The Master´s thesis gives an overview of cord blood, its use, processing and cryopreservation. The role of cord blood as an alternative resource for transplantation is being widely discussed. In the experimental part, 50 grafts of donor cord blood were processed and the effect of cryopreservation and demographic factors of mother and child were evaluated on the cellularity of cord blood. Based on the evaluation, a recommendation about the inclusion of additional tests in routine processing of cord blood were made.

Afin d’améliorer au mieux le greffon placentaire, nous suggérons de réaliser sa culture d’expansion ex vivo dans des conditions proches de l’environnement des cellules souches hématopoïétiques in vivo. Ainsi, nous proposons que la co-culture de cellules CD34+ placentaires avec des cellules stromales mésenchymateuses (CSM) à basses concentrations d’O2 (BC-O2) pourrait contribuer à équilibrer les processus d’autorenouvellement et de différenciation afin d’obtenir un greffon optimisé. Sur le plan fonctionnel, nos résultats confirment un effet bénéfique de notre modèle expérimental par rapport aux conditions où figure la culture simple et/ou l’oxygénation atmosphérique (20%) en termes du maintien de progéniteurs (PH) primitifs (pré-CFC) et de cellules souches Scid-Repopulating Cells (SRC). Sur le plan quantitatif, l’amplification des cellules CD34+ et des PH engagés, bien qu’elle soit en retrait dans nos conditions de référence par rapport à la condition de 20% d’O2, elle demeure néanmoins importante. Par ailleurs, le rôle de l’IL-3 exogène se montre crucial à BC-O2 notamment en co-culture à 1,5% d’O2 où elle permet non seulement de préserver mais aussi d’amplifier le taux de SRC par rapport au témoin de cellules CD34+ de J0. Enfin, l’étude de la sécrétion des facteurs solubles et l’expression des marqueurs phénotypiques sur les CSM montre que l’IL-6, le VEGF et l’IL-8 sont plus sécrétés et les CD146, CD49a, CD54, CD200 et CD105 sont plus exprimés après incubation à 5% d’O2. Cependant, l’implication réelle de ces facteurs et antigènes dans l’effet paracrine et/ou de contact cellulaire direct menés par les CSM dans notre protocole requiert de nouvelles investigations / To optimize at best the hematopoietic engraftment, we suggest in this work to improve the ex vivo expansion conditions by moving them closer to physiology. Indeed, we propose to culture placental CD34+ (HSC/PH) on MSC layer in combination with LO2-C to ensure the amplification of HP together with the maintenance/expansion of HSC. Compared to the single culture and/or atmospheric oxygenation, our experimental model allows a better maintenance of primitive HP (Pre-CFC) and HSC together with a quite good amplification of total cells, CD34+ cells and committed HP despite of lower than control condition. Moreover, exogenous IL-3 shows crucial effect in co-culture at LO2-C (1.5% O2) since its addition better preserves and even increases the number of HSC compared to the CD34+ cells control from D0. We then studied the secretion of soluble factors in culture supernatants and found that IL-6, VEGF and IL-8 were present in larger quantities at LO2-C in both co-culture and MSC culture. Finally, the CD146, CD49a, CD54, CD200 and CD105 membrane antigens appear to be up-regulated in MSCs when incubated at 5% O2. However, the involvement of these factors and antigens in paracrine effect and/or direct cell to cell contact mechanisms at LO2-C requires further investigations. In conclusion, the combination of LO2-C and MSC would be promising in the field of HSC/PH grafts expansion to achieve its main objective of reducing the post-transplant cytopenia period together with maintaining the long-term graft potential

Os tumores carcinoides broncopulmonares típicos são considerados tumores de baixo grau de malignidade, o que faz com que muitas vezes seja negligenciada sua capacidade de gerar metástases e levar a óbito. A atual impossibilidade de se fazer predições fidedignas do potencial metastático para individualizar a terapêutica e o manejo clínico do paciente portador de tumor carcinoide típico muitas vezes impõe situações de dúvida nas decisões da prática clínica diária. O conhecimento das características moleculares e genéticas desses tumores é a esperança de melhor compreensão de sua história natural, da identificação de seus fatores prognósticos e da avaliação de novas propostas terapêuticas. O objetivo deste estudo foi quantificar três imunomarcadores: o D2-40, o CD-34 e o Ki-67 e avaliar se eles são capazes de predizer metástase. Como informação adicional também foram avaliadas as variáveis clínicas e suas associações com metástases. Material e métodos: Foram analisados prontuários de 97 pacientes submetidos à cirurgia para tratamento de tumor carcinoide típico broncopulmonar e que apresentavam período de acompanhamento pós operatório de cinco anos completos. Foi estabelecido um banco de dados epidemiológicos, anátomopatológicos, cirúrgicos e clínicos relacionados à doença. Os blocos de parafina contendo os tumores primários, metastáticos e os linfonodos ressecados foram recuperados e reavaliados por dois patologistas para confirmação do diagnóstico histológico. Após confirmação diagnóstica foram realizadas as reações imunohistoquímicas para o D2-40, o CD34 e Ki-67. As variáveis demografia, gênero, idade, localização do tumor, tamanho do tumor, margem comprometida, total de linfonodos dissecados e a quantificação dos marcadores Ki-67, CD34 e podoplanina (área linfática e densidade) foram comparadas a cinco desfechos: metástase linfática; metástase em linfonodos hilares, peribrônquicos e pulmonares ipsilaterais (N1); metástase em linfonodos mediastinais ipsilaterais (N2); metástase hematogênica; metástase linfática ou hematogênica. Para análise estatística adotou-se o valor de significância <= 5% (p <= 0,05). Resultados: Há imunoexpressão do D2-40, do CD-34 e do KI67 nos tumores carcinóides broncopulmonares típicos, sendo possível sua quantificação. Nessa casuística não foi detectada a relação dos mesmos com metástases. Dentre as variáveis clínicas estudadas, a margem cirúrgica comprometida apresentou associação com metástase hematogênica (Mann-Witney, p=0,03) e o gênero masculino apresentou associação marginal com metástase linfática (p=0,051) / Typical bronchopulmonary carcinoid tumors are slow-growing tumors considered to be of low malignancy, a fact that often underscores their capacity to generate metastasis that leads to death. The literature does not contain any assessment of the metastatic potential that would allow for individualized and optimized therapy that could have a positive impact upon the survival rate of patients. Genetic and biomolecular studies are the most promising venues for better comprehension of the behavior and natural history of such tumors. The objective of this investigation was to analyze three immunomarkers associated to malignity phenotypes: D2-40, CD-34, and Ki-67, and to verify whether or not they are associated to metastasis. D2-40 is a specific marker of the proliferation of the lymphatic endothelium and allows for the quantification of lymphangiogenesis. CD-34 identifies the endothelial cells of micro vessels and quantifies angiogenesis. Ki-67 in turn is a marker of neoplasia cell proliferation. As additional information several clinical variables were scrutinized for their association to metastasis. Ninety-seven subjects were assessed herein. These had undergone surgery for typical bronchopulmonary carcinoid tumor and all had complied with a full 5-year follow-up period. The paraffin blocks containing the primary and metastatic tumors and the dried lymph nodes were recovered. Once the histologic diagnosis was confirmed immunohistochemical reactions were performed for D2-40, Ki-67, and CD-34. The variables demography, gender, age, tumor site, tumor size, compromised margin, total dissected lymph nodes and quantification of D2-40 (lymphatic area and density), Ki-67 and CD-34 markers were compared to 5 outcomes: lymphatic metastasis, metastasis in hilar, peribronchic and ipsilateral pulmonary lymph nodes (N1), metastasis in ipsilateral mediastinal lymph nodes (N2), haematogenic metastasis, and lymphatic or haematogenic metastasis. It was concluded that there is immunoexpression of D2-40, CD-34 and Ki-67 markers in typical bronchopulmonary carcinoid tumors, and their quantification was possible, but in this casuistic their relation to metastasis was not detected. Among the clinical variables that were investigated the compromised surgical margin presented association with haematogenic metastasis (Mann-Witney, p=0.03), and the male gender was boderline associated to lymphatic metastasis (p=0,051)

Em estudos anteriores desenvolvidos por este grupo de pesquisa uma expressão mais elevada de alvos transcricionais e componentes da via NF-kB, bem como altos níveis de NOTCH1, foi identificada em células-tronco hematopoéticas (CTH) CD34+ de sangue de cordão umbilical (SCU) quando comparadas às CTH CD34+ de medula óssea (MO). Este grupo verificou ainda, por comparação das células CD34+ com as CD133+ (mais primitivas) que diversos fatores de transcrição (FT) envolvidos com o potencial de hemangioblasto, com a autorenovação das CTH, e com a diferenciação linfóide; como: RUNX1/AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXA9 e HOXB4 apresentaram-se mais expressos em células mais primitivas. A potencial participação das vias Notch e NF-kB na regulação destes FT tem importância conceitual e prática no entendimento da biologia das CTH, e dos processos envolvidos na diferenciação destas células. Com isto em vista, este projeto teve como objetivo, estudar o papel da via NF-kB e da via Notch na regulação destes FT. Para isso, um modelo experimental in vitro, de diferenciação de CTH CD34+ em linfócitos T, foi utilizado e a influência de fatores agonistas e inibidores farmacológicos destas vias, foram avaliados por citometria de fluxo e PCR em tempo real. Nossos resultados evidenciam o papel da via Notch na regulação transcricional de HOXB4 e GATA3 em células-tronco hematopoéticas CD34+ humanas, o que foi confirmado com base na expressão dos alvos diretos de Notch (HEY1 e HES1). Notamos ainda, que a expressão dos transcritos HES1, GATA3 e HOXB4 é prejudicada pela síntese protéica das CTH, uma vez que quando empregamos o prétratamento com a droga CHX há aumento da transcrição dos mesmos. Também podemos inferir que a ação do TNF- é positiva sobre esses transcritos, já que quando o utilizamos há elevação do nível de expressão desses transcritos, com exceção a HES1. Em relação ao cocultivo das CTH com as células estromais de camundongos, verificamos que apenas a linhagem OP9-DL1 detém a capacidade de promover a diferenciação celular T, e isso foi comprovado pelo surgimento de células comprometidas com a linhagem linfocítica T, através da presença dos marcadores de superfície específico CD7+ e CD1a+. Esses resultados auxiliarão na compreensão dos mecanismos moleculares de regulação transcricional envolvidos não apenas na diferenciação de linfócitos T, mas também na manutenção de um estado mais primitivo das CTH. Este conhecimento pode vir a contribuir com o desenvolvimento ou otimização de protocolos laboratoriais visando à expansão de CTH ou geração de células T para usos terapêuticos. / In previous studies by this research group a higher expression of transcriptional targets and components via NF-kB, as well as high levels of NOTCH1, was identified in hematopoietic stem cells (HSC) CD34 + cells from umbilical cord blood (UCB) compared to CD34 + hematopoietic stem cells from bone marrow (BM). This group also found, by comparing the CD34 + cells with CD133 + (more primitive) that several transcription factors (TF) involved in the potential of hemangioblast, with self-renewal of hematopoietic stem cells and to differentiated lymphocytic; as Runx1 / AML1, GATA3, USF1, TAL1/SCL, HOXB4 and HOXA9 were more expressed in more primitive cells. The potential involvement of Notch signaling pathways and NF-kB in the regulation of FT has conceptual and practical importance in understanding the biology of HSC, and the processes involved in differentiation of these cells. With this in mind, this project aimed to study the role of NF-kB pathway and Notch signaling in the regulation of FT. For this, an experimental model in vitro differentiation of CD34 + hematopoietic stem cells into T lymphocytes, was used and the influence of pharmacological agonists and inhibitors of these pathways were evaluated by flow cytometry and real-time PCR. Our results highlight the role of Notch signaling in the transcriptional regulation of GATA3 and HOXB4 in hematopoietic stem cells CD34 + human, which was confirmed based on the expression of direct targets of Notch (HES1 and HEY1). We also note that the expression of transcripts HES1, GATA3 and HOXB4 protein synthesis is hampered by the HSC, since when we use the pre-treatment with the drug there CHX increased transcription thereof. We can also infer that the action of TNF- is positive about these transcripts, since when we use it for raising the level of expression of these transcripts, except the HES1. In relation to the HSC coculture with stromal cells of mice, we found that only the line-DL1 Op9 has the ability to promote T cell differentiation, and this was evidenced by the appearance of cells committed to the T lymphocyte lineage, through the presence of specific surface markers CD7 + and CD1a +. These results will help understand the molecular mechanisms of transcriptional regulation involved not only in the differentiation of T lymphocytes, but also in maintaining a more primitive state of HSC. This knowledge may contribute to the development or optimization of laboratory protocols aimed at the expansion of HSC or generation of T cells for therapeutic use.

Aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) können sich neben allen anderen Zellen des Immunsystems auch dendritische Zellen (DCs) entwickeln. DCs spielen eine zentrale Rolle sowohl bei der Induktion von Immunantworten als auch bei der Aufrechterhaltung peripherer Toleranz. Eine Beeinflussung von DCs zur therapeutischen Nutzung wäre wünschenswert, erfordert aber ein noch tieferes Verständnis über deren Entwicklung im humanen Organismus. Das erste Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung potentieller DC-Vorläuferzellen in humanen lymphatischen Geweben. In Immunfluoreszenzaufnahmen von Thymus, Milz und Tonsillen mit Stammzell-charakterisierenden Markern konnten sowohl die in der Literatur als „Hämatopoetisches Stammzellkompartiment“ beschriebene Zellpopulation als auch weitere Zwischenstufen der Entwicklungsreihe der HSCs detektiert werden. Als Nächstes wurde untersucht, ob die im Gewebe identifizierten CD34+ Zellen in der in vitro Kultur zu DCs differenziert werden konnten. Hierzu wurden zunächst Protokolle etabliert und weiterentwickelt, in denen CD34+ Stammzellen des Nabelschnurbluts zu DCs gereift wurden. In einem anschließenden Schritt wurde das Protokoll mit den besten Ausbeuten an DCs auf Thymuszellen angewendet. Somit gelang es, aus Thymusstammzellen eine DCSubpopulation zu generieren, die aufgrund ihrer Markerexpression den Langerhanszellen ähnelt. Auf ihnen konnten außer Langerin auch andere C-Typ Lektinrezeptoren (Clec9a, DCIR und CD205) detektiert werden. Diese Zellen sind daher interessante Ziele für Untersuchungen zur Antigenbeladung von DCs und deren Präsentation an das adaptive Immunsystem. Zur effektiven Antigenbeladung von DCs werden Antikörper gegen endozytotisch wirksame Oberflächenmoleküle benötigt. Für deren Produktion wurden im weiteren Verlauf der Arbeit His-tragende und Ig-Fusionsproteine von Clec9a, Langerin, Dectin-1 und Dectin-2 produziert, um diese zur Immunisierung und Antikörperproduktion einzusetzen. In Zukunft können diese Antikörper zur Charakterisierung verschiedenster DC-Subpopulationen und außerdem zur Antigenbeladung von DCs herangezogen werden.

Efficient immobilization of the antibody to the substrate is of crucial importance in the development of anti-CD34-based endothelial progenitor cells capturing cardiovascular devices. This should go along with precise control of the antibody orientation by appropriate immobilization technology for retaining antibody activity, like in immunosensors. Recently, great attention was paid to immobilization of anti-CD34 antibody onto substrates by covalent binding, but at random orientation. Here, to investigate the biological effect of antibody orientation, we have prepared two kinds of anti-CD34 antibody coated surfaces, with random immobilization and oriented immobilization. The immunological binding activity (IBA) of the antibody at oriented immobilization was 3.48 times higher than at random immobilization, indicating that the two different surfaces were successfully prepared. The endothelial progenitor cell-capturing capability of oriented antibody-immobilized surface was 1.35 and 1.64 times higher than for the random immobilized surface after seeding for 2 and 12 h under flow condition, respectively. The endothelial progenitor cell-capturing efficiency per antibody by oriented immobilization was 5.16 and 6.26 times higher than for the random after seeding for 2 and 12 h under flow condition, respectively. In addition, the oriented antibody-immobilized surface possessed better blood-compatibility. These results clearly revealed the significance of antibody orientation which could retain its biological effect and may revolutionize the antibody-immobilization protocols used in cardiovascular and other bloodcontacting biomedical devices.

Atherosklerotische Arterien unterliegen strukturellem Umbau und chronischer Inflammation, die von einer dynamischen Entwicklung von Vasa vasorum (VV) begleitet wird. Die Beteiligung von Leukozyten und von vaskulären Vorläuferzellen an der Neovaskularisierung sowie die intimale Hyperplasie stehen im Zentrum der Atheroskleroseforschung. Damit verbundene Erkenntnisse könnten neue therapeutische Ansätze ermöglichen. Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der morphologischen Verteilung von Leukozyten (CD45, CD68, Mastzellen) und von Zellen mit Vorläufermarkern (CD34, CD117, VEGFR-2) in menschlichen Coronararterien mit verschiedenen atherosklerotischen Schweregraden. Mittels immunhistologischer Technik wurden Intima und Adventitia untersucht und die Ergebnisse zu den atherosklerotischen Schweregraden und der Neovaskularisierung korreliert. In Intima, Adventitia und dem perivaskulären Fettgewebe hat die Dichte der CD45+ Lymphozyten ihr Maximum im atherosklerotischen Grad 3. Dabei konnte sowohl in der Intima als auch in der Adventitia gezeigt werden, daß eine lineare Korrelation der CD45+ Lymphozyteninfiltration und VV-Dichte vorliegt. Es wurden zwei unterschiedliche Entzündungsmuster festgestellt. Beide zeigen in Grad 3 eine Zunahme der Zelldichten. In Grad 4-5 fällt die Dichte des einen Musters (CD45+, VEGFR-2+, VV) jedoch ab, während die Dichte des anderen Musters (CD34+, CD68+, Tryptase+, CD117+) in Grad 4-5 keine Veränderung aufweist. Die Ergebnisse deuten darauf hin, daß Leukozyten und vaskuläre Vorläuferzellen im Verlauf der Atherogenese wechselnde Funktionen wahrnehmen können. Sie nehmen offensichtlich VV als Eintrittspforte in die Gefäßwand.

Στην επίκτητη απλαστική αναιμία (ΑΑ) ο υποκυτταρικός μυελός και η πανκυτταροπενία στο περιφερικό αίμα είναι αποτέλεσμα βλάβης των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι κύριο χαρακτηριστικό γνώρισμα της νόσου είναι η ποσοτική αλλά και ποιοτική διαταραχή της stem cell δεξαμενής. Κλινικά και εργαστηριακά ευρήματα προτείνουν το σημαντικό ρόλο του ανοσοποιητικού συστήματος και ειδικά των Τ λεμφοκυττάρων στην ανάπτυξη της απλαστικής αναιμίας. Σήμερα, πλέον, είναι ευρύτερα αποδεκτό ότι η καταστολή του μυελού, που παρατηρείται στην ιδιοπαθή απλαστική αναιμία, είναι αποτέλεσμα της υπερπαραγωγής των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α από διεγερμένα CD8+ κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα, τα οποία συναντούμε τόσο στο περιφερικό αίμα όσο και στο μυελό ασθενών με απλαστική αναιμία. Οι κυτοκίνες αυτές παρουσιάζουν μάλλον προσθετική αντί συνεργική δράση, η οποία σχετίζεται με την IFN-γ-εξαρτώμενη αύξηση της έκφρασης του Fas στα CD34+ κύτταρα και από την IFN-γ-επαγώμενη έκκριση του TNF-α από τα μακροφάγα. Μελέτες έχουν δείξει ότι τόσο τα CD34+ όσο και τα BMMNC κύτταρα του μυελού των ασθενών με ΑΑ είναι περισσότερα αποπτωτικά σε σχέση με φυσιολογικούς μυελούς. Στόχος της διατριβής ήταν η περαιτέρω μελέτη των μοριακών μηχανισμών που εμπλέκονται στην ανοσολογικής προέλευσης απλαστική αναιμία. Λόγω, όμως, του ότι η απλαστική αναιμία είναι μια σπάνια νόσος, η παρουσία ενός εύκολα αναπαραγώγιμου in vitro μοντέλου μυελικής απλασίας θα βοηθούσε περισσότερο στη μοριακή μελέτη αυτής. Στη μελέτη μας, η αναπαραγωγή του καταλληλότερου μοντέλου μυελικής απλασίας επιτεύχθηκε με την προσθήκη των μυελοκατασταλτικών κυτταροκινών IFN-γ και TNF-α σε φυσιολογικό σύστημα μακράς διάρκειας καλλιέργειας μυελού των οστών. Στο μοντέλο αυτό έγινε διερεύνηση των μοριακών μονοπατιών των σχετιζομένων με την Fas και TRAIL επαγόμενη απόπτωση. Παράλληλα, έγινε σύγκριση των δεδομένων από το in vitro μοντέλο με τα αποτελέσματα της παράλληλης μελέτης των αντίστοιχων μοριακών παραμέτρων σε κύτταρα μυελού ασθενών με απλαστική αναιμία. Στο IFN-γ/ΤNF-α μοντέλο παρατηρήθηκε σημαντική μείωση τόσο των πιο άωρων LTC-IC όσο και των πιο δεσμευμένων προγονικών κυττάρων, σε σχέση με τις καλλιέργειες-μάρτυρες. Επιπλέον, τα αποτελέσματα των πρωτογενών και δευτερογενών καλλιεργειών βραχείας διάρκειας σε μυελικά κύτταρα ασθενών με ενεργό νόσο, επιβεβαίωσαν το χαρακτηριστικό γνώρισμα της απλαστικής αναιμίας, δηλαδή, το μειωμένο αριθμό προγονικών αιμοποιητικών κυττάρων. Η επώαση φρέσκων φυσιολογικών μυελικών κυττάρων, σε 5-6 εβδομάδων LTBMC σύστημα, με συνδυασμό των TNF-α/IFN-γ παραγόντων οδηγεί σε αύξηση της Fas mRNA έκφρασης στα CD34+ κύτταρα, κάτι που δεν παρατηρείται στα, αντίστοιχα, φρέσκα και στα 5-6 εβδομάδων κύτταρα-μάρτυρες. Το εύρημα αυτό σε συνδυασμό με τη χαμηλή mRNA έκφραση της caspase 3 καθώς και την απουσία έκφρασης των Bcl-2, Bax και της caspase 8 στον ίδιο πληθυσμό, προτείνουν το σημαντικό ρόλο του external μονοπατιού επαγωγής της απόπτωσης, όπως αυτό ρυθμίζεται από την δράση των μυελοκατασταλτικών κυτοκινών TNF-α/IFN-γ. Παράλληλα, η παρουσία χαμηλής Bcl-2 mRNA έκφρασης, στα CD34+ κύτταρα, τονίζει τη σημασία της αναλογίας προ-αποπτωτικών/αντι-αποπτωτικών σημάτων στη κυτταρική έκβαση. To σημαντικότερο, πάντως, εύρημα του TNF-α/IFN-γ μοντέλου είναι η συνεχής TRAIL mRNA έκφραση, στα CD34+ κύτταρα αυτού, κάτι το οποίο δεν έχει αναφερθεί, ως τώρα, στη βιβλιογραφία. Η μοριακή ανάλυση των μυελικών κυττάρων των ΑΑ ασθενών απεκάλυψε, εκτός της Fas mRNA έκφρασης στα BMMNC και/ή στα CD34+ κύτταρα, την αυξημένη TRAIL mRNA έκφραση στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό των ασθενών με ενεργό νόσο. Αντίθετα, στους ασθενείς σε ύφεση, απουσιάζει η έκφραση και των δύο γονιδίων στον ίδιο πληθυσμό. Ενώ, στα BMMNC η έκφραση του TRAIL mRNA παραμένει, ένα συνεχές εύρημα, ακόμη και στους ασθενείς σε ύφεση. Επιπρόσθετα, η μειωμένη έκφραση των αντι-αποπτωτικών γονιδίων Bcl-xl και/ή Bcl-2 στα BMMNC όλων των ασθενών και του Bcl-xl στα CD34+ κύτταρα των ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει «ανίκανη» να αναστείλλει το μηχανισμό της απόπτωσης στους AA ασθενείς. Το γεγονός ότι η έκφραση του TRAIL mRNA είναι συνεχής στο CD34+ κυτταρικό πληθυσμό του TNF-α/IFN-γ μοντέλου και μόνο στα CD34+κύτταρα ΑΑ ασθενών με ενεργό νόσο, δείχνει τη σημαντικότητα του συγκεκριμένου μορίου στην απόπτωση των προγονικών κυττάρων στη μυελική απλασία. Συμπερασματικά, το μοντέλο μυελικής απλασίας που τελικά επιλέξαμε επιβεβαιώνει προηγούμενη γνώση της συμμετοχής των TNF-α και IFN-γ στη παθοφυσιολογία της απλαστικής αναιμίας. Παράλληλα, τα μοριακά δεδομένα, τόσο του μοντέλου όσο και των ασθενών με απλαστική αναιμία, ενισχύουν την εμπλοκή του Fas/FasL στη παθογένεση της νόσου και προτείνουν την πιθανή συμμετοχή του TRAIL/Apo2L στην όλη διαδικασία. / In aplastic anemia (AA) the hypocellular bone marrow and blood pancytopenia occur as a result of damage to hematopoietic stem cells . Previous studies have shown that a profound quantitative and qualitative defect in the stem cell compartment is a common feature in most patients with AA. Clinical and laboratory data suggest that the immune system, especially T lymphocytes, have an important role in the development of AA. It is well established that IFN-γ and TNF-α mediate hematopoietic stem cell suppression in aplastic anemia. These proinflammatory cytokines exhibit additive rather than synergistic effect, which may be mediated by the IFN-γ-dependent increase in Fas expression on CD34+ progenitor cells and by the IFN-γ-inducible secretion of TNF-α by macrophages. Bone marrow total mononuclear and progenitor cells from aplastic anemia patients are more apoptotic than cells from normal donors, indicating that apoptosis may be a major mechanism of stem cell loss in aplastic anemia. The aim of our study was to investigate the molecular mechanisms involved in the immune-mediated pathology of aplastic anemia. Since aplastic anemia is a rare disease the existence of an easily reproducible model of in vitro hematopoietic cell suppression can facilitate studies concerning the molecular pathways of this disease. In our study, we reproduced such a model with the addition of the myelosuppressive cytokines IFN-γ and TNF-α in a normal long term bone marrow culture system. In this model, we examined the Fas mediated pathway of apoptosis and especially the correlation between TRAIL expression and myelosuppression. We, also, studied these parameters in marrow cells from aplastic anemia patients. The IFN-γ and TNF-α inhibitory cytokines appeared to affect both immature LTC-ICs and more commited progenitor cells capable of lineage-specific colony formation (CFCs). In addition our progenitor cell assays results in patients, supported this unifying feature of reduced haematopoietic progenitor cells in aplastic anemia. TNF-α and IFN-γ treatment up-modulated Fas expression and induced apoptosis of 5-6 weeks cultured normal CD34+ cells, while normal freshly isolated and 5-6 weeks untreated cultured CD34+ cells showed no Fas mRNA expression. This finding, along with the low mRNA expression of caspase 3 and the absence of Bcl-2, Bax and caspase 8 expression, proposes the major role for activation of the extrinsic apoptosis pathway due to treatment of BMMNC with TNF-α and IFN-γ. In parallel, the existence of the low Bcl-xl mRNA expression in the same cell compartment points to the importance of the ratio of pro-apoptotic to anti-apoptotic signals, in cell fate. The most interesting finding is the constant TRAIL mRNA expression on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC, something not mentioned before. Molecular analysis of patients’ marrow cells revealed, apart from Fas mRNA expression in BMMNC and/or CD34+ cells, TRAIL mRNA expression in CD34+ cell population in active disease. Ιn contrast, in patients in remission, both Fas and TRAIL mRNA expression does not exist. Instead, in BMMNC’s cell compartment TRAIL mRNA expression remains a constant finding even in patients in remission. Additionally, the decreased expression of anti-apoptotic bcl-xl and/or bcl-2 in all patients’ BMMNCs and bcl-xl expression in CD34+ cells from patients with active disease, seems unable to inhibit the mechanism of apoptosis in aplastic anemia patients. In our study, the fact that the expression of TRAIL was constant on CD34+ cells in TNF-α/IFN-γ treated LTBMC and only in CD34+ cells of patients with active disease, points out its significance in apoptosis of progenitor cells. In conclusion, our in vitro model of hematopoietic suppression confirmed previous knowledge for participation of TNF-α and IFN-γ in the pathophysiology of marrow failure in aplastic anemia. In parallel, the molecular data both from the in vitro model, as well as from patients with aplastic anemia, reinforce the implication of Fas/FasL pathway in the pathogenesis of this disease and propose a probable role for TRAIL/Apo2L in the process.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2017-11-09T15:57:04Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Ernesto Santos Sousa Neto.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-11-17T14:44:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Ernesto Santos Sousa Neto.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-17T14:44:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ODONTO_ Ernesto Santos Sousa Neto.pdf: 4765427 bytes, checksum: ae3f93ce46ff32b7ce466869740090de (MD5) / Fapesb / O presente trabalho teve como objetivo estudar, por meio da imunohistoquímica, a participação de componentes celulares estromais a exemplo dos mastócitos (mast cell triptase), miofibroblastos (alfa-SMA) e macrófagos (CD163) e componentes vasculares (CD34 e D2-40) em uma série de tumores odontogênicos queratocísticos (TOQ), na tentativa de fornecer subsídios para compreender a interação entre esses componentes e o comportamento biológico distinto desta lesão. Para fins comparativos, cistos radiculares (CRs) e folículos pericoronários (FPs) também foram incluídos. A amostra foi composta por 30 TOQs, 15 CRs e 07 FPs. Para a avaliação dos mastócitos, miofibroblastos e macrófagos, foram quantificadas as células imunorreativas aos marcadores mast cell triptase, alfa-SMA e CD163, respectivamente, em 10 campos (400x). Os índices angiogênico e linfangiogênico foram avaliados por meio da densidade microvascular (MVD) e densidade microvascular linfática (MVDL) dos microvasos marcados, respectivamente, pelos marcadores CD34 e D2- 40. Foi utilizado o teste ANOVA com pós-teste de correção de Tukey, para análise estatística entre os marcadores segundo o tipo de lesão. Para a análise da correlação entre os marcadores dentro da mesma lesão, utilizamos a correlação de Pearson. Para a associação, no TOQ, entre os marcadores e a presença de inflamação, utilizamos o Teste T de Student. A análise da expressão do marcador mast cell triptase revelou existir diferenças significativas (p<0,05) entre a densidade de células mastocitárias presentes nos CRs (22,7) em relação aos FPs (1,23) e TOQs (7,39), e entre a densidade de mastócitos presentes no TOQs e FPs. Houve também diferença significativa (P<0,05) entre a densidade de miofibroblastos em TOQs (29,25) em relação aos CRs (4,66) e os FPs (1,50). A diferença da densidade de miofibroblastos entre os CRs e FPs não foi significativa (p>0,05). A respeito dos macrófagos, não houve diferenças significativas (p= 0,084) entre as densidades de macrófagos presentes nos TOQs (2,31), CRs (1,42) e FPs (0,14). Na avaliação do índice angiogênico, não houve diferenças significativas da MVD entre as três lesões estudadas. No entanto, para o índice linfangiogênico, houve diferença significativa (p<0,05) entre a MVDL presentes nos TOQs (11,64) em relação aos CRs (4,19) e aos FPs (0,167). A diferença entre a MVDL dos CRs em relação aos FPs não foi estatisticamente significante (p>0,05). Não foi encontrada associação significativa (p>0,05) entre os marcadores estudados com a presença de inflamação no TOQ. No presente trabalho, encontramos uma correlação positiva e moderada entre os marcadores mast cell triptase e o CD34 nos TOQ (p = 0,025). Já nos CRs encontramos uma correlação inversa e moderada entre os marcadores SMA x CD34 (p = 0,017). Nos FPs também encontramos uma correlação inversa entre os mesmos marcadores anteriores, porém forte (p=0,049). Embora os componentes celulares estromais e microvasculares aqui representados por mastócitos, miofibroblastos, macrófagos CD163 positivos e vasos CD34 e D240, respectivamente, sejam importantes para manutenção do arcabouço estrutural do TOQ e CR, existiu uma interação significante entre mast cell triptase e CD34 no TOQ e entre CD34 e o alfa –SMA no CR.

Einleitung: Humanisierte Mausmodelle werden in der humanmedizinischen Forschung bereits vielseitig eingesetzt und haben zu zahlreichen wissenschaftlichen Erkenntnissen im Zusammenhang mit zum Beispiel humanen Vorläuferzellen oder in Bezug auf humane Infektionskrankheiten beigetragen. Orientierung für die vorliegende Arbeit bot eine der zahlreichen Methoden zur Humanisierung von Mäusen, bei der immundefizienten Mäusen hämatopoetische Vorläuferzellen transplantiert werden. Ziele der Untersuchungen: Das etablierte Modell der humanisierten Maus sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit auf die Spezies Rind übertragen werden, um sogenannte bovinisierte Mäuse zu entwickeln und somit die Grundlage für ein vielversprechendes Modell des Immunsystems des Rindes zu schaffen. Es sollten zweckmäßige Transplantationsmethoden etabliert werden, die zu einer nachweisbaren Bovinisierung immundefizienter Mäuse führen. Tiere, Material und Methoden: Aus bovinem Nabelschnurblut (NSB) und bovinem peripheren Blut (pB) wurden mittels Dichtegradientenzentrifugation die jeweiligen mononukleären Zellen gewonnen (bCBMC (bovine cord blood mononuclear cells) aus NSB; bPBMC (bovine peripheral blood mononuclear cells) aus pB). Hierfür wurde methodisch die Durchführung unter Anwendung eines Mediums mit einer Dichte von 1,077 g/ml etabliert. Zur Isolierung boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen aus den genannten Zellfraktionen kamen verschiedene magnetische Separationsmethoden zum Einsatz. Mittels positiver Separation wurden aus den bCBMC zum einen CD34-positive (CD34+) und zum anderen c-kit-positive (c-kit+) Zellen isoliert, welche jeweils neugeborenen NSG™ Mäusen (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl) transplantiert wurden (Versuchsgruppe A: CD34+: n = 1 und c-kit+: n = 4). Darüber hinaus wurden mittels negativer Separation die T-Lymphozyten aus den bCBMC und bPBMC depletiert um die Stammzell-enthaltenden Fraktionen (SeF) zu gewinnen. Zur Depletion boviner T-Lymphozyten kamen zeitgleich drei Antikörper gegen bovine Oberflächenmarker dieses Zelltyps zum Einsatz: WC1, CD4 und CD8. Die isolierten SeF wurden in der Versuchsgruppe B ebenfalls NSG™ Mäusen transplantiert, jedoch, im Unterschied zur Versuchsgruppe A, neugeboren und auch adult (Versuchsgruppe B: neugeb. NSB: n = 10; neugeb. pB: n = 7; adult NSB: n = 2). Beide Versuchsgruppen bestanden aus mehreren unterschiedlich großen Untergruppen, welches auf die Größe der jeweils selektierten Zellpopulationen zurückzuführen war. Transplantationsverlauf und -erfolg innerhalb der Versuchsgruppen wurden mittels klinischem Scoring und Gewichtsbestimmung, wiederholter Blutbildanalyse sowie mittels durchflusszytometrischer Analysen des Blutes im laufenden Versuch und Analysen von Blut und Organsuspensionen aus Milz und Knochenmark zum Zeitpunkt des Versuchsendes untersucht. Für die durchflusszytometrischen Analysen des peripheren Blutes der Mäuse kamen verschiedene bovine Antikörper zum Einsatz, wobei dem Pan-Leukozytenmarker anti-CD45 die größte Bedeutung zukam. Durch den Einsatz muriner und boviner anti-CD45-Antikörper gelang die Unterscheidung zwischen originären murinen Leukozyten und den nach der Transplantation im Organismus der Maus sich etablierten bovinen Leukozyten. Statistische Analysen zwischen den Untergruppen waren aufgrund der unterschiedlichen Gruppengrößen nur eingeschränkt möglich. Es wurde mittels Kolmogorov-Smirnov-Test auf Normalverteilung untersucht. Je nach Anzahl der zu vergleichenden Grundgesamtheiten wurden die Daten anschließend entweder mittels t-Test für unabhängige Stichproben beziehungsweise mittels Mann-Whitney-U-Test (n = 2) oder mittels nicht parametrischer, einfaktorieller Varianzanalyse (Kruskal-Wallis-Test, wenn n ≥ 3) ausgewertet. Das Signifikanzniveau wurde jeweils auf p = 0,05 festgesetzt. Ergebnisse: Bei den Tieren der Untergruppe neugeb. pB der Versuchsgruppe B wurden nach der Transplantation während des Versuchszeitraumes von 18 Wochen keine klinischen Auffälligkeiten festgestellt. Das gleiche galt für die Tiere beider Untergruppen der Versuchsgruppe A. Aus den anderen beiden Untergruppen der Versuchsgruppe B, neugeb. NSB und adult NSB, mussten hingegen aufgrund des eingetretenen starken Gewichtsverlustes und der Verschlechterung des klinischen Zustandes Tiere vorzeitig getötet werden. In der Untergruppe neugeb. NSB der Versuchsgruppe B handelte es sich um 3 von 10 Tieren (30 %), in der Untergruppe adult NSB um 1 von 2 Tieren (50 %). In allen Versuchsgruppen konnten im Laufe des Experimentes im peripheren Blut der Mäuse durchflusszytometrisch bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen werden. Im Falle der Versuchsgruppe A wurden während des gesamten Versuches im peripheren Blut der Tiere der Untergruppe c-kit+ im Mittel höhere Anteile boviner CD45-positiver Zellen an der Gesamtleukozytenzahl nachgewiesen als im Blut der Tiere der Untergruppe CD34+ (c-kit+: 11,5 %; CD34+: 0,733 %). Im Vergleich zu den genannten Ergebnissen der Versuchsgruppe A wurde bei den neugeboren transplantierten Tieren der Versuchsgruppe B durchschnittlich eine größere Zahl boviner CD45-positiver Zellen im peripheren Blut nachgewiesen (neugeb. NSB: 13,5 % und neugeb. pB: 16,0 %). Es konnte kein signifikanter Unterschied zur Untergruppe c-kit+ der Versuchsgruppe A festgestellt werden (Kruskal-Wallis-Test). Im peripheren Blut der adult transplantierten Mäuse der Versuchsgruppe B wurden während des Versuchszeitraumes im Mittel 2,89 % bovine CD45-positive Zellen nachgewiesen. Schlussfolgerungen: Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, ein Modell bovinisierter Mäuse zu entwickeln. Unter Berücksichtigung der klinischen Parameter erwies sich die Transplantation von T-Zell-depletierten mononukleären Zellen aus bovinem peripherem Blut in neugeborene NSG™ Mäuse als am vielversprechendsten, auch wenn aufgrund der begrenzten Tierzahlen statistische Analysen nur eingeschränkt auswertbar waren. Daran anknüpfend können die dargelegten Untersuchungen fortgesetzt und bovinisierte Mausmodelle ausgewählter Infektionserreger des Rindes etabliert werden. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen bilden eine Grundlage, um weitere Anwendungen zur Immunologie in der Rindermedizin zu etablieren.:Abkürzungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis 1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Immunsystem 2.2 Besonderheiten des bovinen Immunsystems 2.3 Humanisierte Mausmodelle 2.3.1 Humanes Nabelschnurblut 2.3.2 Marker humaner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.4 Bovine Mausmodelle 2.4.1 Transplantation boviner Leukozyten 2.4.2 Transplantation bovinen Gewebes 2.4.3 Infektionsversuche mit bovinen Infektionserregern 2.5 Bovines Nabelschnurblut 2.6 Marker boviner hämatopoetischer Vorläuferzellen 2.7 Ziele der vorliegenden Arbeit 3 Tiere, Material und Methoden 3.1 Verbrauchsmaterialien 3.2 Laborgeräte 3.3 Software 3.4 Gewinnung bovinen Materials 3.4.1 Gewinnung von Nabelschnurblut 3.4.2 Gewinnung von peripherem Blut 3.5 Aufarbeiten des bovinen Materials 3.5.1 Dichtegradientenzentrifugation 3.5.2 Stammzellisolierung 3.5.2.1 Positive Separation 3.5.2.2 T-Zell-Depletion 3.6 Tierexperimentelle Methoden 3.6.1 Versuchstiere 3.6.2 Präkonditionierung durch Bestrahlung 3.6.3 Markierung der Tiere 3.6.4 Transplantation und Versuchsgruppen 3.6.5 Scoring 3.6.6 Blutentnahme 3.6.7 Finale Präparation 3.7 Erfassung des Blutbildes 3.8 Durchflusszytometrische Analysen 3.8.1 Erfassung und Auswertung der Daten 3.8.2 Verwendete Antikörper 3.8.3 In vivo-Analysen 4 Ergebnisse 4.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 4.1.1 Dichtegradientenzentrifugation 4.2 Stammzellisolierung 4.2.1 Positive Separation 4.2.2 T-Zell-Depletion 4.3 Transplantationsverlauf 4.3.1 Versuchsgruppe A - CD34+/ c-kit+ 4.3.1.1 Scoring 4.3.1.2 Blutbild 4.3.1.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.2 Versuchsgruppe B - T-Zell-Depletion 4.3.2.1 Scoring 4.3.2.2 Blutbild 4.3.2.3 Durchflusszytometrische Analysen 4.3.3 Zusammenfassung des Transplantationsverlaufes 5 Diskussion 5.1 Gewinnung boviner mononukleärer Zellen 5.2 Stammzellisolierung 5.2.1 Positive Separation 5.2.2 T-Zell-Depletion 5.3 Transplantationsverlauf 5.3.1 Versuchsgruppe A – CD34+/ c-kit+ 5.3.2 Versuchsgruppe B – T-Zell-Depletion 5.4 Bewertung und Ausblick 6 Zusammenfassung 7 Summary 8 Literaturverzeichnis A Anhang A.0.1 Tätowierschema A.0.2 Mittels T-Zell-Depletion isolierte Zellfraktionen A.0.3 Versuchsgruppe A - Blutbild A.0.4 Versuchsgruppe B - Blutbild Danksagung