Camundongos da linhagem BALB/ c foram infectados com 5x106 leveduras de S. schenckii e acompanhados durante vinte e oito dias de infecção. Através da contagem do número de UFC nos baços fígados verificou-se que a carga fúngica nos órgãos dos animais diminui drasticamente na segunda semana de infecção. O teste ELISA revelou que nos órgãos destes animais a citocina IL-10 produzida em níveis mais elevados durante toda a infecção, assim modulando o controle da infecção. O padrão de proteínas secretadas pelas células leveduriformes de S. schenckii quando cultivadas em meio de cultura líquido e visualizado através de SDS-PAGE, apresentou bandas com pesos moleculares entre 97kDa e 20,1 kDa. Uma banda de 70 kDa foi reconhecida pelos soros dos animais infectados somente após a segunda semana de infecção e persistiu até o final desta. Os níveis de Ig total produzidos contra o antígeno solúvel e a proteína de 70 kDa aumentaram na segunda semana infecção e os títulos mantiveram-se durante a infecção. A isotipagem dos anticorpos revelou a predominância dos isotipos IgG1 e IgG3 para os dois antígenos testados. Notou-se que o aumento dos níveis de Ig contra o exoantígeno e a proteína imunorreativa de 70kDa, assim como o reconhecimento desta proteína, ocorreu inversamente proporcional à diminuição da carga fúngica nos órgão dos animais infectados. As proteínas secretadas pelas leveduras de S. schenckii, principalmente a proteína de 70 kDa, são capazes de ativar uma resposta humoral e conseqüente produção de altos níveis anticorpos e inibir a fagocitose do fungo pelos macrófagos. Desta maneira, estes antígenos modulam a resposta imune na esporotricose e contribuem para a patogenicidade do fungo. / BALB/c mice had been infected with 5xl06 yeasts of S. schenckii and followed during twenty and eight days of infection. Through the counting of the number of UFC in the livers and spleens it was verified that the fungaI load in the organs of the animais decreased drastically in the second week of infection. The ELISA test disclosed that in the organs of these animaIs the cytokine IL-10 was produced in leveIs more raised during alI the infection, thus modulating the control of the infection. The protein standard secreted for the yeasts of S. schenckii when cultivated in liquid medium and visualized through SDS-PAGE, it presented bands with molecular weights between 97 and 20,1 kDa. A band of 70 kDa was recognized for the sera of the infected animals after the second week of infection and persisted until the end of this. The leveIs of total Ig produced against the exoantigen and the protein of 70 kDa had increased in the second week of infection and the titers had been remained during the infection. The isotyping of the antibodies disclosed the predominance of the IgG1 and IgG3 for two tested antigens. One noticed that the increase of the leveIs of Ig against antigens and the recognition of the protein of 70 kDa occurred parallel with the reduction of the fungal load in the organs of the infected animals. The proteins secreted by the yeasts of S. schenckii, mainly the protein of 70 kDa, they are capable to activate a humoral response and consequent production high leveIs of antibodies and to inhibit phagocytosis of the fungi for the macrophages. In this way, these antigens modulate the immune response in sporotricosis and contribute for the pathogenic potential of fungi.

Orientadores: Ana Maria Marcondes, Newton Kara Jose / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-03T16:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Poterio_MarisaBraga_D.pdf: 773656 bytes, checksum: 72542a4d45c8aefe15115e27725a70ba (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a influência da mitomicina C (MMC) a 0,02%, aplicada em dose única por 3 minutos, na proliferação e diferenciação das células do epitélio da córnea de coelhas. Durante o procedimento cirúrgico aplicou-se MMC ou soro fisiológico (SF) sendo a droga a ser utilizada em cada animal (nos 2 olhos) definida por sorteio. A solução sorteada foi aplicada topicamente na episclera da região limbar temporal, com o tecido epitelial da córnea íntegro (em um olho) e após a desepitelização parcial (no olho contra-lateral). Os animais foram distribuídos em lotes A (20 olhos), B (16 olhos) e C (14 olhos) e sacrificados respectivamente no 4º, 15º e 45º dia de experimento. Para estimular a proliferação celular, os animais do lote C foram submetidos à desepitelização da córnea central 3 dias antes do dia do sacrifício. Para o estudo da diferenciação do epitélio da córnea empregou-se anticorpos monoclonais (AE-1, AE-3 e AE-5). Para a análise da proliferação celular utilizou-se solução de 5-bromo-2-deoxiuridina (BrdU), aplicada via endovenosa em todos os animais, 24 horas antes do sacrifício. Nas lâminas preparadas para o estudo com BrdU, sob microscopia óptica foram definidas as porções temporal, nasal e central da córnea. Em cada porção contou-se, o número de células com expressão positiva deste marcador, em 3 campos aleatórios, definidos com objetiva milimetrada. A média aritmética dos 3 campos foi utilizada para análise estatística. Os resultados das médias e desvios-padrão do número de células marcadas pela BrdU nos lotes A, B e C utilizando-se a técnica de desepitelização parcial prévia da córnea e solução fisiológica, nas regiões temporal, central e nasal foram respectivamente de 15,07 ± 12,18; 5,53 ± 5,11; 1,80 ± 2,37 no lote A, 11,17 ± 11,15; 8,50 ± 7,18; 9,67 ± 9,09 no lote B e 12,34 ± 9,02; 15,67 ± 5,84; 3,78 ± 2,80 no lote C. Com a mesma técnica cirúrgica usando-se a MMC, foram respectivamente: 6,60 ± 5,33; 3,80 ± 6,36 e 1,93 ± 2,14 no lote A, 3,09 ± 2,40; 4,34 ± 2,97 e 2,59 ± 0,63 no lote B e 5,83 ± 8,55; 6,17 ± 1,55; 4,42 ± 2,63 no lote C. Para a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução fisiológica as médias foram respectivamente: 13,80 ± 8,51; 7,47 ± 3,79; 3,07 ± 1,55 no lote A, 5,67 ± 4,49; 4,75 ± 2,13; 3,84 ± 3,45 no lote B e 6,78 ± 3,35; 11,67 ± 2,97; 3,78 ± 1,39 no lote C. Quando foi aplicado MMC e utilizada a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução, 8,73 ± 7,35; 7,60 ± 6,88; 3,27 ± 1,85 no lote A, 1,75 ± 0,78; 3,92 ± 3,06; 2,67 ± 1,98 no lote B e 2,83 ± 3,54; 2,50 ± 2,08; 8,75 ± 9,62 no lote C. As diferenças entre MMC e SF foram significativas nos animais dos lotes A, B e C, nas áreas central e temporal das córneas estudadas quando a técnica de desepitelização parcial prévia foi aplicada. Não houve diferença entre as drogas quando se utilizou a técnica de desepitelização parcial da córnea após a aplicação de solução. Nas lâminas coradas com o AE1/AE3 e AE5 não houve interferência na diferenciação celular independentemente da droga ou da técnica. Esses resultados sugerem que a MMC a 0,02% em aplicação única episcleral por 3 minutos atua restritamente no local onde as células foram expostas e tem um efeito prolongado sobre a proliferação celular, na técnica de desepitelização parcial prévia / Abstract: This study was performed to evaluate the influence of 0,02% mitomycin C (MMC), applied on a single dose for 3 minutes, in proliferation and differentiation of the cornea rabbits epithelium cells. During the surgery procedure, MMC or 0,9% physiologic saline solution (SF) was applied and the solution for each animal (both eyes) was performed by raffle. A topic solution was applied at episclera of the temporal limbic area, with intact epithelial tissue (one eye) and after partial corneal desepithelization (other eye). The animals were arranged in a group A (20 eyes), group B (16 eyes) and group C (14 eyes). They were sacrificed respectively at 4th , 15th and 45th days of the post-operative. To stimulate cell proliferation, the animals of group C were submitted to central corneal desepithelization 3 days before the sacrifice day. Cellular differentiation markers (AE1, AE3 and AE5) were used for differentiation study of the corneal epithelium. A cellular proliferation marker 5-Bromo-2-Deoxyuridine (BrdU) was applied by intravenous injection in all of the animals, 24hs before the sacrifice. In the slides labeled with BrdU technique, the nasal, temporal and central areas were determined under optic microscopy. The number of labeled cells was counted in 3 different fields of each area using millimeter lenses. The arithmetic means of the 3 different fields was used for statistical analysis. The mean and standard deviation of the number of labeled cells with BrdU marker in A, B and C groups using previous partial corneal desepithelization technique and SF at temporal, central and nasal area were respectively 15.07 ± 12.18; 5.53 ± 5.11; 1.80 ± 2.37 in group A, 11.17 ± 11.15; 8.50 ± 7.18; 9.67 ± 9.09 in group B e 12.34 ± 9.02; 15.67 ± 5.84; 3.78 ± 2.80 in group C. Using the same technique and MMC the results were: 6.60 ± 5.33; 3.80 ± 6.36 e 1.93 ± 2.14 in group A, 3.09 ± 2.40; 4.34 ± 2.97 e 2.59 ± 0.63 in group B e 5.83 ± 8.55; 6.17 ± 1.55; 4.42 ± 2.63 in group C. For the corneal desepithelization surgical technique after SF application, the results were: 13.80 ± 8.51; 7.47 ± 3.79; 3.07 ± 1.55 in group A, 5.67 ± 4.49; 4.75 ± 2.13; 3.84 ± 3.45 in group B e 6.78 ± 3.35; 11.67 ± 2.97; 3.78 ± 1.39 in group C. When MMC was applied in the same surgical technique, the results were: 8.73 ± 7.35; 7.60 ± 6.88; 3.27 ± 1.85 in group A, 1.75 ± 0.78; 3.92 ± 3.06; 2.67 ± 1.98 in group B e 2.83 ± 3.54; 2.50 ± 2.08; 8.75 ± 9.62 in group C. The difference between MMC and SF were statistically significant at central and temporal areas when previous partial corneal desepithelization was performed in all groups. There was no difference between drugs when corneal desepithelization technique was used after solution application. There was no difference between differentiation cells in the slides labeled with AE1, AE3 and AE5 when drugs or surgical technique were analysed. These results suggests that 0,02% MMC applied for 3 minutes at the episclera, acts only at the exposed cells and have late effect under the cell proliferation, when the previous partial desepithelization surgery was applied. / Doutorado / Oftalmologia / Doutor em Ciências Médicas

As células dendríticas (DCs) expressam receptores que reconhecem padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs), sendo capazes de capturar, processar e apresentar antígenos para os linfócitos. O contato com PAMPs induz a maturação das DCs e, consequentemente, a ativação dos linfócitos. Nossa estratégia para desenvolver vacinas é empregar anticorpos monoclonais contra os receptores endocíticos DEC205 e DCIR2, presentes nas subpopulações de DCs, em fusão com o antígeno de interesse. E estimular a maturação delas utilizando os adjuvantes poly I:C, CpG ODN 1826 e flagelina de S. Typhimurium . Imunizamos camundongos selvagens ou knockouts para os receptores TLR 3, 5 e 9 com adjuvantes e anticorpos quiméricos anti-DEC205, anti-DCIR2 ou isotipo controle (Iso) fundidos a proteína MSP119 de Plasmodium vivax. Avaliamos as repostas humoral e celular no grupos imunizados. Os resultados indicam que, seja qual for o adjuvante usado, a maioria dos parâmetros analisados aponta para a superioridade do direcionamento do antígeno para o receptor DEC205. / Dendritic cells (DCs) express receptors that recognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), and are able to capture, process and present antigens to lymphocytes. In recent years, a immunization strategy that directs antigens to DCs in vivo has been developing. This consists in the use of monoclonal antibodies fused with the antigen of interest. However, effective immune activation occurs mainly when the chimeric antibodies anti-DEC or anti-DCIR2 are administered in the presence of a DC maturation stimulus. We immunized wild type and knockout mice for TLR3, 5 and 9 with adjuvants (poly I:C, CpG ODN 1826 and flagellin from S. typhimurium) and chimeric anti-DEC205, anti-DCIR2 or isotype control fused to the Plasmodium vivax MSP119 protein. After the administration of two doses, we evaluated the humoral and cellular immune responses in the different groups. Our results indicate that, irrespectively of the adjuvant, the majority of parameters analyzed points out to the superiority of antigen targeting to the DEC205 receptor.

Uma biblioteca genômica de T. cruzi, construída no vetor λgt11, foi selecionada com um soro anti-tripomastigota. Dois clones, denominados B12 e B13, foram isolados, verificando-se que expressam proteínas que contém repetições seriadas de 20 aminoácidos (B12) e 12 aminoácidos (B13). Os insertos respectivos foram subclonados e expressos em fusão com β-galactosidase no vetor pMSgt11. A caracterização dos antígenos em T. cruzi foi feita por Western blot, utilizando soros de coelho contra as proteínas de fusão ou anticorpos imuno-selecionados de soros de pacientes chagásicos. Concluiu-se que B12 corresponde a antígenos de 230 kDa e 200 kDa expressos em tripomastigotas e epimastigotas, respectivamente. Anticorpos contra B13 reconheceram antígenos de 140 kDa e 116 kDa nas duas formas evolutivas. A imunoprecipitação de parasitas radioiodados indicou que o antígeno de 140 kDa está localizado na superfície de tripomastigotas, enquanto os demais polipeptídios correspondem a antígenos internos em ambos os estágios evolutivos. As proteínas recombinantes B12 e B13 foram avaliadas no diagnóstico sorológico da doença de Chagas por radioimunoensaio. Foi feito um levantamento com 128 soros, sendo 70 de pacientes chagásicos, 38 de pacientes com outras parasitoses e 20 de indivíduos normais. B12 e B13 obtiveram índices Kappa, que estimam a proporção de acertos verdadeiros, de 0,94 e 0,61, respectivamente. Esses resultados indicam que o antígeno B13 é um candidato potencial para ser empregado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas. Os insertos dos clones B12 e B13 foram usados como sondas para o isolamento de clones genômicos de uma biblioteca em λEMBL3.O mapa de restrição de uma região de 32 kb do genoma de T. cruzi indicou que os genes B12 e B13 são contíguos. Em ensaios de Northern blot B12 hibridizou com transcritos de 7,2 e 8,8 kb e B13 com mRNAs de 3,5 e 4,2 kb. O arranjo genômico de B12 e B13, deduzido de Southern blots de DNA e de cromossomos separados por eletroforese de campo pulsado, é compatível com genes de cópia única. A seqüência completa de um gene homólogo a B13 foi previamente descrita por Buschiazzo e cols. (Mol. Biochem. Parasitol, 54: 125-128, 1992), indicando que 75 repetições seriadas de 36 pb estão presentes em um único bloco. A seqüência completa do gene B12 e da região intergênica entre B12 e B13 foi determinada. B12 codifica uma proteína de 223 kDa contendo um domínio de 173 aminoácidos repetido 3 vezes ao longo da proteína e intercalado por blocos contendo um número variável de repetições seriadas de 20 aminoácidos. A estrutura de B12 é peculiar, uma vez que em outros antígenos de T. cruzi clonados as repetições seriadas estão contidas em um único bloco. Uma busca no banco de dados GenBank demonstrou homologia com proteínas ricas em prolina, incluindo a subunidade pesada da proteína triplet de neurofilamento (NF-H)de mamíferos. Um terceiro gene, denominado B11, e que hibridiza com um transcrito de 5,5 kb, foi localizado a cerca de 9,5 kb a montante de B12. Análises de Southem blot, feitas a partir de DNA de T. cruzi digerido com enzimas de restrição ou de cromossomos, demonstrou que B11 apresenta múltiplas cópias dispersas no genoma do parasita. A seqüência nucleotídica de um fragmento de 0,7 kb de B11 revelou homologia, a nível protéico, com o produto de TRS-1, um elemento semelhante a retrotransposon, isolado de T. brucei (Murphy et al.: J. Mol. Biol. , 195: 855-871, 1987). / Characterization of two contiguous antigen genes of Trypanosoma cruzi presenting immunodominant repetitive epitopes A genomic library of T. cruzi in the vector λgt11 was screened with antitrypomastigote serum. Two clones, named B12 and B13, were isolated and shown to express proteins which contain tandemly repeated units of 20 amino acids (B12) and 12 amino acids (B13). lnserts from clones B12 and B13 were subcloned in the vector pMSgt11 and expressed as β-galactosidase fusion proteins. The characterization of T. cruzi antigens coded by recombinants B12 and B13 was performed by Western blot, using either rabbit antisera to the fusion proteins or immunoselected antibodies from chagasic patients. It was concluded that B12 corresponds to antigens of 230 kDa and 200 kDa found, respectively, both in trypomastigotes and epimastigotes, whereas B13 corresponds to polypeptides of 140 kDa and 116 kDa expressed in both evolutive stages. Immunoprecipitation of radioiodinated parasites indicates that the 140 kDa antigen is located on the surface of trypomastigotes, whereas the other polypeptides correspond to internal antigens. B12 and B13 recombinant proteins were evaluated by radioimmunoassay in the serological diagnosis of Chagas\' disease. Analysis of 128 sera from 20 normal individuals, 70 chagasic patients and 38 patients with other parasitoses indicated kappa indexes of 0.94 and 0.61, respectively, for the B12 and B13 proteins. These data indicate that B13 polypeptide is a potential candidate for the diagnosis of Chagas\' disease. The inserts of B12 and B13 were used to isolate genomic clones from a λEMBL3 library. The restriction map of a region of 32 kb from T. cruzi genome indicated that B12 and B13 genes are contiguous. Northern blots showed that B12 corresponds to 7.2 and 8.8 kb mRNAs, whereas B13 hybridizes to transcripts of 3.5 and 4.2 kb. Southern blot analysis of total digested T. cruzi DNA and pulse field-separated chromosomes lead to the conclusion that B12 and B13 correspond to single copy genes. The entire sequence of a gene homologous to B13 was previously reported (Buschinazzo et aI.: MoI. Biochem. Parasitol. , 54: 125-128, 1992), indicating that ca. 75 units of the 36 bp repeat motif are organized in a single cluster. The complete sequence of B12 gene and the intergenic region between B12 and B13 genes were determined. B12 encodes a 223 kDa protein bearing a 173 amino acids motif repeated 3 times along the sequence and intercalated by clusters containing a variable number of tandemly repeated 20 amino acids units. The sequence of B12 gene is peculiar since in other cloned antigen genes of T. cruzi the repeat units are generally located in a single cluster. A search for homology, with the BLAST program, revealed some homology to proline-rich proteins, like mammalian heavy neurofilament subunit (NF-H). A third gene, denominated B11 and hybridizing to a 5.5 mRNA species, was identified 9.5 kb upstream from the 5\' end of B12 gene. Southern blots of digested DNA and pulse field-separated chromosomes hybridized with the B11 probe, indicating that B11 is a multicopy gene distributed in many chromosomes. The nucleotide sequence of a 0.7 kb fragment from B11 was determined and a search in GenBank database, performed with BLAST program, revealed a significant homology at the protein leveI to the product of TRS-l element, a retrotransposon-like sequence of T. brucei (Murphy et aI.:J MoI. Biol., 195:855-871).

A leptospirose é uma doença endêmica causada por Leptospiras. O genoma da Leptospira interrogans sorovar Copenhageni foi analisado para seleção de potenciais antígenos vacinais. Oito genes foram selecionados e clonados para expressão e purificação dos antígenos. A salmonela SL3261 foi usada como carregadora dos genes de leptospira em vetor pAEsox para expressão das proteínas in vivo. As salmonelas recombinantes induziram resposta imune quando administradas em camundongos por via intraperitoneal. Hamsters foram imunizados com as salmonelas, observando-se que a SLLIC10191 induziu proteção parcial no desafio com L. interrogans sorovar Pomona. Vetores híbridos foram construídos para expressão simultânea de dois antígenos em salmonelas in vivo. Observamos indução de anticorpos específicos, porém, os ensaios de desafio não foram conclusivos. Vários parâmetros do desafio com sorovar Copenhageni foram estudados, como contagem das bactérias e ajuste de dose, variação de virulência por passagens em cultivo e interferência da idade dos animais. / Leptospirosis is an endemic disease caused by Leptospira. The genome of Leptospira interrogans serovar Copenhageni was analyzed for screening potential vaccine antigens. Eight genes were selected and cloned for expression and purification. Salmonella SL3261 was used as carrier of the genes of leptospira in pAEsox vector for in vivo proteins expression of proteins in vivo. Recombinant Salmonella induced immune response when administered intraperitoneally in mice intraperitoneally. Hamsters were immunized with salmonella, resulting we observed that the SLLIC10191 induced partial protection against on challenge with L. interrogans serovar Pomona. Hybrid vectors were constructed for expression of two antigens simultaneously by salmonella in vivo. We observed induction of specific antibodies, however, the challenge tests were not conclusive. Several parameters of the challenge assay with serovar Copenhageni were studied, such as the counting of bacteria count and dose adjustment, changes in virulence by passages in culture and interference backgroundof from the age of animals.

O Monometoxi-polietilenoglicol succinimidil ácido propiônico (mPEG-SPA 5 e 20 kDa) foi analisado como adjuvante e inibidor da atividade neurotóxica da toxina tetânica (TxT) adsorvida ou não em Al(OH)3, à qual o polímero foi conjugado. Avaliou-se a toxicidade das amostras por DL50, demonstrando que a atividade neurotóxica da TxT foi inibida. A via subcutânea foi mais efetiva na indução de resposta à TxT tratada pelo mPEG-SPA e o efeito adjuvante do Al(OH)3 se deu pela intramuscular. Trinta cavalos foram submetidos a esquema de imunização seletiva, dividindo-se os dezoito escolhidos em grupos para imunização com TxT conjugada ao mPEG-SPA 5.000 e 5.000(2X) e TxT adsorvida ou não. Os soros dos cavalos foram analisados por ToBI Teste, que avaliou a evolução da resposta imune. Os soros também foram analisados por imunodifusão, eletroforese e immunoblotting, tendo este indicado uma provável superioridade antigênica da TxT Fluida relativamente aos adjuvantes. A conjugação mPEG-SPA provou ser efetiva na produção do soro antitetânico terapêutico para uso humano. / Monometoxypolyethylene glycol succinimidyl propionic acid (SPA-mPEG 5 and 20 kDa) was analyzed as adjuvant and inhibitor of tetanus toxin neurotoxic activity (TxT) adsorbed or not by Al(OH)3, to which the polymer was conjugated. The samples toxicity was evaluated by DL50, disclosing that TxT neurotoxic activity was inhibited. The subcutaneous inoculation was more effective in induction of response to TxT treated with SPA-mPEG and the adjuvant effect of Al(OH)3 was evidenced by the intramuscular. Thirty horses were submitted to a selective scheme of immunization and eighteen were divided in groups to be immunized with TxT conjugated to SPA-mPEG 5,000 and 5,000(2X) and TxT adsorbed or not. The horses sera were analysed by ToBI Test, which evaluated the immune response development. The sera were also analysed through immunodifusion, electrophoresis and immunoblotting and the last one indicates a probable antigenic superiority of TxT fluid relatively to the adjuvants. The SPA-mPEG conjugation proved to be effective for anti-tetanus human therapeutic serum production.

A leptospirose é uma zoonose mundial causada por bactéria do gênero Leptospira. O desenvolvimento de uma vacina de subunidade eficaz seria de grande interesse em saúde pública. Propusemos investigar 4 antigenos de Leptospira interrogans srv Copenhageni, genes LIC12659, LIC12660, LIC12631 e LIC10868, os quais foram amplificados e clonados nos vetores de expressão pAE e pAEsox. As proteínas VapB, VapC, VapBC e Sph2 foram expressas em E. coli e em salmonela SL3261 e purificadas por cromatografia de afinidade a metal. As atividades hemolítica de Sph2 e ribonucleásica de VapC não foram evidenciadas, possivelmente devido a diferenças estruturais entre as proteínas recombinantes e as nativas. Os clones de E. coli com os genes do módulo toxina-antitoxina vapBC sofreram os efeitos de inibição (vapC) e recuperação (vapBC) de crescimento, como descrito. As proteínas recombinantes, VapB purificada ou em salmonlea e Sph2, mostraram-se imunogênicas em camundongos e em hamsters. A imunização com Salmonela-VapB determinou a melhor proteção no teste de desafio. / Leptospirosis is a zoonosis worldwide distributed, caused by bacteria from the genus Leptospira. The development of an efficient vaccine of sub-unities would be of major interest for public health. We proposed to investigate 4 antigens from Leptospira interrogans srv Copenhageni, genes LIC12659, LIC12660, LIC12631 and LIC10868, which were amplified and cloned into expression vectors pAE and pAEsox. The proteins VapB, VapC, VapBC and Sph2 were expressed in E. coli and in salmonella SL3261, and purified by metal-affinity chromatography. The activities hemolytic of Sph2 and ribonuclease of VapC were not confirmed, possibly due to differences between native and recombinant proteins. The clones of E. coli with genes of the toxin-antitoxin module vapBC suffered inhibition (vapC) and recovery (vapBC) of growth rate as described. The recombinant proteins VapB purified or in salmonella and purified Sph2, showed to be immunogenic in mice and in hamsters. The immunization with Salmonella-VapB determined better protection on challenge assay.

A utilização de vacinas destaca-se como medida preventiva contra a leptospirose. Sete potenciais antígenos vacinais de L. interrogans sorovar Copenhageni foram estudados: LipL32, LipL23 e LipL22 (lipoproteínas), SphH e Sph4 (hemolisinas), AnkB (domínio anquirina) e OmpA76 (domínio OmpA). Os genes foram amplificados, clonados e as proteínas expressas em E.coli e Salmonella enterica para ensaios de imunização e desafio. As sete proteínas foram purificadas. No primeiro desafio, hamsters foram imunizados com a salmonela recombinante para expressar a OmpA76 e desafiados com sorovar Pomona. Sobreviveu 30% do grupo salmonela recombinante, 100% da vacina comercial e 10% dos controles. No segundo desafio, hamsters foram imunizados com pool das sete proteínas e desafiados com sorovar Copenhageni. Sobreviveram 30% do grupo pool de proteínas, 90% da vacina comercial, 100% da bacterina e 0% do grupo PBS. A LipL32, OmpA76, LipL23 e LipL22 reagiram com soros de hamsters infectados. Extratos de leptospiras foram reconhecidos pelos soros específicos contra LipL32, OmpA76 e LipL23. / Preventive measures as vaccines are the best strategies to combat leptospirosis. Seven potential vaccine candidates from L. iInterrogans serovar Copenhageni were studied: LipL32, LipL23 and LipL22 (lipoproteins), SphH e Sph4 (hemolysins), AnkB (ankyrin domain) and OmpA76 (OmpA domain). The genes were amplified, cloned and the proteins expressed in E. Coli e Salmonella enteric for challenge assays. In the first assay, hamsters were immunized with the recombinant salmonella to express OmpA76 in vivo, and challenged with serovar Pomona. The survival was 30% of the recombinant salmonella group, 100% of the commercial vaccine and 10% of the control groups. In the second assay, hamsters were immunized with a pool of the purified proteins and challenged with serovar Copenhageni. The survival was 30% of the group pool of proteins, 90% of the commercial vaccine, 100% of the bacterin and 0% of the PBS group. LipL32, OmpA76, LipL23 and LipL22 reacted with hamsters infected sera. Leptospiral extracts were recognized by specific sera against LipL32, OmpA76 and LipL23.

A demanda por transfusões sanguíneas tem aumentado no Brasil e o número de doações de sangue permanecem insuficientes. Há escassez de componentes de sangue para transfusão, principalmente de concentrados de células vermelhas do sangue. As células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCs) possuem um grande potencial para se tornar uma fonte de CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE, pois podem se diferenciar em qualquer tipo celular, incluindo CÉLULAS VERMELHAS DO SANGUE de fenótipo específico. O objetivo deste trabalho é a geração de hiPSCs para partir de células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) de candidatos a doação de sangue que possuem fenótipo eritrocitário de baixa imunogenicidade, bem como a diferenciação eritroide das hiPSCs geradas. As amostras de sangue periférico (PB) de 11 indivíduos foram coletadas e caracterizadas quanto ao genótipo para os seguintes antígenos eritrocitários: Sistema Rh (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02) e MNS (GYPB*03/GYPB*04). Outros antígenos de grupos sanguíneos distintos foram determinados por meio de fenotipagem. Duas amostras (PBMCs PB02 e PB12) foram selecionadas para a reprogramação devido ausência de múltiplos antígenos eritrocitários e, portanto, considerados de baixa imunogenicidade. Os PBMCs foram enriquecidos em eritroblastos e em seguida, as células foram transfectadas com os vetores episomais pEB-C5 e pEB-Tg e então, co-cultivados sobre fibroblastos de embriões murinos (MEFs) até o surgimento de colônias semelhantes a hiPSCs (hiPSC PB02 e hiPSC PB12). Estas colônias foram transferidas para condições de cultivo próprias e posteriormente caracterizadas quanto à sua pluripotência. A expressão dos genes de pluripotência OCT4, SOX2 e NANOG demonstrou níveis de expressão maior em comparação às linhagens não pluripotentes. As análises de imunofenotipagem por citometria de fluxo revelaram que em torno de 86% das células expressaram Nanog, 88% Oct4 e 88% Sox2. Os níveis de expressão de genes de pluripotência e marcadores foram consistentes com o estado indiferenciado encontrado em células pluripotentes conhecidas. A análise funcional para avaliação da pluripotência foi realizado pela injeção das hiPScs em camundongos imunodeficientes, demonstrando a formação de teratoma nas linhagens geradas. A metodologia para diferenciação hematopoética das hiPSCs geradas a partir dos corpos embrioides estão em progresso. O potencial de diferenciação foi confirmado durante a padronização deste processo, utilizando ensaio de formação de colônias em metilcelulose. Uma média de 10,5 colônias de precursores eritroide foram obtidas a partir de 50x103 hiPSC PB02 em diferenciação e uma colônia mista (mieloide e linfoide) a partir de 15x103 hiPSC PB12 foram obtidas. Neste trabalho foi possível gerar duas linhagens de hiPSCs com fenótipos de antígenos eritrocitários de interesse que podem ser mantidas em cultura por um longo período (26 passagens) e demonstram um potencial de diferenciação hematopoética. / The demand for blood transfusion has increased in Brazil and the number of blood donations remains insufficient. Therefore, there is a shortage of blood components for transfusion, mainly concentrates of red blood cells (RBCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have great potential to become a source of RBCs, because they can differentiate into every cellular type, including RBCs of a particular phenotype. The objective of this work was to generate hiPSC from mononuclear cells of peripheral blood (PBMCs) from blood donors who presented low immunogenic phenotype for transfusion, and erythroid differentiation of the generated hiPSCs. Peripheral blood samples from 11 individuals were collected and characterized for the following erythrocyte antigens: Rh system (RHCE*01/RHCE*02/RHCE*03/RHCE*04/RHCE*05), Kell (KEL*01/KEL*02), Duffy (FY*01/FY*02 and FY*02N.01), Kidd (JK*01/JK*02), MNS (GYPB*03/GYPB*04). Additionally, other antigens of different blood groups were determined by phenotyping. The samples PBMC PB02 and PBMC PB12 were chosen for iPS generation due to their multiple negative erythrocyte antigens. They were isolated, expanded into erythroblasts, and transfected using the reprogramming episomal vectors PEB-C5 and PEB-Tg. This population was co-cultured on mouse embryonic fibroblasts (MEFs) until the appearance of hiPSC like colonies (hiPSC PB02 and hiPSC PB12). These colonies were transferred to human embryonic stem cells (hESCs) culture conditions and characterized regarding their pluripotency. The expression of OCT4, SOX2 and NANOG pluripotency genes demonstrated that the expression of both lineages was higher in comparison with non-pluripotent lineages. Immunophenotyping performed by flow cytometry revealed that 86% of cells expressed Nanog, 88% Oct4 and 88% Sox2. Expression levels of pluripotency genes and markers were consistent with undifferentiated state found in known pluripotent cells. Functional analysis for pluripotency was achieved by the hiPSC injection in immunodeficient mice showing that both hiPSC cell lines were able to induce teratoma tumor. The hematopoietic differentiation potential was confirmed using methylcellulose assay, with an average of 10.5 erythroid colonies from 50x103 single cells and a mixed colonies of myeloid and lymphoid cells) and finally a colony composed of white cells from 15x103 PB12 hiPSC. In conclusion, it was possible to generate a hiPSC from a red blood cell phenotype that are negative for multiple antigens, and this cell line can be maintained for a long period in culture (26 passages) and show potential for hematopoietic differentiation.

Bacillus subtilis é uma alternativa ao emprego de Escherichia coli para a produção de proteínas recombinantes. O principal entrave à utilização de B.subtilis para esse fim é a baixa disponibilidade de sistemas de expressão. Nesse trabalho, testamos diferentes plasmídeos e promotores com o objetivo de desenvolver sistemas de expressão heteróloga eficientes. Ao fim do trabalho, propomos dois novos sistemas de expressão baseados do arcabouço do plasmídeo pMTL500E e nos promotores dos genes cdd e gsiB, ambos de B.subtilis. Os dois plasmídeos construídos apresentam expressão constitutiva e demonstraram desempenho superior no tocante à produção de proteínas heterólogas quando comparados ao único sistema comercialmente disponível, conhecido como pHT01. Em uma segunda parte do trabalho, propomos a utilização de Listeria innocua como veículo de entrega para antígenos vacinais. Por meio de ensaios ex-vivo e in vivo, demonstramos que essa bactéria possui potencial promissor para aplicações vacinais, inclusive quando comparada ao bem estabelecido B.subtilis. / Bacillus subtilis is an alternative to the use of Escherichia coli for the production of recombinant proteins. The main bottleneck to the use of B. subtilis for this purpose is the low availability of expression systems. In this study, we evaluated different plasmids and promoters with the aim of developing efficient heterologous expression systems. At the end of this work, we propose two new expression systems based on plasmid pMTL500E and the promoters from cdd and gsiB genes, both of them from B.subtilis. The two plasmids constructed exhibit constitutive expression and demonstrated superior performance regarding the production of heterologous proteins compared to the unique commercially available system, which is known as pHT01. In a second part of the work, we propose the use of Listeria innocua as a delivery vehicle for vaccine antigens. After ex-vivo and in-vivo experiments, we demonstrated that this bacterium has a promising potential for vaccine applications, even when compared to well established B.subtilis.