A epilepsia do lobo temporal (ELT) é a um dos casos mais frequente epilepsia em humanos e de maior refratariedade nos pacientes. A maioria dos fármacos antiepilépticos são moduladores da atividade neuronal e atuam sobre canais iônicos do receptor GABAA. Estudos vêm demonstrando o papel das células gliais e da neuroinflamação na epileptogênese e a modulação desta resposta pode ser um alvo potencial para drogas adjuvantes aos fármacos anti-epilépticos. Astrócitos são células gliais participantes da sinapse tripartite, moduladores da atividade neuronal. Os astrócitos são capazes de promover a homeostase de íons e de neurotransmissores, são responsáveis pelo metabolismo energético e da produção de fatores neurotróficos, glutationa, glutamina, S100B e citocinas. Neste trabalho, induzimos status epilepticus (SE) em ratos jovens (PN28) através do modelo lítio-pilocarpina que mimetiza alterações neuronais, bioquímicas e morfológicas similares à ELT em humanos. Os animais foram divididos nos tempos 1, 14 e 56 dias após a indução de status epilepticus (SE). Estes períodos são caracterizados respectivamente como a fase aguda, latente e crônica da epilepsia. Inicialmente, analisamos as mudanças neuroquímicas e astrocitárias ao longo do tempo. Foi observada neuroinflamação inicial e transitória que promove morte neuronal e mudanças ao longo do tempo de astrogliose e disfunção astrocitária. Também foi observado que a proteína S100B, proteína ligante de cálcio, predominantemente astrocitária, pode ser considerado um marcador da disfunção neuronal e astrocitária promovida neste modelo de epilepsia. Em seguida, demonstramos que a modulação da secreção de S100B pelo anti-inflamatório dexametasona um dia após indução de SE reverte a neuroinflamação, astrogliose e disfunção astrocitária à curto e à longo prazo. Por conseguinte, observamos que a modulação do receptor GABAA através de agonistas e antagonistas GABAérgicos altera a secreção de S100B em fatias hipocampais agudas e em cultura de astrócitos. Portanto, pode-se sugerir que as alterações astrogliais e a neuroinflamação dependentes do tempo podem estar ligadas à excitabilidade neuronal e/ou à morte neuronal em ratos jovens em modelo de epilepsia; que a proteína S100B pode ser considerada um marcador deste modelo de epilepsia e que a modulação da sua secreção pode ser um possível alvo farmacológico no tratamento da epilepsia. / Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most frequent type of epilepsy in humans and is more associated to refractory to anti-epileptic drugs (AED) in patients. The most AEDs are modulators of neuronal activity and act on ion channels, such as GABAA receptor. Studies have been demonstrating the role of glial cells and neuroinflammation in epileptogenesis. The modulation of this response may be a potential target for adjunctive drugs to anti-epileptic drugs. Astrocytes are glial cells that participated in the tripartite synapse and modulated neuronal activity. Astrocytes are able to promote homeostasis of ions and neurotransmitters, are responsible for energy metabolism and the production of neurotrophic factors, glutathione, glutamine, S100B and cytokines. In this work, we induced status epilepticus (SE) in young rats (PN28) through the lithiumpilocarpine model that mimics neuronal, biochemical and morphological alterations similar to ELT in humans. The animals were divided at times 1, 14 and 56 days after the induction of SE. These periods are characterized respectively as the acute, latent and chronic phase of epilepsy. Initially, we analyzed neurochemical and astrocytic changes over time. Initial and transient neuroinflammation was observed and promoted over time neuronal death, astrogliosis and astrocytic dysfunction. It has also been observed that the protein S100B, a calcium-binding protein, predominantly astrocytic, can be considered a marker of neuronal and astrocytic dysfunction promoted by this model of epilepsy. Next, we demonstrate that the modulation of S100B secretion by the antiinflammatory dexamethasone one day after SE induction reverses neuroinflammation, astrogliosis and astrocytic dysfunction in the acute and chronic time. Therefore, we analyzed that modulation of the GABAA receptor through GABAergics agonists and antagonists alters the secretion of S100B in acute hippocampal slices and in astrocyte culture. Therefore, it may be suggested that astroglial changes and time dependent neuroinflammation may be related to neuronal excitability and/or neuronal death in young rats in this epilepsy model; that S100B protein can be considered a marker of this epilepsy model and that the modulation of its secretion may be a possible pharmacological target in the treatment of epilepsy.

A aquaporina-4 (AQP-4) é o principal canal de água localizado no sistema nervoso central (SNC). Durante o aumento do potássio (K+) extracelular, a captação de K+ pelos astrócitos está provavelmente associada com o co-transporte de água. Neste caso, a AQP-4 poderia servir como uma rota de saída para a água, e isto seria vantajoso para a liberação de K+ se a permeabilidade à água da AQP-4 fosse aumentada pela alta concentração de K+ extracelular. Diversos estudos demonstraram a sobreposição da expressão ontogenética de AQP-4 e do canal retificador interno de K+ Kir 4.1, sugerindo uma associação molecular da AQP-4 e Kir 4.1 no tamponamento espacial do K+, o que facilitaria o movimento de água através da membrana plasmática. A S100B é uma proteína expressa e secretada no SNC principalmente por astrócitos, que possui efeitos neurotróficos quando expressa em concentrações nanomolar (nM) e efeitos neurotóxicos quando presente em concentrações micromolar (μM). Foi demonstrado um aumento compensatório na AQP-4 em resposta a superexpressão de S100B, no entanto ainda não foi demonstrado se a AQP-4 ou os canais Kir 4.1 podem modular a secreção de S100B. Além disso, há poucos relatos sobre as alterações da expressão de AQP-4 e Kir 4.1 ao longo do desenvolvimento cerebral. Nós investigamos se a secreção de S100B é alterada em fatias hipocampais de ratos com diferentes idades (15, 30, 45, 60 e 90 dias) expostas à inibidores de AQP-4 e Kir 4.1 e se ocorrem alterações na expressão de AQP-4 e Kir 4.1 em cérebros de ratos com 15, 30, 60 e 90 dias. Observamos um aumento na secreção de S100B em hipocampos de ratos mais jovens expostos a acetazolamida (AZA) e tetraetilamônio (TEA), inibidores de AQP-4, e uma diminuição na secreção de S100B em hipocampo de ratos expostos a cloreto de bário (BaCl2), inibidor de Kir 4.1. Também encontramos uma diminuição na expressão de AQP-4 nos hipocampos de ratos com 60 e 90 dias quando comparados com os mais jovens e uma diminuição na expressão de Kir 4.1 em animais de 90 dias. Apesar da AQP-4 e Kir 4.1 estarem co-localizadas e apresentarem um padrão de expressão similar, o mecanismo pelo qual estas proteínas modulam a secreção de S100B parece ser independente. / The aquaporin-4 (AQP-4) is the main water channel located in the central nervous system (CNS). During the increase of extracellular potassium (K+), this is take up by astrocytes and probably is associated with the co-transport of water. In this case, the AQP-4 could serve as an exit route for the water, and it would be advantageous for the release of K+ if the permeability to water of AQP-4 was increased by high extracellular K+ concentration. Several studies have demonstrated the overlap between ontogenetic expression of AQP-4 and inwardly rectifying K+ channel Kir 4.1, suggesting a molecular association of AQP-4 and Kir 4.1 in the K+ spatial buffer, which facilitates the trespass of water across the plasma membrane. The S100B protein is expressed and secreted by astrocytes in the CNS, which has neurotrophic effects when expressed in the nanomolar (nM) concentrations and neurotoxic effects when present at concentrations micromolar (μM). It has been shown a compensatory increase in AQP-4 in response to overexpression of S100B, but has not yet been demonstrated if the AQP-4 channels or Kir 4.1 may modulate the secretion of S100B. In addition, there are few reports showing changes in the expression of Kir 4.1 and AQP-4 along the developing brains. We investigated whether S100B secretion is altered in hippocampal slices from rats with different ages (15, 30, 45, 60 and 90 days old) exposured to inhibitors of AQP-4 and Kir 4.1 and if there are changes in the expression of AQP-4 and Kir 4.1 in brain of 15, 30, 60 and 90-days old rats. We observed an increase in S100B secretion in hippocampus of younger rats exposed to tetraethylammonium (TEA) and acetazolamide (AZA), AQP-4 inhibitors and a decrease in the secretion of S100B in hippocampus of rats exposed to barium chloride (BaCl2), an inhibitor of Kir 4.1. We also found a decrease in AQP-4 expression in hippocampus of rats with 60 and 90 days old when compared with younger rats and a decrease in the expression of Kir 4.1 in 90-days old animals. Despite the Kir 4.1 and AQP-4 are co-located and present a similar pattern of expression, the mechanism by which these proteins modulate S100B secretion seems to be independent

Introdução. O complexo amigdalianohumano é formado por diversos núcleos. Pouco se sabe sobre núcleo cortical da amigdala, o qual faz parte da denominada amígdala vomeronasal. Pouco é conhecido de seus componentes celulares, suas conexões e funções em seres humanos até o momento. Objetivos. Descrever os componentes neuronais presentes no núcleo cortical da amígdala humana, buscando obter dados sobre sua morfologia, caracterizando-os pelo formato do soma, número de dentritos primários e padrão de ramificação, além da presença, distribuição, densidade e forma dos espinhos dendríticos locais. Materiais e métodos. Foram estudadas peças anatômicas do lobo temporal de muitos hemisférios cerebrais obtidas de homens adultos post-mortem (N= 8, 47-68 anos) e submetidas à técnica de tionina, à técnica de imunohistoquimica para a proteína ácida fibrilar glial e à técnica de Golgi adaptada para o tecido humano fixado em formol a 10% por longa data. A obtenção de imagens foi realizada empregando-se microscópio de luz acoplada a computador com programa de análise de imagem (image-Pro Plus 7.0). Para a elaboração das imagens dos neurônios e sua forma geral bidimensional foi utilizado o programa Adobe Photoshop CS3 (EUA). Para a reconstrução tridimensional dos espinhos dendríticos foi desenvolvido algorítmo de processamento de imagens. Resultados Foram observados astrócitos protoplasmáticos e identificadas 10 formas neuronais diferentes no núcleo cortical da amigdala humana, a saber: neurônios piramidal modificado (pyramidal-like), fusiforme, angular-esférico, triangular, retangular, poligonal-estrelado, redondo-cônico, pear shaped, fork-like e "pequeno". Espinhos com formato fino (thin), achatado (stubby), espesso (wide), de tipo cogumelo (mushroom), ramificado (ramified), atípico ou de transição (atypical or trasitional) foram observados em todos os neurônios estudados, guardadas particularidades de ramificação dedrítica de cada um deles. Conclusão. O núcleo cortical da amígdala humana apresenta neurônios tipo piramidal-like. Isso lhe confere características de área de transição para o alocórtex e de área de surgimento evolutivo de tais neurônios no continuum subcortical-alocórtex-neocórtex. Muito importante toda a diversificada celularidade encontrada neste núcleo pode significar que esta região desempenhe múltiplas funções de integração e processamento de informações em seres humanos.

Durante o desenvolvimento fetal, o sistema nervoso central (SNC) apresenta-se mais vulnerável aos efeitos tóxicos do etanol. Sabe-se que a exposição pré-natal sob altas doses de álcool aumenta a propensão de síndromes fetais. No entanto, muitas gestantes optam por manter o “beber social”, mesmo que estudos mostrem que doses moderadas de etanol na fase do desenvolvimento possa causar danos ao SNC associados a transtornos cognitivos, sociais e neuroquímicos. O objetivo desta tese é avaliar parâmetros astrogliais e comportamentais no período da adolescência em fatias hipocampais de ratos Wistar machos submetidos a um modelo animal de exposição pré e pós-natal sob doses moderadas de etanol. O modelo animal utilizou cerveja sem álcool para administração por via oral de etanol. As ratas foram expostas ao tratamento durante toda a gestação até o final do desmame. Ratas prenhas foram divididas em três grupos de tratamento: apenas água (grupo controle), cerveja sem álcool (grupo veículo) ou cerveja sem álcool adicionado de 10%v.v. etanol (MPAE group 9 moderate prenatal alcohol exposure). Filhotes adolescentes machos foram submetidos a tarefa de esquiva discriminativa passiva com o objetivo de avaliar o comportamento de aprendizado/memória e de ansiedade. No dia pós-natal 30 (DPN 30) o hipocampo foi dissecado e fatias foram obtidas para a imunoquantificação de GFAP, NeuN, S100B, receptores NMDA e para os transportadores gliais de glutamato, EAAT1 e EAAT2. O ensaio para dosagem da captação de glutamato, bem como o conteúdo de glutationa (GSH) também foram realizados. Os filhotes do grupo MPAE apresentaram comportamento do tipo ansiolítico, mesmo tendo aprendido a evitar o braço aversivo. Observamos neste grupo uma diminuição da captação de glutamato, que parece ser dose 9 dependente, além de alterações na quantificação dos receptores NMDA e dos transportadores de glutamato EAAT1 e EAAT2, que podem ter contribuído para os efeitos comportamentais encontrados. Os níveis da proteína S100B estavam claramente elevados no líquido cefalorraquidiano apenas no grupo MPAE e alterações na expressão de GFAP também foram evidenciadas neste grupo. Contudo, este trabalho mostra que mesmo doses moderadas de etanol, administradas durante o período do desenvolvimento fetal, podem interferir no comportamento de risco associado a diminuição da ansiedade, visto na fase da adolescência. Além disso, os resultados ressaltam uma maior vulnerabilidade do sistema glutamatérgico à toxicidade do etanol, bem como da possibilidade das células da glia participarem de uma resposta de ativação e reparo após o tratamento pré-natal com etanol. / The central nervous system (CNS) is more vulnerable to ethanol effects during fetal development. It is known that high doses of prenatal ethanol exposure increases the probability of fetal alcohol syndromes. Women have chosen to continue drinking socially despite being pregnant, even with studies demonstrating that moderate doses of ethanol during development can impact the CNS leading to cogitive, social and neurochemical impairments. The aim of this thesis is evaluate glial and behavior parameters during adolescence period on hippocampal slices of male Wistar rats submitted to an animal model of prenatal and postnatal ethanol exposure under moderate dose. An animal model of oral self-administration of etanol through a non-alcoholic beer was performed during the role gestation period until weaning. The pregnant rats were divided in three treatment groups: only water (control group), non-alcoholic beer (vehicle group) or non-alcoholic beer with 10% v.v. added (MPAE group – moderate prenatal alcohol exposure). Adolescent male offspring were subjected to the discriminative passive avoidance task to evaluate the learning/memory and anxiety-like behavior. On postnatal day 30 (PND 30) hippocampi were dissected and slices were obtained for immunoquantification of GFAP, NeuN, S100B, NMDA receptors and for glial glutamate transporters, EAAT1 and EAAT2. In addition, we measured the glutamate uptake, as well as the GSH content. Offspring from MPAE group presented an anxiolytic-like behavior, even though they had learned how to avoid the aversive arm. We observed a decrease in glutamate uptake, that seems to be dose-dependent, and alterations in the quantification of glutamate NMDA receptors and EAAT1 and EAAT2 transporters, that could contribute to the behavior findings. The S100B protein levels were clearly increased in the cerebrospinalfluid only for MPAE group and alterations in GFAP expression were also seen for this group. Nevertheless, this thesis shows that even moderate ethanol doses administred during fetal development can impact the rink taking behavior associated to reducement in anxiety, common seen during adolescence. Moreover, the results highlight a vulnerability of glutamate system associated to etanol toxicity, as well as the possibility of glial cells are involved in an activated and repair response after prenatal etanol treatment.

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é associado ao comprometimento cognitivo, sendo capaz de induzir morte neuronal, de alterar o número e a morfologia das células astrocitárias, de aumentar a permeabilidade da barreira hematoencefálica (BBB) e de promover dano neurovascular. O exercício físico, por outro lado, possui efeitos benéficos sobre o sistema nervoso central (SNC), induzindo plasticidade e melhorando o processo de aprendizagem, de memória e a atividade locomotora. Em nosso primeiro estudo, investigamos os efeitos de cinco semanas de exercício aeróbico sobre a prevenção ou reversão do déficit de memória espacial produzido pelo diabetes, e sobre alterações bioquímicas e imuno-histoquímicas de astrócitos no hipocampo, em ratos machos Wistar com DM1 induzido por estreptozotocina. Foram utilizados quatro grupos: controle não treinado (NTC); controle treinado (TC); diabético não treinado (NTD); e diabético treinado (TD). Neste estudo demonstramos que o exercício reverteu o dano na memória espacial causado pelo DM1, aumentou os níveis de glutationa (GSH) e de glutamina sintetase (GS) nos animais TC, mas não no grupo TD; aumentou a densidade de astrócitos GFAP positivos nos grupos TC e TD, e promoveu ramificação astrocitária no grupo TD. Não observamos nenhuma alteração na captação de glicose e de glutamato entre todos os grupos. No segundo estudo, com os mesmos grupos experimentais, avaliamos os efeitos do exercício sobre a memória de reconhecimento do novo objeto, sobre o comportamento motor no rotarod, e sobre a expressão das proteínas claudina-5 e aquaporina-4 (AQP4), proteínas associadas à integridade da BBB, no hipocampo e no estriado de animais diabéticos. Observamos que o exercício melhorou a memória não espacial e a habilidade motora nos animas TC e TD. O diabetes produziu uma diminuição da expressão da claudina-5 no hipocampo e no estriado, e reduziu os níveis de AQP4 hipocampal. O exercício preservou os níveis de claudina-5 no estriado dos animais TD, mas não no hipocampo, e não alterou os níveis reduzidos de AQP4 hipocampal produzidos pelo diabetes. Nossos resultados indicam que o exercício físico reverte o déficit de memória espacial induzido pelo DM1, melhora a memória de reconhecimento do novo objeto, e a atividade motora, induz importantes alterações morfológicas nas células astrocitárias, e afeta importantes componentes da BBB no estriado. Nossos dados contribuem para a compreensão dos benefícios comportamentais, motores, histofisiológicos e neuroquímicos do exercício físico no DM1. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) affects cognitive domains, induces neuronal death, changes in the number and in morphology of astrocytes, increases blood brain barrier (BBB) permeability and promotes neurovascular impairment. Physical exercise, on the other hand, has beneficial effects on brain functions, inducing brain plasticity and improving learning, memory and locomotor activity. In our first study, we investigated the effects of five weeks of aerobic exercise to prevent or reverse spatial memory deficits produced by diabetes and some biochemical and immunohistochemical changes in hippocampal astrocytes of streptozotocin-induced T1DM in male Wistar rats. The rats were divided in four groups: trained control (TC), non-trained control (NTC), trained diabetic (TD) and non-trained diabetic (NTD). In this study, we demonstrated that exercise reversed spatial memory impairments generated by T1DM, increased glutathione (GSH) and glutamine synthetase (GS) levels in TC animals, but not in TD rats; increased the density of GFAP immunoreactive astrocyte in TC and TD groups, and increased astrocyte ramification in TD group. Glucose and glutamate uptake were not affected. In the second study, using the same experimental groups, we evaluated the effects of exercise on novel object recognition task, on motor behavior in rotarod test, and on the expression of proteins related to BBB integrity, such as claudin-5 and aquaporin-4 (AQP4) in the hippocampus and striatum in diabetic rats. We showed that exercise enhanced the non-spatial memory performance and rotarod ability in the TC and TD animals. Diabetes produced a decrease in claudin-5 expression in the hippocampus and striatum and reduced AQP4 in the hippocampus. Physical exercise preserved the claudin-5 content in the striatum of TD rats, but not in the hippocampus, and the reduction of AQP4 levels produced by diabetes was not reversed by exercise. Our findings indicate that physical exercise reverses the cognitive deficits present in T1DM, improves novel object recognition task retention, enhances motor performance, induces important morphological astrocytic changes, and affects important structural components of the striatal BBB. Our date could enhance the knowledge regarding the behavioral, locomotor, histophysiological and neurochemical benefits of exercise in diabetes.

A hemorragia intracerebral (HIC) é uma das principais causas de mortalidade em todo mundo, desencadeando eventos adversos e déficits neurológicos graves. A partir disso, essa tese teve como objetivo avaliar as respostas celulares e suas interações envolvidas na HIC e investigar os possíveis mecanismos que contribuem para os déficits sensório-motores relacionados, principalmente, à habilidade dos membros anteriores dos animais. Para isso foram realizados dois experimentos. Em ambos os animais de 90 dias foram submetidos à HIC induzida por colagenase no estriado dorsolateral. No primeiro experimento, após 24h, 72h e 7 dias os animais foram avaliados funcionalmente, e histologicamente quanto ao volume da lesão. Ainda, durante 6h, 24h, 72h e 7 dias, o estriado e o córtex foram avaliados quanto ao número de células neuronais, gliais, e em apoptose; a expressão de GFAP e S100B, no estriado e no córtex, a secreção de S100B, no soro e líquido cérebro-espinhal (LCE). A HIC provocou déficits sensório-motores e perda tecidual; induziu morte neuronal e gliose reativa no estriado. O córtex obteve uma resposta astrocitária similar, mas quanto à microglia houve um aumento apenas em 6h. A S100B correlacionou-se positivamente com o número de células gliais; e negativamente com a força e função dos membros anteriores dos animais lesados. No segundo experimento, foram avaliados o estado oxidativo, o nível de TNF-α, a atividade da glutamina sintetase (GS) e a captação de glutamato nos tempos de 6h, 24h, 72h e 7 dias pós-lesão. Após 6h da HIC houve aumento no nível de TNF-α e excitotoxicidade glutamatérgica; entretanto, a função de clearence astrocitário foi restabelecida 7 dias após o dano. A HIC gerou estresse oxidativo e aumento de antioxidantes endógenos, além disso, as espécies reativas de oxigênio (ERO) inibiram a atividade da GS em 24h e 7 dias após a lesão. A partir dos resultados obtidos, podemos concluir que a S100B atua na lesão hemorrágica produzindo respostas distintas, região dependente, contribuindo para o aumento das células gliais no estriado e córtex, correlacionando-se positivamente com os déficits funcionais. Este é o primeiro relato descrevendo a relação da S100B com as alterações celulares e funcionais durante a progressão da HIC experimental. Além disso, os mecanismos envolvidos na HIC demonstraram padrões e respostas envolvendo excitotoxicidade glutamatérgica e inflamação, que colaboraram para o dano oxidativo; em resposta ao estresse houve o aumento de antioxidantes endógenos que podem ter contribuído para o reestabelecimento da função astrocitária. / Intracerebral haemorrhage (ICH) is a major cause of mortality worldwide, triggering adverse events and serious neurological deficits. From this standpoint, this thesis aimed to evaluate the cellular responses and interactions involved in ICH and investigate the possible mechanisms that contribute to sensory-motor deficits, mainly related to the ability of the forelimbs of animals. For this, two experiments were conducted. In both, animals of 90 days of age were subjected to ICH induced by collagenase in dorsolateral striatum. In the first experiment, after 24h, 72h and 7 days, the animals were evaluated functionally, and histologically about the lesion volume. Also, at 6h, 24h, 72h and 7 days, the striatum and the cortex was evaluated as the number of neuronal, glial and apoptotic cells; the expression of GFAP and S100B, the striatum and cortex, S100B secretion in serum and cerebrospinal fluid (CSF). ICH caused sensorimotor deficits and tissue loss; induced neuronal death and reactive gliosis in the striatum. The cortex astrocyte obtained a similar response, but about the microglia there was an increase only at 6h. S100B was positively correlated with the number of glial cells; and negatively correlated with the strength and function of the forelimbs of injured animals. In the second experiment, were evaluated the oxidative state, the level of TNF-α, the activity of glutamine synthetase (GS) and glutamate uptake at 6h, 24h, 72h and 7 days post-injury. After 6h from ICH, there was an increase in TNF-α levels and glutamatergic excitotoxicity; however, the astrocyte clearance function was established 7 days after the damage. HIC generated oxidative stress and increase of endogenous antioxidants, in addition, reactive oxygen species (ROS) inhibited the activity of GS in 24h and 7 days after injury. Based on the results obtained, we can conclude that S100B acts in hemorrhagic lesions producing different responses, region-dependent, contributing to the increase in glial cells in the striatum and cortex, correlating positively with functional deficits. This is the first report describing the relation of S100B with cellular and functional changes during the progression of experimental ICH. Furthermore, the mechanisms involved in ICH displayed patterns and responses involving glutamatergic excitotoxicity and inflammation, that contributed to oxidative damage; in response to stress there was an increase of endogenous antioxidants which may have contributed to the re-establishment of astrocyte function.

A fenilcetonúria (PKU) é o erro inato do metabolismo dos aminoácidos mais comum. Ela é uma doença autossômica recessiva causada por mutações no gene da fenilalanina hidroxilase (Pah) que é responsável por converter a fenilalanina (Phe) em tirosina (Tyr), que acaba elevando os níveis de Phe e seus metabólitos no sangue e tecidos. Se não tratada, a PKU pode desenvolver problemas neurológicos como convulsões, distúrbios motores e retardo mental. O objetivo deste estudo é investigar os efeitos da Phe em alguns parâmetros do metabolismo, estresse oxidativo e viabilidade celular em cultura de astrócitos de ratos Wistar. Os astrócitos foram cultivados sob quatro condições: controle (com 0,4 mM de Phe no meio de cultura) e outros três grupos com concentrações finais de Phe de 0,5, 1,0 e 1,5 mM. Após 72 horas, os astrócitos foram coletados para análises bioquímicas. Nós observamos que os teste de brometo de tetrazolium (MTT) e lactato desidrogenase mostraram alterações na viabilidade celular em todas as doses testadas. Também foram notadas alterações em parâmetros de estresse oxidativo, indicando que a Phe pode induzir a produção de radicais livres, mas não encontramos diferenças significaticas nos parâmetros do metabolismo como a creatina-cinase, piruvato-cinase e adenilato-cinase. Estes resultados sugerem que a fenilalanina nas concentrações encontradas na PKU pode induzir estresse oxidativo e consequente morte celular em cultura de astrócitos. Considerando a importâncias dessas células para a manutenção da homeostase cerebral, é possível que estas alterações estejam relacionadas com os problemas neurológicos encontrados em pacientes com PKU. / Phenylketonuria (PKU) is the most common inborn error of amino acid metabolism. It is an autosomal recessive disease caused by mutations in the gene that expresses phenylalanine hydroxylase enzyme (Pah) that converts phenylalanine (Phe) into tyrosine (Tyr), that leads to high levels of Pheand its metabolites in blood and tissues. If left untreated, PKU can develop neurological problems as seizures, motor disturbances and severe mental retardation. The aim of this study is to investigate the effects of Phe on oxidative stress, some metabolic parameters and cell viability in astrocytes culture of Wistar rats.Astrocytes were cultures under four conditions: control (0.4 mMPhe in the medium), and other three groups with final Phe concentration of 0.5, 1.0 and 1.5 mM. After 72 hours, astrocytes were collected for biochemical measurements. We observed that tetrazolium bromide (MTT) and lactate dehydrogenase (LDH) assays indicated that Phedecreased cell viability at all tested doses. Alterations on oxidative stress parameters indicated that Phecould induce free radicals production, but we didn’t find significative differences on metabolic parameters as creatine, pyruvate and adenylate kinases. Those results suggest that phenylalanine at concentrations found in PKU can induce oxidative stress and consequently cell death in astrocytes cultures. Considering the importance of astrocytes in brain homeostasis, it is possible that these changes may be related to neurological problems seen in PKU patients.

A síndrome hiperornitinemia-hiperamonemia-homocitrulinúria (HHH) é um erro inato do metabolismo do ciclo da ureia, de caráter autossômico recessivo e caracterizada por um defeito no transporte mitocondrial de ornitina (Orn), levando a um acúmulo citosólico desse aminoácido, além do acúmulo de homocitrulina (Hcit) e amônia. Os sinais e sintomas clínicos são variáveis, dentre eles podemos citar coagulopatia, coma, letargia, retardo mental, atrofia cortical e ataxia cerebelar. Embora os sintomas neurológicos sejam frequentes, a fisiopatogenia dessa doença ainda é desconhecida. Nesse trabalho investigamos os efeitos in vitro e ex vivo da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos de 30 dias de vida. Além disso, também investigamos os efeitos desses metabólitos sobre alguns parâmetros em astrócitos cultivados de córtex cerebral. Primeiramente investigamos os efeitos in vitro da Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de homeostase redox e energética em cerebelo de ratos jovens. Ambos metabólitos aumentaram significativamente os níveis de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBA-RS). Além disso, esses níveis foram totalmente prevenidos pela melatonina e pela glutationa reduzida (GSH). Observamos também que os níveis da produção de nitratos e nitritos não foi alterada por nenhum dos metabólitos utilizados, por outro lado, a Hcit aumentou a produção de peróxido de hidrogênio Ao investigarmos os níves de GSH observamos que tanto a Orn quanto a Hcit reduziram esse parâmetro e que a Orn reduziu o conteúdo de grupamentos sulfidrila, indicando uma dimunioção nas defeas antioxidantes não enzimáticas. Com relação ao metabolism energetic, a Orn e Hcit diminuíram a atividade da enzima aconitase, porém não alteraram outros parâmetros estudados. Além disso, a redução causada pela Orn foi prevenida pela GSH, indicando que essa enzima é suscetível a oxidação causada por exxe aminoácido. Também investigamos os efeitos ex vivo da injeção intracerebelar de Orn e Hcit sobre importantes parâmetros de estresse oxidativo e sobre a ativdade da Na+, K+ ATPase. A Orn aumentou significativamente os níveis de TBA-RS e atividade da superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase, glutationa redutase e glucose 6-fosfato desidrogenase e diminuiu a ativdade da Na+,K+-ATPase. Por outro lado, as concentrações de GSH não foram alteradas pelo tratamento com ornitina. Por fim, a Hcit não foi capaz de alterar nenhum dos parâmetros avaliados. Os efeitos da Orn e Hcit foram também investigados em astrócitos cultivados a partir de córtex cerebral de ratos neonatos. Observamos que Orn e Hcit diminuíram a viabilidade celular, a função mitocondrial e os níveis de GSH, porém não alteraram a produção de citocinas. Nossos resultados demonstram um prejuízo moderado na homeostase energética, porém, quando observamos a homeostase redox, observamos um dano mais pronunciado. Dessa forma, concluímos que alterações na homeostase energética, mas principalmente na homeostase redox podem estar envolvidos na fisiopatogenia do dano neurológico observado nos pacientes com a síndrome HHH. / Hyperornithinemia-hyperammonemia-homocitrullinuria (HHH) syndrome is an autosomal recessive disorder of urea cycle characterized by a defect in the transport of ornithine (Orn) into mitochondrial matrix leading to accumulation of Orn, homocitrulline (Hcit) and ammonia. The clinical signs and symptoms are variable, ranging from coagulopathy, coma, lethargy, mental retardation, cortical atrophy and cerebellar ataxia. Although neurological symptoms are frequent, the pathophysyology of this disorder is poorly known. In the present study, we investigated the in vitro and ex vivo effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of 30-day-old rats. Besides that, we also investigated the effects of these metabolites on some parameters in cultured cortical astrocytes. We first studied the in vitro effects of Orn and Hcit on important parameters of redox and energy homeostasis in cerebellum of young rats. Orn and Hcit significantly increased thiobarbituric acid reative species (TBA-RS) levels that was totally prevented by melatonin and reduced glutathione (GSH). We also found that nitrate and nitrite production was not altered by any of the metabolites, in contrast to hydrogen peroxide production, which was significantly enhanced by Hcit. These results suggest that probably reactive nitrogen species were not involved on the observed results Furthermore, GSH concentrations were significantly reduced by Orn and Hcit and sulfhydryl content by Orn, implying an impairment of antioxidant defenses. As regards to energy metabolism, Orn and Hcit provoked a significant reduction of aconitase activity, without altering other parameters of energy metabolism. Furthermore, Orn-elicited reduction of aconitase activity was totally prevented by GSH, indicating that critical groups of this enzyme were susceptible to oxidation caused by this amino acid. We also investigated the ex vivo effects of intracerebellar administration of Orn and Hcit on important parameters of oxidative stress and on Na+, K+ ATPase activity. Similarly with our in vitro results, Orn significantly increased TBA-RS levels and the activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) and glucose 6-phosphate dehydrogenase (G6PDH), and reduced Na+,K+-ATPase activity. In contrast, GSH concentrations were not changed by Orn treatment. Furthermore, intracerebellar administration of Hcit was not able to alter any of these parameters. The effects of Orn and Hcit were also investigated in cultured cortical astrocytes. We observed that Orn and Hcit diminished cellular viability, mitochondrial function, GSH levels, without altering cytokine production. Our results demonstrate a mild impairment in energy metabolism, but mostly in redox homeostasis in cerebellum and cortical cultured astrocytes. Therefore, we conclude that alterations of energy metabolism and especially redox homeostasis may be involved in the pathophysiology of the neurological damage observed in patients with HHH syndrome.

O Diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada principalmente por hiperglicemia crônica. Durante o DM, a atenção está voltada principalmente para doenças que afetam sistemas periféricos, contudo, as complicações do DM podem resultar em danos ao sistema nervoso central (SNC), podendo levar a prejuízos cognitivos. Em vista disso, o objetivo desta tese foi investigar alterações no SNC, particularmente relacionadas às funções astrocitárias e do funcionamento das barreiras encefálicas em modelo animal de DM baseando-se nas alterações periféricas. Além disso, foi analisado o efeito da exendina-4 (EX-4), um agonista dos receptores do peptídeo semelhante ao glucagon (GLP-1), em reverter os parâmetros avaliados. Os resultados observados mostraram prejuízos periféricos e no SNC decorrentes do DM. O DM foi responsável pela excessiva produção de AGEs e alterações em parâmetros periféricos como peso corporal, glicemia, hemoglobina glicada (HbA1c) e peptídeo C. Ao analisar o SNC, observamos prejuízo nas funções cognitivas, em parâmetros astrocitários, disfunções nas barreiras encefálicas e diminuição do conteúdo da subunidade GluN1 do receptor N-metil D-Aspartato (NMDA). O tratamento com EX-4 reverteu o prejuízo cognitivo, o dano nas barreiras encefálicas, a captação de glutamato e o conteúdo de GluN1. No entanto, a EX-4 não teve efeito sobre a glicemia e formação de AGEs. O dano em funções astrocitárias e nas barreiras encefálicas observado no DM pode ser decorrente da ativação de vias de sinalização desencadeadas pelos elevados níveis de AGEs. Da mesma maneira, o prejuízo no comportamento cognitivo provavelmente possa ser atribuído aos danos astrocitários e nas barreiras encefálicas observados no DM. O efeito da EX-4 na melhora cognitiva possivelmente seja devido aos seus efeitos na captação de glutamato, no conteúdo de GluN1 e na recuperação das barreiras do encéfalo. Ainda, os papéis já estabelecidos da EX-4 na ativação de vias de sinalização relacionadas com a aprendizagem e memória e na diminuição da expressão de mediadores inflamatórios, podem ter atenuado os danos causados pela hiperglicemia e pelo acúmulo de AGEs. No entanto, mais estudos são necessários para estabelecer o mecanismo de ação da EX-4 na recuperação dos danos causados pelo DM no SNC. / Diabetes mellitus (DM) is a metabolic disorder characterized primarily by chronic hyperglycemia. During the DM, attention is mainly focused on diseases affecting peripheral systems. However, DM complications may result in damage to the central nervous system (CNS), leading to cognitive impairments. In view of this, the aim of this thesis was to investigate changes in the CNS, particularly related to astrocytic functions and the functioning of the brain barriers in animal model of DM relying on the peripheral changes and to analyze the effect of exendin-4 (EX-4), an agonist of glucagon like peptide-1 (GLP-1) receptors, in reversing the parameters evaluated. The observed results showed peripheral and CNS damage resulting from DM. The DM was responsible for the excessive production of AGEs and changes in peripheral parameters such as body weight, blood glucose, glycated hemoglobin (HbA1c) and C-peptide When assessing the CNS, we observed impairment in cognitive functions, astrocytic parameters, dysfunctions in the brain barriers and decrease in N-methyl-D-aspartate (NMDA) GluN1 subunit content. Treatment with EX-4 reversed the cognitive impairment, damage in brain barriers, glutamate uptake and GluN1 content. However, the EX-4 had no effect in the glycemia and ADEs formation. The loss of astrocytic and brain barriers functions observed in DM may be due to the activation of signalling pathways triggered by high levels of AGEs. In addition, impairment in cognitive behavior can probably be attributed to astrocyte and brain barriers damage observed in DM. The effect of EX-4 on the cognitive improvement possibly be due to its effects on glutamate uptake, in the GluN1 content and in the recovery of the brain barriers. In addition, the EX-4 established roles in the activation of signalling pathways associated with learning and memory and in the decrease expression of inflammatory mediators, can attenuate the damage caused by hyperglycemia and by accumulation of AGE. However, further studies are needed to establish the mechanism of EX-4 action in the recovery of damage caused by DM in CNS.

O hipocampo é uma das principais estruturas relacionada aos processos de aprendizado e memória e também ao envelhecimento cerebral. Os astrócitos são células dinâmicas que mantém a homeostase cerebral, regulando sistemas de neurotransmissores, processamento da informação sináptica, metabolismo energético, liberação de fatores tróficos, defesas antioxidantes e resposta inflamatória. Considerando a relevância dessa estrutura cerebral e também a fundamental importância dos astrócitos para manutenção das condições fisiológicas do sistema nervoso central, nesse trabalho nós aprimoramos o estudo de um modelo de cultura de astrócitos hipocampais de ratos Wistar adultos (90 dias) e envelhecidos (180 dias), previamente padronizado pelo grupo. Observamos aqui a alteração da expressão dos principais marcadores gliais, em função da idade: proteína glial fibrilar ácida (GFAP), vimentina, transportadores de glutamato (GLAST e GLT-1) e enzima glutamina sintetase (GS). Além disso, também observamos alterações na liberação de GDNF, BDNF, S100B e TGF-β dependente da idade. Esses astrócitos ainda apresentaram parâmetros de estresse oxidativo/nitrosativo aumentados com o envelhecimento cerebral com simultânea disfunção mitocondrial e da enzima NADPH oxidase (NOX). Ainda em relação à homeostase redox, foram observadas disfunções nas enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa peroxidase (GPx) e glutationa (GSH) em função da idade. Os astrócitos maduros também desencadearam uma resposta inflamatória distinta dos astrócitos de animais neonatos com aumento dos níveis de citocinas proinflamatórias como TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 e MCP-1. Os principais mecanismos associados a alterações gliais em função da idade em cultura de astrócitos hipocampais envolve as vias de sinalização NFkB, p38, Nrf-2 e HO-1. Essas vias de sinalização estão relacionadas à homeostase redox e resposta inflamatória. Esses resultados reforçam o papel dos astrócitos hipocampais como alvo para o entendimento dos mecanismos envolvendo o envelhecimento cerebral bem como desordens neurológicas relacionadas a ele. / The hippocampus is one of the structures more closely related to behavior, neurochemical and cellular alterations during aging. Astrocytes are dynamic cells that maintain brain homeostasis by regulating neurotransmitter systems, synaptic information processing, energy metabolism, release of trophic factors, antioxidant defense and inflammatory response. Considering the importance of this brain structure and also the astrocyte importance for maintenance physiological conditions of the central nervous system, in this work we have improved the study of hippocampal astrocytes culture model of adult Wistar rats (90 days) and aged (180 days), previously standardized by the group. Here we see the age-dependent changes of expression of the major glial markers: glial fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, glutamate transporters (GLAST and GLT-1) and glutamine synthetase (GS).The GDNF, BDNF, S100B protein and TGF-β also changed their release with age. Astrocytes showed an age-dependent increase in oxidative/nitrosative stress with significant mitochondrial and NADPH oxidase (NOX) dysfunction. Furthermore, alterations related to age in superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx) activities and glutathione (GSH) levels contribute to impaired redox state. Astrocytes also displayed age-dependent inflammatory response with augment of proinflammatory cytokine levels such as TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-18 and chemokine MCP-1. The putative mechanisms associated to age-dependent changes in glial functionality in hippocampal astrocyte cultures involve NFκB, p38, Nrf-2 and HO-1 pathways. These signaling pathways are critical to interconnect redox homeostasis and inflammatory response. These results reinforce the role of hippocampal astrocytes as target for understanding mechanisms involved in aging and age-related neurological disorders.