La transformation des cellules normales de l'organisme en un phénotype malin est souvent accompagnée de changements dans leur antigénicité. L'antigène Tn (GalNac-O-Ser/Thréo) est un antigène (Ag) glycopeptidique spécifique des tumeurs et exprimé à la membrane plasmique des cellules cancéreuses dans la majorité des carcinomes humains ainsi que dans certaines tumeurs hématologiques, tandis qu'il n'est pas détecté dans les cellules normales. Il représente donc une cible potentielle très intéressante pour l'immunothérapie passive par anticorps, car il n'est pas détectable dans les cellules normales, mais est démasqué dans environ 90% des cancers épithéliaux du fait d'une dérégulation des processus de glycosylation. Les anticorps monoclonaux (AcM) spécifiques d'antigènes exprimés à la membrane des cellules tumorales ont une efficacité prouvée dans le traitement de certains cancers. Ces AcM thérapeutiques sont particulièrement intéressants pour le traitement des cancers du fait de leur forte spécificité pour les cellules tumorales et de leur faible toxicité pour les cellules normales, contrairement aux chimiothérapies conventionnelles, mais leur mécanisme d'action est encore mal connu. L'AcM Chi-Tn est un anticorps chimérique homme/souris capable de se fixer de façon spécifique à l'antigène tumoral Tn, alors qu'il ne se fixe pas sur les cellules normales. Cet AcM pourrait donc être envisagé comme agent thérapeutique dans le traitement des cancers épithéliaux par immunothérapie passive.Nous nous sommes intéressés à l'AcM Chi-Tn non couplé en vue d'analyser son mécanisme d'action et d'évaluer son efficacité thérapeutique in vivo. Nous avons montré que l'AcM Chi-Tn seul ne possède pas d'effet toxique direct sur les lignées de cellules tumorales Tn-positives in vitro. Cependant, en présence de macrophages, cet AcM est capable d'induire la lyse de ces cellules par un mécanisme d'ADCC. In vivo, l'AcM Chi-Tn, associé à la cyclophosphamide, induit le rejet d'une tumeur du sein dans plus de 80% des souris. Cette inhibition de la croissance tumorale est abolie chez les souris déficientes pour la chaine associée aux récepteurs RFc activateurs, suggérant in vivo un mécanisme d'ADCC. Par l'étude microscopique du microenvironnement tumoral, nous avons observé que les cellules tumorales forment in vivo des synapses avec des macrophages, des neutrophiles, mais aussi des lymphocytes B. Des expériences de survie in vivo chez des souris déficientes pour différentes populations cellulaires montrent que les lymphocytes T semblent nécessaires à la protection des souris par Chi-Tn contre la tumeur. Ainsi, ces résultats confirment le rôle des effecteurs exprimant des RFc activateurs, mais aussi le rôle indispensable de la réponse immune adaptative pour assurer l'effet thérapeutique des AcM.Nous nous sommes également intéressés à l'utilisation potentielle de l'AcM Chi-Tn comme vecteur d'agents cytotoxiques. In vivo, dans un modèle de tumeurs solides chez la souris, des expériences de biodistribution montrent que l'AcM Chi-Tn est capable de cibler spécifiquement les zones tumorales, ce qui en fait un anticorps potentiellement utilisable comme vecteur de molécules toxiques. L'internalisation du complexe anticorps/antigène cible est un pré-requis nécessaire à l'utilisation de l'anticorps conjugué. Nous avons montré in vitro que l'AcM Chi-Tn est internalisé dans les endosomes précoces et de recyclage pendant un temps relativement long, faisant de cet AcM un bon candidat pour être couplé à des agents cytotoxiques. Durant ma thèse, nous avons couplé l'AcM Chi-Tn à la toxine saporine ou à la molécule cytotoxique auristatine F, et nous avons montré in vitro que ces conjugués sont cytotoxiques sur des lignées cellulaires Tn-positives.

L’efficacité d’une radioimmunothérapie (RIT) peut impliquer la coexistence des effets ciblés et des effets dit « non ciblés ». Les effets ciblés regroupent les effets biologiques observés dans les cellules ou tissus traversés par les particules ionisantes alors que les effets non-ciblés (ou bystander) sont observés dans des cellules qui n’ont pas été irradiées mais qui sont au proche voisinage des cellules exposées. Nous avons au cours de cette étude évalué in vitro et in vivo, la contribution des effets ciblés et non ciblés dans l’efficacité obtenue lors de la RIT alpha (212Pb, 213Bi) et de la RIT Auger (125I). Les effets ciblés ont été mesurés in vitro sur les cellules irradiées (cellules donneuses) alors que les effets bystander sont mesurés sur les cellules non irradiées (cellules receveuses) par une méthode de transfert de milieu. Elle consiste, à traiter les cellules receveuses dans un milieu de culture pré-incubé pendant 2h avec les cellules donneuses. Nos résultats montrent que la contribution des effets ciblés est nettement plus importante qu’en RIT alpha qu’Auger. En RIT alpha, on observe que les lésions de l’ADN (foci 53BP1et γ-H2AX) pourraient être différenciées en lésions complexes (sites multilésés = observation de gros foci) ou simples lésions (petit foci). Par contre en RIT Auger, ce sont les effets non ciblés qui prédominent sur les effets ciblés. L’utilisation d’inhibiteurs pharmacologiques des ROS montre l’implication du stress oxydatif dans ces effets non ciblés observés en RIT alpha et Auger. Ces effets non ciblés ont été observés également in vivo sur des souris athymiques porteuses de carcinoses péritonéales de petites tailles ; démontrant ainsi leur contribution dans l’efficacité thérapeutique finale observée après la RIT alpha et Auger. L’ensemble de ces résultats indiquent que même si des lésions de l’ADN sont produites après irradiation, que les effets non ciblés pourraient aussi contribuer à l’efficacité thérapeutique finale observée avec les anticorps couplés aux émetteurs de particules alpha ou d’électrons Auger. Ces résultats sont particulièrement intéressants pour la thérapie ciblée car les vecteurs utilisés n’ont pas souvent accès à l’ensemble des cellules constituant la tumeur. / We investigated in vitro and in vivo the relative contribution of targeted and non-targeted effects in the therapeutic efficacy against tumors of antibodies radiolabeled with alpha particle (212Pb, 213Bi) or Auger electron (125I) emitters. Targeted effects occurs in cells directly crossed by ionising particles while non-targeted effects are measured in cells neighbouring irradiated cells. Targeted effects were measured in vitro in cells exposed to antibodies radiolabeled with alpha or Auger emitters (donor cells) while non-targeted effects were investigated in recipient cells. Recipient cells consisted of cells not exposed to radiolabeled-mAbs, but grown in medium previously incubated for 2h with donor cells. We showed that the relative contribution of targeted effects versus non-targeted effects was higher during alpha RIT than Auger RIT. Alpha particles produced 53BP1 and gamma-H2AX foci in donor cells that could be differentiated in large, medium and small foci, while only small foci were observed in recipient cells. We assumed that large foci would correspond to locally multiply damage sites in DNA. Conversely, Auger RIT led predominantly to non-targeted effects compared with targeted effects. Use of radical scavengers showed that oxidative stress was involved in non-targeted effects. In vivo, we showed in athymic nude mice bearing tumor xenograft that non-targeted effects were also involved and participated to therapeutic efficacy of radiolabeled antibodies. These results indicate that although producing single DNA lesion, non-targeted effects can contribute to the therapeutic efficacy of mAbs radiolabeled with alpha particle or Auger electron emitters. These findings are particularly relevant for targeted therapy in which vectors cannot gain access to every tumor cell.

La sialylation des N-glycanes du fragment Fc des immunogobulines G (IgG) est une modification peu fréquente des IgG humaines. Pourtant, elle est l’objet de beaucoup d’attention depuis que deux articles fondateurs ont été publiés, qui montrent l’un que la sialylation des IgG diminue leur capacité à déclencher la cytotoxicité cellulaire dépendant de l’anticorps (ADCC), et l’autre que les IgG sialylées en α2,6 seraient la fraction efficace des IgG intraveineuses (IgIV) anti-inflammatoires. Les anticorps monoclonaux thérapeutiques, qui sont le plus souvent des IgG recombinantes produites en culture de cellules de mammifère, connaissent depuis la fin des années 90 un succès et une croissance phénoménaux sur le marché pharmaceutique. La maîtrise de la N-glycosylation du Fc des IgG est une clé de l’efficacité des anticorps monoclonaux. Si les IgG sialylées sont des molécules peu fréquentes in vivo, elles sont très rares en culture cellulaire. Dans cette étude, nous avons développé une méthode de production d’IgG avec une sialylation de type humain en cellules CHO. Nous avons travaillé principalement sur la mise au point d’une stratégie de production d’IgG sialylées par co-expression transitoire d’une IgG1 avec la β1,4-galactosyltransférase I (β4GTI) et la β-galactoside-α2,6-sialyltransférase I (ST6GalI). Nous avons montré que cette méthode permettait d’enrichir l’IgG1 en glycane fucosylé di-galactosylé mono-α2,6-sialylé G2FS(6)1, qui est le glycane sialylé présent sur les IgG humaines. Nous avons ensuite adapté cette méthode à la production d’IgG présentant des profils de glycosylation riches en acides sialiques, riches en galactose terminal, et/ou appauvris en fucosylation. L’analyse des profils de glycosylation obtenus par la co-expression de diverses combinaisons enzymatiques avec l’IgG1 native ou une version mutante de l’IgG1 (F243A), a permis de discuter des influences respectives de la sous-galactosylation des IgG1 en CHO et des contraintes structurales du Fc dans la limitation de la sialylation des IgG en CHO. Nous avons ensuite utilisé les IgG1 produites avec différents profils de glycosylation afin d’évaluer l’impact de la sialylation α2,6 sur l’interaction de l’IgG avec le récepteur FcγRIIIa, principal récepteur impliqué dans la réponse ADCC. Nous avons montré que la sialylation α2,6 augmentait la stabilité du complexe formé par l’IgG avec le FcγRIIIa, mais que ce bénéfice n’était pas directement traduit par une augmentation de l’efficacité ADCC de l’anticorps. Enfin, nous avons débuté le développement d’une plateforme d’expression stable d’IgG sialylées compatible avec une production à l’échelle industrielle. Nous avons obtenu une lignée capable de produire des IgG enrichies en G2FS(6)1 à hauteur de 400 mg/L. Cette étude a contribué à une meilleure compréhension de l’impact de la sialylation sur les fonctions effectrices des IgG, et a permis d’augmenter la maîtrise des techniques de modulation du profil de glycosylation des IgG en culture cellulaire. / Only a fraction of the N-glycans present on the Fc fragment of the human IgGs is sialylated. However, a new interest for sialylation has risen since two major articles were published, one showing that sialylation reduces the capacity of the antibody to trigger antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC), whereas the other showed that the IgGs carrying α2,6-sialic acids on their Fc N-glycans were responsible for the anti-inflammatory activity of intravenous immunoglobulins (IVIGs) injected at high doses. Therapeutic monoclonal antibodies (mAbs) are in majority recombinant IgGs produced in mammalian cell culture. Since the end of the nineties, mAbs have become a major class of pharmaceutical products, and their success is still growing. The control of Fc N-glycosylation is a key parameter for the improvement of the therapeutic efficacy of mAbs. Sialylated IgGs are found only as traces in the classic CHO cell culture processes. In this study, we developed a method for the production of IgGs with a human-like sialylation in CHO cells. We focused on a production strategy relying on the transient co-expression of an IgG1 with the β1,4-galactosyltransferase I (β4GTI) and the β-galactoside-α2,6-sialyltransferase I (ST6GalI). We showed that this method allowed the enrichment of the IgG1 glycoprofile in the fucosylated di-galactosylated mono-α2,6-sialylated glycane G2FS(6)1, which is the main sialylated glycan found in human IgGs. We then adapted this method to the production of highly galactosylated or highly sialylated IgGs with and without core-fucosylation. The analysis of the glycosylation profiles obtained using the various enzyme combinations co-expressed with the native IgG1 or the mutant IgG1 F243A allowed us to discuss the influence of the under-galactosylation found in IgGs produced in CHO cells versus the Fc structural constraints on the limitation of IgG sialylation in CHO cells. We used the IgG1 glycovariants produced with our method to assess the impact of Fc α2,6-sialylation on the interaction of the IgG with the receptor FcγRIIIa, which is the main receptor mediating the ADCC response. We showed that the presence of α2,6-sialylation in the Fc increased the stability of the IgG-FcγRIIIa complex. This benefit however did not translate into an improved ADCC capacity. Finally, we initiated the development of a stable expression platform for the production of sialylated IgGs at yields relevant for the industry. We obtained a cell line capable of producing IgGs enriched in G2FS(6)1 at 400 mg/L. This may eventually represent a novel approach to manufacture a recombinant IVIG surrogate. With this work, we contributed to a better understanding of the impact of sialylation on the effector functions of IgGs. We also improved our understanding of the techniques allowing for the modification and control of the glycosylation profile of IgGs in cell culture.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La majorité des ADC qui sont actuellement en clinique et en développement sont produits par une conjugaison chimique via les résidus lysine ou cystéine, menant à un produit hétérogène pour leur ratio toxine sur anticorps (DAR). L'objet des travaux de thèse a pour but de décrire la caractérisation in vitro et in vivo de nouveaux ADC optimisés et construits à partir de l'anticorps anti-CD30 cAC10, ayant le même squelette polypetidique que Adcetris, et de comparer les résultats à ce dernier. La transglutaminase bactérienne (BTG) a été utilisée pour conjuguer de manière site-spécifique la MMAE aux glutamines aux positions 295 et 297 du cAC10, amenant à des ADCs homogènes de DAR 4, TG-ADC. Des travaux préliminaires ont permis d’établir les conditions optimales de conjugaison avec un procédé en deux étapes. Les tests de cytotoxicité ont révélé des EC50 comparables entre Adcetris et les TG-ADC. Les données d’efficacité in vivo montrent une efficacité équivalente voire légèrement supérieure pour les TG-ADC que Adcetris. L'étude de biodistribution in vivo dans un modèle avec et sans tumeur est réalisé avec un 125-I TG-ADC et est comparé à 125I-Adcetris. Le TG ADC site spécifique montre une meilleure distribution tumorale. Adcetris a une distribution non médiée par la cible, dans le foie et la rate, plus importante. En ligne avec ces résultats, la dose maximale tolérée des TG ADC est significativement plus élevée que Adcetris chez le rat. Ces résultats suggèrent que les ADC homogènes ont une meilleure pharmacocinétique et un meilleur index thérapeutique comparés aux ADC avec des DAR hétérogènes. / Most ADC that are currently in clinical use or development produced by chemical conjugation of a toxin via either lysine or cysteine residues, inevitably leading to heterogeneous products with variable drug-to-antibody ratios (DARs). Here, we describe the in vitro and in vivo characterization of novel ADCs that are based on the anti-CD30 antibody cAC10, which has the same polypeptide backbone as Adcetris, and compare the results with the latter. Bacterial transglutaminase (BTG) was exploited to site-specifically conjugate derivatives of MMAE to the glutamines at position 295 and 297 of cAC10, yielding homogeneous ADCs with a DAR of 4, TG-ADC. Preliminary works have led to define optimal conditions for conjugation, but also define a two step process. In vitro cell toxicity experiments revealed comparable EC50-values for Adcetris and TG-ADC. The efficacy data have shown slightly better efficacy for TG-ADC compared to Adcetris. Quantitative time-dependent in vivo biodistribution studies in normal and xenografted mice were performed with a selected 125I TG ADC and compared with 125I-Adcetris. Adcetris has an higher liver and spleen unspecific uptakes. In line with these results, the maximum tolerated dose of the BTG-coupled ADC (> 60 mg/kg) was significantly higher than that of ADCETRIS® (18 mg/kg) in rats. These results suggest that homogenous ADCs display improved pharmacokinetics and better therapeutic indexes compared to chemically modified ADCs with variable DARs.

Lorsqu'il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d'une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d'ITK est l'imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C'est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L'inhibition de l'activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d'une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d'intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l'activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l'oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l'utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l'imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants.

Lorsqu'il est surexprimé ou activé constitutivement par mutation, le récepteur tyrosine kinase KIT est impliqué dans le développement de pathologies prolifératives comme les mastocytoses, les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) et certaines leucémies. La voie de signalisation KIT représente donc une cible thérapeutique majeure en oncologie. Le développement d'une nouvelle classe de molécules pharmacologiques appelées inhibiteurs de tyrosine kinase (ITK) est en plein essor. Un exemple majeur d'ITK est l'imatinib qui cible, entre autre, KIT et est efficace dans la plupart des GIST. Cependant, le traitement aux ITK est souvent confronté au phénomène de résistance primaire ou acquise par mutation secondaire. C'est pourquoi nous cherchons à développer de nouveaux composés ciblant KIT ou les voies de transductions activées par ses formes oncogéniques, et ce par 3 approches.Nous avons récemment montré que les mutants oncogéniques de KIT ont une localisation intracellulaire alors que KIT sauvage est exprimé à la membrane. L'inhibition de l'activité kinase des mutants restaure une localisation normale. A partir de cette observation, nous avons créé et validé un test de criblage par cytométrie mesurant la relocalisation de KIT muté à la surface cellulaire. Le criblage d'une chimiothèque nous a permis de sélectionner de nouveaux inhibiteurs de la signalisation KIT actifs sur des lignées cellulaires mutées pour KIT.Nous avons utilisé la technique du phage display pour sélectionner des anticorps au format scFv et VHH spécifiques de la partie intracellulaire de KIT mutant. Lors de leur expression dans le cytosol (on parle alors d'intrabodies), leur fixation au niveau de KIT inhibe soit directement l'activité kinase, soit le recrutement de partenaires de signalisation. Nous avons obtenu des intrabodies de différentes spécificités vis-à-vis des formes de KIT dont la caractérisation fonctionnelle est en cours Les intrabodies inhibiteurs seront utilisés pour cribler des chimiothèques par ELISA. Les molécules chimiques recherchées empêcheront la fixation des intrabodies sur la région intracellulaire de KIT. On sélectionnera donc des molécules inhibant potentiellement l'oncogénicité de KIT.Nous avons développé des anticorps au format scFv-Fc par phage display qui reconnaissent le domaine extracellulaire de KIT. Deux des anticorps sélectionnés inhibent donc la signalisation induite par le SCF. Dans des lignées de leucémie exprimant KIT WT, nous avons montré que l'utilisation de ces anticorps entraîne une diminution de la viabilité cellulaire. De plus, ils diminuent également la prolifération de lignées de leucémie à mastocytes sensibles et résistantes à l'imatinib (HMC11 et HMC12, respectivement). Ils représentent donc des outils thérapeutiques potentiels pour le traitement des pathologies impliquant KIT ainsi que pour contourner la résistance aux ITK de certains mutants.

En Afrique, les fièvres récurrentes causées par différentes espèces bactériennes du genre Borrelia sont des infections négligées transmises par les arthropodes et sont responsables de manifestations cliniques variant d’une septicémie mortelle à des formes plus bénignes et d'autres manifestations cliniques, en particulier d'avortement chez les femmes enceintes. Quatre espèces différentes de Borrelia, initialement séparées les unes des autres sur la base de leur répartition géographique et de leur vecteur, sont actuellement cultivées de prélèvements cliniques et de vecteurs : Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et Borrelia hispanica. Ces différentes espèces circulent sur le continent africain en parallèle avec au moins six espèces non encore cultivées et détectées dans des vecteurs. Notre travail est une contribution à l’investigation des fièvres récurrentes à Borrelia en Afrique. Dans cette perspective, nous avons mis au point la détection rapide en spectrométrie de masse MALDI-TOF des Borrelia dans les tiques en créant au préalable une base de données Borrelia MALDI-TOF-MS. La base de données de Borrelia et un logiciel de soustraction IHU ont été utilisés pour détecter B. crocidurae dans 20 tiques Ornithodoros sonrai, y compris huit tiques qui ont été testées positives pour B. crocidurae par PCR-séquençage, ce qui ouvre la voie à l'utilisation du MALDI-TOF-MS pour la double identification des vecteurs et des agents pathogènes vectorisés, dont il s’agissait du premier exemple maintenant étendu à d’autres modèles dans notre laboratoire. / In Africa, relapsing fever borreliae are neglected arthropod-borne pathogens causing mild to deadly septicemia and other clinical manifestations, particularly abortion in pregnant women. Four different species of Borrelia, initially distinguished one from another on the basis of geography and vector, are currently cultured causative agents in Africa: Borrelia crocidurae, Borrelia duttonii, Borrelia recurrentis et Borrelia hispanica. These different species are circulating in parallel to at least six not-yet cultured species in vectors. Our work consisted in the investigation of recurrent fevers borreliosis in Africa. We have developed rapid detection in MALDI-TOF mass spectrometry of Borrelia in ticks by creating a prior a Borrelia MALDI-TOF-MS database. The Borrelia database and a custom software program that subtracts the uninfected O. sonrai profile were used to detect B. crocidurae in 20 O. sonrai ticks, including eight ticks that tested positive for B. crocidurae by PCR-sequencing; which paves the way for the use of MALDI-TOF-MS for the dual identification of vectors and vectorized pathogens. We have also illustrates a non-specialized circulation of B. crocidurae borreliae within a collection of 35 O. sonrai ticks in West Africa. These ticks were genotyped by 16S rRNA mitochondrial gene sequencing while B. crocidurae was genotyped by Multispacer Sequence Typing (MST). The 35 ticks were grouped into 12 genotypes strong geographic structuring and 35 B. crocidurae into 29 genotypes without strict geographic structure. One O. sonrai genotype carried several B. crocidurae genotypes and one B. crocidurae genotype was found in different O. sonrai genotypes.

La manipulation des anticorps monoclonaux thérapeutiques (Acm) reconstitués avant administration aux patients est susceptible d’entraîner leurs dégradations physiques (e.g. dénaturation, agrégation). Ceci peut avoir un impact sur leur efficacité et sécurité. Afin d’étudier la conformation et la stabilité des Acms reconstitués, nous avons développé des méthodes séparatives couplées avec la spectrométrie de masse (MS) en conditions non-dénaturantes (« native »). Une méthode de CZE-native MS utilisant un revêtement constitué d’une triple-couche ionique a été développée pour séparer et détecter les différentes conformations (monomère natifs, dénaturés, dimères) d’Infliximab. Une étude approfondie réalisée en analysant de l’infliximab digéré a permis d’établir que la formation du dimère était liée à la dénaturation du fragment Fab. L’intérêt des revêtements statiques (commerciaux et préparés in situ) ont été étudiés pour analyser les Acms par CZE-UV et CZE-MS. Nos résultats ont montré l’intérêt d’un nouveau revêtement monolithique. Un couplage simultané de la SEC avec la MS et un détecteur de fluorescence a été développé. Nous avons ainsi identifié les conditions expérimentales qui entraînaient des dénaturations et des dimérisations artificielles. Cette méthode a ensuite été également appliquée avec succès pour la caractérisation d’un échantillon de Trastuzumab stressé. Une méthode orthogonale en utilisant la SEC-mobilité ionique-MS a été employé pour évaluer la proportion de monomères dénaturés par rapport aux monomères natifs. La méthodologie ainsi développée permettra la détection de très faibles taux d'anticorps dégradés dans des poches d'infusion. Ceci permettra de définir les paramètres critiques à maîtriser lors de la reconstitution et la manipulation d’anticorps à usage hospitalier. / Manufacturing and manipulation of therapeutic monoclonal antibodies (mAb) in the hospital before administration to patient is prone to induce their physical degradations (e.g., denaturation, aggregation). This may impact their efficacy and safety. To study the stability of mAbs, capillary zone electrophoresis (CZE) and size exclusion chromatography (SEC), coupled to native mass spectrometry (MS) have been developed. CZE-native MS method using a triple-layer coating was developed to detect and separate different conformational states (unfolded monomer, dimer) of Infliximab in a single analysis. In-depth study with digested infliximab confirmed that dimer formation was related to the Fab fragment. We also focused on covalent coatings in order to find the more adapted coating to analyze mAbs by CZE-UV and CZE-MS. We also developed for SEC a simultaneous coupling with MS and a fluorescence detector to detect the degraded mAbs. We have identified the biases inducing conformational changes (e.g. dimerization, denaturation) that may arise during native MS. We also successfully characterized aggregates and denatured monomer in stressed Trastuzumab sample. In addition, the orthogonal method SEC-ion mobility-MS has been employed to separate and measure the denatured monomers compared to their related native conformations. Moreover, the developed system enables the detection of a very low levels of degraded mAbs in infusion bags. It allows to define the critical parameters to be controlled during the reconstitution and manipulation of therapeutic mAbs in hospital.

Le CD154 est une glycoprotéine transmembranaire de type II, appartenant à la famille des facteurs de nécrose tumorale (TNF) et s’exprime d’une façon transitoire à la surface des lymphocytes T activés et des plaquettes. Notre laboratoire a démontré que la forme membranaire devient soluble suite à un clivage enzymatique par les métalloprotéinases (ADAM-10 et ADAM-17). De plus, il a été montré que le CD154 soluble (sCD154) peut aussi être relâché du milieu intracellulaire sans qu’il soit exprimé à la surface cellulaire suite à un clivage enzymatique intracellulaire entre les résidus acide Glutamique 112 (E112) et Méthionine 113 (M113). Les deux formes du CD154, soluble et membranaire, possèdent une structure trimérique nécessaire pour son activité biologique. Son récepteur principal, le CD40, est une glycoprotéine de type I appartenant à la famille des récepteurs des TNFs. Il est exprimé constitutivement à la surface des cellules B, des cellules dendritiques, des macrophages, des basophiles, des plaquettes, ainsi qu’à la surface de certaines cellules non hématopoïétiques telles que les cellules endothéliales, les fibroblastes et les cellules du muscle lisse vasculaire. Outre le CD40, quatre autres récepteurs appartenant à la famille des intégrines, ont été identifiés: l’αIIbβ3, l’α5β1, l’αMβ2, l’αvβ3 et l’α4β1. Les études de notre laboratoire ont démontré que l’interaction du CD154 avec ses récepteurs induit une activation bidirectionnelle, cependant, on a observé que le clivage du CD154 de la membrane cellulaire reste une propriété privilège au CD40. Le travail illustré dans cette thèse consiste à étudier l’inhibition du clivage enzymatique du CD154 et son effet dans la régulation de la réponse immune. Les résultats générés ci-dessous montrent que le CD154 résistant au clivage est un stimulant plus important que sa forme clivable. En effet, la double mutation des résidus E112 et M113 du CD154 abolit sa libération spontanée du milieu intracellulaire ainsi que son clivage de la membrane médié par le CD40 sans affecter sa liaison à ce dernier. Ce mutant s'est avéré capable d'induire une réponse apoptotique plus importante des cellules B, des réponses prolifératives plus prononcées et déclenche la différenciation des cellules B humaines d’une manière plus significative que le CD154-WT. De plus, notre étude met en évidence le développement et la caractérisation d'un anticorps monoclonal (mAb), le Clone 8, capable d'inhiber la libération/le clivage du CD154 à partir des cellules et ainsi de le maintenir à la surface cellulaire et d'augmenter sa puissance en tant qu'activateur des réponses induites par le CD40. Le Clone 8 est capable de lier le CD154 murin et d’inhiber son clivage de la surface cellulaire de la même façon que celle étudiée dans les cellules humaines. Ces travaux vont permettre le passage de cet anticorps bloquant le clivage du CD154 au stade des essais cliniques afin de mettre en place un nouveau traitement efficace pour les maladies auto-immunes et le cancer. / CD154 is a type II transmembrane glycoprotein belonging to the tumor necrosis factor superfamily (TNF), that is transiently expressed on the surface of activated T cells and platelets. We have demonstrated that this membrane form becomes soluble following an enzymatic cleavage by metalloproteinases (ADAM-10 and ADAM-17). CD154 also exists in a soluble form originating from a direct release of an intracellular processing without being expressed on the cell surface. This fragment is the result of an intracellular enzymatic cleavage between the residues Glutamic acid at position 112 (E112) and Methionine at position 113 (M113). Both soluble and membrane-bound forms of CD154 occur as non-covalently-linked homotrimers a property conveying to CD154 its biological activity. Its main receptor, CD40, is a type I glycoprotein belonging to the TNF receptor family. It is constitutively expressed on the surface of immune and non-immune cells including B cells, dendritic cells, macrophages, basophils, endothelial cells, fibroblasts, and vascular smooth muscle cells. CD154 was also shown to bind other receptors: αIIbβ3, α5β1, αMβ2, αvβ3 and α4β1 integrin. We have shown that the interaction of CD154 with its receptors induces bidirectional activation, however, only CD40 was capable of inducing the cleavage of CD154 from T cell surface. Our results here consist in studying the inhibition of the enzymatic cleavage of CD154 and its effect in the regulation of the immune response. Our data show that the cleavage resistant CD154 is a more potent stimulant than its cleavable form. Indeed, the double mutation of residues E112 and M113 of CD154 abolishes its spontaneous release from the intracellular milieu as well as its cleavage from the membrane. This mutant was found to be able to induce a stronger apoptotic response from B cells, induce more pronounced proliferative responses and trigger human B cell differentiation in a more significant way than CD154-WT. In addition, our study highlights the development and characterization of a monoclonal antibody (mAb), Clone 8, capable of inhibiting the release/cleavage of CD154 from cells and thus maintain it on the cell surface and increase its potency as an activator of CD40-induced responses. Clone 8 binds murine CD154 and inhibit its cell surface cleavage in the same way that in human cells. This study will allow the passage of this antibody blocking the cleavage of CD154 to the stage of clinical trials to develop a novel tool to treat diseases in which CD154 is implicated.