Les champs électriques pulsés sont largement utilisés dans la recherche, la médecine, l'industrie alimentaire et d'autres procédés biotechnologiques. L'interaction d'une impulsion de 100 µs avec la membrane plasmique et la membrane du réticulum endoplasmique a été évaluée dans deux types cellulaires différents. La perméabilisation des organites cellulaires avec ce type d'impulsions est démontrée expérimentalement pour la première fois. L'utilisation d'une telle impulsion afin de contrôler les oscillations calciques spontanées dans les cellules souches mésenchymateuses humaines issues du tissu adipeux a été évaluée. En créant des pics calciques électro-induits d’amplitudes différentes, l'impulsion peut ou bien induire un pic calcique supplémentaire ou bien inhiber les oscillations spontanées pour quelques dizaines de minutes. Cette inhibition rend possible d’imposer à la cellule des pics d’amplitude et de fréquence désirés. Un essai d’application de l'impulsion 100 µs à des cellules souches subissant une différenciation osseuse a aussi été réalisé. Une impulsion électrique semble retarder la différenciation. Lors d'une différenciation osseuse, plusieurs couches cellulaires ont été observées. La caractérisation de ces couches a donné des résultats qui pourraient aider à obtenir des ostéoblastes matures dans un temps moindre que la normale. L'utilisation des champs électriques pulsés microsecondes, pour perméabiliser la membrane plasmique et les membranes internes des cellules, ainsi que pour moduler les concentrations du calcium intracellulaire, semble donc très intéressante pour étudier le rôle du calcium dans de nombreux processus physiologiques et pour manipuler les dynamiques calciques (oscillations, vagues, pics) dans différents types de cellules. Ainsi, cette technologie simple, facile à appliquer et disponible dans beaucoup de laboratoires serait envisageable pour la modulation et le contrôle de fonctions cellulaires basiques telles que la prolifération, la différenciation et l'apoptose. / Pulsed electric fields are widely used in research, medicine, food industry and other biotechnological processes. The interaction of one 100 µs pulse with the plasma membrane and the endoplasmic reticulum membrane was evaluated in two different cell types. Pulse amplitude ranged between 100 and 3 000 V/cm. Organelles membrane permeabilization using this kind of pulses was experimentally demonstrated for the first time. The use of such a pulse to control the spontaneous calcium oscillations in human-adipose mesenchymal stem cells was also assessed. By creating electro-induced calcium spikes of different amplitudes, the pulse can either add a supplementary spike, or, on the contrary, inhibit the spontaneous oscillations for some tens of minutes. During this inhibition period, the electric pulse-mediated addition of calcium spikes of desired amplitude and frequency is still possible. The delivery of 100 µs pulses to stem cells undergoing osteodifferentiation was also performed. The electric pulse seemed to delay the differentiation. Moreover, during osteogenic differentiation, cells cultures displayed an organization in a few cell layers. The characterization of these layers gave results that may help to obtain mature osteoblast in less time than usual one. The use of the microsecond electric pulses technology to permeabilize the plasma and the internal cell membranes as well as to modulate internal calcium concentrations is therefore interesting to study the role of calcium in many physiological processes and to manipulate the cell calcium dynamics (oscillations, waves, spikes) in different cell types. Doing so, this available, simple and easy to apply technology could be used for the modulation and the control of basic cellular functions such as proliferation, differentiation and apoptosis.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Objectifs : Identifier le rôle des récepteurs de l'angiotensine II (AT1 et AT2) et des canaux calciques de type-L dans la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales in vivo. Théories et hypothèses : Selon plusieurs études réalisées en laboratoire, la sécrétion basale des catécholamines médullaires, en réponse à l'angiotensine II, est principalement contrôlée par la stimulation des récepteurs AT1. Cette sécrétion des catécholamines n'est pas complètement inhibée en présence d'un antagoniste des récepteurs AT1, ce qui suggère l'implication de d'autres voies d'activation, soit les récepteurs AT2, soit les canaux calciques de type-L. De telles études n'ont jamais été réalisées à partir d'un modèle animal in vivo. Nous avons donc tenté de vérifier ces hypothèses dans les trois études présentées ici, dans lesquelles nous avons utilisé un antagoniste sélectif des récepteurs AT1 (BMS 186295), deux antagonistes sélectifs des récepteurs AT2, [le PD 123319 et le CGP 42112], et un bloqueur des canaux calciques de type-L, [la nifédipine]. Méthodes : Nous avons travaillé chez le chien anesthésié, ce qui nous a permis d'administrer les différents agents pharmacologiques directement dans la glande surrénale tout en minimisant les effets systémiques. Les concentrations plasmatiques des catécholamines étaient mesurées à partir d'échantillons prélevés de la veine surrénale et l'aorte. Le dosage des catécholamines a été réalisé par la technique de chromatographie liquide à haute performance (CLHP) couplé à un détecteur électrochimique. Résultats : Nos résultats confirment que la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales, en réponse à l'angiotensine II, est principalement contrôlée par la stimulation des récepteurs AT1. En effet, le BMS 186295 a inhibé significativement la sécrétion de catécholamines induite par l'administration de l'angiotensine II. Le PD 123319 et le CGP 42112 ont également inhibé, la libération des catécholamines en réponse à l'angiotensine II, suggérant cette fois-ci une participation des récepteurs AT2 dans la sécrétion des catécholamines. Enfin, nous avons observé que la nifédipine inhibe que partiellement la réponse médullaire à l'angiotensine II. Cependant, celle-ci a inhibé complètement la libération des catécholamines induite par l'administration de Bay K 8644, un activateur sélectif du canal calcique de type-L. Nos résultats ont indiqué que la combinaison du BMS 186295 et du PD 123319 n'a pas davantage inhibé cette sécrétion lorsque compare aux réponses obtenues avec le BMS 186295 ou le PD 123319 administré en monothérapie. De plus, nous avons démontré que la nifédipine combinée à ces deux antagonistes, diminuent significativement la sécrétion des catécholamines lorsque comparée à celle obtenue avec la combinaison des deux antagonistes des récepteurs à l'angiotensine II. Conclusions : Nos résultats suggèrent que les récepteurs à l'angiotensine II (AT1 et AT2) peuvent moduler la sécrétion des catécholamines par les médullo-surrénales chez le chien anesthésié. Les canaux calciques de type-L, sensibles à la dihydropyridine, semblent également impliqués de façon directe et indirecte dans la sécrétion des catécholamines médullaires induite par l'angiotensine II. Puisque les deux mécanismes contrôlés par le récepteur AT1 et le récepteur AT2 sont fonctionnellement impliqués de façon similaire dans la sécrétion des catécholamines induite par l'angiotensine II, il semblerait que la stimulation simultanée de ces récepteurs soit nécessaire pour permettre cette sécrétion chez le chien anesthésié.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Durant la grossesse normale, la pression artérielle et la réactivité vasculaire à plusieurs vasoconstricteurs diminuent. Ces changements hémodynamiques sont renversés durant la prééclampsie, soit une complication grave de la grossesse spécifique à l'humain. Des suppléments sodiques, 0.9% et 1.8% NaCI, administrés à des rates gestantes entraînent des symptômes caractéristiques de la prééclampsie. Ce nouveau modèle fut utilisé pour caractériser les mécanismes de réactivité vasculaire. Nous nous intéressions à l'activité des canaux potassique et calciques ainsi qu'aux récepteurs de l'endothéline. Des courbes concentration-réponse au tétraéthylammonium furent mesurées. Le tétraéthylammonium induit une contraction des anneaux aortiques seulement chez les rates non gestantes. Les suppléments sadiques n'ont pas induit de réponse au tétraéthylammonium sur les tissus de rates gestantes. Les effets de différents modulateurs de canaux potassiques (cromakalime et NS-1619) et calciques (nifédipine) sur les réponses myotropes à la phényléphrine, au chlorure de potassium et à la vasopressine furent mesurés. Les résultats obtenus suggèrent que chez les rates gestantes recevant des suppléments sodiques, l'activité des canaux KATP diminue tandis que celles des canaux Kca et des canaux calciques dépendants du voltage augmentent. Des courbes concentration-réponse à l'endothéline-1 furent mesurées en absence et en présence de BQ123. La sarafotoxine fut aussi testée. Les résultats obtenus suggèrent que les suppléments sadiques modulent la sensibilité des EÎA de façon différente chez les rates non gestantes et gestantes et que les ETe sont absents des muscles lisses de l'aorte thoracique. Les changements induits par les suppléments sadiques pourraient être caractéristiques de la prééclampsie.

Le canal calcique de type-L CaV1.2 participe au couplage excitation-contraction des cardiomyocytes. Cav1.2 est composé d’une sous-unité principale CaVα1, associée aux sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. Lorsque présente à la membrane, c’est CaVα2δ1 qui est responsable de moduler la densité du courant calcique. Elle ne possède qu’un seul segment transmembranaire présent du côté C-terminal, au niveau de la protéine δ, ce qui en fait une protéine transmembranaire de type I. Certaines protéines qui appartiennent à cette famille doivent être clivées au niveau du site dit « omega », une modification post-traductionnelle nécessaire à leur fonction. Une fois clivées, ces protéines sont retenues à la membrane plasmique par une ancre glycosyl-phosphatidyl-inositol (GPI). Nos études en microscopie confocale montrent que la protéine sauvage est sensible à l’action de la phospholipase C qui clive de manière spécifique les groupements phosphoinositol, ce qui est compatible avec la présence d’une ancre GPI fonctionnelle. De plus, la mutation des résidus formant le site « omega » en isoleucine au niveau des sites G1060 et G1061 prévient l’adressage membranaire de CaVα2δ1 estimé par cytométrie en flux et imagerie confocale, et réduit la modulation des courants calciques mesurés par la méthode du « patch-clamp ». Les mutants G1060I et G1061I sont aussi associés à un changement dans le patron de migration de la partie C-terminale, suggérant un processus protéolytique défecteueux. Les mutations simples des glycines en alanines préservent les propriétés de la protéine mais le double mutant G1060A/G1061A réduit significativement l’expression de CaVα2δ1 à la surface de la cellule et sa modulation sur le canal CaV1.2. Ces données suggèrent fortement que le clivage requiert spécifiquement un résidu Glycine en position 1060 ou 1061 pour produire le clivage protéolytique dominant chez CaVα2δ1, et que cet ancrage GPI est essentiel à la fonction du canal. / Voltage-gated calcium channels CaV1.2 play an essential role in the regulation of cardiac excitability. Functional channels are formed by the CaVα1 subunit and the intracellular CaVβ and the extracellular CaVα2δ1 subunits. CaVα2δ1 are type I transmembrane proteins that undergo a posttranslational modification producing their association at the plasma membrane through a glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor. The molecular determinants required for the proteolytic cleavage of the recombinant CaVα2δ1 protein were studied using biochemical, immunocytochemical, fluorescence, and electrophysiological methods. Enzymatic treatment with a phospholipase C specific for the cleavage of phosphatidyl inositol lipids abolished the colocalisation of CaVα2δ1 with a plasma membrane marker as shown using live-cell confocal imaging. Single point mutations G1060I or G1061I in the predicted transmembrane CaVδ domain was shown to significantly reduce the cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging, and to prevent the CaVα2δ1-mediated increase in the peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2 currents. The isoleucine mutations were also associated with a change in the migration pattern of the C-terminal fragments suggesting that proteolytic processing was altered. Single glycine to alanine mutations preserved the protein properties but the double mutant G1060A/G1061A significantly impaired cell surface expression of CaVα2δ1 and its functional regulation of CaV1.2. Altogether our data support a model where one Glycine residue at position 1060 or 1061 is required to produce the dominant proteolytic cleavage of CaVα2δ1 and further suggest that the GPI-anchored form of CaVα2δ1 is essential for channel function.

Les canaux calciques de type L CaV1.2 sont principalement responsables de l’entrée des ions calcium pendant la phase plateau du potentiel d’action des cardiomyocytes ventriculaires. Cet influx calcique est requis pour initier la contraction du muscle cardiaque. Le canal CaV1.2 est un complexe oligomérique qui est composé de la sous-unité principale CaVα1 et des sous-unités auxiliaires CaVβ et CaVα2δ1. CaVβ joue un rôle déterminant dans l’adressage membranaire de la sous-unité CaVα1. CaVα2δ1 stabilise l’état ouvert du canal mais le mécanisme moléculaire responsable de cette modulation n’a pas été encore identifié. Nous avons récemment montré que cette modulation requiert une expression membranaire significative de CaVα2δ1 (Bourdin et al. 2015). CaVα2δ1 est une glycoprotéine qui possède 16 sites potentiels de glycosylation de type N. Nous avons donc évalué le rôle de la glycosylation de type-N dans l’adressage membranaire et la stabilité de CaVα2δ1. Nous avons d’abord confirmé que la protéine CaVα2δ1 recombinante, telle la protéine endogène, est significativement glycosylée puisque le traitement à la PNGase F se traduit par une diminution de 50 kDa de sa masse moléculaire, ce qui est compatible avec la présence de 16 sites Asn. Il s’est avéré par ailleurs que la mutation simultanée de 6/16 sites (6xNQ) est suffisante pour 1) réduire significativement la densité de surface de! CaVα2δ1 telle que mesurée par cytométrie en flux et par imagerie confocale 2) accélérer les cinétiques de dégradation telle qu’estimée après arrêt de la synthèse protéique et 3) diminuer la modulation fonctionnelle des courants générés par CaV1.2 telle qu’évaluée par la méthode du « patch-clamp ». Les effets les plus importants ont toutefois été obtenus avec les mutants N663Q, et les doubles mutants N348Q/N468Q, N348Q/N812Q, N468Q/N812Q. Ensemble, ces résultats montrent que Asn663 et à un moindre degré Asn348, Asn468 et Asn812 contribuent à la biogenèse et la stabilité de CaVα2δ1 et confirment que la glycosylation de type N de CaVα2δ1 est nécessaire à la fonction du canal calcique cardiaque de type L. / L-type CaV1.2 channels play a key role in the excitation-contraction coupling in the heart. They are formed of a pore-forming CaVα1 subunit in complex with the intracellular CaVβ and the disulfur-linked CaVα2δ accessory subunits. CaVα2δ significantly increases peak current densities of CaV1.2. The mechanism underlying this effect is still under study but requires that CaVα2δ be trafficked at the cell surface. CaVα2δ contains 16 putative N-glycosylation sites. A study was carried out to identify the role of N-glycosylation in the trafficking and protein stability of the subunit CaVα2δ. Herein we show that enzymatic removal of N-glycans produced a 50 kDa shift in the mobility of cardiac and recombinant CaVα2δ1 proteins. Simultaneous mutation of the 16 Asn sites was required to fully account for this change in protein mobility. Nonetheless, the mutation of only 6/16 sites was sufficient to 1) significantly reduce the steady-state cell surface fluorescence of CaVα2δ1 as characterized by two-color flow cytometry assays and confocal imaging; 2) accelerate the degradation kinetics estimated from cycloheximide chase assays; and 3) prevent the CaVα2δ1-mediated increase in peak current density and voltage-dependent gating of CaV1.2. Reversing the N348Q and N812Q mutations in the non-operational 6 Asn mutant functionally rescued CaVα2δ1. Single mutation N663Q and double mutations N348Q/ N468Q, N348Q/ N812Q, N468Q/N812Q decreased protein stability/synthesis and abolished steady-state cell surface density as well as upregulation of L-type currents. These results demonstrate that Asn663, and to a lesser extent Asn348, Asn468, and Asn812 contribute to the stability of CaVα2δ1 function and furthermore that N- glycosylation of CaVα2δ1 is essential to produce functional L-type Ca2+ channels.

La demande en énergie grandissante, les gisements d'uranium à faible teneur pourront être ceux exploités dans le futur. Le traitement conventionnel de minerais d'uranium utilise peu de procédés minéralurgiques de concentration permettant la réduction de consommation de réactifs de lixiviation. Le but de ce travail est de développer un procédé de valorisation visant l'amélioration du procédé d'exploitation (lixiviation alcaline en tas) prenant en compte la variabilité minéralogique et texturale du minerai. Le gisement de Trekkopje, est composé d'une calcrète et d'une gypscrète. Le minéral porteur de l'uranium est la carnotite (K2(UO2)2[VO4]2.3H2O). Les minéraux de gangue sont composés de silicates tels que le quartz, les feldspaths, les micas et de minéraux du calcium, la calcite et le gypse (analyses en DRX, ICP-MS). Un traitement d'images MEB a permis d'étudier les propriétés texturales et la surface exposée des inclusions dans les amas d'argiles (cf. Figure 1). Dans la calcrète broyée à -200 µm, 50 % de l'ensemble de la carnotite est en moyenne associée aux amas d'argiles, composés à 98 % de palygorskite, 2% d'illite, de montmorillonite et d'interstratifiés (analyses DRX et microsonde électronique de Castaing). La taille des grains de carnotite est à 95 % inférieure à 70 µm. La calcite est la principale inclusion dans les amas d'argiles avec un taux moyen d'inclusion de 12% tandis que celui de la carnotite s'élève à 5%. Le pourcentage de surface exposée moyen de ces minéraux, dans les amas, est de 6 % et de 3 %, respectivement, ceci indiquant que les inclusions ne devraient pas influencer le comportement des particules mixtes d'argile. Cependant, les essais de flottation sur minerai n'ont pas vérifié cette hypothèse. Trois voies de séparation minérales ont été proposées en fonction de l'aptitude des minéraux à consommer le réactif de lixiviation : les minéraux calciques des silicates, la palygorskite des minéraux de gangue et la carnotite des minéraux de gangue. Une étude des propriétés électrocinétiques en électrophorèse des silicates et des minéraux calciques a été réalisée afin de choisir les collecteurs et l'intervalle de pH optimal à une flottation sélective. Un pH basique proche de la neutralité est révélé optimal pour la séparation des minéraux de gangue avec des collecteurs cationiques ou anioniques en s'appuyant sur les valeurs de PIE des minéraux : silicates pH 1-2, palygorskite pH 3, francolite pH 3-4 et minéraux du calcium pH 9-10. Les isothermes d'adsorption des amines primaires avec un réactif nonionique obtenues par chromatographie gazeuse mettent en évidence leur coadsorption sur la surface des silicates à pH 8. La présence du réactif non ionique permet la formation d'une couche d'adsorption plus dense sur la surface minérale déduite des déplacements des bandes de vibration symétriques et asymétriques des groupements CH2, CH3 sur les spectres infrarouge en réflexion diffuse. La palygorskite est séparée de l'ensemble de minéraux calciques et silicates purs à pH 8, avec un mélange de collecteurs tels qu'une amine primaire et un alcool aliphatique sans utiliser de déprimants spécifiques. Une séparation nette entre minéraux du calcium et des silicates est réalisée à pH 8 en combinant l'oléate de sodium avec le même réactif nonionique. Des effets synergiques des mélanges de réactifs ioniques avec un réactif non ionique ont été mis en évidence avec un abaissement de la consommation en réactif ionique de deux à dix fois. Les essais de flottation en cellule mécanique de laboratoire de 1L sur le minerai ont confirmé les résultats obtenus en flottation des minéraux purs avec les collecteurs anioniques. L'élimination des minéraux du calcium (produit flotté contenant 25 % de l'uranium), des silicates (produit non flotté contenant 75 % de l'uranium) en utilisant une combinaison d'oléate de sodium et d'un alcool aliphatique est la voie de séparation par flottation retenue [...] / Due to the energy growing demand, uranium low grade ores may be those exploited in the future. Uranium ores conventional treatment doesn't often use mineral processing such as concentration methods for reducing leaching reagent consumption. The aim of this work is to develop an upgrading process to improve the operating process (alkaline heap leaching) taking into account the mineralogical and textural variability of the ore. The Trekkopje deposit is composed of calcrete and a gypscrete. The uranium bearing mineral is carnotite (K2 (UO2)2 [VO4]2.3H2O). The gangue minerals are composed by silicates, such as quartz, feldspars, micas and Ca-minerals, calcite and gypsum (XRD and ICP-MS analysis). A SEM image processing was used to study the textural properties and the exposed free surface of mineral inclusions in clay clusters. In calcrete milled to -200 µm, 50 % of all carnotite is associated with clay clusters, which are composed by 98 % of palygorskite, 2 % of illite, montmorillonite, and interbedded clays (XRD and microprobe analysis). The carnotite grain size is 95% less than 70 µm. Calcite is the main inclusion in clay clusters. Indeed, the calcite inclusions average rate in the clay clusters is 12 % and 5 % for carnotite inclusion. And the free exposed surface percentage of these minerals in clay clusters is 3 % and 6 %, thus indicating that the inclusions should not affect the behavior of mixed clay particles. However, ore flotation essays didn't verify this hypothesis. Three minerals separation have been proposed based on the mineral ability to consume leaching reagents: separating Ca-minerals from silicates, palygorskite from gangue minerals and carnotite from gangue minerals. A study of silicates and Ca-minerals electrokinetic properties (electrophoresis) was carried out to select the collectors and the optimum pH range for selective flotation. Basic pH near neutral was proved to be optimal for the separation of gangue minerals with cationic or anionic collectors (silicates IEP - pH 1-2, palygorskite IEP - pH 3, francolite IEP - pH 3-4 and IEP minerals calcium - pH 9 - 10). The adsorption isotherms of the primary amines with a nonionic reagent obtained by gay chromatography highlight their coadsorption on the silicates surface at pH 8. The presence of nonionic reagent allows to the formation of a compact layer on the mineral surface, derived from the displacement of the symmetric and asymmetric vibration groups CH2, CH3 of the infrared diffuse reflectance spectra. Palygorskite is separated from the pure Ca-minerals and silicates at pH 8, with a mixture of a primary amine and a nonionic reagent such as collectors, without using specific depressant. A clear separation of Ca-minerals and silicates is carried out at pH 8 by combining sodium oleate with aliphatic alcohols. The synergistic effects of ionic and nonionic reagents were highlighted with an ionic reagents consumption reduction by two to ten fold. The ore flotation tests have confirmed the results obtained in pure mineral flotation with anionic collectors. The removal of Ca-minerals (floated product containing 20 % of uranium), silicates (nonfloated product containing 80 % of uranium) using a combination of sodium oleate and an aliphatic alcohol is the separation by flotation chosen solution. This study led to exploitable results in solving the problem by coupling multi-scale approaches

Il est possible de perméabiliser la membrane plasmique des cellules par des agents chimiques (tels que les polyéthylènes glycols ou le diméthylsulfoxyde) ou par des agents physiques (tels que les ultrasons ou les impulsions électriques). Cette perméabilisation peut être réversible ou non, ce qui signifie qu’après la perméabilisation, la membrane retrouve son intégrité et ses propriétés d’hémi-perméabilité ou pas. Ces techniques peuvent être utilisées pour faire rentrer des médicaments ou des acides nucléiques dans les cellules ou pour générer des fusions cellulaires. Une approche récente, la dynamique moléculaire, utilise des simulations numériques pour prédire les effets des agents perméabilisants sur les membranes à l’échelle moléculaire, et permet d’apporter de nouvelles données pour comprendre les mécanismes moléculaires, encore peu connus à ce jour.Les impulsions dites « classiques » en électroperméabilisation, de l’ordre de la dizaine de millisecondes à la centaine de microsecondes et d’amplitude de champ de l’ordre de 100 kV/m, perméabilisent la membrane plasmique uniquement. Cependant, récemment, des impulsions plus courtes, dites impulsions nanoseconde (quelques nanosecondes) et de plus grande amplitude de champ (de l’ordre de 10 MV/m) ont été utilisées et permettent d’affecter également les membranes des organites cellulaires. Les travaux de cette thèse portent dans un premier temps sur les effets perméabilisants d’un agent chimique (le diméthylsulfoxyde, DMSO) en comparant les modèles prédictifs de la dynamique moléculaire avec des expériences in vitro sur des cellules. Le modèle numérique prédit trois régimes d’action en fonction de la concentration du DMSO. Utilisé à faible concentration, il y a déformation de la membrane plasmique. L’utilisation d’une concentration intermédiaire entraîne la formation de pores membranaires et les fortes concentrations de DMSO ont pour conséquence la destruction de la membrane. Les expériences in vitro faites sur des cellules ont confirmé ces résultats en suivant l’entrée de marqueurs de perméabilisation. Cette étude a été comparée avec la perméabilisation par un agent physique (les impulsions électriques). Dans un deuxième temps, ces travaux traitent du développement et de l’utilisation d’un nouveau dispositif d’exposition des cellules aux impulsions nanoseconde qui permet d’appliquer des champs électriques très élevés et d’observer par microscopie leurs au niveau cellulaire. Pour finir, ce dispositif a été utilisé avec des impulsions nanoseconde pour générer des pics calciques dans de cellules souches mésenchymateuses qui présentent des oscillations calciques spontanées liées à leur état de différenciation. Ces pics induits sont dus à la libération de calcium stocké dans les organites et/ou à la perméabilisation de la membrane plasmique permettant l’établissement d’un flux de calcium intramembranaire. Il est aussi possible d’utiliser des impulsions microseconde pour générer des pics calciques dans ces cellules. Dans ce cas, les pics calciques ne sont dus qu’à la perméabilisation de la membrane plasmique. En jouant sur l’amplitude des champs électriques appliqués et sur la présence ou l’absence de calcium externe, il est possible de manipuler les concentrations calciques cytosoliques en mobilisant le calcium interne ou externe. Une des particularités de ces nouveaux outils est de pouvoir être déclenchés et arrêtés instantanément, sans réminiscence, contrairement aux molécules chimiques permettant de produire des pics calciques. Ces outils pourraient donc permettre de mieux comprendre l’implication du calcium dans des mécanismes comme la différenciation, la migration ou la fécondation. / It is possible to permeabilize the cellular plasma membrane by using chemical agents (as polyethylen glycols or diméthylsulfoxyde) or physical agents (as ulstrasounds or electric pulses). This permeabilization can be reversible or not, meaning that after the permeabilization, the membrane recovers its integrity and its hemi-permeable properties. These techniques can be used for the uptake of medicines or nucleic acids or to generate cellular fusions. A recent approach, the molecular dynamics, uses numerical simulations to predict the effects of permeabilizing agents at the molecular scale, allowed generating of new data to understand the molecular mechanisms that are not completely known yet.The pulses so called “classical” in electropermeabilization, from the range of the ten of milliseconds to the hundred of microseconds and with a field amplitude in the range of 100 kV/m, can only permeabilize the plasma membrane. However, more recently, shorter pulses, so called nanopulses (few nanosecondes) and with an higher field amplitude (in the range of 10 MV/m) have been used and allow to affect also cellular organelles membranes.This thesis is, in a first time, about the permeabilizing effects of a chemical gent (the diméthylsulfoxyde, DMSO) by comparing predictive models from molecular dynamics with experiments in vitro on cells. The numerical model predicts three regimes of action depending on the DMSO concentration. Used at low concentration, there is a plasma membrane deformation. The use of an intermediate concentration lead to membrane pores formation and higher DMSO concentrations resulted in membrane destruction. The experiments done in vitro on cells confirmed these results using the following of permeabilization markers. This study has been compared to permeabilization due to a physical agent (electric pulses).Secondly, it is about the development and the use of a new cell exposure device for nanopulses that permit to apply very high electric fields and to observe induced cellular effects simultaneously by microscopy.To finish, this device has been used with nanopulses to generate calcium peaks in mesenchymal stem cells that are presenting spontaneous calcium oscillations in correlation to their differentiation state.. These induced peaks are due to the release of the calcium stored in organelles and/or to plasma membrane permeabilization leading to a intramembrane calcium flux establishment. It is also possible to use microsecond pulses to generate calcium peaks in these cells. In this case, the calcium peaks are due to the plasma membrane permeabilization . By changing the amplitude of the applied electric fields and the presence or the absence of external calcium, it is possible to manipulate cytosolic calcium concentrations by mobilizing internal or external calcium. One feature of these new tools is to be triggered and stopped instantly without reminiscence, unlike chemical molecules permitting the production of calcium peaks. These tools could therefore lead to a better understanding of the involvement of calcium in mechanisms such as differentiation, migration or fertilization.

La mise en place d’une agriculture plus durable nécessite une compréhension de l’impact des pratiques de gestion sur le fonctionnement des agroécosystèmes et sur la fourniture de services écosystémiques. En représentant près de 68% des terres agricoles mondiales et contribuant à la subsistance de plus de 800 millions de personnes, les prairies sont l’un des agroécosystèmes où l’optimisation des pratiques agricoles apparaît comme cruciale. Ce travail de thèse porte sur le chaulage, une pratique agricole connue pour lutter contre les effets de l’acidification des sols – qu’elle soit naturelle ou induite par la gestion – mais dont l’efficacité est variable en prairie permanente. De fait, la littérature documentant l’impact du chaulage en prairie permanente est limitée et ne prend en compte que rarement la multifonctionnalité de ces agroécosystèmes. Par une approche intégrant différents types d’expérimentations, mon travail de thèse a cherché à répondre à ce besoin et à renforcer les connaissances du chaulage sur le fonctionnement de l’écosystème prairial. Le développement d’expérimentations au champ (in situ), en conditions semi-contrôlées (mésocosmes) et d’incubations de sol au laboratoire (microcosmes) a permis d’explorer les effets du chaulage sur les différents compartiments de l’écosystème prairial (végétation, microorganismes, sol) ainsi que l’influence de facteurs modulant ces effets. Dans l’ensemble des expérimentations, le chaulage a effectivement augmenté le pH des sols. Toutefois, cette amélioration du statut acido-basique du sol ne s’est pas toujours traduite par une augmentation de la productivité du fourrage ou des biomasses microbiennes et racinaires. Mes travaux ont montré que le chaulage contribue aux émissions de gaz à effet de serre par différentes voies (réémission du carbone apporté sous forme de chaulage et stimulation de la minéralisation) et peut potentiellement réduire les émissions de CO2 à l’échelle de la respiration de l’écosystème. Collectivement mes résultats soulignent l’importance du contexte pédoclimatique sur l’impact du chaulage en prairie permanente, et la difficulté d’extrapoler les effets du chaulage, en particulier sur la production de fourrage et les émissions de gaz à effet de serre, d’une échelle d’étude fine à l’échelle de la parcelle en prairie permanente. L’efficacité du chaulage semble dépendre du type d’amendement et de son dosage et peut également interagir avec d’autres pratiques de gestion telles que la fertilisation azotée et le niveau d’intensité de gestion. / The development of sustainable agriculture requires greater understanding of the impact of management practices on agroecosystem functioning, and on the ecosystem services provided by these agroecosystems. Representing nearly 68% of world's agricultural surfaces and contributing to the livelihoods of more than 800 million people, grasslands are one of the major agroecosystems where optimized agricultural practices are of concern. This PhD focuses on liming, a well-known practice for counteracting soil acidification (due to ongoing natural processes or accelerated by management practices), but which has variable efficiency in permanent grasslands. Indeed, liming effects on grassland are poorly documented and existing studies rarely take into account grassland multifunctionality. My thesis uses an integrated approach to improve the knowledge of liming impacts on grassland functioning. Different types of experiments – in the field (in situ), in semi-controlled conditions (mesocosms) and laboratory soil incubations (microcosms) – were used to study liming effects on different grassland compartments (vegetation, microorganisms, soil) along with possible interacting factors. Liming effectively increased soil pH in all the experiments. However, improving pH status did not always lead to greater forage production or increases in microbial and root biomass. My results showed that liming can enhance greenhouse gas emissions through several pathways (reemission of lime-derived carbon or stimulation of carbon mineralization), but may also reduce CO2 emissions from ecosystem respiration. Collectively, my findings emphasize the importance of pedoclimatic conditions for liming impacts on permanent grasslands and highlight the difficulty of upscaling liming effects, particularly on forage production and greenhouse gas emissions. The efficiency of liming appears to depend on the type and dose of soil improvers and can also interact with other management practices such as nitrogen fertilization and management intensification.

Les polynucléaires neutrophiles représentent 50-70% des leucocytes sanguins et possèdent un rôle majeur dans la défense de l'organisme contre les pathogènes. Le Ca2+ est un second messager qui joue un rôle primordial dans le chimiotactisme, la phagocytose, la dégranulation et la production de formes réactives de l'oxygène (FRO) afin de neutraliser l'agent pathogène. Dans ces cellules, l'influx calcique de type SOCE est essentiel pour l'homéostasie calcique. Il est peu étudié en raison du manque d'outils pharmacologiques spécifiques d'où l'importance dans un premier temps de chercher de nouvelles molécules. Les cellules T Jurkat dont le SOCE est largement caractérisé servent de modèle pour la caractérisation initiale de ces molécules. Le 2-APB est parmi les molécules les plus largement utilisées dans la caractérisation du SOCE en raison de sa double activité sur le SOCE avec une potentialisation à [1-10 μM] et une inhibition à [> 20 μM]. En revanche, ce produit manque de spécificité et agit sur d'autres cibles cellulaires comme les récepteurs à l'inositol (1,4,5)-trisphosphate (InsP3Rs). La 1ère étape est de sélectionner à partir d'analogues commerciaux du 2-APB (Methoxy-APB, Dimethoxy-APB, Cyclic-APB, Benzothienyl-APB, Thienyl-APB et MDEB), des composés plus spécifiques et également plus efficaces que la molécule mère. Deux molécules se sont distinguées : le MDEB comme uniquement potentialisant du SOCE et le Benzothienyl-APB comme un puissant inhibiteur. En revanche, tous les analogues du 2-APB inhibent les InsP3Rs à l'exception du MDEB qui semble plus spécifique du SOCE. L'effet du MDEB sur le courant calcique, ICRAC, a été étudié grâce à la technique du patch-clamp. Il augmente d'environ 4 fois l'amplitude de ICRAC par rapport à celle enregistrée dans les cellules contrôle. Par ailleurs, le MDEB ralentie l'inactivation rapide de ICRAC due au Ca2+. Sur le plan physiologique, le MDEB à des concentrations croissantes inhibe la synthèse de l'IL-2 dans les cellules Jurkat stimulées et ceci malgré son effet potentialisant du SOCE. Cette activité est liée à son effet pro-apoptotique dans les cellules Jurkat stimulées. Le MDEB et le Benzothienyl-APB caractérisés dans la 1ère partie nous ont servi d'outils potentiels afin d'étudier le SOCE des cellules PLB-985 différenciées en cellules proches de neutrophiles. Le SOCE a été induit soit par un traitement des cellules avec la thapsigargine (Tg) soit de manière physiologique avec les peptides fMLF et le WKYMVm deux chimioattractants, ligands des récepteurs aux peptides formylés FPR et FPRL1 respectivement. En plus, le SOCE induit par la Tg est modulable par le 2-APB, potentialisé par le MDEB et inhibé par le Benzothienyl-APB. La phagocytose des levures par les cellules PLB-985 différenciées ainsi que la production de FRO intraphagosomales ont été inhibées par le MDEB et le Benzothienyl-APB. Les FRO extracellulaires ont été également inhibées par Benzothienyl-APB en revanche à cause de la forte interférence du MDEB avec la technique de mesure nous n'avons pas pu étudier ses activités. En conclusion, le MDEB et le Benzothienyl-APB sont de nouveaux outils pharmacologiques potentialisant ou inhibant le SOCE des leucocytes, qui nous permettront dans l'avenir une meilleure compréhension de l'entrée calcique et ses rôles dans ces cellules.

Le gisement de tungstène de Salau (Ariège, France), est reconnu comme étant du type skarn à scheelite. Les roches composant une grande partie de la gangue du minerai sont formées par l'altération des roches d'origine métasomatique. Ces roches sont de deux types : (¤) Des skarns zonés et massifs, développés aux dépens de l'encaissant carbonaté, (¤) des skarnoïdes développés sur des alternances de pélites et de marbres, appelées barrégiennes. Le premier type compose 10 % des roches d'origine métasomatique, le reste étant constitué par les barrégiennes. C'est surtout à ces dernières que nous nous intéressons dans cette thèse. L'étude entreprise a abouti à la connaissance de l'évolution pétrographique et minéralogique de ces roches. La formation d'origine composée de bancs de calcite et de lits de pélites : Biotite , chlorite, feldspath, quartz, subit plusieurs phénomènes successifs : (#) Une transposition de stratification marquée par la cristallisation de clinozoïsite dans une schistosité, ainsi que dans les lits pélitiques, avec développement de salite dans la roche. (#) Un métamorphisme de contact développant le grenat et la vésuvianite. (#) Une métasomatose d'infiltration avec formation de pyroxène et de grenat. (#) Une altération siliceuse affectant essentiellement le pyroxène, accompagnée par la cristallisation de la scheelite. (#) Une altération hydrothermale développant les sulfures, et oblitérant la structure de la roche. L'étude minéralogique est complétée par une étude géochimique. Enfin une discussion sur les conditions de formation des différentes roches est proposée.