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Imobilização da enzima butirilcolinesterase e o desenvolvimento de métodos de triagem para inibidores seletivos / Screening of selective inhibitors by immobilized capillary reactors based on butyrylcholinesterase enzymes: Development and application

Vilela, Adriana Ferreira Lopes 22 February 2013 (has links)
A descoberta de inibidores seletivos é extremamente importante para o desenvolvimento de novos fármacos que possam ser usados no tratamento de pacientes diagnosticados com a doença de Alzheimer (DA). Neste contexto, o desenvolvimento de métodos de triagem para a identificação de novos compostos biologicamente ativos se torna interessante. Butirilcolinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) é uma serina hidroxilase que está classicamente associada à hidrólise do neurotransmissor acetilcolina (ACh) formando colina e ácido acético. Este trabalho descreve a imobilização covalente da BChE de soro humano nas paredes internas de capilares de sílica fundida utilizando o agente espaçador glutaraldeído, e sua aplicação na triagem de inibidores seletivos. O ICER-BChE resultante foi conectado a um sistema de cromatografia líquida de alta eficiência com monitoramento on line da atividade catalítica, envolvendo detecção UV. Após os estudos das melhores condições cromatográficas, variações de pH e vazão e a influência de solventes orgânicos na atividade enzimática o método foi validado com o uso de inibidores padrões. O maior valor obtido com o ICER-BChE no parâmetro cinético, constante de Michaelis KM = 33,6 ± 6,9 mM, comparado com a enzima em solução, KM = 0,12 ± 0,02 mM, evidencia o efeito da imobilização sobre a afinidade pelo substrato. No entanto, houve retenção da atividade catalítica e seletividade frente a inibidores padrão. O método foi aplicado na triagem de novos ligantes utilizando cinco coleções de diferentes classes de compostos, entre derivados cumarínicos, complexos metálicos com cobre (Cu), complexos metálicos com cobalto (Co) e zinco (Zn), glicosídeos, e derivados de fenilpropanóides e ácido barbitúrico. Desta triagem foram selecionados sete compostos promissores com os quais foram realizados os estudos sobre a potência mínima inibitória (IC50) e destes quatro foram escolhidos para estudos de mecanismos de ação utilizando o ICER-BChE. Dos complexos metálicos os melhores compostos foram o HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), o NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) ambos com mecanismo competitivo o HesFCu (IC50 = 13,6 ± 2,9 µM), o NNINABCu (IC50 = 94,8 ± 16) e o NarFCu (IC50 = 81,7 ± 13). Dos derivados cumarínicos os compostos 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) e 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) apresentaram mecanismo incompetitivo. Os resultados demonstraram que a abordagem proposta é útil na triagem on line de inibidores seletivos, pois fornece resultados rápidos, precisos e reprodutíveis. / The discovery of selective inhibitors is extremely important for the development of drugs that can be used in the treatment of patients diagnosed with the Alzheimer disease (AD). In this context, the development of screening methods for the identification of new, biologically active compounds is a challenging task. Butyrylcholinesterase (BChE, EC 3.1.1.8) is a serine hydroxylase that is classically associated with the hydrolysis of the neurotransmitter acetylcholine (ACh), which yields choline and acetic acid. This paper describes the development of capillary enzyme reactors (ICERs) containing BChE from the human serum, covalently immobilized onto silica fused capillaries, using glutaraldehyde as spacer, and its application in the screening of selective inhibitors. The resulting BChE-ICER was connected to a liquid chromatography system high efficiency where monitoring of activity was online involving UV detection. After studying the best chromatographic conditions, pH variations, flow-rate and the influence of organic solvents on enzyme activity method was validated using standard inhibitors. The higher value obtained with the BChE-ICER in kinetic parameter, constant Michaelis KM = 33.6 ± 6.9 mM, compared with the enzyme in solution, KM = 0.12 ± 0.02 mM, shows the effect of immobilized on the affinity substrate. However, there was retention of catalytic activity and selectivity towards standard inhibitors. The method was applied in the screening of new ligands using collections of five different compounds, among coumarin derivatives, metal complexes with copper (Cu) metal complexes with cobalt (Co) and zinc (Zn), glycosides, phenylpropanoids and derivatives, and barbituric acid. These screenings were selected seven promising compounds with which the studies were made on the minimum inhibitory potency (IC50) and these four were chosen for studies of mechanisms of action using the ICER-BChE. Of the compounds metal complexes best were HPTBCu (IC50 = 8,74 ± 1,5 µM, Ki = 9,6 ± 0,5 M), NarBCu (IC50 = 8,0 ± 1,4 µM, Ki = 2,0 ± 0,1 M) both competitive mechanism, the HesFCu (IC50 = 13.6 ± 2.9 µM), NNINABCu (IC50 = 94.8 ± 16 µM) and NarFCu (IC50 = 81.7 ± 13 µM). Of coumarin derivatives, 17 (IC50 =109 ± 21 µM, Ki = 108 ± 10 M) and 19 (IC50 =128 ± 28 µM, Ki =36.0 ± 5.0 M) showed mechanism uncompetitive. The results demonstrated that the proposed approach is useful in screening for selective inhibitors online because it provides quick results, accurate and reproducible.
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Efeitos da administração de melatonina sobre a resposta imune em ratos Wistar na amebíase hepática / Effects of melatonin administration on the immune response of Wistar rats in amebic liver abscess

Fernandez, Vania 04 October 2012 (has links)
Os trofozoítos de Entamoeba histolytica após se evadirem de uma complexa resposta imune ao nível da mucosa intestinal, invadem o epitélio, podendo disseminar-se pela circulação portal, atingindo o fígado e outros órgãos. A amebíase hepática é a forma mais comum de amebíase extraintestinal e corresponde a menos de 1% dos casos clínicos de amebíase. A modulação das respostas imunológicas frente à administração de substâncias farmacologicamente ativas em modelos experimentais infectados por diferentes patógenos tem contribuído de maneira importante nas investigações de terapias alternativas para colaborar no tratamento das diferentes doenças parasitárias. A melatonina (N-acetil-5- metoxitriptamina) é uma indolamina cuja síntese ocorre na glândula pineal e em vários locais extrapineais, como, as células do sistema imune, retina, medula óssea, pele, leucócitos, e trato gastrointestinal. É uma molécula pleiotrópica que possui atividades imunoestimulatórias e efeitos pró e anti-inflamatórios. O presente estudo teve como objetivo avaliar um possível efeito imunomodulatório subseqüente à administração oral de melatonina em ratos da linhagem Wistar machos infectados no fígado pela cepa HM1-IMSS de Entamoeba histolytica na fase aguda da amebíase hepática experimental. Foram utilizados vários parâmetros como: dosagens das citocinas IFN-?, IL-4, análise por citometria de fluxo das populações celulares TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+ e produção de óxido nítrico. Através dos resultados obtidos, podemos concluir que a melatonina exerceu seus efeitos imunomodulatórios, ora induzindo uma reposta imune mais eficaz de forma a minimizar os efeitos patogênicos da infecção ao mesmo tempo em que exerceu um papel anti-inflamatório na tentativa de manter a homeostase imunológica do hospedeiro, evitando uma exacerbação dessas respostas que certamente iriam influenciar o grau de patogenicidade desta parasitose. / The trophozoites of Entamoeba histolytica after evade a complex immune response at the intestinal mucosal level, invade the epithelial layer and may spread into the portal circulation reaching the liver and other organs. The amoebic liver abscess (ALA) is the most common form of the extraintestinal amebiasis and is less than 1% of clinical cases of human amoebiasis. The modulation of immune responses by the administration of pharmacological active substances in experimental models infected by different pathogens has contributed in investigations of alternative therapies in order to aid the treatment of various parasitic diseases. Melatonin (N-acetyl-5-methoxytryptamine) is an indolamine whose synthesis occurs in the pineal gland and in several extra-pineal locations such as the immune system cells, retina, bone marrow, skin, leukocytes, and gastrointestinal tract. This molecule has pleiotropic effects with immunoenhancing actions besides pro and anti inflammatory effects. The present study aimed to evaluate a possible immunomodulatory effect following the oral administration of melatonin in male Wistar rats infected with the strain HM1-IMSS of E. histolytica during the acute phase of experimental amebic liver abscess. Several immune parameters were evaluated such as of cytokines IFN-?, IL-4, flow cytometry analysis of cell populations TCD3+, TCD4+, TCD8+, CD45+, CD161+, and nitric oxide production. According to our results, we can conclude that melatonin exerted its immunomodulatory actions, once triggering a more accurate host´s immune response reducing the pathogenic effects from the infection and at the same time, exerting an anti-inflammatory role in the attempt to control host´s immune homeostasis, avoiding an exacerbation of these responses that would certainly influence the degree of pathogenicity of this parasitosis.
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Caracterização funcional e estrutural do sistema Tiorredoxina mitocondrial de Saccharomyces cerevisiae / Functional and structural characterization of the mitochondrial thioredoxin system from Saccharomyces cerevisiae

Nakamatsu, Eduardo Hiroshi 14 September 2012 (has links)
NADPH, tiorredoxina e tioredoxina redutase compõem o sistema tiorredoxina, estão envolvidos na redução de ligações específicas de dissulfetos que desempenham um grande número de funções biológicas, tais como: síntese de DNA, defesa contra o estresse oxidativo, apoptose e sinalização redox. Tem sido demonstrado que as interações tioredoxina redutase-tiorredoxina são espécies específicas, sendo assim, investigamos aqui a especificidade dos substratos da tioredoxina redutase 2 mitocondrial (ScTrxR2) de Saccharomyces cerevisiae frente a outras tioredoxinas. ScTrxR2 especificamente reduziu as tiorredoxinas de levedura (tiorredoxina 1 = ScTrx1, tiorredoxina 2 = ScTrx2 e tiorredoxina = ScTrx3), mas não conseguiu reduzir a tiorredoxina de Homo sapiens e a de Escherichia coli. Além disso, ScTrxR2 exibiu eficiência catalítica semelhante para ScTrx3, que está localizado na mitocôndria e ScTrx1 e ScTrx2 que estão localizadas no citosol. Para compreender as características deste fenômeno, resolvemos a estrutura cristalográfica da ScTrxR2 a 1,9 Å de resolução por meio de substituição molecular utilizando as coordenadas de ScTrxR1 (PDB Id = 3ITJ) como modelo (Oliveira et al., 2010). A ScTrxR2 é uma proteína de dois domínios (domínio de ligação do NADPH e domínio de ligação do FAD). As tiorredoxinas redutases de baixo peso molecular podem adotar duas conformações: flavina oxidada (FO) e flavina reduzida (FR), estando esta última envolvida na interação física com as tiorredoxinas. A estrutura cristalográfica da ScTrxR2 obtida por nós está na conformação FO. Posteriormente, modelamos a conformação FR (Flavina reduzida) da ScTrxR2, a partir da estrutura do cristal na conformação FO, e utilizando a estrutura cristalográfica da tiorredoxina redutase de E. coli complexada com a tiorredoxina (PDB 1F6M). Pela análises dessas estruturas, levantamos hipóteses de que alguns resíduos de aminoácidos podem estar envolvidos nas interações espécie-específicas entre tiorredoxina redutase e tiorredoxina. Com isso, geramos mutantes sítio dirigidos das Trx de levedura e da ScTrxR2 e através de ensaios enzimáticos e bioquímicos com estas proteínas mutantes estamos testando as hipóteses levantadas sobre possíveis amino ácidos envolvidos em interações entre tiorredoxina e tiorredoxina redutase / NADPH, thioredoxin and thioredoxin reductase, comprising the thioredoxin system, are involved in the reduction of specific disulfides linkages that play a large number of biological roles, such as: DNA synthesis, defense against oxidative stress, apoptosis and redox signaling. It has been shown that thioredoxin reductase-thioredoxin interactions are species-specific, therefore we have investigated here the substrate specificity of mitochondrial Thioredoxin reductase 2 (ScTrxR2) from Saccharomyces cerevisiae towards other thioredoxins. ScTrxR2 specifically reduced yeast thioredoxins (thioredoxin 1 = ScTrx1, thioredoxin 2 = ScTrx2 and thioredoxin = ScTrx3), but failed to reduce thioredoxin from Homo sapiens and from Escherichia coli. Furthermore, ScTrxR2 displayed similar catalytic efficiency towards ScTrx3, which is located in the mitochondria and ScTrx1 and ScTrx2 that are located in the cytosol. To understand the features of this phenomenon, we have solved the crystallographic structure of ScTrxR2 at 1,9Å resolution through molecular replacement using ScTrxR1 as search model (Oliveira et al., 2010)1. ScTrxR2 is a two-domain protein (NADPH and FAD binding domains). Low molecular weight thioredoxin reductases can adopt two conformations: flavin oxidized (FO) or flavin reduced (FR), the late one physically interacts with thioredoxins. Our ScTrxR2 crystal structure is in the FO conformation. Therefore, we have modeled the ScTrxR2 FR (Flavin reduced) conformation from our FO crystal structure and using the E. coli thioredoxin reductase crystallographic structure complexed with thioredoxin (PDB code 1F6M). Then, we have raised hypothesis that some amino acid residues that may be involved in the thioredoxin reductase-thioredoxin interactions. Next, site-directed mutants of yeast Trxs and ScTrx2 were generated. Through enzymatic and biochemical assays with these mutant proteins we are testing the hypothesis generated by structural analysis
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Avaliação da toxicidade de águas de chuva a organismos aquáticos / Evaluation of toxicity of rainwater on aquatic organisms

Martins, Renata de Souza Leão 30 October 2009 (has links)
A degradação da qualidade do ar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) bem como seus efeitos à saúde humana vem sendo estudados há algumas décadas. No entanto, pouco se sabe a respeito dos efeitos causados aos ambientes aquáticos e sua biota. A deposição atmosférica úmida é considerada como importante rota de remoção dos poluentes presentes na atmosfera terrestre. Desse modo, este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade de amostras de águas de chuva de dois locais, utilizando diferentes organismos-teste. As amostras foram coletadas no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, município de São Paulo, e também no distrito de Taiaçupeba, pertencente ao município de Mogi das Cruzes, SP. As coletas foram realizadas manualmente, com recipientes com capacidade para 20L. Em seguida, as amostras foram levadas ao laboratório para medição de pH e condutividade, onde também foram fracionadas para os ensaios ecotoxicológicos e análise cromatográfica dos íons majoritários. Para as amostras coletadas no IPEN, foram realizados ensaios de toxicidade aguda com o microcrustáceo Daphnia similis e com a bactéria marinha luminescente Vibrio fischeri, além dos ensaios de toxicidade crônica com o microcrustáceo Ceriodaphnia dubia e com a alga Pseudokirchneriella subcapitata. As amostras coletadas em Taiaçupeba foram testadas com os mesmos organismos-teste, com exceção da alga P. subcapitata. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as amostras de águas de chuva dos dois locais foram capazes de provocar efeito tóxico aos organismos-teste expostos. Além disso, foi possível observar que as amostras coletadas IPEN durante o verão-08/09 apresentaram toxicidade mais elevada para D. similis, V. fischeri e C. dubia. Em relação às análises químicas, as maiores concentrações dos constituintes da amostras do IPEN foram nitrato, sulfato e amônio, indicando contaminação por fontes antropogênicas. Ao contrário, as análises químicas das amostras de Taiaçupeba indicaram menor concentração de poluentes em relação às amostras do IPEN. De maneira geral, os resultados das análises químicas convergiram com os resultados dos ensaios ecotoxicológicos para os dois locais. / The air quality degradation in Metropolitan Area of São Paulo (MASP) and also the effect to human health have been studied. However, little is known about the effects to aquatic environments and their biota. Wet atmospheric deposition is considered an important route of atmospheric pollutants removal. Thus, the aim of this work was evaluate the toxicity of rainwater samples from two sites, using different test-organisms. The samples were collected at Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo city, and also in Taiaçupeba, part of Mogi das Cruzes city. The samples were collected manually, using 20L containers. After collection, the samples were taken to laboratory to measure pH values and electric conductivity, it were separated to ecotoxicological assays and chromatographic ionic analyze. The samples collected at IPEN were submitted to acute toxicity assay with microcrustacean Daphnia similis and luminescent marine bacteria Vibrio fischeri, and also to chronic toxicity assay with Ceriodaphnia dubia and green algae Pseudokirchneriella subcapitata. The samples collected in Taiaçupeba were tested with the same test organisms, except P. subcapitata. Results obtained in this study indicate that rainwater samples from both sites were able to promote toxic effect to tested organisms. Furthemore, it was possible to observe that samples collected at IPEN during summer 08/09 presented high toxicity to D. similis, V. fischeri and C. dubia. The chemical analyzes showed that the highest concentrations of constituents of IPEN samples were nitrate, sulphate and ammonium, indicating contamination by anthropogenic sources. In contrast, chemical analyzes of Taiaçupeba indicated lower pollutants concentration than IPEN samples. Generally, chemical results corroborated with ecotoxicological results for the two sites.
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Efeito da administração de melatonina em ratos orquiectomizados e infectados com Trypanosoma cruzi / Effect of melatonin administration in rats orchietomized and infected with Trypanosoma cruzi

Santello, Fabricia Helena 13 October 2009 (has links)
Os esteróides gonadais exercem importantes influências no direcionamento da resposta imune do hospedeiro frente à infecção. Alterações decorrentes de sua ausência ou reposição podem significar em uma evolução distinta de determinada parasitose. Existe também uma relação entre a produção de melatonina e o ritmo de atividade do sistema imune. A resposta imune depende de uma interação entre inúmeros hormônios que irão agir sinergicamente com distintas células imunes. O objetivo desse trabalho foi investigar o efeito dos hormônios sexuais masculinos, através da orquiectomia, e da administração oral de melatonina sobre a resposta imune de ratos Wistar machos infectados com a cepa Y de Trypanosoma cruzi, durante a fase aguda da doença de Chagas experimental. Inúmeros parâmetros foram avaliados, entre eles: parasitemia, histologia cardíaca, peso dos animais e órgãos, linfoproliferação de timócitos e esplenócitos, quantificação de macrófagos, dosagem de óxido nítrico, citometria de fluxo para avaliação das populações de CD3+CD4+ e CD3+CD8+; e ensaios imunológicos como IFN-gama, IL-2, IL-6, IL-12, IL-10. Observou-se em todos os parâmetros analisados a ação sinérgica da melatonina e da orquiectomia sobre o sistema imune, favorecendo uma resposta positiva contra o parasita na fase aguda da infecção. Dessa forma, concluiu-se que a melatonina e a redução dos hormônios sexuais masculinos exerceram um papel imunoestimulador importante, que se refletiu em uma resposta mais efetiva do hospedeiro durante a infecção experimental. / Gonadal steroids exert important influence in the host immune response during infection. Changes resulting from the absence or replacement of these hormones may represent a distinct evolution of a particular parasite. There is also a relationship between melatonin production and the rhythmic activity of the immune system. The immune response depends on the interaction of many hormones that will act synergistically with other immune cells. The objective of this research was to evaluate the effect of male sex hormones through orchiectomy, and oral administration of melatonin on the immune response of male Wistar rats infected with the Y strain of Trypanosoma cruzi, during the acute phase of experimental Chagasdisease. Several parameters were evaluated among them: quantification of blood parasites, heart histology, body weight of animals and organs, lymphoproliferation of thymocytes and splenocytes, quantification of peritoneal macrophages, nitric oxide concentration, alterations in CD3+CD4+ and CD3+CD8+ lymphocyte populations by flow cytometry and immunological assays, as IFN-gama, IL-2, IL-6, IL-12, IL-10. It was observed in all parameters examined the synergistic action of melatonin and orchiectomy on the immune system, promoting a positive response against the parasite in the acute phase of infection. Thus, it was concluded that melatonin and the absence of male sex hormones exerted an important immunostimulating role, which reflected a more effective hosts response during the experimental infection.
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Avaliação da toxicidade de águas de chuva a organismos aquáticos / Evaluation of toxicity of rainwater on aquatic organisms

Renata de Souza Leão Martins 30 October 2009 (has links)
A degradação da qualidade do ar na Região Metropolitana de São Paulo (RMSP) bem como seus efeitos à saúde humana vem sendo estudados há algumas décadas. No entanto, pouco se sabe a respeito dos efeitos causados aos ambientes aquáticos e sua biota. A deposição atmosférica úmida é considerada como importante rota de remoção dos poluentes presentes na atmosfera terrestre. Desse modo, este trabalho teve como objetivo avaliar a toxicidade de amostras de águas de chuva de dois locais, utilizando diferentes organismos-teste. As amostras foram coletadas no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, município de São Paulo, e também no distrito de Taiaçupeba, pertencente ao município de Mogi das Cruzes, SP. As coletas foram realizadas manualmente, com recipientes com capacidade para 20L. Em seguida, as amostras foram levadas ao laboratório para medição de pH e condutividade, onde também foram fracionadas para os ensaios ecotoxicológicos e análise cromatográfica dos íons majoritários. Para as amostras coletadas no IPEN, foram realizados ensaios de toxicidade aguda com o microcrustáceo Daphnia similis e com a bactéria marinha luminescente Vibrio fischeri, além dos ensaios de toxicidade crônica com o microcrustáceo Ceriodaphnia dubia e com a alga Pseudokirchneriella subcapitata. As amostras coletadas em Taiaçupeba foram testadas com os mesmos organismos-teste, com exceção da alga P. subcapitata. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que as amostras de águas de chuva dos dois locais foram capazes de provocar efeito tóxico aos organismos-teste expostos. Além disso, foi possível observar que as amostras coletadas IPEN durante o verão-08/09 apresentaram toxicidade mais elevada para D. similis, V. fischeri e C. dubia. Em relação às análises químicas, as maiores concentrações dos constituintes da amostras do IPEN foram nitrato, sulfato e amônio, indicando contaminação por fontes antropogênicas. Ao contrário, as análises químicas das amostras de Taiaçupeba indicaram menor concentração de poluentes em relação às amostras do IPEN. De maneira geral, os resultados das análises químicas convergiram com os resultados dos ensaios ecotoxicológicos para os dois locais. / The air quality degradation in Metropolitan Area of São Paulo (MASP) and also the effect to human health have been studied. However, little is known about the effects to aquatic environments and their biota. Wet atmospheric deposition is considered an important route of atmospheric pollutants removal. Thus, the aim of this work was evaluate the toxicity of rainwater samples from two sites, using different test-organisms. The samples were collected at Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, São Paulo city, and also in Taiaçupeba, part of Mogi das Cruzes city. The samples were collected manually, using 20L containers. After collection, the samples were taken to laboratory to measure pH values and electric conductivity, it were separated to ecotoxicological assays and chromatographic ionic analyze. The samples collected at IPEN were submitted to acute toxicity assay with microcrustacean Daphnia similis and luminescent marine bacteria Vibrio fischeri, and also to chronic toxicity assay with Ceriodaphnia dubia and green algae Pseudokirchneriella subcapitata. The samples collected in Taiaçupeba were tested with the same test organisms, except P. subcapitata. Results obtained in this study indicate that rainwater samples from both sites were able to promote toxic effect to tested organisms. Furthemore, it was possible to observe that samples collected at IPEN during summer 08/09 presented high toxicity to D. similis, V. fischeri and C. dubia. The chemical analyzes showed that the highest concentrations of constituents of IPEN samples were nitrate, sulphate and ammonium, indicating contamination by anthropogenic sources. In contrast, chemical analyzes of Taiaçupeba indicated lower pollutants concentration than IPEN samples. Generally, chemical results corroborated with ecotoxicological results for the two sites.
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Ensaios celulares para a determinação da atividade citotóxica de moléculas antineoplásicas / Cellular assays to determine the cytotoxic activity of anticancer molecules

Saidel, Marta Érica 27 October 2016 (has links)
A pesquisa de substâncias bioativas apresenta diversas etapas de grande complexidade técnico-científica e envolve uma atividade multidisciplinar. No estudo de antineoplásicos, dentre outros candidatos a fármacos, a determinação do perfil de atividade biológica é um ponto essencial para a determinação da potência, toxidez e o índice de seletividade. Neste projeto, os ensaios in vitro de compostos inibidores de catepsinas serão realizados usando células de câncer de próstata resistentes à quimioterapia (DU 145 e PC-3). Os estudos envolverão análises fenotípicas da resposta celular para determinar a viabilidade e o tipo de perturbação do ciclo celular utilizando técnicas colorimétricas e citometria de fluxo, juntamente com o estudo de sinalização celular PI3K-Akt-mTOR. Os testes de atividade citotóxica serão realizados com as células de fibroblasto de camundongo (Balb-c 3T3). Os resultados levarão a caracterização do tipo de resposta biológica e também da citotoxidez das substâncias de interesse. / The search for bioactive substances leads to molecules that need to be qualified throughout many complex steps, involving multidisciplinary activities. For antineoplastic molecules, among other classes of candidate drugs, the determination of the biological activity is the core of the whole process with the aim of determining the potency, toxicity and the selectivity index. In this project, in vitro cell-based bioassays of cathepsin inhibitors are going to be performed using prostate cancer cells resistant to chemotherapy (DU 145 and PC-3). Phenotypic studies are going to be used as end-points to observe the cell viability and the perturbation of the cell cycle by means of colorimetric, flow cytometry, coupled with the study of PI3K-Akt-mTOR signaling pathway. Cytotoxic assays are going to be performed in mouse fibroblasts (Balb-c 3T3). As a result, the biological outcome and the cytotoxic profile of the compounds of interest will be addressed.
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Triagem biológica, identificação e planejamento de novos candidatos a agentes anticâncer a partir de produtos naturais e compostos sintéticos / Biological screening, identification and design of new candidates for anticancer agents from natural products and synthetic compounds

Altei, Wanessa Fernanda 05 May 2014 (has links)
Câncer é a denominação para um grupo de doenças devastadoras caracterizadas pelo crescimento e multiplicação descontrolados de células anormais que são capazes de invadir estruturas próximas e se espalhar por diversas regiões do organismo.Trata-se de um grande problema de saúde pública mundial, fazendo milhares de novas vítimas a cada ano. De acordo com o Instituto Nacional do Câncer (INCA), são estimados cerca de 580 mil casos novos da doença no Brasil para 2014. A presente tese de doutorado teve como foco principal a identificação e o desenvolvimento de novas moléculas com atividade anticâncer, através de triagens biológicas de compostos de origem natural e sintética, e do estudo das relações entre a estrutura e atividade (SAR). Triagens in vitro de derivados sintéticos do ácido gálico, ácido protocatecuico e guanidínicos, além de uma variedade de produtos naturais, possibilitaram a identificação de agentes inibidores da migração e proliferação de células tumorais metastáticas. Uma série de derivados sintéticos indólicos e espirocicloexadienonas, com potente efeito inibitório da migração celular, teve caracterizada a sua ação frente à proteína tubulina, alvo molecular de compostos importantes como o taxol, a vimblastina e a colchicina. Ensaios de imunofluorescência revelaram a ação dos compostos associada a alterações do citoesqueleto celular. Também foram realizados o planejamento e a síntese de três cadeias peptídicas por meio da metodologia de síntese peptídica em fase sólida. Os resultados da avaliação biológica dos peptídeos indicaram o efeito de inibição na migração e proliferação de células tumorais de mama. Finalmente, estudos de metabolômica de duas linhagens tumorais de mama foram conduzidos através de análises de RMN do material celular cultivado. / Cancer is a group of devastating diseases characterized by the abnormal growth of defective cells which invade adjacent tissues and eventually disseminate to several locations of the body. It is a major public health problem, affecting thousands of people each year. According to the brazilian National Institute of Cancer (INCA), approximately 580,000 new cases of cancer are predicted for the year of 2014 in Brazil. The main goal of this PhD thesis was the identification and development of new molecules possessing anticancer activity, through biological screenings of compounds from natural and synthetic sources, as well as the investigation of structure-activity relationships (SAR). In vitro screening of synthetic derivatives of gallic acid, protocatechuic acid and guanidines, along with a diverse set of natural products, allowed the identification of inhibitors of cellular migration and metastatic cell proliferation. A series of synthetic indolic derivatives and cyclohexanediones, having potent inhibitory activity in cellular migration, was characterized upon tubulin, an important macromolecular target for compounds such as taxol, vinblastine and colchicine. Immunofluorescence assays revealed that the compounds act by altering the cellular cytoskeleton. The design and synthesis of three polypeptides were also performed through solid phase synthesis. The biological evaluation of the peptides demonstrated their inhibition effects on the migration and proliferation of breast cancer cells. Finally, metabolomic studies of two strains of breast cancer cells were conducted by NMR analyses of cellular cultures.
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Partículas de sílica funcionalizadas contendo complexos de TR3+ para aplicação como marcadores em ensaios biológicos / Amino-functionalized silica particles containing RE3+ complexes for application as label in biological assays

Lourenço, Ana Valéria Santos de 17 September 2010 (has links)
Este trabalho apresenta o processo para obtenção de partículas de sílica amino-funcionalizadas contendo complexos de TR3+ utilizando os métodos de Stöber e por micro-ondas. Os espectros de absorção no infravermelho das partículas TR-BTC-Si preparadas pelo método de micro-ondas exibiram bandas de absorção atribuídas aos modos vibracionais dos complexos TR-BTC e da rede de sílica, indicando a incorporação destes complexos na matriz SiO2. Por outro lado, os complexos Eu-(β-dicetonatos) preparados pelo método Stöber mostraram apenas as bandas atribuídas à estrutura da rede de sílica, devido à dupla camada de revestimento de sílica. As morfologias das partículas de sílica amino-funcionalizadas contendo complexos de TR3+ foram visualizadas usando a técnica MEV. As diferenças nas morfologias entre o complexo precursor e o material amino-funcionalizado pode ser atribuído a presença da sílica na superfície do material. Além do mais, o método da ninidrina indicou a presença de grupos amina (-NH2) na superfície destes materiais. Os espectros de emissão dos materiais funcionalizados com os complexos de Eu3+ e Tb3+ apresentaram as bandas de emissão da transição intraconfiguracional dos íons Eu3+ (5D0→7FJ, J = 0-6) e Tb3+ (5D4→7FJ, J = 6-0), exibindo cores características de emissão vermelha e verde, respectivamente. É observado um decréscimo nos valores dos parâmetros Ω2 dos materiais Eu-(β-dicetonato)-Si e Eu-BTC-Si comparados com os respectivos complexos, devido a diminuição da intensidade da transição 5D0→7F2, indicando um maior caráter centrossimétrico. Conseqüentemente, os íons Eu3+ nos materiais com sílica estão em um ambiente químico menos polarizável do que nos complexos, sugerindo uma menor contribuição do mecanismo de acoplamento dinâmico. Os altos valores dos Ω4 para os sistemas com sílica Eu-(&#946-dicetonato)-Si e Eu-BTC-Si comparados com os valores de Ω2 reflete a intensidade extremamente alta da transição 5D0→7F4 observada nos espectros de emissão. Este resultado corrobora com o maior caráter centrossimétrico e evidencia a incorporação dos complexos de Eu3+ na rede de sílica. Foi realizado um fluoroimunoensaio usando os compostos amino-funcionalizados, que mostraram uma luminescência e propriedades físico-químicas eficientes para atuarem como marcadores biológicos. O marcador óptico foi conjugado com o anticorpo anti-oxLDL, que se liga a um suporte específico com o antígeno oxLDL. Portanto, estes materiais são candidatos promissores para conjugação molecular em clínicas de diagnóstico. / This work presents the process to obtain amino-functionalized silica particles containing complexes of trivalent rare earth ions (RE3+) using Stöber and microwave methods. Infrared spectra of the TR-BTC-Si particles prepared by microwave method exhibited absorption bands assigned to the vibrational modes of the TR-BTC complexes and silica network, indicating that the complexes have been incorporated in the SiO2 matrix. However, due to double coating of the silica network, the IR spectra of the Eu-(β-diketonates) complexes prepared by Stöber method showed only bands assigned to the silica structure. The morphologies of the amino-functionalized silica particles containing RE3+ complexes were examined using SEM technique. The difference in morphology between the complex precursor and amino-functionalized material can be attributed to the silica network on the material surface. Besides, the ninhydrin method confirmed the presence of amine groups (-NH2) in the functionalized materials. The emission spectra of the functionalized materials containing Eu3+ and Tb3+ complexes showed the emission bands originated from the intraconfigurational transitions of the Eu3+ (5D0→7FJ, J = 0-4) and Tb3+ (5D4→7FJ, J = 6-0), exhibiting red and green color emission, respectively. It is observed decreasing values of experimental intensity parameters (Ω2) of the Eu-(β-diketonate)-Si and Eu-BTC-Si materials when compared with the complex precursors, owing to the decreased intensity of the 5D0→7F2 transition, indicating a higher centrosymmetric character. As a result, the Eu3+ ions in silica materials are located in a chemical environment less polarizable than in the complexes, suggesting a smaller contribution of dynamic coupling mechanism. On the other hand, an abnormally high intensity of the 5D0→7F4 transition was observed, which is reflected by the high values of Ω4 of the silica systems, Eu-(β-diketonate)-Si and Eu-BTC-Si, compared with the Ω2 ones. These spectroscopic data corroborate with a higher centrosymmetric character, indicating the incorporation of the Eu3+ complexes in the silica network. A fluoroimmunoassay was developed using the amino-functionalized compounds that exhibit efficient luminescence and physical and chemical properties suitable for optical label. The biolabel was then chemically conjugated to anti-oxLDL antibody, which is linked in a specific support with oxLDL antigen. The result showed that it is a promising candidate for molecular conjugation in clinical diagnosis.
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Investigation of mechanisms of drug resistance in colorectal cancer : a proteomic and pharmacological study using newly developed drug-resistant human cell line subclones

Duran, M. Ortega January 2017 (has links)
Despite therapeutic advances, colorectal cancer still has a 45% mortality rate, and one of the most crucial problems is the development of acquired resistance to treatment with anticancer drugs. Thus the aims of this project are to develop drug-resistant colon cancer cell lines in order to identify mechanisms of resistance for the most commonly drugs used in colorectal cancer: 5-fluorouracil, oxaliplatin, and irinotecan. Following evaluation of drug sensitivity to these agents in an initial panel of eight colorectal cancer cell lines, 3 lines (DLD-1, KM-12 and HT-29) were selected for the development of 5-FU (3 lines), oxaliplatin (2) and irinotecan (1) resistant sublines by continuous drug exposure, with resistance confirmed using the MTT assay. Consistently resistant sublines were subject to a „stable isotope labelling with amino acids in cell culture‟ (SILAC) approach and a MudPIT proteomics strategy, employing 2D LC and Orbitrap Fusion mass spectrometric analysis, to identify novel predictive biomarkers for resistance. An average of 3622 proteins was quantified for each resistant and parent cell line pair, with on average 60-70 proteins up-regulated and 60-70 down-regulated in the drug resistant sublines. The validity of this approach was further confirmed using immunodetection techniques. These studies have provided candidate proteins which can be assessed for their value as predictive biomarkers, or as therapeutic targets for the modulation of acquired drug resistance in colorectal cancer.

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