A Doença de Alzheimer é uma desordem que acomete milhões de indivíduos por todo o mundo, e a sua incidência tem aumentado muito nas últimas décadas. A doença é caracterizada por diversas alterações no sistema nervoso central, e dentre elas ocorrem alterações importantes no metabolismo da glicose, com redução da utilização desse composto, levando a um importante déficit energético. A Doença de Alzheimer está intimamente relacionada com o Diabetes Mellitus, pois além de ocorrerem alterações semelhantes nas duas desordens, pacientes com diabetes têm risco aumentado de desenvolver Alzheimer. Além da correlação com Diabetes Mellitus, existem evidências de que a hipercolesterolemia também está associada ao maior risco de desenvolver Doença de Alzheimer, o que nos levou a investigar o potencial neuroprotetor das estatinas. Esse trabalho tem como objetivo avaliar alterações comportamentais e bioquímicas em dois modelos de desordens do metabolismo da glicose, bem como avaliar o possível papel neuroprotetor das estatinas, aminoguanidina e n-acetil-cisteína. / Alzheimer’s disease is a disorder that affects millions of individuals around the world, and its incidence has increased in recent decades. Alzheimer’s disease is characterized by several alterations in the central nervous system, and changes in glucose metabolism is among the most important, reducing the uptake of this compound, leading to a significant energy deficit. Alzheimer’s disease is closely related to Diabetes Mellitus, and similar metabolic changes occur in both disorders. Besides, diabetic patients present increased risk for Alzheimer’s disease. In addition, another risk factor to Alzheimer’s is high levels of plasma cholesterol, which lead some research groups to evaluate the potential neuroprotective effect of statins. The aim of this study is to asses behavioral and biochemical changes in two models of glucose metabolism disorders, and evaluate the possible neuroprotective role of statins, aminoguanidine and N-acetyl-cysteine

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Neurociências. / Made available in DSpace on 2012-10-22T22:52:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 226540.pdf: 2004432 bytes, checksum: b7d3aba93332fe51901667638c91c74a (MD5) / Neste estudo foi avaliado o efeito de GMP ou Guanosina em três diferentes situações: o efeito trófico sobre astrócitos em cultura, o efeito direto sobre neurônios em cultura e a influência de fatores tróficos liberados no meio de cultura durante o pré-tratamento dos astrócitos com GMP ou guanosina, sobre neurônios em culturas.

A doença de Alzheimer (DA) resulta de múltiplos eventos patogênicos, que incluem anormalidades no processamento protéico, inflamação e estresse oxidativo, levando à destruição seletiva de populações neuronais, especialmente de neurônios colinérgicos. Tal hipótese colinérgica justifica o uso de inibidores da acetilcolinesterase (AChE) como a estratégia utilizada para tratamento de pacientes com DA. Huperzina A (HupA), um alcalóide Licopodium extraído de uma espécie vegetal (Huperzia serrata) de uso tradicional pela medicina chinesa, parece se apresentar como uma alternativa. A HupA atua como um inibidor potente, reversível e altamente específico da AChE. Sua potência como anticolinesterásico é similar ou superior à da fisostigmina, galantamina, donepezil e tacrina, anticolinesterásicos aprovados para o tratamento da DA Este alcalóide também demonstrou múltiplos efeitos neuroprotetores, incluindo modificação do processamento do peptídeo -amilóide, redução do estresse oxidativo, proteção neuronal contra apoptose e regulação da expressão e secreção de fatores tróficos, tais como fator de crescimento neuronal e em situações de injúria com comprometimento de funções glutamatérgicas. A S100B é uma proteína da família S100 de proteínas ligantes de cálcio, produzida e secretada por astrócitos no SNC. Quando em baixas concentrações no meio extracelular (nanomolar), ela é trófica; já em concentrações maiores (micromolar), é tóxica, podendo levar à apoptose. Sabe-se que a S100B está envolvida na patofisiologia de diversas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na DA, no qual ocorre um aumento dos níveis dessa proteína no líquor em sua fase precoce. Neste trabalho investigamos o efeito da HupA, da tacrina (tetraaminoacridina ou THA) e da acetiltiocolina (ATCh) em astrócitos e em fatias hipocampais, quanto à secreção e conteúdo intracelular de S100B e proteína fibrilar glial ácida (GFAP), durante 1 e 24 h. A HupA (100 μM) aumentou a secreção em cultura de astrócitos em 1 h, mas diferentemente causou uma redução em fatias hipocampais, bem como ATCh (100 μM). Após 24 h de tratamento, foi possível observar em cultura de astrócitos um efeito da tacrina a 100 μM sobre a redução do conteúdo de S100B intracelular, mas não de HupA ou ATCh. O imunocontéudo de GFAP não foi alterado após os tratamentos. Uma análise geral desses resultados nos mostra que a HupA pode regular mecanismos de secreção da S100B. Além disto, a modulação de secreção desta proteína parece ser modulada por receptores colinérgicos. / Alzheimer´s Disease (AD) results in multiple pathogenic events, which include abnormalities of protein process, inflammation and oxidative stress, leading to a neuronal population destruction, especially of cholinergic neurons. This cholinergic hypothesis justifies the use of acetylcholinesterase inhibitors (IAChE) as the strategy for patients with AD. Huperzine A (HupA), a novel Lycopodium alkaloid isolated originally from a traditional Chinese medicine, seems to be an alternative. HupA is a reversible, potent and selective IAChE. Its potency and duration of AChE inhibition rival those of physostigmine, galanthamine, donepezil and tacrine, approved for treatment of DA. HupA also demonstrated multiple neuroprotector effects, including modifying the β-amyloid processing, decreasing oxidative stress, protecting neurons against apoptosis and also expressing and regulating secretion of trophic factors, such as neuronal growth factor (NGF) and also acts reducing glutamatergic excitotoxicity. S100B is a calcium-binding protein, produced and secreted by astrocytes in the central nervous system (CNS) and plays a regulatory role in the cytoskeleton and cell cycle. Moreover, extracellular S100B, a marker of glial activation in several conditions of brain injury, for example in AD, has a trophic or apoptotic effect on neurons, depending on its concentration. Here we investigated the effect of HupA, tacrina (tetraminoacridine or THA) and acetilthiocholine (ATCh), on S100B secretion, S100B and GFAP intracellular contend in cortical astrocytes cultures and hippocampal slices treated for 1 and 24 h. For 1 h, HupA and ATCh (100 μM) increased the secretion in astrocytes for 1 h, but caused a reduction on hippocampal slices (P < 0.05). After 24 h of treatment, tacrine (100 μM) reduced the S100B intracellular contend in astrocytes cultures, but it was not observed with HupA or ATCh. The GFAP immunocontent did not change after these treatments. Generally, our data show that HupA can regulate S100B secretion mechanisms and that this modulation could be activated by cholinergic receptors.

O hipocampo compõe uma das estruturas do sistema límbico, suas funções são variadas, tendo seu papel na regulação do comportamento emocional e em processos relacionados com a estocagem de memórias. Apesar de ter pouco ou nenhum papel no controle da função reprodutiva, o hipocampo é ainda assim um alvo sensível aos esteróides gonadais. Filamentos intermediários, como a proteína ácida fibrilar glial (GFAP) é um eficiente marcador do citoesqueleto de astrócitos e sofrem modificações sob ação de hormônios gonadais. Os objetivos do presente estudo foram mensurar o numero de células imunorretivas à GFAP (GFAP-ir), avaliar a imunorreatividade dos marcadores para filamentos intermediários astrocitários, bem como sua morfologia pelo método de Scholl, a GFAP-ir, no estrato radiatum da região CA1 do hipocampo, de ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal. Além disso, também foi investigada a GFAP-ir nas mesmas regiões de fêmeas adultas, tanto em condições fisiológicas de variação hormonal (ao longo do ciclo estral), como em situações suprafisiológicas (reposição hormonal após ovariectomia). Três experimentos foram realizados: no primeiro foram utilizados ratos machos e fêmeas durante o desenvolvimento pós-natal (n = 48), cujas idades foram: 11 dias pós-natal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) e 45 (PN45). No segundo experimento, utilizou-se ratos Wistar adultos machos e fêmeas nulíparas adultas durante as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; n = 30) para revelar diferenças provocadas pelos hormônios gonadais femininos na composição astrocitária do hipocampo. No terceiro experimento utilizaram-se fêmeas adultas nulíparas submetidas à ovariectomia (OVX) (n = 18) e tratadas com substituição hormonal de benzoato de estradiol adicionado ou não à progesterona. Os dados foram comparados entre os grupos por meio de um teste de análise da variância (ANOVA) de uma via, sendo aplicado o teste post-hoc Bonfferoni. A comparação dos dados de GFAP-ir apresentou diferenças significativas no número de células e na orientação dos prolongamentos. O número de prolongamentos centrais, aumentaram com a idade, sendo mais significativo para as fêmeas (F45xF11, p≤ 0,001, F45xF21, p≤ 0,01 e F45xF31 p≤ 0,01) que nos machos (M45x M21 p≤ 0,05). Já o número de processos laterais mostrou um aumento mais significativo com a idade nos machos (M45XM11, p≤ 0,001; M45XM21, p≤ 0,001 e M45xM31, p≤ 0,01) que nas fêmeas (F45xF11, p≤ 0,01). Havendo ainda diferenças quando analisados a orientação dos processos primários separadamente de suas ramificações. Os ratos machos apresentaram maior GFAP-ir do que as fêmeas em todas as fases do ciclo estral (diestro, proestro, estro e metaestro; p < 0,001), assim como apresentaram mais células que as fêmeas (p<0,001). Para orientação mais uma vez as diferenças ficaram restritas aos machos, tanto para os processos centrais como para os laterais (p<0,001 e p<0,05 respectivamente). Em fêmeas ovariectomizadas, injeções de estradiol provocaram aumento da GFAP-ir (P < 0,001), assim como houve um aumento do numero de células (P < 0,05) enquanto a morfologia não mostrou diferenças entre os grupos. Esses achados sugerem que a GFAP astrocitária pode ser afetada tanto por níveis fisiológicos de hormônios ovarianos quanto por manipulação hormonal destes esteróides, o que pode contribuir para a plasticidade neuro-glial relacionada a atividades locais e integradas destas áreas encefálicas em machos e fêmeas. Esses achados permitem concluir que esta influência hormonal sobre o hipocampo está presente ainda em fases iniciais do desenvolvimento do SN de ratos, apresentando particularidades morfológicas acima de tudo. Além disso, as diferenças de composição astrocitárias encontradas, ao longo do desenvolvimento, provavelmente se relacionam com a interação neurônio-glia em consonância com aspectos comportamentais e ajustes neuroendócrinos pertinentes a cada sexo, e a cada fase de diferenciação do sistema nervoso. / The hippocampus is part of the limbic system, its functions are varied, and their role in the regulation of emotional behavior and in processes related to the memories storage. Despite having little or no role in the control of reproductive function, the hippocampus still a sensitive target to gonadal steroids. Intermediate filaments such as glial fibrillary acidic protein (GFAP) is an efficient marker of the cytoskeleton of astrocytes and the action of gonadal hormones could alter this structure. The objectives of this study were to measure the number of GFAP imunorreactive cells (GFAP-ir), analysing the immunoreactivity the intermediate filaments of astrocyte, and their morphology by the Scholl‟s method, GFAP-ir in the stratum radiatum of the CA1 region from dorsal hippocampus of male and female rats during postnatal development. In addition, we investigated the GFAP-ir in the same regions of adult males and females, these under physiological hormonal changes (during the estrous cycle), as shown by supraphysiological (hormone replacement after ovariectomy). Three experiments were performed: the first was used male and female rats during postnatal development (n = 48), whose ages were 11 days postnatal (PN11), 21 (PN21), 31 (PN31) and 45 ( PN45). In the second experiment, we used adult male Wistar rats and nulliparous adult females during the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, n= 30) to reveal differences caused by female gonadal hormones on the content of astrocytes in the hippocampus. In the third experiment, a nulliparous adult females subjected to ovariectomy (OVX) (n = 18) and treated with hormone replacement therapy of estradiol benzoate added or not with progesterone. Data were compared between groups by means of a test analysis of variance (ANOVA) one-way, and applied post-hoc Bonfferoni‟s test. A comparison of the GFAP-ir showed significant differences in cell number and orientation of the extensions. The number of central extensions, increased with age, being more significant for females (F45xF11, p ≤ 0,001, F45xF21, p ≤ 0,01 and F45xF31 p ≤ 0,01) than in males (M45x M21 p ≤ 0,05). Since the number of lateral processes showed more significantly with age in males (M45XM11, p ≤ 0,001; M45XM21, p ≤ 0,001 and M45xM31, p ≤ 0,01) than in females (F45xF11, p ≤ 0,01). We also found differences when analyzed the orientation of primary processes separately from their branches. Male rats showed higher GFAP-ir than females at all stages of the estrous cycle (diestrus, proestrus, estrus and metestrus, p <0,001) and had more cells than females (p <0,001). About cell orientation, the differences were observed just in males, both for the core processes and to the lateral (p <0,001 and p <0,05 respectively). In ovariectomized females, injections of estradiol benzoate caused an increase in GFAP-ir (P <0,001), as well as an increase in the number of cells (p <0,05), but the morphology did not differ between groups. These findings suggest that the GFAP astrocyte can be affected both by physiological levels of ovarian hormones and on the hormonal manipulation of these steroids, which may contribute to neuro-glial plasticity related to local activities and integrated these brain areas in males and females. These findings show that hormonal influence on the hippocampus were present in early stages of development of the SN of rat, specially in the morphological characteristics. In addition, differences in astrocytic composition found throughout the development, probably were related to the neuron-glia interaction in accordance with aspects of behavioral and neuroendocrine adjustments, specific to each gender, and each stage of differentiation of the nervous system.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. / Made available in DSpace on 2015-11-10T03:10:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 335903.pdf: 3436374 bytes, checksum: d64f01ea784144e72802fb02cfca8bb1 (MD5) Previous issue date: 2015 / O modelo de derrota social (DS) tem sido considerado um modelo naturalístico de estresse, caracterizado por interações agressivas e imprevisíveis que ajudam a compreender melhor as respostas neurobiológicas ao estresse, consistindo em um importante modelo translacional para o transtorno de estresse pós-traumático (TEPT). O presente trabalho teve como objetivo a caracterização temporal das respostas comportamentais defensivas do modelo de derrota social e a investigação do papel do sistema taquicinérgico neste contexto. Camundongos C57BL/6 utilizados como animais intrusos ou derrotados, foram inseridos na caixa moradia de um animal residente (camundongos Swiss) ? dentro de uma caixa metálica a fim de conferir proteção física. Durante as sessões de treino (1, 3 ou 6 h) a caixa metálica foi retirada em períodos aleatórios, permitindo o contato direto entre os animais por 2 min ou 10 ataques. Após as sessões de treino, grupos independentes de animais foram submetidos ao teste de partição (TP) em diferentes tempos após a DS (24 h, 7 ou 30 dias). Os animais controle (CTL) foram submetidos ao mesmo protocolo, porém na ausência do animal residente. Nossos resultados mostraram que sessões de treino com duração de 3h por 3 dias consecutivos e avaliação comportamental 24 h após ao TP promoveram respostas comportamentais defensivas mais evidentes (redução do tempo de aproximação na barreira e aumento do comportamento de avaliação de risco), quando comparadas ao demais tempos. Esse foi, portanto, eleito o tempo de protocolo para avaliação das alterações moleculares e bioquímicas do presente estudo. O estresse social induzido pelo DS promoveu o aumento da imunomarcação de substância P, particularmente ao redor do corpo das células neuronais, em regiões encefálicas como hipocampo (HC) e córtex (CT) que são algumas das mais importantes estruturas envolvidas no TEPT. Em paralelo a este aumento, foi observada ainda uma ativação astrocitária e, em menor intensidade, a ativação/migração de micróglias, culminando com a instalação de um importante processo neuroinflamatório que parece ser fundamental para a manutenção da patologia. Os dados obtidos mostraram ainda que a situação de estresse social promoveu um aumento da expressão de receptores NK1 em células GFAP positivas no HC de animais derrotados (58%) em relação ao grupo CTL (32%). Associado a este evento, a expressão do receptor12NK1 na camada de células neuronais foi reduzida pelo estresse. Foram observadas ainda alterações como a degeneração neuronal e prejuízos na neurogênese nas sub-regiões CA3 e giro denteado do hipocampo. O tratamento com uma única administração do antagonista seletivo não peptídico do receptor NK1 - L-703, 606; 10 mg/kg; i.p. - reduziu as respostas comportamentais defensivas. Além disso, parece reestabelecer a expressão de receptores NK1 nas células astrocitárias (35%), assim como a expressão deste receptor na camada de células neuronais. A intervenção farmacológica realizada neste trabalho promoveu também um aumento na expressão dos marcadores de neurogênese como BDNF e espinofilina, sugerindo um possível efeito benéfico deste antagonista. Além disso, o bloqueio dos receptores NK1 promoveu uma redução nos níveis de corticosterona plasmática e reestabeleceu a expressão de receptores de glicocorticoide no HC e CT dos animais, semelhante ao grupo CTL, que havia sido reduzida após o estresse social. Os dados obtidos indicam a relevância do sistema taquicinérgico na neurobiologia do modelo de derrota social. Em conjunto, os resultados sugerem que a SP parece ser liberada em decorrência do estresse social e induz a degeneração neuronal, possivelmente por ativação de vias neuroinflamatórias específicas. Desta forma, sugerimos que o bloqueio o receptor NK1 possa ser uma abordagem terapêutica atrativa para o TEPT.<br> / Abstract : The social defeat model (SD) has been considered a naturalistic model of stress featured by aggressive and unpredictable interactions, and it seem to be an important translational model for the post-traumatic stress disorder (PTSD). The present study aimed to evaluate the temporal defensive behavioral responses a social defeat model, besides elucidating the role of tachykinin system on this model. C57BL/6 mice were used as intruders (defeated animals) and were inserted into the housing box of a resident animal (Swiss) inside a metal box in order to provide physical protection. During the training sessions (1, 3 or 6 h), the metal box was randomly removed allowing direct contact between the animals, during 2 min or 10 attacks. After the training sessions, independent groups of animals were submitted to the partition test (PT) at different times (24 h, 7 or 30 days). Control group (CTL) underwent the same protocol in the absence of the resident animal. Our results showed that animals submitted to training sessions lasting 3 h for 3 consecutive days with behavioral assessment 24 h after in the PT presented more evident defensive behavioral responses ? reduction of time spent in the barrier and increased risk assessment behavior ? when compared to other protocol times. Therefore, this was the chosen standard protocol to further evaluate the molecular and biochemical changes in this model. The stress augmented substance P animals submitted to the SDM, particularly, surrounding the neuronal cells bodies in the hippocampus (HC) and cortex (CT), well-known cerebral areas involved in PTSD. Moreover, as increased astroglial activation and less intense microglial activation were observed and they could contribute to a neuroinflammatory process. Overall, these alterations seem to be essential for the maintenance of the neurobiology. Our data also have shown a stress-induced NK1 receptor expression in GFAP positive cells in the HC of defeated animals (58%), associated a with reduced NK1 expression in the neuronal cell layer, compared to CTL group (32% of co-localization). In addition, defeated animals presented impaired neurogenesis and neurodegeneration. A single administration of the selective non-peptide NK1 receptor antagonist ? L-703, 606; 10 mg/kg; i.p. ? reduced the defensive behavioral responses. NK1 receptors antagonism restored the NK1 receptors expression in astrocytic cells (35%), as well as in the neuronal cell layer. NK1 receptor antagonism also increased markers of14neurogenesis, namely, BDNF and spinophilin, suggesting a beneficial effect of this pharmacological intervention. Blockage of NK1 receptors induced in the defeated animals a decreased plasma corticosterone, compared to CTL levels. Moreover it reduced the expression of glucocorticoid receptors in the HC and CT. Data obtained in the present study indicates the relevance of tachykinergic system in the neurobiology of social defeat model. Taken together, our results suggest that social stress induces SP release contributing to neuronal degeneration, possibly by activating specific neuro-inflammatory pathways. Thus, we here propose that NK1 receptor may be an attractive therapeutic target to PTSD treatment.

A Doença de Alzheimer é uma desordem que acomete milhões de indivíduos por todo o mundo, e a sua incidência tem aumentado muito nas últimas décadas. A doença é caracterizada por diversas alterações no sistema nervoso central, e dentre elas ocorrem alterações importantes no metabolismo da glicose, com redução da utilização desse composto, levando a um importante déficit energético. A Doença de Alzheimer está intimamente relacionada com o Diabetes Mellitus, pois além de ocorrerem alterações semelhantes nas duas desordens, pacientes com diabetes têm risco aumentado de desenvolver Alzheimer. Além da correlação com Diabetes Mellitus, existem evidências de que a hipercolesterolemia também está associada ao maior risco de desenvolver Doença de Alzheimer, o que nos levou a investigar o potencial neuroprotetor das estatinas. Esse trabalho tem como objetivo avaliar alterações comportamentais e bioquímicas em dois modelos de desordens do metabolismo da glicose, bem como avaliar o possível papel neuroprotetor das estatinas, aminoguanidina e n-acetil-cisteína. / Alzheimer’s disease is a disorder that affects millions of individuals around the world, and its incidence has increased in recent decades. Alzheimer’s disease is characterized by several alterations in the central nervous system, and changes in glucose metabolism is among the most important, reducing the uptake of this compound, leading to a significant energy deficit. Alzheimer’s disease is closely related to Diabetes Mellitus, and similar metabolic changes occur in both disorders. Besides, diabetic patients present increased risk for Alzheimer’s disease. In addition, another risk factor to Alzheimer’s is high levels of plasma cholesterol, which lead some research groups to evaluate the potential neuroprotective effect of statins. The aim of this study is to asses behavioral and biochemical changes in two models of glucose metabolism disorders, and evaluate the possible neuroprotective role of statins, aminoguanidine and N-acetyl-cysteine

Made available in DSpace on 2016-05-11T13:02:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 rafael_silva_ioc_dout_2015.pdf: 3184979 bytes, checksum: 424c613846e42fb4bb955e915c629888 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A doença de Chagas (DC) é causada pela infecção pelo Trypanosoma cruzi e consiste num importante problema de saúde pública nas Américas do Sul e Central. Embora não caracterizado, o acometimento do sistema nervoso central (SNC) na DC foi demonstrado na fase aguda em crianças e na reativação da infecção em pacientes crônicos imunossuprimidos. Porém, os alvos celulares do T. cruzi e a origem dos parasitos no SNC em episódios de reativação crônica não estão claros. Os astrócitos são as células gliais mais abundantes do SNC humano e sua participação na DC carece de informação, bem como o papel das citocinas Interferon-gama (IFN\03B3) e fator de necrose tumoral (TNF), duas importantes citocinas no contexto da infecção pelo T. cruzi, no processo de infecção do SNC. Estudos nesse sentido são importantes diante da crescente ocorrência de co-infecção T. cruzi/HIV, bem como acesso dos pacientes a transplantes e demais situações que causam imunossupressão. Assim, investigamos a infecção de astrócitos pelo T. cruzi e os efeitos de IFN\03B3 e TNF nesse processo. Mostramos que o T. cruzi persistiu no SNC de camundongos da linhagem C3H/He cronicamente infectados em paralelo à expressão de mRNA de IFN\03B3, e a maioria das células albergando o T. cruzi eram astrócitos frequentemente localizados próximo a células mononucleares IFN\03B3+, micrógliais, como mostrado por imunoistoquímica. Utilizamos cultivos primários de astrócitos de camundongos C3H/He e C57BL/6 tratados com IFN\03B3 ou TNF na presença de tripomastigotas da cepa Colombiana do T. cruzi e analisamos taxa de infecção, crescimento do parasito e produção de mediadores inflamatórios in vitro; e o efeito do bloqueio de TNF na infecção do SNC pelo T. cruzi Confirmamos que astrócitos de ambas as linhagens foram suscetíveis à infecção pelo T. cruzi, e que o pré-tratamento com IFN\03B3 ou TNF favoreceu a invasão dos astrócitos pelo parasito e aumentou o número de formas amastigotas nos astrócitos. Tanto o T. cruzi quanto o IFN\03B3 não foram capazes de induzir sozinhos produção de óxido nítrico (NO), que só foi induzido pela associação de ambos os estímulos. O tratamento com L-NAME (inibidor de síntese de NO) reduziu parcialmente o número de formas amastigotas do T. cruzi em astrócitos tratados com IFN\03B3, enquanto o tratamento com Infliximab (anticorpo neutralizante anti-TNF) preveniu completamente o efeito de IFN\03B3 no favorecimento à infecção de astrocitos pelo T. cruzi, indicando que IFN\03B3 favorece a infecção de astrócitos pelo T. cruzi via TNF. Somado a isso, a expressão de mRNA e a produção de TNF foram aumentadas nos cultivos de astrócitos infectados pelo T. cruzi, enquanto que o seu receptor TNFR1 teve expressão aumentada apenas quando a infecção ocorreu na presença de TNF. O inibidor de expressão de TNFR1 reduziu o número de amastigotas/célula e a porcentagem de células infectadas nos cultivos pré-tratados com TNF. Finalmente, a administração de anti-TNF a camundongos C3H/He agudamente infectados reduziu o número de áreas positivas para antígenos do T. cruzi no SNC Em conjunto, os nossos dados sugerem que IFN\03B3 e TNF são possíveis facilitadores da entrada do T. cruzi em astrócitos, contribuindo para a manutenção de um ambiente inflamatório no SNC, o que poderia levar à morte células neuronais, além de facilitar a persistência do T. cruzi nesse sítio, possivelmente albergado em astrócitos, os quais agiriam como fonte de parasitos em episódios de reativação crônica / Chagas disease (CD) is caused by Trypanosoma cruzi infection and is a major public health problem in South and Central America. Although not characterized, the involvement of the central nervous system (CNS) in DC was demonstrated in the acute phase in children and reactivation of infection in immunosuppressed chronic patients. However, the cellular targets of T. cruzi and the origin of the parasites in the CNS in episodes of chronic reactivation are not clear. Astrocytes are the most abundant glial cells in the human CNS and its involvement in AD lacks information as well as the role of the cytokines interferon-gamma (IFN\03B3) and tumor necrosis factor (TNF), two cytokines important in the context of T. cruzi, in the process CNS infection. Studies in this direction are important given the increasing occurrence of coinfection T. cruzi/HIV, as well as patient access to transplants and other situations that cause immunosuppression. Thus, we investigated the infection of astrocytes by T. cruzi and the effects of IFN\03B3 and TNF in the process. We show that the T. cruzi persisted in the CNS of mice C3H/He chronically infected parallel to IFN\03B3 mRNA expression, and most of the T. cruzi-cells were astrocytes frequently located near IFN\03B3+-mononuclear cells, microglia, as shown by immunohistochemistry. We used primary astrocytes C3H/He and C57BL/6 mices treated with IFN\03B3 or TNF in the presence of trypomastigotes of T. cruzi Colombian strain and analyzed rate of infection, parasite growth and production of inflammatory mediators in vitro; and the effect of TNF blockade in CNS infection with T. cruzi We confirm that astrocytes of both strains were susceptible to infection with T. cruzi, and that pretreatment with IFN\03B3 or TNF favored the invasion of astrocytes by the parasite and increased the number of amastigotes in astrocytes. Both the T. cruzi as IFN\03B3 was not alone capable of inducing nitric oxide (NO) production, which was induced just by combination of both stimuli. Treatment with L-NAME (NO synthase inhibitor) partially reduced the number of amastigotes of T. cruzi in astrocytes treated with IFN\03B3, while treatment with infliximab (anti-TNF-neutralizing antibody) completely prevented the effect of IFN\03B3 in favoring infection of astrocytes by T. cruzi, indicating that IFN\03B3 favors infection of astrocytes by T. cruzi via TNF. In addition to this, expression of mRNA and TNF production were increased in cultures of astrocytes infected with T. cruzi, while its TNFR1 receptor expression was increased only when the infection occurred in the presence of TNF. The TNFR1 expression inhibitor reduced the number of amastigotes/cell and the percentage of infected cells in cultures pretreated with TNF. Finally, the anti-TNF administration acutely infected C3H/He mice reduced the number of positive areas for T. cruzi antigens in the CNS. Together, our data suggest that IFN\03B3 and TNF are possible facilitating the entry of T. cruzi in astrocytes, thereby contributing to the maintenance of a CNS inflammatory environment, which could lead to neuronal cell death, and to facilitate the persistence of T. cruzi in that site, possibly housed in astrocytes, which would act as a source of parasites in episodes of chronic reactivation / 2100-08-17

O uso de culturas de células do Sistema Nervoso Central é extensivamente aplicado na compreensão dos mecanismos celulares, moleculares e bioquímicos do cérebro, sendo que a maioria dos protocolos utilizados faz uso de animais neonatos para a obtenção das células. Neste estudo, propomos e caracterizamos um protocolo de obtenção de cultura de astrócitos corticais de ratos Wistar adultos, de 90 dias de idade. Para a elaboração da cultura, os cérebros foram cuidadosamente dissecados e o córtex foi dissociado mecanicamente e enzimaticamente com tripsina e papaína. As células foram cultivadas com DMEM/F12 (10% SFB) nas duas primeiras semanas e DMEM/F12 (20% SFB) nas últimas semanas. Ao final deste período, as células apresentavam morfologia poligonal caracteristicamente astrocitária, extensiva marcação para a Proteína Glial Fibrilar Ácida (GFAP) e para a Glutamina Sintetase (GS), ambas importantes marcadores gliais. Também foi avaliada a captação de glutamato, a atividade da GS e o conteúdo de glutationa (GSH). Ainda, verificamos a expressão de outras proteínas características de astrócitos, como vimentina, S100B e ALDH1L1, além dos transportadores glutamatérgicos GLAST e GLT-1. Sob exposição ao H2O2 e Zn2+, podemos verificar que os astrócitos são suscetíveis ao estresse oxidativo, o qual pode causar alterações morfológicas e funcionais. Também, verificamos que estas células são suscetíveis a estímulos inflamatórios. Assim, concluímos que o protocolo proposto é efetivo para gerar uma cultura funcional e caracteristicamente astrocitária, utilizando-se ratos adultos, os quais já têm conexões celulares estabelecidas, ao contrário dos neonatos, que estão ainda no processo de formação das células e conexões. Isto pode representar um importante modelo de estudo para doenças neurodegenerativas, neurotoxicidade e neuroproteção, visto que astrócitos adultos cultivados in vitro apresentam características mais similares ao cérebro adulto in vivo, e podem ser usados para se obter respostas mais fidedignas aos estímulos aos quais serão submetidos. / The use of cell cultures of central nervous system is extensively applied to understand the cellular, molecular and biochemical mechanisms of the brain, and most part of the protocols makes use of newborns to obtain cells. In this study we have characterized a protocol to obtain astrocyte cultures of adult Wistar rats, 90 days old. For the preparation of culture, brains were carefully dissected and the cortex was dissociated mechanically and enzymatically with trypsin and papain. The cells were cultured with DMEM/F12 (10% FBS) in the first two weeks and DMEM/F12 (20% FBS) until it reaches confluence. Thereafter, the cells presented typical polygonal morphology of astrocytes, extensive marking for glial fibrillary acidic protein (GFAP) and Glutamine Synthetase (GS), both important glial markers. We also evaluated glutamate uptake, GS activity and intracellular levels of glutathione (GSH). We observed the expression of other characteristic proteins of astrocytes, such as vimentin, S100B, ALDH1L1 and, in addition, the main glutamate transporters in the brain, GLT-1 and GLAST. Upon exposure to H2O2 and Zn2+, we found that astrocytes are susceptible to oxidative stress, which may cause morphological and functional changes. Also, we found that these cells are susceptible to inflammatory stimuli. Thus, we conclude that the proposed protocol is effective to generate a functional and characteristic astrocytic culture, using adult rats, which already have established neural connections compared to newborns. This may represent an important study model for neurodegenerative diseases, neuroprotection and neurotoxicity, as adult astrocytes cultured in vitro have similar characteristics to the adult brain in vivo, and can be used to obtain more reliable responses to stimuli to which they will be exposed.

Embora a inflamação seja um processo de defesa fisiológica, neuroinflamação desequilibrada tem sido associada com a fisiopatologia de doenças do SNC. Além disso, a exposição pré-natal à infecção bacteriana e/ou viral tem sido implicada em vários estudos como um importante fator ambiental capaz de afetar prejudicialmente o neurodesenvolvimento, aumentando assim o risco de esquizofrenia. Resposta imune materna, em vez de infecção direta do feto, poderia ser responsável pelo desenvolvimento da doença. Glia ativada libera uma variedade de citocinas pró-inflamatórias que contribuem para a disfunção neuronal. Além disso, as alterações de marcadores astrogliais parecem estar intimamente relacionadas à patologia da esquizofrenia, por exemplo, níveis elevados de S100B, uma proteína derivada da glia, foram observados no soro e LCR de pacientes com esquizofrenia. Nesta tese avaliou-se se a secreção de S100B (em células de glioma C6 e fatias de hipocampo de ratos Wistar) poderia ser diretamente modulada por citocinas inflamatórias alteradas na esquizofrenia, assim como o possível envolvimento da via da proteína cinase ativada por mítógeno (MAPK) nestas respostas. Os efeitos dos antipsicóticos típicos e atípicos na secreção de S100B induzida por citocinas foram analisadas. Nós também avaliamos se a administração de LPS em ratas prenhas no final da gestação afeta alguns aspectos comportamentais da prole em sua vida adulta, e investigamos os efeitos deste tratamento sobre parâmetros gliais usando preparação ex vivo dos descendentes, além de observar se o tratamento pré-natal afeta marcadores gliais (S100B e GFAP) da prole adulta. Usamos a prole aos 30 e 60 dias para avaliar as diferenças entre os ratos jovens e adultos e também investigar a existência de diferenças entre os descendentes do sexo masculino e feminino. Avaliamos também os parâmetros de estresse oxidativo NO e GSH. Nós observamos que secreção de S100B foi aumentada pelas citocinas pró-inflamatórias (IL-1, TNF-, IL-6 e IL-8) em glioma C6 e em fatias hipocampais através da via MAPK, e estresse oxidativo pode ser um componente desta modulação. Além disso, IL-6 foi capaz de induzir um aumento no conteúdo de S100B e GFAP em glioma C6 e os antipsicóticos, haloperidol e risperidona, foram capazes de inibir a secreção de S100B estimulada por IL-6. Observamos também que o modelo de alteração imune maternal provocou alterações comportamentais na prole adulta, especialmente no comportamento social dos ratos afetados, além de modificar o padrão de secreção da proteína S100B e da captação de glutamato em fatias ex vivo da prole adulta. Constatamos que conteúdo de glutationa e NO são modificados de forma dependente de idade/gênero. Foi observada também uma pronunciada astrogliose particularmente hipocampal, com GFAP apresentando-se aumentada em ratos juvenis e adultos enquanto que conteúdo de S100B apresentou diminuição na prole juvenil e aumento em ratos adultos em resposta a exposição imune maternal. Aparentemente, infecção pré-natal parece levar a anormalidades comportamentais e neuroquímicas, incluindo modificação de marcadores gliais, na vida pós-natal, possivelmente via citocinas. / Although inflammation may be a physiological defense process, imbalanced neuroinflammation has been associated with the pathophysiology of brain disorders. Furthermore, prenatal exposure to bacterial and viral infection has been implicated by several studies indicating that such exposure is an important environmental factor out that may detrimentally affect neurodevelopment, increasing the risk of schizophrenia. Maternal immune response, rather than direct infection of the fetus, could be responsible for disease development. Activated glia releases a variety of pro-inflammatory cytokines that contribute to neuronal dysfunction. Moreover, changes in astrogliais markers seem to be closely related pathology of schizophrenia, for example, elevated levels of S100B, a glia derived protein, have been observed in the serum and CSF of schizophrenic patients. We evaluated whether S100B secretion (in C6 glioma cells and hippocampal slices in Wistar rats) could be directly modulated by the main inflammatory cytokines altered in schizophrenia, as well as the possible involvement of mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathways in these responses. The effects of typical and atypical antipsychotic drugs on glial cytokine-induced S100B release were analyzing. We also evaluated whether administration of LPS to rats dams in late gestation affects some aspects of the offspring behavior in their adult life, and investigated the effects of this treatment on glial parameters using ex vivo preparation of offsprings, and whether it affects astroglial markers (S100B and GFAP) of the offspring in later life. We used the offspring at 30 and 60 days to evaluate the differences between juvenile and adult rats and also investigate the existence of differences between male and female offspring. We also investigated the oxidative stress parameters NO and GSH. We observed that S100B secretion was increased by the pro-inflammatory cytokines (IL-1 , TNF-, IL-6 and IL-8) in C6 glioma and in hippocampal slices via the MAPK, and oxidative stress may be a component this modulation. Furthermore, IL-6 was capable of inducing an increase in content GFAP and S100B in C6 glioma and antipsychotic, haloperidol and risperidone have been capable of inhibiting S100B secretion stimulated by IL-6. We also note that the model of maternal immune changes caused behavioral changes in the adult offspring, especially in the social behavior of rat affected and modified the pattern of secretion of S100B protein and glutamate uptake in ex vivo slices of adult offspring. We found that content of glutathione and NO are modified so age / gender dependent. There was also a pronounced hippocampal astrogliosis, with GFAP presenting increased in juvenile and adult rats while S100B content was reduced in juvenile and increased in adult offspring rats in response to exposure to maternal immune. Apparently, prenatal infection appears to lead to behavioral and neurochemical abnormalities, including modification of glial markers in the postnatal life, possibly via cytokines.

A amônia é uma neurotoxina implicada em desordens metabólicas cerebrais associadas com hiperamonemia. A neurotoxicidade aguda da amônia pode ser mediada por mecanismos excitotóxicos envolvendo o sistema glutamatérgico, incluindo a ativação do receptor NMDA e o subsequente aumento na concentração de Ca2+. O estresse oxidativo está relacionado à neurotoxicidade da amônia e o óxido nítrico parece estar envolvido nesta condição. Os astrócitos desempenham um papel essencial na proteção dos neurônios contra excitotoxicidade por captar o excesso de amônia e glutamato e convertê-los em glutamina, usando a enzima glutamina sintetase, e também protegendo contra o estresse oxidativo. A proteína S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como parâmetro de ativação ou comprometimento em várias situações de dano cerebral, incluindo hiperamonemia. Antioxidantes, como o resveratrol, apresentam muitos efeitos biológicos, incluindo a modulação de parâmetros gliais como a captação de glutamato, a atividade da glutamina sintetase e a secreção de S100B. Neste estudo, foi investigado o efeito de antioxidantes sobre a secreção de S100B induzida pela amônia em células astrogliais. O resveratrol foi capaz de prevenir o aiumento da secreção de S100B, após 24 h de exposição à amônia, provavelmente via inibição de óxido nítrico e proteína cinase A (PKA). Então, o resveratrol pode ser um possível agente protetor contra a neurotoxicidade induzida pela amônia. / Ammonia is a neurotoxin implicated in brain metabolic disorders associated with hyperammonemia. Acute ammonia neurotoxicity can be mediated by excitotoxic mechanism involving glutamatergic system, including NMDA receptor activation and subsequent increase in intracellular Ca2+ concentration. Oxidative stress is related to ammonia neurotoxicity and nitric oxide can be involved in this condition. Astrocytes play an essential role in protecting neurons against excitotoxicity uptake excess ammonia and glutamate and converting it into glutamine, using enzyme glutamine synthetase and also protected against oxidative stress. S100B protein, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation or commitment in several situations of brain injury, including hyperammonemia. Antioxidants, such as resveratrol, showed many biological effects, including modulation of glial parameters as glutamate uptake, glutamine synthetase activity and S100B secretion. In this study, we investigated the effect of antioxidants on S100B secretion induced by ammonia in astroglial cells. Resveratrol was able to prevent the increase of S100B secretion, after 24 h ammonia exposure, probably via nitric oxide and protein kinase A (PKA) inhibition. Then, resveratrol may be a possible protective agent against neurotoxicity induced by ammonia.