Gliomas constituem um grupo heterogêneo de tumores cerebrais. Eles podem ser divididos em duas principais categorias: astrocíticos e oligodendrogliais. Os astrocíticos, objetos deste estudo, são classificados patologicamente em quatro subtipos baseado na presença ou ausência de atipia nuclear, mitose, neovascularização e necrose. Esta classificação é útil para definir tratamento e prognóstico. A origem glial é comumente confirmada pela detecção imunoistoquímica para GFAP. Neste trabalho nós investigamos o imunoconteúdo das proteínas marcadoras astrocíticas GFAP e S100B por ELISA e a atividade da enzima glutamina sintetase (GS) em tumores gliais e tecidos peritumorais de sete pacientes submetidos à ressecção cirúrgica. Os resultados demonstram elevados níveis de S100B em tecidos peritumorais não correlacionados com o grau de malignidade do tumor. Esta elevação poderia contribuir para manifestações convulsivas observadas em alguns pacientes. Em contraste com os dados obtidos pela imunoistoquímica para filamentos gliais, encontrou-se uma aparente correlação positiva entre o conteúdo de GFAP e o grau de malignidade do glioma. É possível que este aumento no conteúdo de GFAP seja referente a GFAP total (frações solúvel e insolúvel), em contraste com o conteúdo insolúvel (fibrilar e granular) detectado pela imunoistoquímica. A alta taxa GFAP/S100B (GFAP elevada/S100B reduzida) está de acordo com a sua elevada atividade mitótica, que pela sua vez poderia ser inibida pela S100B. Além disso, houve uma correlação positiva entre a atividade da GS e o grau de malignidade do tumor.

A dieta de restrição calórica (RC) tem apresentado efeitos que diminuem a progressão, ou previnem completamente, uma variedade de doenças associadas com o envelhecimento, incluindo doenças cardiovasculares, diabetes e doenças neurodegenerativas. O prejuízo da função celular astroglial, incluindo captação de glutamato, atividade da glutamina sintetase (GS) e secreção de S100B, além de parâmetros de estresse oxidativo alterados podem contribuir para a progressão de doenças neurológicas. Este estudo objetivou avaliar alterações astrocíticas hipocampais em resposta à RC, medindo parâmetros astrogliais, tais como: captação de glutamato, atividade da GS e imunoconteúdo de GFAP e S100B. Nós investigamos também, os efeitos da RC nos parâmetros hipocampais (Hc) e corticais cerebrais (Cx) de estresse oxidativo e de comportamento em ratos Wistar machos. Parâmetros bioquímicos sanguíneos também foram avaliados. Os ratos (60 dias de idade) foram alimentados com dieta ad libitum ou com RC por 12 semanas. Os animais do grupo RC apresentaram um ganho de peso menor, de aproximadamente 16% em relação ganho de peso do grupo controle. A RC induziu um aumento significativo (23%) na captação de glutamato e na atividade da GS (26%). Não houve diferença significativa no imunoconteúdo de S100B ou GFAP. Os parâmetros bioquímicos avaliados não diferiram entre os grupos, indicando bom estado de saúde. Além disso, a RC não alterou parâmetros de ansiedade, mas aumentou significativamente a atividade locomotora, elevou os níveis de GSH e diminuiu a atividade de GPx, diminuiu a produção de ERO. Além disso, não alterou a peroxidação lipídica, conteúdo de óxido nítrico e a atividade da catalase. A RC também diminuiu o nível basal de dano oxidativo ao DNA, medido pelo ensaio cometa. Em resumo, este estudo indica que a RC modula as funções astrocíticas, através do aumento da captação de glutamato e da atividade da GS, sugerindo que a dieta pode exercer seus efeitos neuroprotetores contra patologias do SNC através da modulação destas funções. A RC também pode induzir a modulação hipocampal e cortical cerebral, resultando em alterações metabólicas, que por sua vez, melhoram as condições basais de importantes parâmetros de defesa celular, como por exemplo, o aumento dos níveis de GSH e diminuição do dano oxidativo ao DNA. / The dietary caloric restriction (CR) has been shown to slow the progression of, or even prevent entirely, a range of age-dependent pathologies, including cardiovascular disease, diabetes and neurodegenerative diseases. The impairment of astroglial cell function, including glutamate uptake, glutamine synthetase (GS) activity and S100B secretion, besides oxidative stress parameters altered, may contribute to the progression of neurological disorders. The present study aimed to evaluate hippocampal astrocytic changes in response to CR diet, measuring astroglial parameters, such as glutamate uptake, GS activity and the immunocontent of GFAP and S100B. We investigated also the effects of CR on hippocampal (Hc) and cerebral cortical (Cx) oxidative stress and behavioral parameters in male Wistar rats. Blood biochemical parameters were also analyzed. Rats (60-day old) were fed ad libitum or on CR diets for 12 weeks. CR-fed rats showed approximately 16% less body weight gain than control rats. The CR diet was able to induce a significant increase in glutamate uptake (23%) and in GS activity (26%). There were no statistically significant differences in the immunocontent of either GFAP or S100B. No differences were observed in the biochemistry parameters evaluated, indicating normal healthy. CR did not alter anxiety parameters but increased locomotion performance; increased glutathione content; decreased glutathione peroxidase activity; decreased reactive oxygen species production and did not altered lipid peroxidation, nitric oxide content and catalase activity. Also, CR diet decreased basal DNA damage index, measured by comet assay. In summary, the present study indicates that CR modulates astrocyte functions by increasing glutamate uptake and GS activity, suggesting that CR might exert its neuroprotective effects against brain illness by modulation of astrocytic functions. The CR diet also induced hippocampal and cerebral cortical modulation, resulting in metabolic changes which in turn improve the basal status of important parameters of cellular defenses, such as the increased glutathione content and decreased DNA damage.

Submitted by Automação e Estatística (sst@bczm.ufrn.br) on 2018-07-26T17:35:31Z No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2018-07-27T20:19:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-27T20:19:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KellySoaresFarias_TESE.pdf: 6619140 bytes, checksum: 0781e67a43aafb62031ffc8c16432ec1 (MD5) Previous issue date: 2018-02-28 / Os astrócitos, células especializadas da glia, estão envolvidos na homeostase extracelular por tamponar íons de potássio (K+), metabolizar neurotransmissores, controlar o disparo e a sincronização neuronal e contribuir para a formação da barreira hematoencefálica. Em condições patológicas, os astrócitos podem alterar a sua morfologia (hipertrofia dos seus processos celulares) e bioquímica (aumento da expressão da proteína ácida fibrilar glial, GFAP), sendo conhecidos por astrócitos reativos (a.k.a., gliose reativa). Apesar de serem frequentemente observados em regiões cerebrais associadas à geração e propagação de crises epilépticas, a participação dos astrócitos reativos na sincronização anormal é pouco conhecida. Enquanto os astrócitos modificam o metabolismo do potássio e do glutamato, a sua reativação, por períodos prolongados, pode levar à disfunção da atividade neuronal. A epilepsia do lobo temporal (ELT), uma das formas mais comuns de epilepsia e frequentemente associada à refratariedade ao tratamento farmacológico, é caracterizada por morte neuronal em regiões temporais (esclerose do hipocampo), reorganização sináptica (brotamento aberrante de fibras musgosas) e gliose reativa. Nessa tese testamos a hipótese de que o transplante de astrócitos imaturos no hipocampo de animais cronicamente epiléticos reduzirá a atividade epileptiforme, incluindo a ocorrência de crises espontâneas eletrográficas e comportamentais. Para isso, os animais foram feitos epilépticos pela injeção sistêmica da pilocarpina (que induziu o estado epiléptico, SE) e foram transplantados unilateralmente no hilo do giro denteado (GD) com astrócitos que expressavam a proteína fluorescente verde (GFP+) 30 dias após o SE. A alocação dos animais epilépticos nos grupos controle (SE-controle) e experimental (SE-astro GD) foi feita de acordo com a severidade comportamental do SE. Atividades epileptiformes espontâneas (espículas interictais, oscilações de alta frequência e crises recorrentes) foram registradas em ambos os hipocampos (tratado e não tratado) usando eletrodos cronicamente implantados. A sobrevivência dos astrócitos foi de 1 %. Astrócitos GFP+ foram encontrados em diversas sub-regiões hipocampais por até sete meses após o transplante, sendo que algumas células migraram aproximadamente até 1500 µm no polo anteroposterior. Essas células foram localizadas principalmente no hilo, na camada granular do giro dentado e na camada molecular do hipocampo, e em alguns animais, no córtex, tálamo e fímbria. Células ou grupos de tecidos indicativos de tumor não foram identificados. A atividade epileptiforme eletrográfica foi registrada em 80% dos animais controle (SE-controle, N = 8/10), em 80% dos animais experimentais com astrócitos GFP+ localizados no córtex (SE-Astro Córtex, N = 4/5) e em 60% dos animais com astrócitos GFP+ no hipocampo (SE-Astro GD, N=2/5). A frequência de crises espontâneas foi variável entre os animais (21 vs 12 vs 1 crises espontâneas registradas nos grupos SE-control, SEAstro Córtex e SE- Astro GD, respectivamente) e não houve diferença na frequência de crises entre os grupos (crises/hora: 0,05 ± 0,01 vs 0,03 ± 0,003 vs 0,02, para SE-controle e SE-Astro Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). O transplante dos astrócitos não alterou a duração das crises (67,5 ± 3,6 s vs 74,2 ± 3,9 s vs 65,3, para SE-controle e SE-Astro Córtex e SE-Astro GD, respectivamente). Além disso, não observamos diferenças quanto à morfologia, periodicidade ou frequência das espículas interictais do hipocampo entre os grupos experimentais e/ou entre os hemisférios tratados. Interessantemente, o transplante de astrócitos reduziu significativamente a severidade das crises comportamentais nos animais que receberam astrócitos no córtex (Escala livre: 5,0 ± 0,6 vs 4,0 ± 0,4, SE-controle e SE-Astro Córtex, respectivamente, p=0,02, teste de MannWhitney). O grupo SE-Astro GD apresentou apenas uma crise epiléptica e, portanto, não candidato a estatística. Nossos resultados enfatizam o uso da terapia celular para o tratamento das epilepsias e reforçam a importância do sítio do transplante para a redução da atividade epileptiforme. / Astrocytes are specialized glial cells involved in the extracellular homeostasis by buffering potassium cation (K+) concentration, metabolizing neurotransmitters, controlling neuronal firing and synchronization and contributing to the blood-brain barrier. Under pathological conditions, astrocytes may change their morphology in order to compensate abnormal function, being referred to as activated astrocytes (reactive gliosis). This phenomenon is commonly observed in brain regions associated with seizure generation and spread, although its role in abnormal synchronization is unknown. While astrocytes can enhance potassium and glutamate-related metabolism, sustained long-term reactivation can lead to neuronal dysfunction. Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common form of epilepsy and is usually associated to refractoriness. TLE is characterized by extensive cell death (hippocampal sclerosis), synaptic reorganization (mossy fiber sprouting) and reactive gliosis. Here, we hypothesize that transplantation of immature astrocytes in chronically epileptic hippocampus would reduce epileptiform activity, including the occurrence of electrographic and behavioral seizures. To test this hypothesis, animals made epileptic by the systemic injection of pilocarpine (which induced status epilepticus, SE) were unilaterally transplanted with green fluorescent protein-positive (GFP) astrocytes into the hippocampus 30 days after the SE. Group assignment (SE-Saline e SE-Astro GD) was made according to SE behavioral severity and spontaneous epileptiform activities (interictal spikes, high-frequency oscillations, seizures) were recorded in both (treated and untreated) hippocampi using chronically implanted multi-electrodes. Astrocytes had migrated approximately 1500µm injection site, and survival rate was 1%. Astrocytes were found in the host hippocampus seven months after transplantation and were mainly localized at the hilus, at the granular layer of the dentate gyrus, at molecular layer of hippocampus. Cells or tissue clusters indicative of tumor were not identified. In a second group, astrocytes were found in the cortex and constituted the SE-Astro Cortex group. No difference was found in epileptiform activity recorded between groups. Epileptiform electrographic activity was recorded in 80% of control animals (SE-Saline, N= 8/10, in 80% of SE-Astro Cortex group (SE-Astro Córtex, N=4/5) and in 60% of animals that received astrocytes into the hippocampus (SE-Astro GD, N=2/5). Spontaneous seizure occurrence was variable between animals (21 vs 12 vs 1 recorded seizures in SE-Saline and SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively), however, no difference was observed in seizure frequency between groups (seizures/hour: 0.05±0.01 vs 0.03±0.003 vs 0.02, SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro GD, respectively). Astrocytes grafting did not change seizure duration (67.5 ± 3.6 s vs 74.2 ± 3.9 s vs 65.3 s for SE-Saline, SE-Astro Cortex and SE-Astro GD groups, respectively). Also, we did not observe any difference in the morphology, periodicity or frequency of hippocampal interictal spikes between experimental groups and/or treated hemisphere. Additionally, however, the animals of SE-Astro Cortex group showed reduced behavioral seizure severity (scores: 5 ± 0.1 vs 4 ± 0.4; for SE-Saline and SE-Astro Cortex, respectively; p =0.02, Mann-Whitney test). SE-Astro GD group animals showed only one spontaneous seizure, and therefore not a candidate for statistics. Even thought the small sample size, our results present the cell therapy relevance for the treatment of epilepsies and reinforce importance of transplantation site for epileptiform activity reduction.

Orientador: Cláudio Aparecido Casatti / Resumo: As teneurinas (TENs) pertencem a uma família de proteínas transmembrana do tipo II constituída por quatro membros homólogos, estruturalmente conservados entre as espécies. Essas proteínas estão presentes no SNC, principalmente durante a neurogênese, colaborando na estabilização dos circuitos neurais. Estudos neuroanatômicos mostraram que as TENs apresentam distribuição similar em peixes, aves e roedores durante o desenvolvimento e maturação do SNC, permanecendo em algumas regiões em animais adultos. A participação das TENs durante reparação tecidual tem sido pobremente explorada; entretanto a presença neurestina (uma proteína homóloga a Ten-2) foi notada em neurônios do bulbo olfatório de ratos adultos, após indução de lesão química na mucosa olfatória. O propósito do presente estudo foi verificar possíveis alterações na Ten-2 após indução de lesão mecânica no córtex cerebral de ratos adultos empregando técnicas de imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR convencional). Para isso, ratos machos adultos (Rattus norvegicus, n=32) foram divididos em grupo controle (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 12 horas pós-operatório (n=4, IHQ; n=4, PCR), grupo lesão 24 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR) e grupo lesão 48 horas (n=4, IHQ; n=4, PCR). A lesão mecânica foi realizada usando agulha hipodérmica de metal (0,8mm de diâmetro) acoplada ao aparelho estereotáxico (coordenadas AP: +10,21 mm; DV: -2,5 mm e ML: +1,5 mm). Os animais do grupo controle não foram submetidos aos pr... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Teneurins (TENs) constitute a type II transmembrane protein family with four homologues structurally preserved among the species. These proteins are present in the central nervous system (CNS), mainly during neurogenesis, collaborating in the establishment of neuronal circuits. Neuroanatomic studies showed that TENs have compatible distribution among fish, chicken and rodents, during development and maturation of the CNS, remaining in a few regions in adult animals. The participation of TENs during tissue repair in the CNS has been scarcely explored; however, the unusual presence of neurestin (a homologue Ten-2 protein) was noticed in neurons of adult rat olfactory bulb, after chemically induced lesion in the olfactory mucosa. The purpose of the present study was to verify possible Ten-2 alterations after induced mechanical lesion in the adult rat cerebral cortex using immunohistochemistry (IHQ) and conventional polymerase chain reaction (PCR) techniques. For this, adult male rats (Rattus norvegicus, n=32) were divided into control group (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 12h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR), 24h lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) and 48h postoperatory lesion (n=4, IHQ; n=4, PCR) groups. The mechanical lesion was created using a hypodermic metal needle (0.8 mm of diameter) coupled with stereotaxic apparatus (coordinates: AP, +10.21 mm; DV, -2.5 mm; ML, +1.5 mm). Animals from control group were not submitted to surgical procedures. For IHQ analysis, animals were submitted to transc... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A fatty high diet causes inflammation in the hypothalamus, mainly in the neurons that control satiety and thermogenesis. Moreover, activation of apoptosis via TLR4 (toll like receptor 4) is observed in conjunction with inflammatory condition. The neuronal death is a process that involves the release of cytokines and glial activation. The microglia have immune function in nervous tissue, but the astrocytes, the main component of glia, is more involved in synaptic plasticity and chronic responses of the Central Nervous System. Moreover, these cells in the hypothalamus, which is the center of energy metabolism control, have specific characteristics, with receptors for fatty acids, glucose and leptin. In this context, we investigated the response of astrocytes after in vitro treatment with fatty acids on cortical and hypothalamic astrocytes. To that end, we made the dissociation of the cortex and hypothalamus of Swiss mice (1-2 days) and the cells were plated for procedures. Treatments were performed with different doses of stearate (100μM, 200μM and 2mM) and palmitate (200μM, 500μM and 5mM) for one week. Immunocytochemistry was performed with anti-GFAP (evaluates the astroglial reactivity) and anti-NFB (transcription factor that participates in the TLR-4 pathway) and TNF- dosage by ELISA. Dosage of 200μM medium were reserved after 3 days of contact with astrocytes that were treated with palmitate or stearate, for obtaining conditioned medium that were stocked for neurons culture treatment. Cultures of hypothalamic neurons (lineage CLU189) were treated for 3 or 6 days with conditioned medium, in sequence, in this cultures, were performed immunocytochemistry with caspase3 (apoptosis marker) and anti- Ki-67 (cell proliferation marker). The immunostaining was quantified and statistically treated for comparison of experimental and control groups. The results showed that treatment with stearate enhances the expression of GFAP and NFB only in astrocytes from the hypothalamus. The TNF- was upregulated in conditionated medium used for treatment of hypothalamic cells, however this augment did not interfere with apoptosis rate in CLU 189 cultures in first three days of contact with conditionated medium and, in the sixth day, in comparison to conditioned control medium only in astrocytes. Such results showed the protection provided for substances had released by reactived astrocytes from hypothalamus. Also, our results showed that neurons could respond to fatty acid without other cell intervention. / Uma dieta rica em gorduras provoca inflamação no hipotálamo, principalmente nos neurônios que controlam a saciedade e termogênese. Além disso, a ativação de apoptose via TLR4 (toll like receptor 4) também foi observada. A morte neuronal é um processo que envolve a ativação da glia e liberação de citocinas. A microglia tem a função imune no tecido nervoso, mas os astrócitos, o componente mais abundante das células gliais, está mais envolvido com a plasticidade sináptica e respostas crônicas do Sistema Nervoso Central. Além disso, essas células, no hipotálamo, que é o centro controlador do metabolismo energético, têm características específicas, apresentando receptores para ácidos graxos, glicose e leptina. Neste contexto, investigamos a reação dos astrócitos após o tratamento com ácidos graxos em culturas de astrócitos hipotalâmicos e corticais. Para tanto, foi feita a dissociação do córtex e hipotálamo de camundongos Swiss (1-2 dias) e os astrócitos foram plaqueados para os experimentos. Essas culturas foram tratadas com doses diferentes de estereato (100μM, 200μM e 2mM) e palmitato (200μM, 500μM e 5mM) durante uma semana. Foi realizada a imunocitoquímica com o anticorpo anti-GFAP (avalia a reatividade dos astrócitos) e anti- NFB (fator de transcrição que participa da via de ativação TLR-4) e a dosagem de TNF- por ELISA. O meio na dose de 200μM foi recolhido após 3 dias de contato com astrócitos tratados com estereato ou palmitato, para a obtenção de meio condicionado, o qual foi estocado para tratamento de culturas de neurônios. Foram utilizadas culturas de neurônios hipotalâmicos (linhagem CLU189) para o tratamento, por 3 ou 6 dias, com o meio condicionado, e posteriormente, nessas culturas, foi realizada a imunocitoquímica com os anticorpos anti-caspase3 (avalia morte celular por apoptose) e anti-ki-67 (marcador de célula em proliferação). As imunomarcações foram quantificadas e tratadas estatisticamente para comparação dos grupos experimentais e controles. Os resultados mostraram que o tratamento com estereato intensifica a expressão de GFAP e NFB somente em astrócitos do hipotálamo. O TNF- estava aumentado no meio condicionado usado no tratamento de células do hipotálamo, mas esse aumento não interferiu na apoptose nas culturas de CLU189 nos 3 primeiros dias para os meios condicionados, e no 6º dia, em relação ao meio condicionado somente em astrócitos. Mostrando certa proteção fornecida por substâncias produzidas pelos astrócitos hipotalâmicos. Ainda, nossos dados também mostraram que os neurônios respondem, sem mediação de outro tipo de célula, ao tratamento com ácido graxo. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Made available in DSpace on 2013-08-07T18:41:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000396843-Texto+Completo-0.pdf: 208677 bytes, checksum: 50ebe2518a717c97f6596659cfc38e2f (MD5) Previous issue date: 2006 / Background: obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome (OSAHS) is considered a comorbity associated to morbid obesity mainly due to the large neck circumference. Depending on its severity, OSAHS can interfere in many systems homeostasis as, for example, central nervous system (CNS). Neuron Specific enolase (NSE) and S100B protein provenient from astrocytes, are considered sensible cerebral injury biochemical markers. We evaluated in this study, serum S100B and NSE levels, with the objective to mark possible cerebral injuries of OSAHS over CNS. Methods: this is a transversal study with data provenient from 25 OSAHS morbid obese patients. Blood samples were collected before and after polisomnographic exam for S100B and NSE protein dosage. We also analyzed data provenient from depression and excessive daytime sleepiness. Results: S100B levels were higher after [0,029 (0,010-0,199) than before [0,010 (0,010-0,025) ] PSG (P=0,002). S100B levels are expressed in median and IQ25-IQ75. NSE levels did not show significative diferences between after and before PSG. Conclusions: Study shows significative S100B level variations when compared after and before PSG. This suggests that there is a CNS astrocyte reaction because of possible cerebral hypoxemy in OSAHS morbidly obese patients. / Embasamento teórico e objetivos: a síndrome das apnéias-hiponéias obstrutivas do sono (SAHOS) é uma comorbidade associada à obesidade mórbida principalmente em função da grande circunferência do pescoço. Dependendo da sua gravidade, a SAHOS pode interferir na homeostasia de inúmeros sistemas, como por exemplo o sistema nervoso central (SNC). A enolase neurônio-especifica (NSE) e a proteína S100B, proveniente do astrócito, são considerados marcadores sensíveis para lesão cerebral. Nesse estudo avaliamos os níveis séricos de S100B e NSE com o intuito de marcar possíveis injúrias causadas pela SAHOS ao SNC. Pacientes e métodos: nós estudamos dados provenientes de 25 pacientes obesos mórbidos portadores de SAHOS e realizamos a coleta de sangue antes e após o exame polissonográfico (PSG) para a dosagem das proteínas S100B e NSE. Também foram analisados dados relativos a depressão e sonolência diurna excessiva. Resultados: Os valores de S100B foram maiores após [0,029 (0,010-0,199)] em comparação com antes [0,010 (0,010-0,025)] µg/l da PSG (P=0,002). Os valores são expressos em mediana e IQ25-IQ75. Os valores de NSE não mostraram diferenças significativas entre antes e depois do sono. Conclusões: o estudo mostra variações significativas em níveis de S100B quando comparados antes e depois exame polissonográfico.

As hiperhomocisteinemias (HHcy), leve e moderada são consideradas um fator de risco para doenças cardiovasculares e cerebrais, entretanto os mecanismos e as complicações decorrentes dessa condição ainda não estão bem estabelecidos. Ela ocorre em 5-10% da população geral e em 40% dos pacientes com doenças vascular periférica e doenças cerebrovasculares. Estudos recentes têm demonstrado que a vitamina D (calcitriol) possui efeitos protetores em diversos modelos experimentais que enfatizam suas possíveis ações antioxidantes. O objetivo principal dessa tese de doutorado foi estabelecer um protocolo experimental com diferentes concentrações de homocisteína em fatias de cortex cerebral e coração e em cultura de astrócitos de ratos adultos. Seguindo esses modelos experimentais, investigamos alguns parâmetros bioquímicos em córtex cerebral e coração de ratos. Posteriormente foi analisado o efeito protetor do calcitriol. No primeiro capítulo da presente tese, observamos que a incubação de 30 μM de Hcy por 30 min e 60 min em fatias de coração, alterou a função e a permeabilidade mitocondrial, o estado redox e a atividade das enzimas da cadeia respiratória; o calcitriol foi capaz de prevenir a maioria dos efeitos da Hcy. No segundo capítulo, vimos que em fatias de córtex cerebral a Hcy prejudica o metabolismo energético, aumentando a morte neuronal e induzindo estresse oxidativo. Todavia, o calcitriol atenuou esses efeitos deletérios induzidos pela Hcy através da ativação do receptor de vitamina D. No último capítulo desta tese, realizamos um estudo em cultura primária de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos. Nossos resultados demonstram que a Hcy ativa a via do fator nuclear kappa B (NFκB), inibindo a expressão de heme oxigenase 1 (HO-1), promovendo alterações morfológicas, aumentando a resposta inflamatória e diminuindo as defesas antioxidantes e a atividade da Na+, K+ - ATPase. Em resumo, em todos modelos experimentais estudados nesta tese, a Hcy, mesmo em concentrações leves e moderadas causou alterações na homeostasia celular. A vitamina D preveniu parte destes efeitos, tornando-se um possível ferramenta terapêutica no intuito de atenuar os efeitos da Hcy. / Hyperhomocysteinemia (HHcy), mild and moderate are a risk factor for cardiovascular and cerebral diseases, but the mechanisms and complications of this condition are not yet well established. It occurs in 5-10% of the general population and 40% of patients with peripheral vascular and cerebrovascular disease. Recent studies have shown that vitamin D (calcitriol) has protective effects in various experimental models which emphasize their potential antioxidant actions. The main objective of this PhD thesis was to establish an experimental with different concentrations of homocysteine in slices of cerebral cortex and heart in adult rat astrocyte cultures. Following this experimental model, we investigated some biochemical parameters in the cerebral cortex and heart of rats. It was subsequently examined the protective effect of calcitriol. In the first chapter of this thesis, we found that incubation of 30 μM of Hcy for 30 min and 60 min in heart slices change the function and mitochondrial permeability, redox state and activity of the enzymes of the respiratory chain; calcitriol was able to prevent most of the effects of Hcy. In the second chapter, we demonstrated that Hcy in the cerebral cortex slices impairs energy metabolism, increasing neuronal death and inducing oxidative stress. However, calcitriol attenuated these Hcy-induced deleterious by activation of vitamin receptor D. In the last chapter of this thesis, we conducted a study in primary culture of cortical astrocytes. Our results demonstrate that the Hcy active the pathway of nuclear factor kappa B (NFκB) inhibiting heme oxygenase expression 1 (HO-1), promoting morphological changes, increasing the inflammatory response and decreased antioxidant defenses and activity of the Na +, K + - ATPase. In summary, in all experimental models studied in this PhD thesis, Hcy, even in mild and moderate concentrations caused deleterious actions in cellular homeostasis. Vitamin D warned of these effects, becoming a potential therapeutic target in order to attenuate the effects of Hcy.

O diabetes mellitus tipo I é uma enfermidade autoimune relacionada com anormalidades genéticas, influenciada por fatores ambientais, que resultam na destruição de células β-pancreáticas, mediadas por células T. O diabetes durante a gravidez aumenta o risco a alterações no sistema nervoso central. O processo de gliogênese é importante para o desenvolvimento e funcionamento do SNC e começa na segunda semana de gestação, em ratos. A glia é composta por astrócitos, oligodendrócitos, células ependimais e microglia. Os astrócitos são as células mais abundantes e responsáveis pela integração do cérebro com o sistema vascular e imunológico, estando relacionados com as funções cognitivas, além de uma importância física e estrutural na barreira hemato-encefálica. Duas proteínas astrocíticas foram estudadas aqui: a proteína glial fibrilar acida e a S100B, uma proteína ligante de cálcio, produzida e secretada por astrócitos. A S100B está envolvida na comunicação neurônio-glia, possuindo propriedades neurotróficas ou neurotóxicas de acordo com a concentração extracelular. A expressão da proteína glial fibrilar ácida é essencial para a estrutura encefálica e para a integridade da barreira hemato-encefálica. Assim avaliamos essas proteínas gliais na prole oriunda de mães diabéticas (PoD) no desenvolvimento corporal e do sistema nervoso central. Foram utilizadas ratas Wistar-Kyoto diabéticas induzidas por estreptozotocina para obtenção da prole. As fêmeas diabéticas induzidas apresentaram ninhadas menores do que o controle, e os filhotes apresentam menor peso ao nascer A hiperglicemia materna induz aumento da produção insulínica no feto, que leva a um quadro de hipoglicemia pós-natal. Os níveis glicêmicos do PoD foram superiores ao controle (PoC) com 1 dia, e inferiores com 21 dias. A mensuração da proteína S100B no soro de animais PoD14 apresentou diminuição em relação ao controle. A S100B no líquor mostrou valores foram maiores no PoD7. Já a S100B no hipocampo mostrou um crescimento progressivo, com diminuição no PoD14 e um aumento no PoD28. Na quantificação da proteína glial fibrilar acida os animais do grupo PoD7 e PoD14 apresentaram valores menores, em seguida os níveis começaram a subir. No teste de campo aberto os animais PoD apresentaram comportamento ansioso. Já no reconhecimento de objetos os ratos PoD exploraram menos o objeto novo, tanto na memória de curta como de longa duração. As mudanças astrogliais observadas nos animais do grupo PoD estão muito provavelmente relacionadas a alterações da plasticidade neuroglial e ao déficit cognitivo observado. / The type I diabetes mellitus is an autoimmune disease associated with genetic abnormalities, influenced by environmental factors which result in the destruction of pancreatic β-cells, mediated by T cells. Diabetes during pregnancy increases the risk of changes in the central nervous system. The gliogenesis process is important to the development and functioning of the central nervous system and starts the second week of rat gestation. The glia is composed of astrocytes, oligodendrocytes, ependymal cells and microglia. The astrocytes are more abundant cells and responsible for the integration of the brain with vascular and immune systems, being connected with the cognitive functions, as well as a physical and structural importance of the blood-brain barrier. Two astrocity proteins were studied: glial acidic fribrilar protein and S100B, a binding protein of calcium produced and secreted by astrocytes. S100B is involved in neuron-glia communication, having neurotoxic or neurotrophic properties according to the extracellular concentration. Expression of glial acidic fribrilar protein is essential for brain structure and integrity of the blood-brain barrier. So we evaluated this glial proteins the offspring derived from diabetic mothers (PoD) on body development and central nervous system. Wistar-Kyoto rats with diabetes induced by streptozotocin to obtain offspring. Induced diabetic females had smaller litters then the control, and the offsprig have a lower birth weigth Maternal hyperglycemia induces increased insulin production in the fetus. Blood glucose levels were higher in PoD than the control (PoC) with 1 day and less than 21 days. The measurement of S100B protein in PoD14 animal serum showed a decrease compared to the control. The S100B in cerebrospinal fluid showed values were higher in PoD7. Since S100B in the hippocampus showed a progressive increase with decrease in PoD14 and increase in PoD28. Glial acidic fribrilar protein quantification in animals of PoD7 and PoD14 group showed lower values, and then levels began to rise. In the open field test the PoD animals showed anxious behavior. Since the object recognition (RO) least rats explored the new object in both short and long term memory. Induced diabetic females had smaller litters than the control, and the chicks have a lower birth weight. Maternal hyperglycaemia induces increased insulin production in the fetus, which leads to a postnatal hypoglycemia. The variations observed in the animals of group PoD caused biochemical changes related to astroglial plasticity, which caused cognitive impairment.

Os astrócitos são células gliais do sistema nervoso central (SNC) que, entre diversas funções, tem um importante papel na manutenção do ambiente extracelular, removendo neurotransmissores e íons os quais podem ser tóxicos em altas concentrações. Estas células estão envolvidas em diversas doenças neurodegenerativas e representam um importante alvo de estudo para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas. A técnica de cultura primária (CP) de astrócitos de ratos é amplamente utilizada como modelo para o estudo de características mecânicas e bioquímicas dessa célula em um sistema isolado. Alternativamente, astrócitos imortalizados por transfecção (AI) e a linhagem C6 de rato (C6) são usados como modelo astrocítico, uma vez que são células mais homogêneas, além de serem de fácil e rápida manipulação. No entanto, apesar de resultados divergentes serem encontrados na literatura, existe uma carência de estudos comparativos entre estes três modelos experimentais. A escolha de um modelo adequado para o estudo destas células nos permitiria estudar de forma mais precisa as funções extracelulares de proteínas como a S100B. Essa proteína pode ser liberada ou secretada principalmente por astrócitos no SNC e, apesar de possuir efeitos tróficos, exerce funções tóxicas, quando em altas concentrações no meio extracelular. Apesar disso, pouco se sabe sobre o processo de remoção da S100B extracelular. Em vista disso, o objetivo desta tese foi comparar e caracterizar funcionalmente a CP, AI e C6 no que diz respeito a diferenças morfológicas, marcadores proteicos e funções clássicas astrocíticas, bem como estudar a capacidade destas células de internalizar a proteína S100B, avaliando-se o mecanismo deste processo. Além disso, foi realizada a padronização de um ensaio colorimétrico utilizando a atividade glutamil-transferase da glutamina sintetase (GS), visto a carência deste ensaio em cultura de astrócitos e em diferentes estruturas cerebrais. Esta enzima é considerada um marcador astrocítico e sua disfunção pode comprometer o ciclo glutamina-glutamato, processo relacionado ao quadro de excitotoxicidade glutamatérgica, observado em doenças neurodegenerativas. O ensaio mostrou-se preciso, sensível, linear, específico e com alta aplicabilidade no SNC e nos modelos de cultura celular. Nossos resultados mostraram que as duas linhagens celulares (AI e C6) foram positivas para proteínas características de astrócitos, bem como funcionais no metabolismo glutamatérgico e energético. No entanto, estes parâmetros mostraram-se reduzidos em estado basal em comparação com a CP. Frente a estímulos específicos, os AI não se mostraram como um modelo reprodutível das funções astrocíticas clássicas, ao contrário da linhagem C6, a qual apresentou resposta similar aos astrócitos de CP. De forma geral a linhagem C6 representou um modelo válido para estudo das características astrocíticas estudadas, porém sempre com valores basais reduzidos quando comparados com a CP que, em nossa avaliação, representou um melhor modelo para o estudo da internalização da proteína S100B. Estas células foram capazes de endocitar a S100B extracelular por um mecanismo dependente de RAGE e dinamina. Uma vez internalizada, a S100B seguiu pela via endocítica, colocalizando com importantes marcadores, como Dextran e Lysotracker. As vesículas de S100B mostraram um aumento de direcionalidade ao longo do tempo de incubação, afetado pela variação de cálcio intracelular. Estes dados mostram a importância da escolha de um modelo in vitro adequado de cultura de astrócitos, bem como evidenciam o importante papel destas células na remoção de concentrações tóxicas da proteína S100B do meio extracelular, auxiliando na compreensão dos mecanismos de sinalização desta proteína. / Astrocytes are glial cells that participate in a variety of function of central nervous system (CNS) such as the maintenance of the extracellular environment, removing toxic concentration of ions and neurotransmitters. These cells are involved in several neurodegenerative diseases and are important targets for the development of therapeutic strategies. Astrocyte primary culture (PC) is a potent instrument to study these cells in an isolated system, allowing the elucidation of mechanistic features specific for this type of cell. An alternative to this model is the use of cell lines, such as immortalized astrocytes (IA) or C6 glioma cells (C6). These linages have the advantage to present more homogeneous features, are easily, faster and lower cost to manipulate. Despite these facilities, cell lines present highly proliferative features and some different characteristics in comparison to PC, which put into question the validity of them as an astrocytic model. The selection of a suitable model to the study of astrocytes would allow us to evaluate protein extracellular effects, such as S100B with greater reliability. This protein is released and secreted mainly by astrocytes in the CNS, exerting trophic and toxic effect in a RAGE dependent manner. S100B toxic effects are shown in high extracellular concentrations, although the clearance of this protein from the extracellular space is poorly understood. In view of this, the goal of this research was to show a comparative analysis of PC, IA and C6 regarding morphological features, protein profile and classical astrocytic functions. Furthermore, we evaluated the mechanism of S100B internalization, characterization of internalized vesicles and intracellular dynamics in astrocytes. In addition, the standardization of a colorimetric assay to measure the glutamyl-transferase activity of glutamine synthetase (GS) was performed, considering the lack of this study in culture of astrocytes and different brain structures. This enzyme is considered an astrocytic marker and any dysfunction may compromise the glutamine-glutamate cycle, which is observed in many neurodegenerative diseases. The assay was accurate, sensitive, linear, specific and with high applicability in the CNS. Our results showed that the two cell lines (IA and C6) were positive for characteristic proteins of astrocytes, although expressing less quantities then PC. Similarly, the glutamatergic and energetic metabolism and cellular communication by gap junction also showed to be reduced in lineages cells. IA did not reveal a reproducible model of classic astrocytic functions, in opposite to C6 cells that presented a similar response to PC when submitted to the same stimulus. Nevertheless, PC showed pronounced astrocytic characteristics, representing the best model for the study of S100B protein internalization. The results in this study revealed that cultured astrocytes efficiently remove fluorescently labeled extracellular S100B in a time-dependent manner by vesicle endocytosis. The internalization was RAGE and dynamine dependent. In time, vesicles capturing S100B exhibit directional mobility, meaning that vesicles get functionally attached to the cytoskeleton. Moreover, the mobility of vesicles capturing S100B was affected by changes in [Ca2+]. These data support to the understanding of the mechanism of extracellular signaling of S100B protein, as well as the role of astrocytes in this regulation.

O hipotálamo é uma região cerebral fundamental na detecção e na integração de sinais nutricionais e hormonais da periferia, proporcionando mudanças fisiológicas adequadas para a manutenção da homeostase energética, além de estar envolvido em outras funções essenciais aos organismos, tais como a regulação do balanço energético, da temperatura corporal, do ritmo circadiano e da reprodução. O hipotálamo também é uma estrutura crucial durante o envelhecimento, em virtude do papel dominante que desempenha no organismo e, considerando-se o aumento da expectativa de vida da população mundial, entender as alterações ocorridas nesta região cerebral pode ajudar a elucidar mecanismos patofisiológicos de doenças neurometabólicas, bem como levar a uma melhora na qualidade de vida dos indivíduos. Os astrócitos hipotalâmicos desempenham várias funções que podem afetar diretamente a homeostase energética, pois estas células estão envolvidas na detecção e no transporte de nutrientes, e expressam receptores para hormônios metabólicos e neuropeptídios, podendo modular a atividade dos neurônios responsáveis pelo controle do apetite e saciedade. Além disso, este tipo celular participa da resposta inflamatória na região hipotalâmica, podendo levar à resistência à leptina e à intolerância à glicose. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi avaliar as características morfofuncionais de culturas primárias de astrócitos hipotalâmicos de ratos Wistar recém-nascidos, adultos e envelhecidos (1-2 dias, 90 dias e 180 dias, respectivamente). Foram observadas alterações idade-dependentes na regulação da homeostase glutamatérgica, biossíntese da glutationa, perfil de aminoácidos, metabolismo da glicose, suporte trófico, resposta inflamatória e sensibilidade à leptina. Além disso, verificou-se que importantes vias de sinalização, tais como Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS e PI3K/Akt, apresentaram alterações com o passar da idade. Portanto, este estudo evidencia que a capacidade homeostática dos astrócitos hipotalâmicos se mostra alterada ao longo do processo de envelhecimento e que, consequentemente, estas células podem estar envolvidas no desenvolvimento de distúrbios metabólicos, tornando-se alvos terapêuticos em potencial. / The hypothalamus is a fundamental brain region in the detection and integration of nutritional and hormonal signals from the periphery, providing adequate physiological changes to maintain energy homeostasis, besides being involved in other essential functions to the organisms, such as: energy balance, temperature, circadian rythm and reproduction. Additionally, the hypothalamus is crucial in the aging process, due its neurometabolic role, and considering the extending human life span, understanding the changes in this brain region might contribute to elucidate the patho(phisio)logical mechanisms of neurometabolic diseases, as well as might improve the healthy of individuals. Hypothalamic astrocytes perform various functions that may directly affect energy homeostasis, since these cells are involved in the detection and transport of nutrients, and express receptors for metabolic hormones and neuropeptides, thus modulating the activity of neurons responsible for controlling appetite and satiety. In addition, these cells participate in the inflammatory response in the hypothalamic region, and may lead to leptin resistance and glucose intolerance. Thus, the aim of this study was to evaluate the morphofunctional properties of primary cultures of hypothalamic astrocytes from newborn, adult and aged Wistar rats (1-2 days, 90 days and 180 days, respectively). Age-dependent changes in the regulation of glutamatergic homeostasis, glutathione biosynthesis, amino acid profile, glucose metabolism, trophic support, inflammatory response and leptin sensitivity were observed. Furthermore, important signaling pathways, such as Nrf-2/HO-1, p38 MAPK, NFκB, COX-2, iNOS and PI3K/Akt, changed with age. Therefore, this study showed that the homeostatic capacity of hypothalamic astrocytes is altered throughout the aging process and that, consequently, these cells may be involved in metabolic disorders, becoming potential therapeutic targets.