降解可以延遲細胞死亡。因此本論文主要探討漢厚朴酚的神經細胞保護機制是否透過CK2-Nrf1細胞訊息路徑調控蛋白酶體活性，進而減少Mcl-1的降解速率。實驗結果顯示，轉染CK2α-EGFP DNA質體會增加Nrf1磷酸化並抑制蛋白酶體活性，泛素化之Mcl-1蛋白含量亦伴隨增加；轉染CK2α siRNA則會降低Nrf1磷酸化並促進蛋白酶體活性，導致naive Mcl-1蛋白質含量減少24小時的漢厚朴酚後處理（post-treatment）可以部份恢復因轉染CK2α siRNA所造成之CK2蛋白、Phosphoserine蛋白和Mcl-1蛋白質含量減少，在設計縮短間隔5小時漢厚朴酚後處理（post-treatment）的實驗結果雖然仍無法有效恢復CK2蛋白含量，但對於Phosphoserine和Mcl-1蛋白含量以及蛋白酶體活性則具有部份恢復的功效。利用過氧化氫造成細胞氧化壓力環境下，實驗發現間隔3小時的漢厚朴酚後處理才能有效恢復細胞存活率，間隔5小時的漢厚朴酚後處理則無法恢復細胞存活率。在大白鼠紋狀體腦區給予漢厚朴酚微量注射則對pTH、TH和GAD蛋白質含量皆有促進增加的作用，乙醯化的Histone H3蛋白含量也有顯著增加。綜合以上結果，推測漢厚朴酚對細胞保護作用的其中一個機制是參與調控CK2-Nrf1路徑而抑制蛋白酶體活性，減少Mcl-1蛋白質降解速率和提升氧化壓力下之細胞存活能力；此外，從活體動物的實驗結果顯示漢厚朴酚亦可能參與調控多巴胺和γ-氨基丁酸神經細胞功能的機制之中。 / Honokiol is a natural compound, extracted from the Magnolia officinalis, and is known as its anti-oxidative, anti-inflammatory and neuroprotective effects. The previous study has been demonstrated that the honokiol can protect striatal dopamine neuron against 6-OHDA induced damage and reverse the apomorphine-induced rotational behavior in Parkinson’s disease model of rats. However, the cellular mechanisms for its neuroprotective effects are not fully investigated. Protein kinase Casine kinase 2 (CK2) is a serine/threonine kinase has a highly abundant expression in the striatum compared with other brain areas. Further, CK2 is shown to regulate many neuronal functions including neuroprotection. The nuclear factor E2-related factor 1 (Nrf1) has been identified as one of the substrate proteins for CK2 and is indicated to involve in the induction of proteasome subunits gene expressions in mouse embryonic fibroblasts. The anti-apoptotic protein myeloid cell leukemia 1 (Mcl-1) is shown to play a critical initiation role during the apoptosis process due to its synthesis blockage and proteasome degradation. The present study is aimed to investigate whether one of protective effects of honokiol is through CK2-mediated Nrf1 signaling pathway to regulate the proteasome activity in the mouse N2a neuroblastoma cell line. In the current results, transfection of the CK2α-EGFP plasmid DNA increased Nrf1 phosphorylation accompanied with the decrease in the proteasome activity but increased the ubiquitinated Mcl-1 protein. Whereas, transfection of CK2α siRNA decreased Nrf1 phosphorylation leading to the increase in proteasome activity and Mcl-1 protein degradation. The 24 hr duration of honokiol post-treatment only slightly reversed the knock-down effect of CK2α siRNA on CK2α and Mcl-1 protein levels. However, 5 hr duration of honokiol post-treatment could partially reverse the Mcl-1 protein level and proteasome activity but no effect on CK2α protein levels. In the H2O2-induced oxidative stress condition, only 3 hr duration of honokiol post-treatment could protect cells against H2O2-induced cell death. In the experiments of in vivo rat animal model, local administration of honokiol was found to increase phospho-TH, naive TH, GAD as well as acetylated Histone H3 protein levels. These above results suggest one of the protective mechanisms of honokiol might be through CK2-mediated Nrf1 signaling to inhibit the proteasome activity. and to promote cell survival under oxidative stress. Beside these functions, honokiol might also involve in the regulation of nurophysiological functions of dopamine and GABA neurons.

Le système ubiquitine-protéasome est le principal mécanisme par lequel les protéines intracellulaires sont dégradées. Le protéasome dit constitutif (PC) est donc essentiel à l’homéostasie mais aussi à la régulation de la majorité des processus cellulaires importants. La découverte d’un deuxième type de protéasome, appelé immunoprotéasome (IP), soulève toutefois de nouvelles questions. Pourquoi existe-t-il plus d’un type de protéasome ? L’IP a-t-il des rôles redondants ou complémentaires avec le PC ? L’IP étant présent principalement dans les cellules immunitaires ou stimulées par des cytokines, plusieurs groupes ont tenté de définir son rôle dans la réponse immunitaire. Or, l’implication de son homologue constitutif dans un éventail de processus non spécifiquement immunitaires nous laisse croire que l’IP pourrait lui aussi avoir un impact beaucoup plus large. L’objectif de cette thèse était donc de caractériser certains rôles cellulaires de l’IP dans les cellules dendritiques. Nous avons d’abord étudié l’impact global de l’IP sur la présentation antigénique de classe I. Ce faisant, nous avons pu déterminer ses deux contributions principales, soit l’augmentation drastique du nombre et de la diversité des peptides présentés sur les complexes majeurs d’histocompatibilité de classe I. Les différences de clivage entre le PC et l’IP pourraient expliquer en partie cette diversité du répertoire peptidique, notamment par l’affinité apparente de l’IP pour les régions protéiques non structurées. Dans un deuxième temps, nous avons dévoilé un nouveau rôle de l’IP sur un processus dépassant le cadre immunitaire : la transcription. Nous avons découvert que l’IP modifie l’abondance des ARNm en agissant principalement au niveau de leur synthèse. L’impact de l’IP sur le transcriptome est majeur et serait dû en partie à une dégradation différente de facteurs de transcription des familles IRF, STAT et NF-kB. Les cellules dendritiques IP-déficientes activent moins efficacement les lymphocytes T CD8+ et nous croyons que cette défaillance est causée (du moins en partie) par la perturbation transcriptomique provoquée par l’absence d’IP. Il importe donc de comprendre les différents rôles moléculaires de l’IP afin de mieux définir sa contribution globale au fonctionnement de la cellule et comprendre l’avantage évolutif, au niveau de l’organisme, procuré par une telle plasticité du système ubiquitine-protéasome. / The ubiquitin-proteasome system is the major mechanism by which intracellular proteins get degraded. Constitutive proteasomes (CPs) are thus essential for cellular homeostasis but also to regulate the majority of important cellular processes. However, the discovery of a second type of proteasome, named immunoproteasome (IP), raises new questions. Why are there more than one type of proteasome? Does the IP perform redundant or complementary roles with the CP? The IP is predominantly expressed in immune or cytokine-stimulated cells and several groups worked at defining its role during the immune response. Yet, the implication of its constitutive homolog in a variety of processes suggests that the IP may also have a much broader impact. The objective was to characterize cellular roles of the IP in dendritic cells. We first studied the global impact of the IP on class I antigen presentation. We discovered that the IP drastically increases the number and the diversity of peptide presented by class I major histocompatibility complexes. Cleavage differences between the CP and the IP are likely part of the explanation for this peptide repertoire diversity, notably due to IP’s apparent affinity for unstructured protein regions. Second, we discovered a new role for the IP in a process unrestricted to the immune system: transcription. We found that the IP affects transcript abundance mostly at the level of mRNA synthesis. The impact of IPs on the transcriptome is major and would be partly based on a different degradation of IRF, STAT and NF-kB transcription factor family members by the two types of proteasomes. IP-deficient dendritic cells are less potent activators of CD8+ T cells and we believe that this defect is at least partly caused by the transcriptome alterations induced by the absence of IPs. It is therefore important to understand the different molecular roles of the IP in order to better define its global contribution to cellular functions and to understand the evolutionary advantage, at the level of the organism, brought by such plasticity of the ubiquitin- proteasome system.

L’acide rétinoïque (AR) agit via des récepteurs nucléaires (RAR) qui sont des facteurs de transcription inductibles par le ligand. Il active aussi des cascades de kinases qui ciblent les RAR et modulent leur activité transcriptionnelle. Cependant, l’ensemble des protéines phosphorylées en réponse à l’AR de même que les conséquences des dérégulations du « kinome » sur les effets l’AR et le fonctionnement des RAR demeurent mal connus. J’ai comparé les effets de l’AR sur le phosphoprotéome de deux lignées de cellules de cancer du sein : MCF7, qui est sensible à l’AR, et BT474, qui surexprime le récepteur a activité tyrosine kinase erbB-2 et est résistante à l’AR. De nombreuses différences ont été observées avec des répercussions sur l’expression des gènes de même que sur la phosphorylation, le recrutement aux promoteurs des gènes cibles et la dégradation de RAR alpha par le protéasome. J’ai aussi montré que la dégradation de RAR alpha met en jeu TRIM24 qui contrôle sa déubiquitination. / Retinoic acid (RA) acts by binding to specific nuclear receptors (RARs), which are ligand-dependant transcription factors. RA also has non-genomic effects and activates kinase cascades that target RARs and modulate their transcriptional activity. However, the proteins that are phosphorylated in response to RA remain to be identified. The consequences of dysregulations of the "kinome" on the non-genomic effects of RA and on RAR function also require further investigation. I compared the effect of RA on the phosphoproteome of two breast cancer cell lines: MCF7, which is RA-sensitive, and BT474, a RA-resistant cell line that overexpresses the receptor tyrosine kinase erbB-2. Multiple differences were observed with consequences on gene expression as well as on phosphorylation, recruitment on target genes promoters and RARalpha degradation by the proteasome. In the context or RARalpha degradation, I showed the involvement of TRIM24 which controls RARα deubiquitination.

Les papillomavirus humains (HPV) constituent l’archétype des virus à ADN oncogènes. Les HPV muqueux à haut risque (principalement HPV16) sont les principaux agents étiologiques du cancer du col utérin. Les protéines virales E6 et E7 sont des acteurs cruciaux de la cancérogenèse induite par HPV. Nous avons construit une ressource composée de 600 ADNc codant les effecteurs humains du système ubiquitine-protéasome (UPS) et identifié de nouvelles cibles potentielles des protéines E6 et E7 en utilisant une méthode basée sur la complémentation protéique de la Gaussia princeps luciférase (GPCA). HPV16 E6 lie les motifs LxxLL présents dans E6AP et IRF3. Nous avons résolu la structure cristallographique des complexes E6/LxxLL de E6AP/p53 et E6/LxxLL de IRF3. Par ailleurs, nous avons montré que les HPV ciblent une nouvelle voie suppresseur de tumeurs, la voie Hippo, avec ses deux médiateurs clef YAP et TAZ. Nous avons généré une banque d’ADNc codant 265 domaines PDZ humains et identifié de nouveaux partenaires potentiels des protéines YAP/TAZ en utilisant la méthode GPCA. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre la biologie des HPV et leur pouvoir oncogène. / The human papillomavirus (HPVs) are the archetype of DNA oncogenic viruses. High-risk mucosal HPVs (mainly HPV16) are the main causative agents of cervical cancer and are also involved in other cancers. HPV oncogenic properties are mainly due to the expression of E6 and E7 proteins. We built a resource composed of 600 cDNA encoding the human ubiquitin-proteasome system (UPS) effectors and identified novel E6 and E7 potential targets by using a method based on the complementation of the Gaussia princeps luciferase (GPCA). HPV16 E6 binds to specific LxxLL motifs present in E6AP and IRF3. We have solved the crystallographic structure of the E6/E6AP LxxLL/p53 and E6/IRF3 LxxLL complexes. Furthermore, HPV may target a novel tumour suppressor pathway, the Hippo signalling pathway with its two main mediators YAP and TAZ. We have built a cDNA library dedicated to the 265 human PDZ domains and identified news potential partners of YAP and TAZ proteins by using the GPCA. The results provide novel insights on HPV biology and their oncogenic property.

L'augmentation des concentrations de fond en ozone dans la troposphère depuis le XXéme siècle est responsable de baisses conséquentes des rendements des grandes cultures. Le maïs ne semble pas épargné et les pertes de rendement pour l'année 2000 seraient de l'ordre de 2,2% à 5%. Toutefois, ces estimations sont établies à partir des résultats d'un nombre très faible d'expérimentations, toutes réalisées en chambres d'ozonation à ciel ouvert. Afin de vérifier si ces projections sont véritablement transposables aux champs de maïs cultivé en conditions conventionnelles, des plants de la variété NK Perform ont été mis en culture et exposés en champ à différentes concentrations d'ozone, en conditions semi-contrôlées. Pendant le développement des plantes, des séries d'échantillons ont été prélevées afin de comprendre comment le stress oxydatif, potentiellement induit par l'ozone, pourrait les avoir affectées. Ainsi les niveaux d'activités endoprotéolytiques des feuilles de l'épi (précédemment proposés comme indicateurs du degré de contrainte hydrique) ont été mesurés à l'aide d'une méthode par fluorescence (nouvellement adaptée chez les plantes). Parallèlement, les variations des teneurs en protéines oxydées (groupements carbonyles), de la peroxydation lipidiques et de la teneur en espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont également été analysées. Nos résultats mettent en évidence une stimulation des activités endoprotéolytiques en réponse aux niveaux élevés d'exposition à l'ozone, ainsi qu'une différence significative de teneurs en protéines oxydées entre les plants contrôles et les plants les plus exposés. De mêmes les teneurs en ROS et les niveaux de peroxydation lipidique témoignent d'un effet de l'exposition à l'ozone. Toutes ses réponses cellulaires sont également influencées par l'âge des tissus foliaires. Ces résultats semblent abonder dans le sens des modèles en démontrant un impact certain de l'ozone sur le maïs, cependant toutes les analyses menées sur les paramètres de rendement (poids de mille grains, biomasse, teneur en amidon…) ne laisse entrevoir aucune perte, nous obligeant alors à reconsidérer la sensibilité du maïs à l'ozone, généralement admise jusqu'ici / For the past 150 years, background tropospheric ozone concentrations have been increasing constantely to the point where they now affect grain yield in major cereals, such as maize. In 2000, it has been estimated that yield loss was between 2.2% and 5% in this crop. Such estimates have been established from a very low number of experiments, all carried out in open top ozone fumigation chambers. To verify the accuracy of these estimations, we cultivated maize plants and exposed them to various ozone concentrations in the field. During plant development, series of cob-leaf samples have been collected in order to analyze the impact of ozone-induced oxidative stress on various biochemical processes. Thus, we studied changes in leaf endoproteolytic activities (a parameter previously used as a dehydration stress indicator), using a fluorescence-based method newly adapted to plant tissues. Concurrently, changes in protein oxidation levels (carbonyl groups) were analyzed, along with lipid peroxidation and accumulation of reactive oxygen species (ROS).Our results indicate that ozone induced increases in the global level of protein oxidation, endoproteolytic processes and lipid peroxidation, most likely as a result of an over-accumulation of ROS in the leaf tissues. Furthermore, the impact of ozone is enhanced by aging. To some extent, these conclusions agree with those obtained from impact modeling that also show that maize is midly sensitive to ozone. However, because yield was not affected whatsoever in our experiment (1000 grain weight, biomass, starch accumulation), it is our opinion that the general consensus about the sensitivity of maize to ozone should be revised

Les β2-agonistes sont couramment utilisés pour prévenir et réduire les symptômes de l'asthme et de la bronchoconstriction induite par l'exercice. Mais, pris en quantités supérieures aux doses thérapeutiques, les β2-agonistes ont un effet anabolisant qui a été clairement démontré in vivo. Un certain nombre d’acteurs sont mis en jeu dans la réponse biologique du tissu musculaire aux β2-agonistes. L’un de ces acteurs est la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR, voie d’initiation de la traduction, ayant un rôle majeur dans la synthèse protéique. Dans ce contexte, notre première étude avait pour objectif de déterminer la cinétique des événements moléculaires responsables de l’hypertrophie du muscle squelettique de rat après administration de formotérol pendant 1 jour (J1), 3 jours (J3) et 10 jours (J10). Nous avons montré que l’administration de formotérol induisait une hypertrophie musculaire à J3 et J10 associée à l’activation transitoire de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR (J1 et J3), et à une diminution de l’expression de l’E3 ubiquitine ligase MAFbx/Atrogin-1 (J3). La voie autophagie lysosome ne semblait pas être affectée. Ainsi, l’ensemble de ces résultats suggère que l’activation de la voie PI3K/Akt/mTOR est associée à la voie ubiquitine-protéasome mais pas à la voie autophagie-lysosome. La régulation transitoire de la voie PI3K/Akt/mTOR suggère que d’autres voies de signalisation sont impliquées dans l’hypertrophie musculaire induite par le formotérol. Le 007-AM, analogue de l’AMPc, a été décrit comme pouvant stimuler la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR via l’activation de la protéine Epac, suggérant que le 007-AM puisse constituer une molécule de substitution à l’utilisation des β2-agonistes. Notre seconde étude avait pour but de déterminer si le 007-AM avait une action anabolisante sur le tissu musculaire, mais également de déterminer si la 007-AM était une molécule stable permettant d’envisager son usage dans un cadre pharmacologique. L’administration de 007-AM pendant 7 jours chez des souris n’engendrait pas d’hypertrophie musculaire. En revanche, in vitro sur cellules C2C12, le 007-AM activait la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR comme en témoignait l’augmentation de la phosphorylation des protéines rpS6 et 4E-BP1. Nos résultats montraient également que le 007-AM était instable dans le plasma alors que son produit de dégradation, le 007 était plus stable. Pris ensembles, ces résultats suggèrent qu’un traitement de 7 jours au 007-AM n’est pas suffisant pour induire une hypertrophie musculaire et que l’absence d’hypertrophie musculaire pourrait provenir de l’instabilité du 007-AM dans le plasma. Toutefois, des études supplémentaires seront nécessaires pour confirmer ces résultats / Β2-agonists are traditionally used to prevent and reduce asthma symptoms and bronchoconstriction induced by exercise. Nevertheless, when administrated in vivo, at relatively high, far away from therapeutic doses, β2-agonists induce anabolic effects. Numerous actors are involved in biological response of the skeletal muscle, induced by β2-agonists. PI3K/Akt/mTOR signaling pathway, which initiates translation, is one of these actors. In this context, our first study aimed at determined the kinetic of molecular events responsible for skeletal muscle hypertrophy after 1 day (D1), 3 days (D3) and 10 days (D10) of formoterol administration. We have shown that formoterol administration induced skeletal muscle hypertrophy at D3 and D10 associated with a transient activation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway (D1 and D3), and, with a decrease in E3 ubiquitin ligase MAFbx/atrogin-1 expression (D3). The autophagy-lysosome pathway seems not to be regulated by formoterol administration. Taken together, these results suggest that PI3K/Akt/mTOR activation is temporally associated with the regulation of ubiquitin-proteasome but not the autophagy-lysosome pathway. The transient nature of the regulation of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway also indicates that other unidentified pathways are probably activated to sustain the increase in skeletal muscle mass. Recently, 007-AM synthetic molecule has been described to stimulate PI3K/Akt/mTOR signaling pathway through Epac protein activation, suggesting that 007-AM could be an alternative to the use of β2-agonists. The purpose of our second study was to determine whether 007-AM had an anabolic action on skeletal muscle and if 007-AM was stable allowing considering its use in pharmacology. 007-AM administration for 7 days to mice does not lead to muscle hypertrophy. Nonetheless, in vitro on C2C12 cells, 007-AM activated PI3K/Akt/mTOR signaling pathway by increasing phosphorylation of rpS6 and 4E-BP1. Our results showed that contrary to 007, 007-AM was instable in plasma. Altogether, these results suggest that a 7-day 007-AM treatment is not sufficient to induce skeletal muscle hypertrophy. This lack of hypertrophy could be due to 007-AM instability in plasma. However, supplemental studies are needed to confirm these results

p53, known as the “guardian of the genome”, is the most well-characterized tumor suppressor gene. The central role of p53 is to prevent genome instability. p53 is the central node in an incredibly elaborate genome defense network for receiving various input stress signals and controlling diverse cellular responses. The final output of this network is determined not only by the p53 protein itself, but also by other p53 cooperating proteins. p300 and CBP (CREB-Binding Protein) act as multifunctional regulators of p53 via acetylase and ubiquitin ligase activities. Prior work in vitro has shown that the N-terminal 595 aa of p300 encode both generic ubiquitin ligase (E3) and p53-directed E4 functions. Analysis of p300 or CBP-deficient cells revealed that both coactivators were required for endogenous p53 polyubiquitination and the normally rapid turnover of p53 in unstressed cells. Unexpectedly, p300/CBP ubiquitin ligase activities were absent in nuclear extracts and exclusively cytoplasmic. In the nucleus, CBP and p300 exhibited differential regulation of p53 gene target expression, C-terminal acetylation, and biologic response after DNA damage. p300 activated, and CBP repressed, PUMA expression, correlating with activating acetylation of p53 C-terminal lysines by p300, and a repressive acetylation of p53 lysine-320 induced by CBP. Consistent with their gene expression effects, CBP deficiency augmented, and p300 deficiency blocked, apoptosis after doxorubicin treatment. Subcellular compartmentalization of p300/CBP’s ubiquitination and transcription activities reconciles seemingly opposed functions—cytoplasmic p300/CBP E4 activities ubiquitinate and destabilize p53, while nuclear p300/CBP direct p53 acetylation, target gene activation, and biological outcome after genotoxic stress. p53 is a prominent tumor suppressor gene and it is mutated in more than 50% of human tumors. Reactivation of endogenous p53 is one therapeutic avenue to stop cancer cell growth. In this thesis, we have identified S5as a critical regulator of p53 degradation and activity. S5a is a non-ATPase subunit in the 19S regulatory particle of the 26S proteasome. Our preliminary data indicates that S5a is required for p53 instability and is a negative regulator of p53 tranactivation. As a negative regulator of p53, S5a may therefore also represent a new target for cancer drug development against tumors that specifically maintain wild type p53.

Indiana University-Purdue University Indianapolis (IUPUI) / Proteasome assembly is a rapid and highly sequential process that occurs through a series of intermediates. While the quest to understand the exact process of assembly is ongoing, there remains an incomplete understanding of what happens early on during the process, prior to the involvement of the β subunits. A significant feature of proteasome assembly is the property of proteasomal subunits to self-assemble. While archaeal α and β subunits from Thermoplasma acidophilum can assemble into entire 20S units in vitro, certain α subunits from divergent species have a property to self-assemble into single and double heptameric rings. In this study, we have shown that recombinant α subunits from Methanococcus maripaludis also have a tendency to self-assemble into higher order structures when expressed in E. coli. Using a novel cross-linking strategy, we were able to establish that these higher order structures were double α rings that are structurally similar to a half-proteasome (i.e. an α-β ring pair). Our experiments on M. maripaludis α subunits represent the first biochemical evidence for the orientation of rings in an α ring dimer. We also investigated self-assembly of α subunits in S. cerevisiae and attempted to characterize a highly stable and unique high molecular weight complex (HMWC) that is formed upon co-expression of α5, α6, α7 and α1 in E. coli. Using our cross-linking strategy, we were able to show that this complex is a double α ring in which, at the least, one α1 subunit is positioned across itself. We were also able to detect α1-α1 crosslinks in high molecular weight complexes that are formed when α7 and α1 are co-expressed, and when α6, α7 and α1 are co-expressed in E. coli. The fact that we able to observe α1-α1 crosslinks in higher order structures that form whenever α7 and α1 were present suggests that α1-α1 crosslinks might be able to serve as potential trackers to detect HMWCs in vivo. This would be an important step in determining if these HMWCs represent bona fide assembly intermediates, or dead-end complexes whose formation must be prevented in order to ensure efficient proteasome assembly.

Chemotherapien verursachen DNA-Schäden in Krebszellen, was zur Apoptose der meisten Zellen führt. Die überlebenden Zellen können in eine Therapie-induzierte Seneszenz (TIS) eintreten, die zum Zellzyklusarrest führt. Zellen in TIS weisen einen Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp (SASP) auf – eine erhöhte Proteinproduktion, die proteotoxischen Stress bedingt. Verbliebene seneszente Zellen könnten jedoch wieder in den Zellzyklus eintreten und ihr SASP kann entzündungsfördernd wirken. Da seneszente Zellen besonders auf Proteinabbau angewiesen sind, um eine zu hohe Proteotoxizität zu vermeiden, zielten wir auf Proteindegradierungswege mit einer sekundären Therapie ab, um TIS Zellen zu eliminieren. Mittels Bcl2-überexprimierender Lymphome aus dem transgenen Eμ-myc Maus-Modell, die nach Chemotherapie in Seneszenz eintreten, und des Vergleichs mit Lymphomen, die aufgrund einer genetischen Läsion nicht seneszent werden können. identifizierten wir eine verringerte proteasomale Aktivität in TIS, die mit Kennzeichen von proteotoxischem Stress korrelierte. Dabei hängt die daraus folgende Empfindlichkeit von TIS Zellen für proteasomale Hemmung von NF-κB regulierter SASP Produktion ab. Die Kombination aus proteasomaler Hemmung durch Bortezomib und einem Autophagieblocker zeigte einen additiven Effekt auf den Zelltod von TIS Zellen. Diese Ergebnisse konnten in vivo anhand verbesserten Überlebens durch TIS-nachfolgende Sekundärtherapie von mit Lymphomen inokulierten Mäusen bestätigt werden. Schließlich konnte das Prinzip der Seneszenz-spezifischen Beseitigung von Tumorzellen unter Einsatz von Bortezomib in zwei humanen Lymphomzelllinien untermauert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass seneszente Zellen auf eine intakte Proteinabbau-Maschinerie angewiesen sind und auf Veränderungen in proteasomaler Aktivität empfindlich reagieren. Diese Angreifbarkeit könnte in einer neuartigen, synthetisch lethalen Strategie ausgenutzt werden, um maligne Zellen effektiv zu eliminieren. / Chemotherapy causes DNA damage in cancer cells, causing apoptosis in most, but not all cells. Surviving cells can undergo therapy-induced senescence (TIS), an emergency mechanism that arrests the cell cycle. Cells in TIS exhibit a senescence-associated secretory phenotype (SASP) - a massive increase in protein production leading to proteotoxic stress. Sustained senescent cells might reenter the cell cycle, and their SASP can stimulate dangerous inflammation. Aiming to eliminate remaining TIS cells, we reasoned that they need to reduce their excessive protein burden and avoid proteotoxicity and we therefore targeted protein degradation pathways with a secondary treatment. Using Bcl2-overexpressing lymphomas from the Eμ-myc mouse transgenic model, which become senescent after chemotherapy, and comparing them to lymphomas that do not become senescent due to a genetic impairment, we found reduced proteasomal activity in TIS, correlating to hallmarks of proteotoxic stress, such as accumulation of protein aggregates and oxidized proteins. The consequential sensitivity of TIS cells to proteasome inhibition was dependent on NF-κB governed SASP production. Very significantly, combining proteasome inhibition by bortezomib with autophagy inhibition had an additive effect on susceptibility to rapid death after TIS. These findings were confirmed by in vivo treatments improving survival of mice carrying lymphomas that had been treated into TIS. Lastly, the senescent-specific clearance of cells by bortezomib following TIS induction was confirmed using two human, lymphoid cell lines, supporting the proof-of-principle. This study suggests that senescent cells are highly dependent on protein disposal and are hypersensitive to changes in proteasome activity. This vulnerability might be exploited in a novel synthetic lethality strategy to fully eliminate malignant cells.

ERK3 est une protéine de la famille des MAP kinase (MAPK) classifiée comme atypique car elle présente des différences notables comparées aux propriétés redondantes des MAPK dites classiques. ERK3 est notamment une protéine très instable dégradée constitutivement par le système ubiquitine protéasome. Par conséquence, son activité biologique est principalement contrôlée par la régulation de sa dégradation. Pourtant, les facteurs impliqués dans la régulation de la stabilité de ERK3 restent mal compris. Ce travail de thèse vise ainsi à affiner notre compréhension des mécanismes de régulation de la stabilité de ERK3. De manière intéressante, nous avons montré dans une première étude qu’un pH acide stabilise fortement ERK3 alors qu’à l’inverse, un pH basique induit sa rapide dégradation par le protéasome. De plus, la déplétion génétique de NBCn1, un transporteur de bicarbonate impliqué dans la régulation du pH intracellulaire, augmente également la stabilité de ERK3. Ainsi, des variations de pH intracellulaire régulent finement la dégradation de ERK3. Nous avons également montré dans une deuxième étude l’importance de ERK3 dans la progression tumorale dans le cancer du sein. La surexpression de ERK3 au niveau transcriptionnel ou protéique est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein, que ce soit au niveau de la survie globale ou de la survie sans métastase. Ainsi, la déplétion de ERK3 entraîne une diminution drastique du nombre de métastases au foie et aux poumons. ERK3 est également impliquée dans la migration cellulaire in vitro. Nous avons montré pour la première fois que la stabilité d’une kinase peut être modulée par le pH. Or, le pH est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme, entre autres, la prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et la mort cellulaire. Les résultats obtenus pendant ce doctorat ouvrent donc de nouveaux champs d’exploration pour étudier l’activité biologique de ERK3 dans des contextes dépendants du pH. / ERK3 is an atypical member of the MAP kinase (MAPK) family because its regulation differs from the canonical module of classical MAPK. ERK3 is also an unstable protein constitutively degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore, ERK3 stability regulation is an essential element in the control of its biological activity. However, the components implied in the regulation of its stability by the UPS are mainly unknown. This thesis aims to understand the regulation mechanisms controlling ERK3 degradation to better explore its biological function. In a first study, we showed that an acidic extracellular pH strongly stabilizes ERK3. At the opposite, a basic pH triggers its rapid degradation by the proteasome. Moreover, genetic depletion of NBCn1, a bicarbonate transporter involved in the regulation of the intracellular pH (pHi), also impacts ERK3 stability. We demonstrated that pHi variation finely regulates ERK3 degradation. We also explored the role of ERK3 in breast cancer progression in a second study. In breast cancer, high ERK3 expression correlates with a poor overall survival as well as a higher risk to develop metastases. ERK3 depletion triggers a severe decrease in the number of liver and lungs metastasis in a in vivo metastasis model. We also demonstrated that ERK3 is involved in cell migration in vitro. We showed for the first time that a kinase stability is modulated by pH variation. pH homeostasis is finely regulated in cells to assure important cellular functions such as proliferation, invasion, and survival. Therefore, ERK3 protein levels regulation by the pH raises new potential functions to explore for this kinase in a context pH dependent.